CN113827619A

CN113827619A - 动物睾丸提取物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113827619A
Application number: CN202111043531.5A
Authority: CN
Inventors: 张博文; 康志云; 郑新越; 王烈
Original assignee: Beijing First Biochemical Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Beijing First Biochemical Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2021-09-07
Filing date: 2021-09-07
Publication date: 2021-12-24

Abstract

本发明公开了一种动物睾丸提取物及其制备方法和应用。本发明提供了一种动物睾丸提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)对动物睾丸进行外观检查，去除非实质部分；(2)对动物睾丸进行破碎、匀浆；(3)对匀浆后的动物睾丸进行冷冻和解冻，得到动物睾丸冻融液；(4)对动物睾丸冻融液进行冷冻干燥。相对于人工合成的睾酮，本发明提供的动物睾丸提取物的生物安全性更好。本发明提供的动物睾丸提取物还具有促进人或雄性动物性欲，促进人或雄性动物生长发育以及性腺生长发育，增加、恢复人或雄性动物精子数量的作用和功效。

Description

动物睾丸提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种动物睾丸提取物及其制备方法和应用。

背景技术

不孕不育已经成为当今社会发展的重大问题。据权威杂志《柳叶刀》在2020年报道，全球有约1/5的夫妇受不孕不育症影响，约50％的夫妇中男性因素是主要原因，在男性不育中，绝大多数是由于精子问题而导致不育。随着现代社会的发展，生育年龄的推迟，更加提升了不育不孕症的患病率。现代男性精子数量持续下降趋势明显，随着年龄的增加，睾酮含量下降是一个不可逆的趋势。睾酮水平和睾丸储备能力、生育能力以及精子数量和质量都密切相关。

不育症是影响男性生育能力的重要问题，必须引起男性的高度重视。临床上，大多不育症男性被检查出睾酮水平异常。睾酮水平异常会引起男性不育。睾酮与精子的质量和数量密切相关。少精症或无精症患者的血清睾酮水平和精液水平低于正常人。

尽管90％以上的原因是精子数量低或精子质量低或两者兼而有之，但是不育症的治疗却不能单纯地以提高精子数量为治疗目标，男性不育症是一种复杂的多因素疾病，其根本原因往往尚不清楚，经过治疗，仍然有30％的夫妇无法怀孕，到目前为止，尚无有效的治疗方法或药物已被确定可以提高自然受孕的精子参数(如精子的成活率)。

目前临床中部分少精症或弱精症患者，采用口服人工合成睾酮(如十一酸睾酮、甲睾酮等)方法进行治疗。

目前临床中应用的合成睾酮(如十一酸睾酮、甲睾酮等)属于人工合成睾酮。其中，甲睾酮(Methyltestosterone，又称为甲基睾酮)：分子式：C₂₀H₂₈O₂；分子量：300.43500；十一酸睾酮(Testosterone Undecanoate)：分子式：C₃₀H₄₈O₃；分子量：456.70000；十一酸睾酮的结构如下图所示：

口服甲基睾酮首先经过肝，大部分被肝代谢，故疗程长可影响肝功能；丙酸睾酮每周肌注一次，血浆睾酮水平不稳定；肌内埋置睾酮常需半年置入一次，且有发生感染、排斥、血肿的可能，不易被普通病人所接受。Adamopoulos等报道使用十一酸睾酮120mg/天作为他莫昔芬的补充药物治疗特发性不育，结果精子活力升高，Adamopoulos等报道使用十一酸睾酮120mg/天作为他莫昔芬的补充药物治疗特发性不育，结果精子活力升高，但Vandekerckhove等总结了11组雄激素治疗实验后认为无论是使用反跳或是补充疗法对男性不育的治疗作用不能肯定。，

作为一种在临床上运用20多年的药物，其同其他药物相比有一定的优势，但是大量摄入人工合成睾酮，有可能会产生抑制下丘脑-垂体-性腺轴的反馈作用，导致机体自身分泌睾酮功能减弱。在长期或大剂量服用后，会影响患者的肝脏功能、导致高血压、抑制自身雄性激素分泌、脱发等严重的副作用。同时，人工合成睾酮存在安全性问题，可能会导致前列腺增生，研究数据表明，十一酸睾酮具有前列腺增生的潜在风险，长期服用可能导致前列腺癌。因此人工合成睾酮或许并不能作为一种最优的治疗少精、弱精不孕症患者的治疗方案。

对于睾酮缺乏的少精弱精不孕症人群，补充睾酮是比较直接的解决方式，但是由于人工合成睾酮的诸多安全性问题，如何安全、有效、全面的补充睾酮以及提升性腺功能，成为了一个关键的问题。

发明内容

发明要解决的问题

针对现有技术中存在人工合成睾酮具有副作用和安全性等缺陷，本发明提供了一种能够安全、有效用于治疗少精、弱精不育症的动物睾丸提取物，并提供了该动物睾丸提取物的制备方法及其应用，从而完成了本发明。

用于解决问题的方案

本发明人鉴于上述现有技术中存在的问题，进行了深入的研究、反复试验，通过现代生物技术制备动物睾丸提取物，从而完成了本发明。即本发明如下所述：

本发明在第一方面提供了一种动物睾丸提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)对动物睾丸进行外观检查，去除非实质部分；

(2)对动物睾丸进行破碎、匀浆；

(3)对匀浆后的动物睾丸进行冷冻和解冻，得到动物睾丸冻融液；

(4)对动物睾丸冻融液进行冷冻干燥。

在一些具体的实施方式中，步骤(2)中通过将纯化水与动物睾丸破碎物混合、搅拌实现匀浆；优选的，所述纯化水的添加量以重量计为破碎、匀浆后得到的动物睾丸匀浆物质量的2倍。

在另外一些实施方式中，步骤(3)中冷冻的温度为-20℃～-40℃、冷冻的时间为48小时以上；步骤(3)中解冻的温度不高于18℃，优选的，所述解冻的温度为4℃～16℃。

在其它的一些实施方式中，步骤(4)中进行冷冻干燥的冷冻干燥机的冷冻温度为-10℃～-60℃，真空压力为1.5～15帕；优选的，所述冷冻温度为-10℃～-25℃，真空压力为1.5～15帕。

本发明在第二方面提供了一种动物睾丸提取物，其特征在于，所述动物睾丸提取物是根据本发明在第一方面中所述的制备方法制备得到的。

在一些具体的实施方式中，所述动物睾丸选自羊睾丸、牛睾丸、猪睾丸和兔睾丸中的任意一种。

本发明在第三方面提供了一种药物组合物，其包含(1)如本发明第二方面中所述的动物睾丸提取物，和(2)药学上可接受的载体。所述载体包括溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、矫味剂、着色剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、渗透压调节剂、pH调节剂、稳定剂、表面活性剂和防腐剂中的一种或两种以上的组合。

本发明在第四方面提供了如本发明在第二方面中所述的动物睾丸提取物在制备治疗男性少精、弱精或不育症的药物中的用途。

本发明在第五方面提供了如本发明在第二方面中所述的动物睾丸提取物在制备促进人或动物性欲的药物中的用途。

本发明在第六方面提供了如本发明在第二方面中所述的动物睾丸提取物在制备提高人或动物血清中睾酮含量的药物中的用途。

本发明在第七方面提供了治疗男性少精、弱精或不育症等疾病的方法，其特征在于，给予受试者治疗剂量的如本发明在第二方面中所述的动物睾丸提取物。

发明定义

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。为了本发明的目的，下文定义了以下术语。

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大于5％的上限的范围内的数字数值。

术语“和/或”当用于连接两个或多个可选项时，应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或多项。

如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。

术语“睾丸提取物”，在本文中是指由健康动物(例如，羊、牛、猪、兔等)睾丸经现代生物技术提取并经过冷冻干燥而制成的物质。在中医理论中，动物睾丸具有补肾壮阳的功效，如盘羊睾丸就是一种中药材，主肾虚阳痿。

发明的效果

由本发明的技术方案可见，本发明的技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

1，本发明提供的动物睾丸提取物为纯生物提取，无人工添加成分。

2，与其它传统中药材较为简单的炮制方式不同，本发明提供的动物睾丸提取物以新鲜的动物睾丸为原料、去除了杂质，并经过现代生物物理提取方法处理后，提高了活性成分的含量，该动物睾丸提取物在提升动物血清中的睾酮含量、生精、促进性腺发育和减脂功效更为显著。

3，本发明提供的动物睾丸提取物在小鼠动物模型中未发生前列腺增生的情况，相对于人工合成的睾酮具有更好的安全性。

4，本发明提供的动物睾丸提取物具有促进人或雄性动物性欲，促进人或雄性动物生长发育以及性腺生长发育，增加、恢复人或雄性动物精子数量的作用和功效。

为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下：

附图说明

图1示出了三个批次的睾丸提取物中性激素结合球蛋白的Western Blot检测结果；其中，SHBG为性激素结合球蛋白，GAPDH为阳性对照。

图2示出了睾酮ELISA试剂盒标准曲线。

图3示出了各组小鼠血清睾酮OD值对比；其中，A、B、C、D分别代表阴性对照组、阳性对照组、睾丸提取物常规剂量组和睾丸提取物高剂量组。

图4示出了各组小鼠前列腺指数对比；其中，A、B、C、D分别代表阴性对照组、阳性对照组、睾丸提取物常规剂量组和睾丸提取物高剂量组。

图5示出了各组小鼠前列腺组织HE染色结果(200×)；其中，A、B、C、D分别代表阴性对照组、阳性对照组、睾丸提取物常规剂量组和睾丸提取物高剂量组。

图6示出了正常对照组、模型对照组、枸橼酸氯米芬片阳性对照组、五子衍宗丸阳性对照组、睾丸粉200μg/mL组和睾丸粉300μg/mL组斑马鱼精子数量的平均值。

具体实施方式

本发明所列举的具体实施例只作为本发明的范例，本发明并不限制于下文所描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对下文所述的实施例进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

本发明实施例中所使用的试验材料、试验试剂和仪器均可市购获得。

实施例1：睾丸提取物的制备

1.1解冻摘选

对新鲜冷冻的羊睾丸解冻并对其外观进行查验，遴选好的羊睾丸，去除筋膜、脂肪等非实质部分，称重。其中，所述遴选标准为：选择外观整齐、无明显破损和无腐败现象的羊睾丸。

1.2破碎匀浆

将摘选好的睾丸使用纯化水清洗，清洗干净后使用搅拌机破碎至匀浆状态，破碎后称重，以重量计加入2倍量的纯化水，搅拌均匀，匀浆放入冷库-20℃～-40℃冻存，冷冻时间48小时以上。

1.3融化

完成冷冻后出库解冻，解冻温度不得高于18℃，得到羊睾丸冻融液。

1.4冷冻干燥

将羊睾丸冻融液通过管道引入冷冻干燥机，调节羊睾丸冻融液的上液量，使冷冻干燥机的冷冻温度在-10℃～-60℃、真空压力在1.5～15帕；优选的，所述冷冻温度为-10℃～-25℃，真空压力为1.5～15帕，进行冷冻干燥。冷冻干燥成粉状物后入密封管道收至无菌袋内。放入冷库中冷冻保存备用。

实施例2睾丸提取物活性成分鉴定

本实施例中利用以下方法对实施例1中制备的睾丸提取物的活性成分进行鉴定：

蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

具体操作如下：

2.1蛋白裂解

1)将RIPA裂解液(50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1％TritonX-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，以及2mM焦磷酸钠，25mMβ-磷酸甘油，1mM EDTA，1mM Na₃VO₄，0.5μg/ml亮肽素)平衡至室温，与苯甲基磺酰氟(PMSF)按照99:1(体积质量比)的比例混合。此裂解液需现用现配；

2)取实施例1中制备的睾丸提取物0.2g，使用5ml的RIPA裂解液溶解，并使用超声仪混匀样品，于4℃摇床震荡20min；

3)14000g，5min，4℃离心，取上清于一干净EP管，制备得到蛋白样品，置于-20℃冰箱可长期保存。

2.2蛋白变性及凝聚配置

1)5×Protein Loading Buffer与2.1节制备得到的蛋白样品按照1:4(v/v)的比例混匀。震荡离心后，金属浴95℃加热5分钟；其中，所述5×Protein Loading Buffer的制备方法为：称量下列试剂至10mL离心管：1M Tris.Cl(pH6.8)1.25mL，10％SDS 5mL，溴酚蓝25mg，甘油2.5mL，2-ME 250μL，加去离子水溶解后定容至5mL。

2)使用BioSci^TM NewFlash Protein AnyKD PAGE分离胶A液和B液1:1混匀(参考值：每块0.75/1.0/1.5mm的胶，分离胶A液和B液各取2.0/2.5/3.8mL)，配胶可以使用15mL或50mL离心管配制；

3)使用BioSci^TM NewFlash Protein AnyKD PAGE浓缩胶A液和B液1:1混匀(参考值：每块0.75/1.0/1.5mm的胶，浓缩胶A液和B液各取0.8/1.0/1.5mL)；

4)将步骤2)中的分离胶溶液中加入10％APS溶液(5mL加50μL的10％APS溶液)，混匀后灌入模具中，分离胶溶液加至距前玻璃板顶端1.5cm或距梳齿约0.5cm即可；

5)在步骤3)中的浓缩胶溶液中加入10％APS溶液(2mL加20μL的10％APS溶液)，混匀后直接灌入分离胶溶液的上层，无须等待分离胶溶液凝固。

6)将梳子插入凝胶内，静置15～20min，等待凝胶聚合。注意：凝胶放入加有少量电泳缓冲液的密封袋中，可于4℃保存数周。

7)凝胶聚合后拔出梳子，可用1mL注射器或者移液枪将胶孔吹洗干净后上样。

2.3Western blot

1)将按照实施例1所示方法制备的3个批次的睾丸提取物依序上样后，通电电泳。样品在浓缩胶区域时采用100V电压，在分离胶区域时采用120V电压。当分子量标志物(Marker)展开、样品中溴酚蓝跑至胶底部的时候，结束电泳。

2)转膜前，提前将聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)用甲醇浸泡10s活化，去离子水处理5min。

3)电泳结束后，撬开胶板，将凝胶切割成适合的大小，从黑板到白板按照海棉-三层滤纸-凝胶-PVDF膜-三层滤纸-海绵的顺序，制成三明治结构夹在电转夹中，注意排空气泡。

4)将电转夹卡入电转槽中，倒入电转液，在电转槽四周放置冰袋，接通电转仪，以恒流200mA的条件开始电转，约90min后结束。

5)取出PVDF膜，置于5％脱脂牛奶溶液中，放在水平摇床上封闭1小时。封闭后，将PVDF膜置于装有1:1000的目标一抗(鼠抗羊SHBG及GAPDH)稀释液中，摇床4℃过夜。取出PVDF膜，TBST溶液洗涤3次，每次5分钟。

6)将PVDF膜置于装有1:5000的HRP发光二抗(鼠抗鼠二抗)稀释液中，室温下摇床孵育2小时。取出PVDF膜，TBST溶液洗涤3次，每次5分钟。

7)依照Tanon^TM High-sig ECL western Blotting Substrate发光试剂盒说明书进行发光反应，置于G:BOX荧光、化学发光成像系统中拍照成像。

Western blot实验结果：如图1所示，图1中的三个条带为按照实施例1中所述方法通过三批次制备的睾丸提取物PAGE电泳的结果，其中SHBG(sex hormone-bindingglobulin)为性激素结合球蛋白，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)为阳性对照。实验结果表明，三个批次的睾丸提取物中均有大量性激素结合球蛋白，该蛋白为睾丸提取物中的一种活性成分。

实施例3：睾丸提取物促进血液睾酮含量增加及前列腺安全性实验

3.1实验材料

BALB/C小鼠(6-8周)，雄性(非去势)，北京大学医学部动物部购买；

睾丸提取物悬浊液配制：将按照实施例1中所述方法制备的睾丸提取物按下文3.2节所述实验方法中的需要加入合适体积的超纯水进行稀释，制成悬浊液；睾酮悬浊液配制：将睾酮(安耐吉公司，5g装，纯度98％)溶于合适体积的超纯水制成悬浊液；睾酮ELISA检测试剂盒：RnD公司购买；多全波段酶标仪(MULTISKAN MK3，美国Thermo公司)；若干解剖剪刀、镊子；常规天平。

3.2实验方法

将40只小鼠分为4组(每组10只)，分别为(i)阴性对照组(超纯水灌胃)，(ii)阳性对照组(5mg/kg体重睾酮灌胃)，(iii)睾丸提取物常规剂量组(成人日常用药剂量，0.234g/kg；下文又称为“常规剂量组”)，和(iv)睾丸提取物高剂量组(成人日常用药3倍剂量，0.702g/kg；下文又称为“高剂量组”)；每组小鼠均连续灌胃45天。并分别进行以下试验：

(1)采集各组小鼠的血清，测量血清中睾酮的含量；(2)处死各组小鼠，取各组小鼠的前列腺称重，并测量各组小鼠的前列腺的指数，(3)对各组小鼠前列腺组织进行病理切片，HE染色观察结果。

3.3小鼠血清中睾酮含量检测

1)标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的(具体参见表1的第1行)标准品50μL；。

2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品的最终稀释度为5倍)。加样：将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3)加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。

4)温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。

5)配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

6)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

7)显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

8)终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

9)测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

实验结果：本实验在实验结束当天处死小鼠，眼球取血，并离心取上清，利用睾酮检测试剂盒检测血清中睾酮的含量，标准曲线OD值和各组小鼠血清OD值的结果分别如表1-2所示。

表1标准曲线OD值

表2各组小鼠血清OD值

其中，“*”表示取血失败的小鼠，因此未示出具体结果。

根据表1所示的结果，制作标准曲线图(具体参见附图2)，由标准曲线可知，随着睾酮浓度的增加，OD值降低。

结合表2所示的结果，进一步以OD值检测为指标探究各组小鼠血清中睾酮含量是否有差异，结果如图3所示。

根据本实施例所示的结果可以看出：小鼠血清的OD值与血清中睾酮的浓度呈现负相关关系，即血清中睾酮的浓度越高，OD值越小。根据OD值结果比较，阳性对照组小鼠的血清睾酮含量显著高于其他各组(P<0.0001)；睾丸提取物常规剂量组小鼠与阴性对照组小鼠相比血清的睾酮含量无明显变化，睾丸提取物高剂量组小鼠的血清睾酮含量显著高于空白对照组(P<0.05)；睾丸提取物常规剂量组及睾丸提取物高剂量组小鼠的血清睾酮含量均显著低于阳性对照组。实验结果表明，睾丸提取物高剂量组可以显著增加小鼠血清中睾酮的含量。

3.4小鼠前列腺称重指数对比

按照以下方法分离各组(包括阴性对照组、阳性对照组、睾丸提取物高剂量组和睾丸提取物常规剂量组)小鼠的前列腺：

将小鼠脱颈椎处死后头朝前方仰卧于手术台上，将其四肢伸展并予固定用镊子提起小鼠后腹部皮肤和肌肉，以耻骨联合前方向两侧腹股沟剪开，然后沿两侧腹股沟剪开两腹侧皮肤和肌肉，直至肋缘下把剪开的腹部皮肤肌肉翻向胸部，充分暴露腹腔内脏，此时，在小鼠腹腔后部可见到膀胱，在膀胱前侧有左右排列的两条白色或灰白色的精囊腺，其根部紧靠膀胱，在两条精囊腺的内侧自其顶端往下的1/3或2/3处各紧贴一条前列腺在前列腺侧面有一根细血管将其与精囊腺紧紧络在一起把跨两腺体的血管自跨点处截断即可将前列腺游离再夹住前列腺的根部即可完整摘下，用镊子把小鼠的膀胱拨向前侧可见其后面有两片白色的脂肪组织，把该组织向两侧翻开或摘除，即可见到紧靠在膀胱括约肌上的两个前列腺用镊子夹住前列腺的根部即可把膀胱后侧的前列腺完整地取下。然后轻轻用纱布擦干，放在微量天平上称量重量并记录。

实验结果发现，阳性对照组小鼠的前列腺有明显的增生现象，甚至部分小鼠的前列腺出现钙化现象。睾丸提取物常规剂量组及睾丸提取物高剂量组小鼠的前列腺与阴性对照组小鼠的前列腺相比无明显差异。

接着我们对各组小鼠的前列腺进行称重，计算各组小鼠的前列腺指数并对比，结果如表3和图4所示。其中，小鼠前列腺指数＝前列腺重量(mg)/小鼠体重(g)。该指数指征小鼠前列腺是否增生的重要参数。

表3各组小鼠前列腺指数对比

其中，“*”表示取材失败的小鼠，因此未示出具体结果。

根据表3所示数据进行作图，根据图4所示结果可知：阳性对照组小鼠的前列腺指数显著高于阴性对照组(P<0.01)小鼠的前列腺指数，证明小鼠的前列腺增生模型成功构建；常规剂量组、高剂量组与阴性对照组小鼠的前列腺指数相比均无明显变化，而高剂量组小鼠的前列腺指数明显高于常规剂量组(P<0.05)小鼠的前列腺指数；常规剂量组及高剂量组小鼠的前列腺指数均显著低于阳性对照组小鼠的前列腺指数。以上结果证明本发明提供的睾丸提取物对正常小鼠的前列腺没有增生作用。

3.5小鼠前列腺组织HE切片

将本实施例中各组小鼠的前列腺组织固定后做HE染色，镜下观察病理结果。

本次实验主要研究各组小鼠的前列腺组织是否发生变化，如增生、钙化等。结果如图5所示。

根据图5所示本实验中各组小鼠HE染色结果可以看出：阴性对照组小鼠的前列腺细胞膜界限分明，腺体结构特征明显。阳性对照组小鼠的前列腺细胞数量明显增加，从细胞密度可以看出前列腺增生现象非常明显。睾丸提取物常规剂量组小鼠的前列腺与阴性对照组小鼠的前列腺比较无明显变化，细胞正常，界限清楚，腺体特征明显。睾丸提取物高剂量组小鼠的前列腺腺体结构明显，无明显增生现象。结果证明本发明提供的睾丸提取物不会引发小鼠前列腺增生的风险。

实施例4：睾丸提取物对雄性动物生殖功能评价

本实施例进一步对本发明提供的睾丸提取物对雄性动物生殖功能的影响进行评价。具体方法如下：

4.1实验方法

斑马鱼品系：野生型AB品系成年斑马鱼，每个实验组为8尾斑马鱼(8尾雄鱼)，在28℃室温中孵育。

模型建立：用环磷酰胺处理雄性斑马鱼，建立斑马鱼少精症模型。

实验组别：共6组。将实施例1中制备的睾丸提取物研磨成粉、制成睾丸粉，并设置2个检测浓度(根据人体服用剂量换算，分别为200μg/mL、300μg/mL，下文分别称为睾丸粉200μg/mL组和睾丸粉300μg/mL组)、2个阳性对照组(分别给予0.100μg/mL枸橼酸氯米芬片和6.00μg/mL五子衍宗丸)、1个模型对照组(给予环磷酰胺200μg/mL)和1个正常对照组(不进行给药处理)。

给药方式：样品以水溶给药方式处理模型斑马鱼。

实验方法：样品处理结束后，对各实验组斑马鱼进行检测：(1)定性评价各组斑马鱼的追尾情况，拍摄视频；(2)分别测量并统计各组斑马鱼的体长、体重、和精巢的重量；(3)定量评价各组斑马鱼的精子数量，拍照并保存图片。

4.2实验结果

4.2.1表4示出了睾丸粉不同剂量组均有显著的促进斑马鱼追尾的效果，结果表明本发明提供的睾丸提取物具有促进雄性性欲的作用。

表4各组斑马鱼追尾频率对比

根据追尾频率的比较，睾丸粉300μg/mL组的追尾频率高于模型对照组、枸橼酸氯米芬片(0.100μg/mL)阳性对照组、五子衍宗丸(6.00μg/mL)阳性对照组，并且与正常对照组相当；睾丸粉200μg/mL组的追尾频率高于模型对照组，与枸橼酸氯米芬片(0.100μg/mL)阳性对照组相当。实验结果表明，在本实验条件下，本发明提供的睾丸提取物可提高环磷酰胺诱导的少精症斑马鱼追尾频率。

4.2.2表5～表7分别示出了睾丸粉不同剂量组均有促进斑马鱼体长、体重和精巢重量的效果，结果表明本发明提供的睾丸提取物具有促进生长发育，以及性腺生长发育的功效。

表5各组斑马鱼体长对比

根据表5中所示各组斑马鱼体长值结果比较可以看出：与模型对照组相比，睾丸粉(300μg/mL)组斑马鱼体长明显改善，具有极其显著的统计学差异(P<0.001)；与模型对照组相比，睾丸粉(200μg/mL)组斑马鱼体长增长明显，具有极其显著的统计学差异(P<0.001)，实验结果表明，在本实验条件下，本发明提供的睾丸提取物对环磷酰胺诱导的少精症斑马鱼的体长有明显改善。

表6各组斑马鱼体重的对比

根据表6所示的斑马鱼体重值结果比较可以看出：与模型对照组相比，睾丸粉(300μg/mL)组斑马鱼体重明显改善，具有统计学差异(P<0.05)；与模型对照组相比，睾丸粉(200μg/mL)组斑马鱼体长体重明显改善，具有统计学差异(P<0.05)，实验结果表明，在本实验条件下，本发明提供的睾丸提取物对环磷酰胺诱导的少精症斑马鱼的体重有明显改善。

表7各组斑马鱼精巢重量的对比

根据表7所示的斑马鱼精巢重量结果比较可以看出：与模型对照组相比，睾丸粉(300μg/mL)组斑马鱼精巢重量有明显改善，具有统计学差异(P<0.05)；与模型对照组相比，睾丸粉(200μg/mL)组斑马鱼精巢重量有明显改善，具有统计学差异(P<0.05)，实验结果表明，本发明提供的睾丸提取物对环磷酰胺诱导的少精症斑马鱼的精巢重量有明显改善。

4.2.3睾丸粉不同剂量组均有提升斑马鱼精子数量的作用，表明本发明提供的睾丸提取物具有增加、恢复精子数量的功效。

表8各组斑马鱼精子数量的对比

根据表8所示的斑马鱼精子数量结果比较可以看出：与模型对照组相比，睾丸粉(300μg/mL)组斑马鱼精巢重量明显改善，具有极其显著的统计学差异(P<0.001)；与模型对照组相比，睾丸粉(200μg/mL)组斑马鱼精巢重量明显改善，有极其显著的统计学差异(P<0.001)，实验结果表明，本发明提供的睾丸提取物对环磷酰胺诱导的少精症斑马鱼的精子数量有明显改善。根据表8所示的结果制作了各组斑马鱼精子数量对比图，具体参见图6。

Claims

1.一种动物睾丸提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)对动物睾丸进行外观检查，去除非实质部分；

(2)对动物睾丸进行破碎、匀浆；

(4)对动物睾丸冻融液进行冷冻干燥。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤(2)中通过将纯化水与动物睾丸破碎物混合、搅拌实现匀浆；优选的，所述纯化水的添加量以重量计为破碎、匀浆后得到的动物睾丸匀浆物质量的2倍。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中步骤(3)中冷冻的温度为-20℃～-40℃、冷冻的时间为48小时以上；步骤(3)中解冻的温度不高于18℃，优选的，所述解冻的温度为4℃～16℃。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的制备方法，其中步骤(4)中进行冷冻干燥的冷冻干燥机的冷冻温度为-10℃～-60℃，真空压力为1.5～15帕；优选的，所述冷冻温度为-10℃～-25℃，真空压力为1.5～15帕。

5.一种动物睾丸提取物，其特征在于，所述动物睾丸提取物是根据权利要求1～4中任一项所述的制备方法制备得到的。

6.如权利要求5所述的动物睾丸提取物，其中，所述动物睾丸选自羊睾丸、牛睾丸、猪睾丸和兔睾丸中的任意一种。

7.一种药物组合物，其包含(1)如权利要求5或6所述的动物睾丸提取物，和(2)药学上可接受的载体。

8.如权利要求5或6所述的动物睾丸提取物在制备治疗男性少精、弱精或不育症的药物中的用途。

9.如权利要求5或6所述的动物睾丸提取物在制备促进人或动物性欲的药物中的用途。

10.如权利要求5或6所述的动物睾丸提取物在制备提高人或动物血清中睾酮含量的药物中的用途。