CN116162564A - 一株乌头白绢病生防无色杆菌jy-2-3r及其应用 - Google Patents

一株乌头白绢病生防无色杆菌jy-2-3r及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明中公开了一株乌头白绢病生防无色杆菌JY‑2‑3R，所述无色杆菌JY‑2‑3R于2022年7月18日保藏于广东省微生物保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.62631。本发明同时公开了该无色杆菌JY‑2‑3R在乌头白绢病防治上的应用。本发明中的无色杆菌JY‑2‑3R具产葡聚糖降解酶能力，能显著抑制白绢病病原菌菌丝生长、菌核形成和萌发，有效降低乌头田间白绢病的发病率，显著提高乌头植株生物量及附子产量，可作为生防菌株和促生菌；本发明中的无色杆菌JY‑2‑3R分离自健康乌头植株根部，不会对药材品质造成影响，其在乌头白绢病防治上的应用方法属于生物防治，不污染环境、无残留、对人畜无害，在促进乌头生长及白绢病生物防治方面具有重要的应用前景。

Description

一株乌头白绢病生防无色杆菌JY-2-3R及其应用
技术领域
本发明涉及生防细菌技术领域，尤其涉及一株乌头白绢病生防无色杆菌JY-2-3R及其应用。
背景技术
乌头(Aconitum carmichaelii Debx)为毛茛科乌头属药用植物，其子根加工品称附子是我国40种名贵大宗中药材之一。乌头主栽区包括四川、陕西和云南等地，其中四川江油是其道地产区。生产上，乌头采用块根无性繁种，由于抗病品种的缺乏且种植模式单一，连作障碍严重，病害频发，其中以土传白绢病对其产量与品质的影响最大。道地产区乌头的种植会经历修根、打顶、去侧芽等管理过程，但造成的伤口使乌头植株更容易感染病原菌，因而道地产区乌头白绢病的发病率远高于其他地区，据统计，白绢病可使道地产区乌头减产60-80％，严重时甚至绝产。乌头白绢病在4、5月份(修根时期)爆发，病原菌(齐整小核菌)常侵染乌头茎与母根连接部位，随后根茎部逐渐腐烂，叶片萎蔫下垂青枯，地上部逐渐倒伏枯死，染病植株一般会绝产，常能在感病植株周围观察到辐射状白色丝绢状菌丝体。目前乌头土传病害的防治仍以化学农药为主。然而，化学药剂的过度施用导致环境污染、病原菌耐药性、乌头重金属超标等问题，严重制约附子产业的绿色可持续健康发展，也与国家大力推进的化肥农药减量增效的措施相悖。因此，寻找化学农药的替代品是未来发展的重要方向，其中以有益微生物为材料的生物防治是农业绿色发展的重要举措。
植物内生菌因定殖在植物体内，与宿主协同进化，成为了植物抵御病害的重要屏障，也是生防材料的重要资源库。植物内生菌具促生、抗病、抗逆及分泌植物同源次生代谢物的能力，然而目前暂无以乌头内生菌为材料的生物防治应用于乌头土传白绢病的防控，筛选并开发高效生防能力的乌头内生菌用于防治乌头白绢病具有重要的理论和实践意义。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的用于乌头白绢病的生防微生物较少的问题，提供一株乌头白绢病专性生防无色杆菌JY-2-3R及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一株乌头白绢病生防无色杆菌JY-2-3R，所述无色杆菌JY-2-3R于2022年7月18日保藏于广东省微生物保藏中心，保藏编号为GDMCC No.62631。
优选地，所述无色杆菌JY-2-3R的16S rRNA基因序列如SEQ ID No.1所示。
本发明同时提供了上述乌头白绢病生防无色杆菌JY-2-3R在乌头白绢病防治及乌头生长上的应用。
优选地，所述无色杆菌JY-2-3R的应用形式为无色杆菌JY-2-3R的菌悬液、发酵液或无细胞发酵滤液。
本发明所具有的有益效果：
一)本发明中的无色杆菌JY-2-3R对乌头白绢病病原菌有明显的抑制作用，可作为生防菌株，将无色杆菌JY-2-3R制作成菌悬液、发酵液或无细胞发酵滤液应用于乌头白绢病的防治，可有效降低乌头白绢病的发病率，显著提高乌头子根(商品附子)的产量；
二)本发明中的无色杆菌JY-2-3R来源于健康乌头植株，内生菌因定殖在植物体内，不会对药材品质造成影响，其在乌头白绢病防治上的应用方法属于生物防治，不污染环境、无残留、对人畜无害，在生物防治乌头白绢病中具有重要的应用前景。
附图说明
图1是实施例1中菌株JY-2-3R在LB培养基上的菌落形态图；
图2是实施例1中菌株JY-2-3R对白绢病病原菌的拮抗效果图，图2中A和B分别为平板对峙试验的对照组和试验组；
图3是实施例1中菌株JY-2-3R在乌头切片上对白绢病病原菌的拮抗效果图，图3中A和B分别为乌头切片对峙试验的对照组和试验组；
图4是实施例2中菌株JY-2-3R基于16SrRNA基因构建的系统发育树；
图5是实施例3中JY-2-3R无细胞发酵滤液对白绢病病原菌菌丝生长和菌核形成的抑制效果图；图5中A-G依次为对照组白绢病病原菌在72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h时菌丝生长和菌核形成情况；H-N依次为在72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h时试验组JY-2-3R无细胞发酵滤液对白绢病病原菌菌丝生长和菌核形成的抑制效果；
图6是实施例3中JY-2-3R无细胞发酵滤液对白绢病病原菌菌核萌发的抑制效果图；图6中A-D依次为对照组白绢病病原菌菌核在48h、72h、96h、120h时的萌发情况；E-H依次为在48h、72h、96h、120h时JY-2-3R无细胞发酵滤液对白绢病病原菌菌核萌发的抑制情况；
图7是实施例4中菌株JY-2-3R产葡聚糖降解酶能力的效果图；
图8是实施例5中菌株JY-2-3R发酵液对乌头白绢病的大田防治效果；
图9是实施例5中菌株JY-2-3R发酵液对乌头植株茎、乌头、商品附子的鲜重及干重的促生效果。
本发明中的无色杆菌JY-2-3R保藏于广东省微生物保藏中心(GDMCC)，地址为中国广东省广州市越秀区先烈中路100号，保藏日期为2022年7月18日，保藏编号为GDMCCNo.62631，分类命名为Achromobacter sp.JY-2-3R。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1无色杆菌JY-2-3R的分离和筛选
1、乌头内生细菌的分离
本实施例中的乌头植株取自四川省江油市青莲镇邀月村乌头种植地。
具体步骤包括：(1)从健康乌头植株上取下根(主要为附子)、茎、叶，在自来水下反复冲洗干净，注意不要造成物理性伤口，用吸水纸吸干水分。
(2)在超净工作台内先用75％乙醇浸泡1min，然后用无菌水浸泡1min，接着用2％NaClO(有效Cl含量)浸泡5min，无菌水清洗5次，每次浸泡2min并轻微震荡。吸取最后一次清洗液50μL涂布于LB固体培养基，28℃培养一周，观察是否有菌落生长，以检测表面消毒的效果。
(3)表面消毒后，将样品用无菌粉碎机粉碎，并接种于LB固体培养基，28℃暗培养。3d后选取样品组织周围长出的细菌菌落于LB固体培养基进行纯化，最终选取到一株淡黄色、不透明、圆形的菌株，命名为JY-2-3R(如附图1所示)。3次纯化后检测菌株纯度并用25％甘油保藏于-80℃冰箱。
2、乌头内生细菌与病原菌的平板对峙试验
挑取菌株JY-2-3R的单菌落于LB液体培养基培养至对数生长期，调节OD600＝0.2备用；将白绢病病原菌菌饼(直径2mm)接种于PDA固体培养基中心，距病原菌菌饼2.0cm处接种菌株JY-2-3R的菌悬液10μL(OD600＝0.2)，28℃暗培养3d，记录病原菌菌落直径大小，并计算抑菌率(％)＝(对照组病原菌菌落直径-试验组病原菌菌落直径)/对照组病原菌菌落直径×100。结果如附图2所示，图2中A为单接种病原菌的对照组；B为接种菌株JY-2-3R菌悬液和病原菌的试验组，图A和B对比显示，菌株JY-2-3R在平板上对白绢病病原菌的生长具有显著的抑制效果，菌丝生长抑制率为44.35％。
3、乌头内生细菌与病原菌的切片对峙试验
将乌头根部切成1cm厚的圆形薄片，对其进行表面消毒。
挑取菌株JY-2-3R的单菌落于LB液体培养基培养至对数生长期，调节OD600＝0.2备用；将10μL菌株JY-2-3R的菌悬液均匀接种于乌头切片表面，风干后，再将白绢病病原菌菌饼(直径2mm)接种于乌头切片中心，28℃暗培养3d，记录病原菌菌落直径，并计算抑菌率(％)＝(对照组病原菌菌落直径-试验组病原菌菌落直径)/对照组病原菌菌落直径×100。结果如附图3所示，图3中A为单接种病原菌的对照处理；B为接种菌株JY-2-3R菌悬液和病原菌的试验组，对比显示，JY-2-3R在乌头切片上对白绢病病原菌的生长具有抑制效果，菌丝生长抑制率为50.00％。
实施例2菌株JY-2-3R的16SrRNA基因鉴定
(1)采用GUTC法提取实施例1中分离筛选得到的菌株JY-2-3R的总DNA，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检查DNA的浓度。
(2)采用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACCTTGTTACGACTT-3’)进行16S rDNA PCR扩增，PCR扩增体系为：2×mix 12.5μL，10μmoL/mL的27F 1μL，10μmoL/mL的1492R 1μL，DNA1μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃总延伸10min。扩增产物用1％的琼脂糖凝胶检测，电泳电压80V，80min。
(3)PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司测序，所得序列在NCBI数据库进行比对，根据比对结果选取参比菌株，利用MEGA7.0软件构建系统发育树(图4)，明确其分类地位。
(4)菌株JY-2-3R的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示。系统发育树结果显示，JY-2-3R与Achromobacter spanius CCUG 47062聚为一个分支，相似度达到99.85％。
实施例3菌株JY-2-3R无细胞发酵滤液对乌头白绢病病原菌生长的抑制作用
1、菌株JY-2-3R无细胞发酵滤液对乌头白绢病病原菌菌丝生长和菌核形成的抑制作用
(1)病原菌接种材料：将乌头白绢病病株活化接种到PDA固体培养基上，25℃培养4d，使用时用刀片划成长2mm的正方形菌饼。
(2)无细胞发酵滤液：用竹签挑取JY-2-3R单菌落至装有50mL LB液体培养基的100mL三角瓶中，然后用已灭菌的棉花塞和报纸封口，在28℃、160rpm/min摇床培养3d后，在4℃、11000rpm/min的条件下离心15min后取上清液，用0.22μm无菌针头过滤器将上清液过滤除菌制成无细胞发酵滤液。
(3)将无细胞发酵滤液与PDA培养基按1:4比例混合后制作平板，对照组不混合滤液；待培养基冷却后接种病原菌菌饼于平板中央，设3组重复；25℃恒温培养箱中培养，4d后每隔24h测定病原菌菌落直径，216h时记录白绢病病原菌产生的菌核数。如附图5所示，图5中A-G依次为对照组白绢病病原菌在72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h时菌丝生长和菌核形成情况；H-N依次为在72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h时试验组JY-2-3R无细胞发酵滤液对白绢病病原菌菌丝生长和菌核形成的抑制效果。统计发现，216h时，JY-2-3R发酵滤液处理的病原菌直径为0cm，对照组病原菌直径为8.5cm，JY-2-3R无细胞发酵滤液可以极显著(p<0.01)抑制病原菌菌丝生长。JY-2-3R无细胞发酵滤液处理后病原菌形成0.00±0.00个菌核，而对照组形成的菌核数达254.00±70.00个，二者达到极显著差异(p<0.01)。
2、菌株JY-2-3R无细胞发酵滤液对乌头白绢病病原菌菌核萌发的抑制作用
(1)菌核制备：将白绢病病原菌接种于PDA固体培养基上，25℃培养10d，搜集成熟菌核备用。
(2)操作步骤：将无细胞发酵滤液与PDA培养基按1:4比例混合后制作平板；待培养基冷却后将病原菌菌核接种于平板上，每皿12粒，设3组重复；25℃恒温培养箱中培养，2d后每24h记录菌核萌发数，共观察4d。结果如附图6所示，图6中A-D依次为对照组白绢病病原菌菌核在48h、72h、96h、120h时的萌发情况；E-H依次为在48h、72h、96h、120h时实验组JY-2-3R无细胞发酵滤液对白绢病病原菌菌核萌发的抑制情况。结果显示，对照组菌核于48h全部萌发，JY-2-3R无细胞发酵液处理的菌核直至120h仍没有萌发，二者达到极显著差异(p<0.01)，说明JY-2-3R无细胞发酵液对白绢病病原菌菌核萌发具有显著抑制作用。
实施例4菌株JY-2-3R产葡聚糖降解酶的能力检测
配置葡聚糖降解酶培养基：K2HPO41g，酵母粉5g，蛋白胨10g，刚果红0.4g，葡聚糖5g，MgSO4·7H2O0.1g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL。
将菌株JY-2-3R制作成菌悬液，用竹签将菌悬液接种到葡聚糖降解酶培养基上，28℃培养5d后，用1g/L的刚果红染液染色，15min后用1mol/L的氯化钠溶液脱色，观察菌落周围是否产生透明圈，并分别测量菌落和透明圈的直径。结果如附图7所示，JY-2-3R能产生葡聚糖酶，其透明圈直径为1.05±0.30cm。
实施例5菌株JY-2-3R发酵液的田间应用效果
试验方法：将保存在斜面的菌种接入LB固体培养基，28℃恒温培养3d，挑取单菌落接入LB液体培养基中，在28℃、150rpm/min条件下培养，直至溶液中菌浓度大于1×109CFU/mL。在乌头第一次修根时，注射10mL JY-2-3R发酵液到乌头根部，一个月后乌头第二次修根时重复接种(同第一次修根接种)。对照组不注射发酵液，水肥管理方式与试验组一致。设置3个重复，每个重复50株健康乌头植株。收获时统计乌头白绢病发病株数，计算乌头白绢病发病率和生防率。发病率＝发病株数/总株数×100％，生防率＝(对照组发病率-试验组发病率)/对照组发病率×100％。收获时记录植株茎鲜重、主根鲜重和商品附子鲜重，烘干后称量植株茎干重、主根干重和商品附子干重。
试验结果：统计发现，对照组白绢病发病率为48.75±8.93％，试验组白绢病为33.33±11.76％，JY-2-3R接菌处理可使病害发生率平均降低15.42％，JY-2-3R发酵液对乌头白绢病的生防率达到31.63％(图8)。此外，JY2-3R接菌处理的乌头植株茎鲜重、茎干重、主根鲜重、主根干重、商品附子鲜重和商品附子干重分别较不接菌处理增加了56.97％、43.53％、36.40％、52.77％、82.47％和90.02％，均达到显著水平(图9)。(注：*表示在p<0.05水平下，差异显著)
综上，本发明中的无色杆菌JY-2-3R能显著抑制乌头白绢病病原菌菌丝生长、菌核形成和萌发，该菌株能分泌葡聚糖降解酶、能有效降低乌头白绢病发病率、显著促进乌头植株生长且提高商品附子产量，其对乌头白绢病的田间防治具有非常好的效果。
本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的，在本发明基础上，本领域技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中一些技术特征做出一些替换和变形，均在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一株乌头白绢病生防无色杆菌JY-2-3R，其特征在于，所述无色杆菌JY-2-3R于2022年7月18日保藏于广东省微生物保藏中心，保藏编号为GDMCC No.62631。
2.根据权利要求1所述的乌头白绢病生防无色杆菌JY-2-3R，其特征在于，所述无色杆菌JY-2-3R的16SrRNA基因序列如SEQ ID No.1所示。
3.如权利要求1或2所述的乌头白绢病生防无色杆菌JY-2-3R在乌头白绢病防治及乌头生长上的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述无色杆菌JY-2-3R的应用形式为无色杆菌JY-2-3R的菌悬液、发酵液或无细胞发酵滤液。
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