RU2660587C1 - Белково-пептидный комплекс, повышающий жизнеспособность фолликулов в яичниках млекопитающих - Google Patents
Белково-пептидный комплекс, повышающий жизнеспособность фолликулов в яичниках млекопитающих Download PDFInfo
- Publication number
- RU2660587C1 RU2660587C1 RU2017132536A RU2017132536A RU2660587C1 RU 2660587 C1 RU2660587 C1 RU 2660587C1 RU 2017132536 A RU2017132536 A RU 2017132536A RU 2017132536 A RU2017132536 A RU 2017132536A RU 2660587 C1 RU2660587 C1 RU 2660587C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- bod
- solution
- follicles
- ovaries
- Prior art date
Links
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 title claims abstract description 18
- 230000035899 viability Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 title abstract description 14
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims abstract description 57
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims abstract description 28
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 18
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 abstract description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 9
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 abstract description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 abstract description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 abstract description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 3
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 abstract description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 abstract description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 79
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 description 31
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 26
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 description 15
- 238000011161 development Methods 0.000 description 14
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 9
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 8
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 8
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 8
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 8
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 7
- 210000002503 granulosa cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 7
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 6
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 5
- 230000001779 embryotoxic effect Effects 0.000 description 5
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 5
- 230000002625 immunotoxic effect Effects 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 5
- 231100000243 mutagenic effect Toxicity 0.000 description 5
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 4
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 230000002996 emotional effect Effects 0.000 description 4
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 4
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- 208000007984 Female Infertility Diseases 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 206010021928 Infertility female Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 3
- 231100000351 embryotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 3
- 231100000110 immunotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 3
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 3
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000037023 motor activity Effects 0.000 description 3
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000027758 ovulation cycle Effects 0.000 description 3
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000003390 teratogenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 3
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000700112 Chinchilla Species 0.000 description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 206010028400 Mutagenic effect Diseases 0.000 description 2
- 206010033266 Ovarian Hyperstimulation Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 206010043275 Teratogenicity Diseases 0.000 description 2
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 2
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 2
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000007665 chronic toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000160 chronic toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 2
- 231100000238 embryotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000009245 menopause Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 210000002394 ovarian follicle Anatomy 0.000 description 2
- 230000000624 ovulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 2
- 231100000211 teratogenicity Toxicity 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 2
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005641 Adenomyosis Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010002659 Anovulatory cycle Diseases 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 208000019255 Menstrual disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003815 abdominal wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- -1 ammonium ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013059 antihormonal agent Substances 0.000 description 1
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- CRQQGFGUEAVUIL-UHFFFAOYSA-N chlorothalonil Chemical compound ClC1=C(Cl)C(C#N)=C(Cl)C(C#N)=C1Cl CRQQGFGUEAVUIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000005 chromosome aberration Toxicity 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000011037 discontinuous sequential dilution Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000000598 endocrine disruptor Substances 0.000 description 1
- 210000003372 endocrine gland Anatomy 0.000 description 1
- 201000009274 endometriosis of uterus Diseases 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000001752 female genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001368 germline stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 108010019691 inhibin beta A subunit Proteins 0.000 description 1
- 230000030214 innervation Effects 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000029849 luteinization Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000000260 male genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000404 nontoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034004 oogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000000849 parathyroid Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000013933 post-embryonic development Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000003594 spinal ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 231100000456 subacute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 230000002889 sympathetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 210000001694 thigh bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N α-cyano-4-hydroxycinnamic acid Chemical compound OC(=O)C(C#N)=CC1=CC=C(O)C=C1 AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/38—Albumins
- A61K38/385—Serum albumin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, в частности репродуктивной биологии, и может найти применение в медицине, фармакологии и ветеринарии. Белково-пептидный комплекс получают из ткани яичников коров экстракцией в водно-солевом растворе при температуре +4-5°C, выделением из экстракта после обработки сульфатом аммония методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием хроматографа высокого давления. Комплекс содержит пептиды с молекулярными массами 1000-8000 Да и белок, представляющий собой бычий сывороточный альбумин gi|1351907 с молекулярной массой 66690 Да, при массовом соотношении пептиды:белок, составляющем (1):(1-5). Предлагаемый белково-пептидный комплекс обеспечивает повышение жизнеспособности фолликулов в яичниках млекопитающих при концентрации общего белка 10-9 мг/мл, не обладает аллергенными, мутагенными и сенсибилизирующими свойствами и не проявляет токсичности. 2 ил., 4 табл., 13 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности репродуктивной биологии, а именно к биологически активному белково-пептидному комплексу (БПК), выделенному из яичников коров, который содержит пептиды с молекулярными массами 1000-8000 Да и бычий альбумин сыворотки крови с молекулярной массой 66690 Да и способен в низких дозах соответствующих диапазону концентраций 10-8-10-15 мг/мл, повышать жизнеспособность фолликулов в яичниках млекопитающих, что способствует восстановлению процесса созревания фолликулов и нормального функционирования яичников.
Настоящее изобретение может найти применение в медицине, фармакологии и ветеринарии в качестве средства для профилактики и лечения нарушений репродуктивной функции у млекопитающих, в частности человека, связанных с неправильным развитием фолликулов и нарушением овуляторных циклов в яичниках.
В современном мире, в частности в России, очень остро стоит проблема бесплодия среди населения и сельскохозяйственных животных. На понижение уровня репродуктивного потенциала мужских и женских половых органов могут оказывать влияние множество факторов, начиная от частых стрессовых ситуаций и заканчивая плохой экологической обстановкой. Согласно статистическим данным, нарушения репродуктивной функции чаще всего наблюдаются у женщин (В. Baranski, Effects of the workplace on fertility and related reproductive outcomes. Environ Health Perspect. 1993, 101 (Suppl 2), 81-90).
Причинами бесплодия у женщин могут быть как патологии репродуктивной системы женщины, так и заболевания организма в целом. Наиболее распространенной причиной женского бесплодия, наблюдаемой в 35-40% случаев, является нарушение процесса овуляции (выхода яйцеклетки из созревшего фолликула в яичнике), что связано с дисфункцией желез внутренней секреции. Еще одну большую группу пациентов составляют женщины с расстройствами менструального цикла (недостаточность лютеиновой фазы или ановуляторные циклы) в результате нарушений в ходе процесса фолликулогенеза. (W. Foster, М. Neal, Е. Younglai, Endocrine disrupters and ovarian function. International Congress Series 1266. 2004, 126-132).
Фолликулогенезом называется созревание фолликулов яичника, его структурной единицы, представляющей собой плотно упакованную оболочку из соматических клеток, которая содержит незрелую яйцеклетку (ооцит). Основная функция фолликула заключается в защите яйцеклетки от внешних факторов на всех стадиях процесса ее формирования. Процесс фолликулогенеза включает в себя непрерывную трансформацию ряда мелких первичных фолликулов в крупные фолликулы, готовые к овуляции, которые частично возникают во время менструального цикла. Считается, что кора женского яичника во время его эмбрионального развития содержит свое максимальное количество фолликулов: от 4 до 5 миллионов в среднем случае, но отдельные пиковые популяции варьируются от 6 до 7 миллионов (W.H.B. Wallace, T.W. Kelsey. Human ovarian reserve from conception to the menopause. PLoS ONE, 2010, 5, 1: 1-9). Эти примордиальные фолликулы содержат незрелые ооциты. С момента начала полового созревания в женском организме начинается процесс трансформации примордиальных фолликулов в первичные, что сопровождается изменением формы окружающих фолликул гранулезных клеток. (J. Fortune, R. Cushman, С.Wahl, S. Kito. The primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol. 2000, 163, (1-2): 53-60). Первичные фолликулы имеют рецепторы для связывания фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), но они не зависят от гонадотропина до следующей (антральной) стадии, однако, присутствие ФСГ ускоряет рост фолликулов in vitro (R. Vandenhurk, M. Bevers, J. Beckers. In-vivo and in-vitro development of preantral follicles. Theriogenology. 1997, 47: 73-82). Рост и развитие первичных фолликулов также зависит от экспрессии факторов роста и дифференцировки, таких как сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и Фактор-9 роста и дифференцировки (GDF-9) (V.R. М.О. Gastal, J.R. Figueiredo, E.L. Gastal. In vitro culture of bovine preantral follicles: a review. Reprod Biol Endocrinol. 2014, 12:78). Формирование заполненной жидкостью полости, называемой «антрумом», рядом с ооцитом обозначает переход на стадию вторичного (антрального) фолликула. Вторичный фолликул гистологически и структурно характеризуется полностью выращенным ооцитом, окруженным блестящей оболочкой, приблизительно девятью слоями гранулезных клеток, базальной пластинкой, внутренней и наружной оболочками, капиллярной сеткой и наличием полости. В третичном фолликуле полностью формируется основная структура зрелого фолликула, и новые клетки не обнаруживаются. Хорошо выделяется яйценосный бугорок со зрелой яйцеклеткой. Гранулезные клетки продолжают делиться, что сопровождается увеличением объема полости. Третичные фолликулы могут достигать огромных размеров. Основным фактором запуска и развития процесса фолликулогенеза является эндокринная система (К.Ю. Боярский. Молекулярные основы фолликулогенеза. Пробл. Репродукции, 2006, 4: 26-37).
Стимуляция роста и развития вторичных фолликулов является важным фактором в процессе фолликулогенеза для созревания третичного фолликула и последующего выхода созревшей яйцеклетки из яичника (овуляции). Именно вторичные фолликулы готовы к процессу овуляции через один менструальный цикл.
Успешное зачатие и развитие эмбриона является результатом многих реакций и межклеточных взаимодействий, в которых яичник и фолликулярный резерв яичника играют основную роль. Известно, что с возрастом наблюдается рост числа поврежденных фолликулов и сокращение резерва пула фолликулов у млекопитающих (G. Cruz, D. Fernandois, А.Н. Paredes. Ovarian function and reproductive senescence in the rat: role of ovarian sympathetic innervation. Reproduction, 2017, 153, 59-68). Показано, что к 30 годам у женщин сохраняется только 10% фолликулов, не вступивших в стадию роста, от числа фолликулов, сформировавшихся при рождении, и это число с каждым годом неуклонно снижается (W.H.B. Wallace, T.W. Kelsey. Human ovarian reserve from conception to the menopause. PLoS ONE, 2010, 5, 1:1-9).
Тем не менее, в последнее время появились данные о возобновлении появления фолликулов яичников из зародышевых стволовых клеток костного мозга и периферической крови) в постнатальном яичнике мыши (J. Johnson et al. Oocyte generation in adult mammalian ovaries by putative germ cells in bone marrow and peripheral blood. Cell, 2005, 122 (2): 303-315; J. Johnson et al. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature, 2004, 428 (6979): 145-150). Исследования, пытающиеся воспроизвести эти результаты, продолжаются в настоящее время.
Для решения проблемы улучшения репродуктивной функции самок млекопитающих, в частности человека, перспективными могут быть вещества эндогенного происхождения, которые стимулируют жизнеспособность клеток и тканей половых органов млекопитающих, и не вызывают неблагоприятных реакций в отдельных тканях и организме в целом.
Известен ряд средств, в том числе белковой и пептидной природы, улучшающих репродуктивную функцию млекопитающих, в частности человека.
Известно средство для профилактики и лечения женского бесплодия, представляющее собой гормон гонадотропина, который обладает фолликулостимулирующим действием (Патент RU 2059412, A61K 35/22, опубл. 10.05.1996). Для лечения используют подкожные инъекции альфа- (111 аминокислот) и бета-субъединиц (112 аминокислот) гонадотропина, выделенных из постменопаузной мочи пациенток. Недостатками указанного средства является длительность лечения, достигающая нескольких недель или даже месяцев, и большая вероятность возникновения местной аллергии у пациента из-за наличия примесей в используемом препарате.
Известна фармацевтическая композиция, обеспечивающая фолликулогенез и созревание фолликулов без гиперстимуляции яичников, которая содержит фолликулостимулирующий гормон (FSH) и хорионные гонадотропины (hCG) (патент RU №2332228, МПК A61K 38/24, 2008). Данная композиция обладает стимулирующим фолликулогенез действием за счет различных соотношений FSH и hCG. Так как возможно поэтапное регулирование количества FSH и hCG в зависимости от стадии фолликулогенеза, может быть обеспечено прохождение овуляции без гиперстимуляции яичников. Недостатком данного фармакологического препарата является сложность и длительность процедуры индивидуального подбора соотношения FSH и hCG для каждого пациента, а также достаточно высокая его стоимость.
Известно средство, выделенное из яичников животных, восстанавливающее репродуктивную функцию (патент РФ №2056853, МПК A61K 35/54, опубл. 1996), которое содержит полипептиды с молекулярной массой 1000-10000 Да и большое количество (до 70%) веществ не белковой природы, извлекаемых вместе с пептидами. Вещества небелковой природы не проявляют искомой биологической активности, что определяет низкую активность выделенного средства. Кроме того, метод оценки биологического действия, использованный в данном техническом решении, не позволяет выявить механизм биологического действия средства и степень его влияния на репродуктивную функцию: в патенте продемонстрировано лишь изменение продолжительности репродуктивного цикла при воздействии данного средства (патент РФ №2056853, МПК A61K 35/54, опубл. 1996).
Известно средство, нормализующее репродуктивную функцию у женщин (патент РФ №2303454, МПК A61К 35/54, А61Р 15/08, опубл. 2007), представляющее собой препарат для парентерального введения в виде биологически активного пептидного комплекса, выделенного из яичников телят или свиней. Показано наличие в данном препарате низкомолекулярных пептидных фракций с молекулярной массой от 70 до 712 Да, и отсутствие в нем высокомолекулярных фракций. К недостаткам данного изобретения можно отнести отсутствие идентификации пептидов, входящих в состав указанного комплекса, а также биологическое тестирование, проведенное на органотипической культуре яичников крыс in vitro, в котором отсутствуют данные по определению фенотипа пролиферирующих и мигрирующих клеток из эксплантата, что не позволяет проанализировать механизм биологического действия данного пептидного комплекса. В формуле изобретения указан диапазон активных концентраций описанного пептидного комплекса, составляющий 2,5-2,9 мг/мл. Кроме того, в патенте не имеется данных, указывающих на тканеспецифический характер биологической активности данного комплекса.
Известно фармакологическое средство «Эндоферин», которое является близким аналогом заявляемого белково-пептидного комплекса (https://www.vidal.by/poisk_preparatov/endoferin.html), представляющее собой комплекс белков, выделенный из яичников крупного рогатого скота (КРС), содержащий в качестве стабилизатора бычий сывороточный альбумин с молекулярной массой около 66 кДа и биологически активный белок суперсемейства TGF-β с иммунологической специфичностью ингибина βА с молекулярной массой около 56 кДа. Данный препарат рекомендован для лечения эндомитриоза и аденомиоза, как основных причин бесплодия у женщин. К недостаткам данного препарата можно отнести наличие побочных эффектов: увеличение показателей постимплантационной гибели плодов и ускорение оссификации костного скелета. В связи с этим беременность является противопоказанием к применению данного препарата. Кроме того, отсутствуют данные онкогенного потенциала, а его иммуногенный потенциал полностью не изучен, в связи с чем не исключается возможность аллергических реакций при его применении. Также не рекомендуется совместное применение эндоферина с антигормональными средствами и иммуностимуляторами. Информации о механизме биологического действия препарата в описании не имеется.
Таким образом, в литературе отсутствуют сведения о веществах, включая вещества белково-пептидной природы, которые оказывают влияние на жизнеспособность фолликулов в яичниках млекопитающих.
Задачей изобретения является создание эффективного средства, повышающего жизнеспособность фоликуллов в яичниках млекопитающих, получаемого из веществ природного происхождения.
Задача решается белково-пептидным комплексом, выделенным из яичников коров, включающим пептиды с молекулярными массами 1000-8000 Да и белок, представляющий собой бычий сывороточный альбумин gi|1351907 с молекулярной массой 66690 Да, при массовом соотношении пептиды : белок, составляющем (1):(1-5), обеспечивающим повышение жизнеспособности фолликулов в яичниках млекопитающих, который является эффективным при разведении в фармацевтически приемлемом носителе и/или разбавителе до концентрации общего белка от 10-8 до 10-15 мг/мл, предпочтительно 10-9 мг/мл. Заявляемый БПК характеризуется отсутствием токсичности, совместимостью с другими препаратами и отсутствием негативных побочных эффектов.
Технический результат - создание нетоксичного средства, повышающего жизнеспособность фолликулов в яичниках млекопитающих, получаемого из доступного природного сырья, которое является эффективным при введении использовании в низких дозах.
Существенным преимуществом заявляемого изобретения является то, что в качестве вещества, повышающего жизнеспособность фолликулов в яичниках млекопитающих, используется высокоочищенный БПК, выделенный из яичников коров, и проявляющий биологическое действие в сверхнизких дозах при разведении в водном фармацевтически приемлемом носителе и/или разбавителе до концентрации общего белка от 10-8 до 10-15 мг/мл, предпочтительно 10-9 мг/мл. Применение БПК приводит к повышению жизнеспособности фолликулов в яичниках млекопитающих и восстановлению нормального функционирования тканей яичника.
Заявляемый БПК содержит полученные из ткани яичников коров пептиды с молекулярными массами 1000-8000 Да и бычий сывороточный альбумин gi|1351907 с молекулярной массой 66690 Да, характеризующийся аминокислотной последовательностью N-концевого мотива: DTHKSEIAHRFKDLGE. Соотношение пептидов и белка в составе выделенного БПК составляет от 1:1 до 1:5.
Показано, что у заявляемого БПК отсутствуют аллергенные, сенсибилизирующие и иммунотоксические свойства, БПК не обладает мутагенным действием и потенциальной канцерогенной активностью. Исследования показали, что БПК не обладает эмбриотоксическим и тератогенным действием, не оказывает влияния на общее физическое развитие потомства, его двигательную активность и эмоциональное состояние, а также на скорость возникновения сенсорно-двигательных рефлексов.
Изобретение иллюстрируется следующими фигурами и примерами:
Фиг. 1. Диаграмма значений параметра Δ, отражающего количество живых (А) и нежизнеспособных (Б) фолликулов в контрольной и опытной группах и в нативной ткани яичника. Параметр рассчитывается по формуле Δх=Nx/100, где Nx - число фолликулов каждой группы, подсчитанное на ста различных гистологических срезах.
Фиг. 2. Диаграмма значений параметров ΔI, ΔII и ΔIII, характеризующих среднее количество живых первичных (А), вторичных (Б) и третичных (В) фолликулов в контрольной и опытной группах и в нативной ткани, соответственно, где ΔI=NI/100, NI, NII, NIII - число первичных, вторичных и третичных фолликулов, подсчитанное на ста различных гистологических срезах, соответственно.
Пример 1. Способ получения белково-пептидного комплекса из яичников крупного рогатого скота. В работе используют яичники половозрелых коров, полученные при забое крупного рогатого скота на мясокомбинатах Подмосковья. Ткани яичников нарезают на небольшие фрагменты, размером 1,5-2,0 см2, для экстрагирования помещают в раствор следующего состава: 0,15 М NaCl, 2,5×10-3 М KСl, 2×10-3 М CaCl2, 1×10-3 М HEPES. Экстракцию проводят в течение 3-х часов при температуре +4°C. Полученный экстракт фильтруют, центрифугируют при 3000 g в течение 30 мин. К охлажденному раствору тканевого экстракта постепенно добавляют сухой сернокислый аммоний при постоянном перемешивании до образования насыщенного раствора соли (на каждые 100 мл раствора экстракта добавляют 78 г соли). Суспензию белков оставляют на 72 час при +4°C, после чего центрифугируют при 12000 g в течение 30 минут. Собирают фракции супернатанта и осадка. Фракцию супернатанта длительно (8-10 суток) диализуют против дистиллированной воды, а фракцию осадка - против буферного раствора (0,01 М Tris, рН 7,4) до полного удаления ионов сульфата аммония. Присутствие в растворе ионов аммония определяют качественной реакцией с реактивом Несслера. Полученные после диализа фракции супернатанта и осадка далее концентрируют, используя роторный вакуумный испаритель, при температуре не выше 40°C. Концентрацию белка во всех фракциях и на всех стадиях очистки и исследования определяют спектрофотометрически (Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. Справочник биохимика М. Мир, 1991). Затем фракцию осадка яичников КРС (100 мл) разделяют методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Kromasil С4 (4,6×250 мм) с использованием хроматографа высокого давления Agilent 1200 (США). Элюцию осуществляют в градиенте концентрации ацетонитрила (0-60%) в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте (рН 2,2) со скоростью 1 мл/мин в течение 60 мин. Детекцию проводят при 280 и 214 нм. Собирают фракцию с временем удерживания 57,3 мин., из нее в вакуумном испарителе удаляют ацетонитрил и трифторуксусную кислоту и растворяют в физиологическом водно-солевом растворе.
Пример 2. Определение состава и структуры выделенного и очищенного белково-пептидного комплекса. ВЭЖХ-фракцию с временем удерживания 57,3 мин, полученную из экстракта яичников КРС, исследуют методом MALDI TOF масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Braker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты. Получают масс-спектрометрический сигнал, соответствующий молекулярной массе 66690 Да. Также данную фракцию анализируют методом электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (U.K. Laemmli. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature, 1970, 227, 680-685). Из геля вырезают полосу, соответствующую молекулярной массе примерно в 66000 Да. Проведенный триптический гидролиз белка в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза показывает, что выделенный белок с молекулярной массой около 66690 Да представляет собой белок семейства альбуминов млекопитающих под номером gi|1351907 в базе данных SwissProt. Методом Эдмана устанавливают частичную N-концевую аминокислотную последовательность этого белка (DTHKSEIAHRFKDLGE), которая имеет 100%-ную гомологию с N-концевой последовательностью зрелой молекулы бычьего сывороточного альбумина (БСА).
ВЭЖХ-фракцию со временем удерживания 57,3 минуты собирают и подвергают денатурации в буфере, содержащем 6 М GuHCl, 300 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА, для идентификации пептидных компонентов. Инкубация в данном буфере проводится в течение 24 часов при температуре 45°C. После завершения инкубации полученный раствор снова подвергают разделению с помощью метода обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Kromasil С4 в условиях, аналогичным в примере 1. Полученные гидрофильные ВЭЖХ-фракции анализируют MALDI TOF масс-спектрометрией в аналогичных условиях, как и при анализе ВЭЖХ-фракции со временем удерживания 57,3 минуты. При анализе гидрофильных фракций фиксируют масс-спектрометрические сигналы, соответствующие молекулярным массам от 1000 до 8000 Да..
Пример 3. Получение растворов различной концентрации высокоочищенного БПК, выделенного из яичников коров. В качестве раствора БПК используют ВЭЖХ-фракцию со временем удерживания 57,3 минуты, выделенную из ткани яичников коров (описана в Примере 2) с концентрацией по белку 100±10 мкг/мл. Из данного раствора отбирают 100 мкл и вносят в 900 мкл дистиллированной воды, встряхивают полученный раствор 15 раз. Из полученного раствора опять отбирают 100 мкл и вносят в 900 мкл дистиллированной воды в другой флакон, интенсивно встряхивая образовавшийся раствор 15 раз. Данную процедуру повторяют еще 4 раза. В конечный раствор добавляют хлорид кальция до его конечной концентрации 1 мМ и в этом случае получают раствор БПК с концентрацией общего белка, соответствующей 10-6 мг/мл.
Отбирают отдельную аликвоту полученного раствора БПК с концентрацией общего белка 10-6 мг/мл и повторяют аналогичную процедуру разбавления и встряхивания еще 6 раз до получения раствора БПК с концентрацией общего белка, соответствующей 10-12 мг/мл. В конечный раствор добавляют хлорид кальция до его конечной концентрации 1 мМ.
Пример 4. Влияние БПК, выделенного из яичников коров, на выживаемость фолликулов при роллерном органотипическом культивировании яичников крысы. Для проведения эксперимента по изучению специфической активности БПК разрабатывают модель роллерного органотипического культивирования яичников крысы. Изучают растворы БПК, соответствующие различным концентрациям белка в растворе: от 10-8 до 10-15 мг белка/мл (процедура приготовления описана в Примере 3).
Декапитируют 15 крыс линии Wistar под эфирным наркозом, яичники вырезают, очищают от прилегающих тканей. Пять яичников фиксируют в растворе Буэна сразу же после вырезания для изучения гистологии нативной ткани. Для культивирования используют питательную среду 199, которая содержит 10% эмбриональной телячьей сыворотки («HyClone», США) и 1% антибиотика/антимикотика («Sigma», Германия), которую стерилизуют, пропуская через мембранные фильтры GV с диаметром пор 0,22 мкм («Millipore», США). В каждый флакон опытной группы (всего 5 флаконов) добавляют культуральную среду и раствор БПК в различных концентрациях (приготовленные, как описано в Примере 3) и помещают в каждый флакон по одному яичнику. В первый флакон опытной группы к 6 мл культуральной среды добавляют 60 мкл раствора БПК в концентрации, соответствующей 10-6 мг/мл белка до конечной концентрации БПК 10-8 мг/мл в растворе. Во второй флакон опытной группы к 6 мл культуральной среды добавляют 6 мкл раствора БПК в концентрации, соответствующей 10-6 мг/мл белка до конечной концентрации БПК 10-9 мг/мл в растворе. В третий флакон опытной группы к 6 мл культуральной среды добавляют 0,6 мкл раствора БПК в концентрации, соответствующей 10-6 мг/мл белка до конечной концентрации БПК 10-10 мг/мл в растворе. В четвертый флакон опытной группы к 5,4 мл культуральной среды добавляют 0,6 мл раствора БПК в концентрации, соответствующей 10-12 мг/мл белка до конечной концентрации БПК 10-13 мг/мл в растворе. В пятый флакон опытной группы к 6 мл культуральной среды добавляют 6 мкл раствора БПК в концентрации, соответствующей 10-12 мг/мл белка до конечной концентрации БПК 10-15 мг/мл в растворе. Во флаконы контрольной группы (5 флаконов) добавляют по 1 яичнику к 6 мл культуральной среды. Культивирование проводят при температуре 37°C в течение 5 суток. Используют роллер RM5 («Assistant», Германия) со скоростью вращения 35 об/мин. Затем яичники фиксируют в растворе Буэна, готовят стандартные гистологические срезы. Окраска парафиновых срезов (толщина 7 мкм) гистологических образцов гематоксилин-эозином. Изучение полученных гистологических препаратов, подсчет числа фолликулов на срезах и фотофиксацию изображений проводят с помощью микроскопа Olympus (VANOX, АНВТ3) и цифровой камеры Olympus (U-PMTVC, Япония).
Для оценки биологического действия раствора БПК применяют метод прямого подсчета живых и нежизнеспособных фолликулов и общего числа фолликулов на парафиновых срезах ткани яичников животных опытной и контрольной группах, а также нативной ткани яичников. Живые фолликулы визуально можно определить по выраженному ядру ооцита, находящегося внутри фолликула и структурированному слою гранулезных клеток. Нежизнеспособные фолликулы характеризуются отсутствием ядра ооцита либо наличием его фрагментов, а также нечеткой формой из-за отделения гранулезных клеток от блестящей оболочки ооцита.
Первичные фолликулы визуально характеризуются небольшим по размеру ядром ооцита, 1 слоем гранулезных клеток и отсутствием полости. Вторичные фолликулы выделяются более крупным размером ядра ооцита, наличием полости и несколькими слоями гранулезных клеток. Третичные фолликулы (граафовы пузырьки) хорошо идентифицируются визуально благодаря крупному размеру ядра ооцита, большому размеру полости и наличию в полости фолликула яйценосного бугорка, в котором находится ооцит.
Результаты подсчета фолликулов приведены в таблице 1. Для удобства сравнения данные для фолликулов, определенных в яичниках крыс всех экспериментальных серий, приводятся в виде параметра Δ, который рассчитывается по формуле:
Δх=Nx/100, где Nx - число фолликулов, подсчитанное на ста гистологических срезах: NI - число первичных фолликулов; NII - число вторичных фолликулов; NIII - число третичных фолликулов (граафовы пузырьки); ΔН/Ж - число нежизнеспособных фолликулов.
Графические данные подсчета фолликулов приведены на фигурах 1 и 2. Результаты эксперимента обрабатывают методами вариационной статистики по t-критерию Стьюдента. Полученные результаты (число живых и нежизнеспособных фолликулов в нативной ткани, а также в контрольной и опытной группах) являются статистически достоверными (р<0,05).
Важно подчеркнуть, что в нашем случае роллерное органотипическое культивирование яичников крысы проводится in vitro, что исключает возможность активации и воздействия эндокринной системы, в частности, гипоталамо-гипофизарных факторов, на процесс поддержания жизнеспособности и развития фолликулов на разных стадиях их созревания. Предполагается, что существенное улучшение выживаемости фолликулов в яичниках опытной группы по сравнению с контрольной группой (количественно представлено на Фиг. 1, А), может происходить за счет активации стволовых зародышевых клеток, которая происходит при добавлении в культуральную среду БПК, выделенного из ткани яичников коров. Необходимо также отметить, что при роллерном типе культивирования тканей происходит дополнительное активирование клеточных источников регенерации тканей взрослых особей.
В результате проведенного авторами роллерного органотипического культивирования яичников крысы наиболее ярко выражено воздействие БПК, выделенного из ткани яичников коров, на количество жизнеспособных вторичных фолликулов (Фиг. 2, Б). Ранее уже было показано, что в культуре ткани яичников in vitro примордиальные фолликулы способны развиваться до стадии первичных и вторичных фолликулов, но этот процесс протекал недостаточно эффективно (V.R. М.О. Gastal, J.R. Figueiredo, E.L. Gastal. In vitro culture of bovine preantral follicles: a review. Reprod Biol Endocrinol. 2014, 12:78). Наблюдают большое число созревших и жизнеспособных вторичных фолликулов в опытной группе при добавлении заявляемого БПК. Именно вторичные фолликулы становятся вовлеченными в процесс овуляции и дают созревшие яйцеклетки через один менструальный цикл, в то время как слишком большое число первичных фолликулов потенциально приводит к их ускоренной повышенной атрезии на следующей стадии созревания, а третичных фолликулов - к гиперовуляции (R. Cortvrindt, J. Smitz. In vitro follicle growth: achievements in mammalian species. Reprod Domest Anim, 2001, 36: 3-9). Данный факт указывает на то, что выделенный БПК не только повышает жизнеспособность фолликулов, но положительно влияет и на процесс их созревания, что чрезвычайно важно для нормального развития у млекопитающих процессов оогенеза, фолликулогенеза, овуляции и, как следствие, возможности правильного зачатия, формирования и развития эмбриона.
Пример 5. Получение растворов различных концентраций белково-пептидного комплекса, выделенного из яичников коров, для исследования его безопасности. В качестве раствора белково-пептидного комплекса используют ВЭЖХ-фракцию со временем удерживания 57,3 минуты, выделенную из ткани яичников коров (описана в Примере 2) с концентрацией по белку 100±10 мкг/мл. Во флакон, содержащий 0,1 мл водного раствора БПК, добавляют 0,9 мл 0,9%-ного раствора NaCl и интенсивно встряхивают 25 раз. Отбирают 0,1 мл образовавшегося раствора в следующий флакон и добавляют 0,9 мл 0,9%-ного раствора NaCl, встряхивают 25 раз. Данную процедуру повторяют 15 раз, получая таким образом растворы белково-пептидного комплекса с 10-кратным последовательным разбавлением от 1 до 15 степени. В экспериментах по изучению безопасности раствора БПК, выделенного из яичников коров, были исследованы его разведения в концентрациях, соответствующих значениям 10-3; 10-5 - 10-15 мг/мл. Растворы стерилизуют путем пропускания через стерильные мембранные фильтры GV с диаметром пор 0,22 мкм («Millipore», США).
Исследования безопасности БПК, выделенного из яичников КРС, проводят на кроликах породы «Шиншилла», морских свинках, крысах Wistar и белых беспородных мышах. Животные получены из питомника «Крюково», согласно паспорту молодые, половозрелые. Их содержат в стандартных металлических клетках по 5 особей (кролики содержатся индивидуально). Для кормления используют гранулированный комбинированный корм и свежие овощи. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное, температура воздуха 18-22°C. До начала испытаний все животные проходят двухнедельный карантин. В целях стандартизации, перед началом опыта, животных не кормят в течение суток. Результаты эксперимента обрабатывают методами вариационной статистики по t-критерию Стьюдента.
Пример 6. Оценка способности заявляемого БПК вызывать активную кожную анафилаксию у морских свинок in vivo. Исследование проводят на морских свинках в количестве по 10 голов в каждой исследуемой группе, всего 2 группы. Сенсибилизируют животных по схеме: первая инъекция подкожно, две последующие внутримышечно через день в область бедра. На 14 день на выстриженных участках спины морским свинкам вводят внутрикожно раствор БПК в концентрации 10-9 мг/мл (приготовление описано в примере 5). Для контроля реактивности кожи вводят физиологический раствор тому же животному на другой выстриженный участок кожи. Контрольным животным вводят разрешающую инъекцию препарата (равную сенсибилизирующей дозе). Затем животным вводят внутривенно по 0,5 мл 1% раствора синего Эванса. Через 30 минут животных выводят из эксперимента эфирным наркозом и определяют размер синего пятна на внутренней стороне кожи в месте введения. Положительной считают реакцию при размере пятна выше 6 мм, не более 3 мм в контроле. При подсчете результатов эксперимента у обеих групп животных положительных реакций не наблюдалось. При статистической обработке полученных результатов не обнаружена достоверная разница между результатами опытных и контрольной групп (р>0,05).
Пример 7. Влияние заявляемого БПК на реакцию гиперчувствительности замедленного типа у мышей. Опыты проводят на белых беспородных мышах, самцы, весом 18-20 г, по 10 животных в группе. Общее количество животных в опыте - 30. Животных опытной группы однократно сенсибилизируют внутрикожно в основании хвоста эмульсией БПК (1:1) в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ). Доза введения составляет 60 мкл. Контрольных животных сенсибилизируют эмульсией НАФ с раствором Хенкса (1:1). Для выявления сенсибилизации через 5 суток мышам в подушечку задней лапы вводят 40 мкл раствора БПК в концентрации 10-9 мг/мл (приготовление описано в примере 5), приготовленного на растворе Хенкса. Через 24 часа после тестирования измеряют величину отека с помощью инженерного микрометра МК-0-25. Результаты измерения толщины лапы у испытуемых животных приведены в таблице 2.
При статистической обработке полученных результатов не обнаружена достоверная разница в толщине лапок опытных групп и контрольной (р>0,05). Введение раствора БПК не вызывает реакции гиперчувствительности замедленного типа.
Пример 8. Влияние заявляемого БПК на фагоцитарную активность макрофагов крысы in vitro. Эксперименты проводят на крысах Wistar, самки, весом 180-200 г, по 10 животных в каждой группе. Общее число животных в опыте 20. Метод основан на определении оптической плотности лизирующего раствора после разрушения фагоцитов, поглотивших частицы нейтрального красного. Крыс, подвергнутых воздействию исследуемого препарата, декапитируют. Асептически внутрибрюшинно вводят 5 мл среды 199, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки. После массажа брюшной полости среду отбирают шприцем. Порции клеточной суспензии, полученные от всей группы животных, объединяют в общий пул. Концентрацию живых клеток доводят до 1,5×103 клеток/мл. Суспензию клеток стерильно разливают по 2 мл в пластиковые чашки Петри диаметром 40 мм и инкубируют 2 часа при 37°C. Надосадочную фракцию, содержащую не адгезировавшие к пластику клетки, сливают, а фиксированный на пластике монослой дважды промывают средой 199. В слегка подсушенные чашки наливают раствор, содержащий нейтральный красный, и выдерживают при 37°C в течение 1 часа, затем раствор сливают, клетки промывают средой 199. В каждую чашку вносят по 3 мл лизирующего раствора, которым обрабатывают тщательно клетки, совершая вращательное движение чашки. Раствор сливают в пробирки и на спектрофотометре при длине волны 540 нм измеряют оптическую плотность. Результаты исследования светопропускания лизирующего раствора представлены в таблице 3.
При внутрибрюшинном введении БПК в концентрации 10-9 мг/мл (приготовление описано в примере 5) не было отмечено изменения фагоцитарной активности макрофагов по сравнению с животными контрольной группы. Статистически достоверных различий между показателями в опытной и контрольной группах нет (p>0,05).
Пример 9. Влияние заявляемого БПК на реакцию дегрануляции тучных клеток у крыс in vitro. Эксперименты проводят на крысах Wistar, самки, весом 180-200 г, общее количество животных в опыте - 30. Вводят раствор БПК внутрибрюшинно, контролем служит интактная группа.
Для получения взвеси тучных клеток животных декапитируют, в брюшную полость вводят буфер; после массажа передней брюшной стенки взвесь тучных клеток собирают центрифугированием в пробирки (3000 g, 30 мин). Препараты готовят на предметных стеклах, окрашенных 0,3%-ным спиртовым раствором нейтрального красного. К 0,03 мл взвеси тучных клеток добавляют 0,03 мл сыворотки опытного животного и 0,03 мл исследуемого раствора БПК (концентрация составляет 10-9 мг/мл, приготовление описано в примере 5) в разведении 1:100. Препараты накрывают покровным стеклом, края которого герметизируют парафином. Затем инкубируют 15 минут в термостате при 37°C. Препараты исследуют микроскопически при увеличении ×40, подсчитывая тучные клетки, подвергшиеся дегрануляции и нормальные, сумму принимают за 100%. Реакцию считают положительной, если степень дегрануляции превышает 20%.
В контроле дегрануляция не превышала 5%. Введение раствора БПК не вызывает дегрануляции тучных клеток: значения параметра дегрануляции не отличаются от контроля и не превышают порогового значения 5%. Результаты контрольной и опытной групп статистически не имеют достоверных отличий (р>0,05).
Пример 10. Исследование влияния БПК, выделенного из яичников коров, на состояние тканей внутренних органов организма млекопитающих. Исследование по изучению острой токсичности раствора БПК, выделенного из яичников коров, проводят на 70 белых беспородных мышах, самцы, весом 18-20 г. Животные были разделены на 6 групп, по 15 в каждой. Исследуемый препарат вводят животным опытной группы однократно внутримышечно в объеме 0,05 мл в виде стерильных растворов следующих концентраций: 10-3 мг/мл, 10-5 мг/мл, 10-7 мг/мл, 10-9 мг/мл, 10-11 мг/мл, 10-13 мг/мл, 10-15 мг/мл белка, приготовленных на 0,9%-ном растворе NaCl. Животным контрольной группы (10 мышей) в том же объеме аналогичным образом вводят 0,9% раствор NaCl.
При изучении острой токсичности было показано, что однократное внутримышечное введение раствора БПК крысам Wistar, обоего пола, весом 200-220 г., в концентрации 10-5 мг/мл, которая превышает рекомендованную для клинического применения (10-9 мг/мл) в 10000 раз, не вызывает развития никаких реакций, указывающих на токсическое действие заявляемого БПК. Исследование подострой и хронической токсичности раствора БПК в концентрациях 10-9 и 10-5 мг/мл белка также не выявляет развития негативных побочных реакций со стороны отдельных тканей и организма в целом у экспериментальных животных в течение длительного введения раствора БРК.
Патоморфологическими методами изучают состояние головного (гипофиза, гипоталамуса), спинного мозга (спинных ганглиев), костного мозга. Изучают состояние таких желез, как надпочечники, паращитовидные, щитовидная и поджелудочная железы. Кроме того, исследуют сердце, коронарные сосуды, легкие, печень и желчный пузырь, почки, мочевой пузырь, семенники, яичники, желудок, двенадцатиперстную кишку, тонкий и толстый кишечники, а также тимус, селезенку, лимфатические узлы. В периферической крови определяют количество гемоглобина, производят подсчет форменных элементов крови (эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, ретикулоцитов), определяют лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ). Определяют содержание в сыворотке крови ионов калия и натрия, а также содержание общего белка. В результате было показано отсутствие каких-либо изменений в состоянии внутренних органов и составе периферической крови мышей, которые подвергались воздействию раствора БПК в различных концентрациях.
Эксперимент по исследованию хронической токсичности проводят на кроликах породы Шиншилла, обоего пола, весом 2300-2500 г, по 10 животных в каждой группе. В опытной группе животные употребляют вместо воды раствор БПК в концентрации 10-9 мг/мл; в контрольной группе животные употребляют для питья воду, на которой приготовляют раствор БПК. После 4-х месяцев проведения эксперимента кроликов обеих групп выводят из эксперимента эмболией. Результаты изучения общего состояния экспериментальных животных, морфологического состояния их внутренних органов, а также показателей, отражающих состояние крови, свидетельствуют об отсутствии каких-либо патологических изменений в отдельных тканях и организме в целом.
Пример 11. Изучение мутагенного и канцерогенного действия заявляемого БПК на соматических клетках млекопитающих in vivo. Исследование потенциальной мутагенной активности заявляемого БПК проводят на млекопитающих в условиях in vivo с помощью методов, входящих в стандартную систему испытаний в соответствии с утвержденными Фармакологическим комитетом МЗ СССР («Методические рекомендации по проверке мутагенных свойств у новых лекарственных препаратов», 1981).
Эксперимент проводят на мышах линии C57B 1/6J, самцы, весом 20-22 г, в каждой группе по 6 животных. Мышам опытной группы №1 в течение пяти дней ежедневно внутрибрюшинно вводят по 0,1 мл раствора БПК (концентрация составляет 10-9 мг/мл, приготовление описано в примере 5); животным контрольной группы №2 внутрибрюшинно в течение 5 дней вводят по 0,1 мл физиологического раствора; группа №3 - интактные животные, которые не получают ни БПК, ни физиологического раствора.
Через 7 дней животных всех групп выводят из эксперимента эфирным наркозом, из бедренных костей извлекают мозг и приготовляют цитогенетические препараты по общепринятой методике, включающей предварительное введение колхицина, гипотоническую обработку 0,6%-ным KCl, фиксацию в смеси метанол: уксусная кислота (1:3). Результаты обрабатывают с помощью t-критерия Стьюдента. Мутагенный эффект изучают по микроядерному тесту и тесту частоты хромосомных аберраций в клетках костного мозга (таблица 4).
В результате проведенных исследований установлено, что при воздействии заявляемого БПК доля поврежденных клеток и количество аберраций на клетку в костном мозге мышей были такими же, как у интактных и контрольных животных, получавших физиологический раствор.
Пример 12. Изучение иммунотоксических и аллергизирующих свойств раствора заявляемого БПК. Исследование иммунотоксических и аллергизирующих свойств раствора БПК проводят на морских свинках. Раствор БПК наносят на кожу экспериментальным животным в дозе 0,1 мл в концентрации 10-9 мг/мл (приготовление описано в примере 5) в течение 5 дней. Действие препарата определяют, оценивая такие параметры, как:
- состояние кожных покровов в области нанесения препаратов,
- реакцию специфического лизиса лейкоцитов,
- реакцию специфической агломерации лейкоцитов при накожном применении,
- реакцию бласттрансформации клеток тимуса,
- реакцию бласттрансформации клеток селезенки.
Анализируя результаты проведенных экспериментов по изучению иммунотоксических и аллергенных свойств раствора заявляемого БПК, можно сделать следующее заключение, что исследуемый раствор БПК:
- Не вызывает каких-либо изменений кожных покровов морских свинок.
- При накожном применении не влияет на реакцию специфического лизиса лейкоцитов.
- Не влияет на реакцию специфической агломерации лейкоцитов при накожном применении (опытная серия 4,2±1,6%, контрольная серия 3,8±1,5%).
- Не оказывает влияния на бласттрансформацию клеток тимуса (индекс стимуляции - опытная серия 141,2±7,3; контрольная серия 138,5±6,4).
- Не влияет на бласттрансформацию клеток селезенки (индекс стимуляции - опытная серия 278,4±5,2; контрольная серия 267,3±6,8).
Пример 13. Исследование эмбриотоксичности и тератогенности заявляемого БПК.
Экспериментальная оценка токсического действия БПК на эмбриональное развитие зародышей, а также выявление нарушений эмбрионального развития, проявляющихся только в постнатальном периоде жизни, проводится на крысах Wistar, самки, весом 200-220 г, по 6 штук в каждой группе. Исследование БПК проводили в течение всего периода беременности - 20 дней. Животным вводили раствор БПК (0,1 мл в концентрации 10-9 мг/мл) внутримышечно ежедневно. Исследование эмбриотоксических и тератогенных свойств раствора БПК проводят в два этапа: 1-ый - исследуют влияние препарата на эмбриональное развитие в пренатальном периоде, во 2-ом - обследуют потомство в постнатальном периоде. Для оценки влияния раствора БПК на эмбриотоксичность и тератогенность определяют количество выкидышей у крыс, количество крысят в помете, количество выживших крысят, оценивают физическое и эмоциональное состояние потомства, двигательную функцию и скорость созревания сенсорно-двигательных рефлексов. Кроме того, проводят изучение изменения половых органов у крыс после введения раствора заявляемого БПК.
Было показано, что при воздействии раствора БПК у опытных животных не наблюдается выкидышей, потомство рождается в срок, количество крысят в пометах не отличается от количества крысят контрольной группы. Крысята опытной группы имеют тот же вес, что и потомство контрольной группы, выживаемость крысят, испытавших влияние раствора исследуемого БПК была полной. Их двигательная и эмоциональная активности не отличается от крысят контрольной группы. У экспериментальных животных, получавших раствор БПК, не было обнаружено изменений в половых органах. Таким образом, в ходе проведенных исследований не установлено наличие каких-либо патологических нарушений в ходе эмбрионального и постэмбрионального развития потомства экспериментальных животных после приема раствора заявляемого БПК.
Заявляемый белково-пептидный комплекс, выделенный из яичников коров, может быть использован как субстанция для разработки средств, повышающих жизнеспособность фолликулов в яичниках млекопитающих, которые могут использоваться для профилактики и лечения женского бесплодия, связанного с нарушениями овуляторных циклов. Заявляемый БПК стимулирует процессы фолликулогенеза, обеспечивает повышение жизнеспособности фолликулов, а также восстанавливает нормальное функционирование яичников. Заявляемый БПК является тканеспецифичным, но не видоспецифичным, так как не проявляет биологического действия при исследовании на таких экспериментальных моделях, как: CCl4-иедуцируемый цирроз печени у крыс, ранозаживление у мышей in vivo, органотипическое культивирование семенников крыс in vitro.
Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод об отсутствии аллергенных, сенсибилизирующих и иммунотоксических свойств БПК, выделенного из яичников коров. Заявляемый БПК является нетоксичным веществом и может быть рекомендован для проведения клинических испытаний. Экспериментальные данные, полученные в ходе проведенной оценки генетической активности свидетельствуют об отсутствии мутагенного действия в соматических и генеративных клетках млекопитающих и отсутствии потенциальной канцерогенной активности заявляемого БПК. Полученный БПК, исследуемый в виде раствора, не обладает эмбриотоксическим и тератогенным действием, не оказывает влияния на общее физическое развитие потомства, его двигательную активность и эмоциональное состояние, а также на скорость возникновения сенсорно-двигательных рефлексов. Данный БПК рекомендуется вводить в виде питьевого раствора низкой концентрации, что исключает развитие побочных негативных реакций со стороны как отдельных тканей и органов, так и со стороны организма в целом.
Claims (1)
- Белково-пептидный комплекс, выделенный из яичников коров, включающий пептиды с молекулярными массами 1000-8000 Да и белок, представляющий собой бычий сывороточный альбумин gi|1351907 с молекулярной массой 66690 Да, при массовом соотношении пептиды:белок, составляющем 1:(1-5), повышающий жизнеспособность фолликулов в яичниках млекопитающих и эффективный при разведении в фармацевтически приемлемом носителе и/или разбавителе до концентрации общего белка от 10-8 до 10-15 мг/мл, предпочтительно 10-9 мг/мл.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017132536A RU2660587C1 (ru) | 2017-09-19 | 2017-09-19 | Белково-пептидный комплекс, повышающий жизнеспособность фолликулов в яичниках млекопитающих |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017132536A RU2660587C1 (ru) | 2017-09-19 | 2017-09-19 | Белково-пептидный комплекс, повышающий жизнеспособность фолликулов в яичниках млекопитающих |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2660587C1 true RU2660587C1 (ru) | 2018-07-06 |
Family
ID=62815790
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017132536A RU2660587C1 (ru) | 2017-09-19 | 2017-09-19 | Белково-пептидный комплекс, повышающий жизнеспособность фолликулов в яичниках млекопитающих |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2660587C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2703257C1 (ru) * | 2018-12-04 | 2019-10-16 | Закрытое акционерное общество "СКАЙ ЛТД" | Способ лечения воспалительных процессов суставов и простатита |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2303454C1 (ru) * | 2006-06-22 | 2007-07-27 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Сиа Пептайдс" | Средство, нормализующее репродуктивную функцию у женщин, и способ его получения |
RU2428196C1 (ru) * | 2010-07-01 | 2011-09-10 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Способ получения биологически активного комплекса и биологически активный белково-полипептидный комплекс |
WO2015160284A1 (ru) * | 2014-04-18 | 2015-10-22 | Закрытое акционерное общество "СКАЙ ЛТД" | Фармацевтическая композиция для лечения эндометриоза и способ ее получения |
-
2017
- 2017-09-19 RU RU2017132536A patent/RU2660587C1/ru active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2303454C1 (ru) * | 2006-06-22 | 2007-07-27 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Сиа Пептайдс" | Средство, нормализующее репродуктивную функцию у женщин, и способ его получения |
RU2428196C1 (ru) * | 2010-07-01 | 2011-09-10 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Способ получения биологически активного комплекса и биологически активный белково-полипептидный комплекс |
WO2015160284A1 (ru) * | 2014-04-18 | 2015-10-22 | Закрытое акционерное общество "СКАЙ ЛТД" | Фармацевтическая композиция для лечения эндометриоза и способ ее получения |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2703257C1 (ru) * | 2018-12-04 | 2019-10-16 | Закрытое акционерное общество "СКАЙ ЛТД" | Способ лечения воспалительных процессов суставов и простатита |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Beaumont et al. | A quantitative and cytological study of oogonia and oocytes in the foetal and neonatal rat | |
Amann et al. | The epididymis and sperm maturation: a perspective | |
Golestaneh et al. | Wnt signaling promotes proliferation and stemness regulation of spermatogonial stem/progenitor cells | |
Grier et al. | Germinal epithelium, folliculogenesis, and postovulatory follicles in ovaries of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum, 1792)(Teleostei, Protacanthopterygii, Salmoniformes) | |
Mylonas et al. | Cyto‐histological examination of post‐vitellogenesis and final oocyte maturation in captive‐reared striped bass | |
Park et al. | A rare and often unrecognized cerebromeningitis and hemodynamic disorder: a major cause of sudden death in somatic cell cloned piglets | |
Fàbrega et al. | Impact of epididymal maturation, ejaculation and in vitro capacitation on tyrosine phosphorylation patterns exhibited of boar (Sus domesticus) spermatozoa | |
Sarsaifi et al. | Protein profile and functionality of spermatozoa from two semen collection methods in Bali bulls | |
Bukovsky et al. | Study origin of germ cells and formation of new primary follicles in adult human and rat ovaries | |
RU2660587C1 (ru) | Белково-пептидный комплекс, повышающий жизнеспособность фолликулов в яичниках млекопитающих | |
Galdos-Riveros et al. | Bovine yolk sac: from morphology to metabolomic and proteomic profiles | |
JP7199625B2 (ja) | 哺乳動物における精子運動能の活性化剤としての、Maurus palmatusの毒液から単離されたLa-1様ペプチドの使用 | |
RU2725491C2 (ru) | Субстанция для получения средства, повышающего жизнеспособность и подвижность сперматозоидов млекопитающих | |
Sasse et al. | Replacement of fetal calf serum in cell cultures by an egg yolk factor with cholecystokinin/gastrin-like immunoreactivity | |
Cañón-Beltrán et al. | Acquisition of fertilization competence in guinea pig spermatozoa under different capacitation protocols | |
Bouma et al. | An in vitro system for the long‐term tissue culture of juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) testis | |
Atroshchenko et al. | Protein spectrum and blood biochemical parameters in stallions with different sperm motility | |
Wei et al. | Male reproductive systems of Macaca mulatta: Gonadal development, spermatogenesis and applications in spermatogonia stem cell transplantation | |
Rishnan et al. | Identification of high molecular weight proteins in buffalo (bubalus bubalis) ovarian follicular fluid by SDS PAGE | |
Kronick et al. | Experimental hyperphenylalaninemia in the pregnant guinea pig: Possible phenylalanine teratogenesis and p‐chlorophenylalanine embryotoxicity | |
Padodara et al. | Gross as well as microscopic anatomy and physiological functions of fetal placenta in Jaffrabadi buffaloes | |
Massa et al. | Lactoferrin affects fertilization, implantation, and pregnancy in rats | |
Nurkarimah et al. | THE EFFECTIVITY OF CYSTEAMINE SUPPLEMENTATION ON IMPROVING THE IN VITRO FERTILIZATION RATE OF SHEEP OOCYTES | |
Ashour et al. | Influence of the different ages during breeding and non-breeding seasons on ovarian activity of the dromedary she-camels | |
Elbert | MATERNAL IMMUNITY: PREIMPLANTATION PREPARATION AND SPATIAL DISTRIBUTION OF CCL19 |