CN116144749A

CN116144749A - 一种检测人ApoE基因突变的引物探针组及试剂盒

Info

Publication number: CN116144749A
Application number: CN202211167379.6A
Authority: CN
Inventors: 高强; 牛成镇; 吴超超; 朱建国
Original assignee: Hangzhou Baichen Medical Instrument Co ltd; Hangzhou Baichen Medical Laboratory Co ltd
Current assignee: Hangzhou Baichen Medical Instrument Co ltd; Hangzhou Baichen Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2022-09-23
Filing date: 2022-09-23
Publication date: 2023-05-23

Abstract

本发明公开了一种检测人ApoE基因突变的引物探针组及试剂盒，包括检测ApoE T388C引物对与探针以及检测ApoE C526T引物对与探针；所述检测ApoE T388C引物对与探针包括：388F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，388R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，探针388P的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述检测ApoE C526T引物对与探针包括：526F的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，526R的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，探针526P的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。本发明设计多对引物、探针并进行测试，挑选最优引物、探针组合，检测限更低；此外，本发明提供的引物探针组合，不需要额外添加剂，如PCR稳定剂、增效剂等，试剂成分更简单，操作更简便，成本更低。

Description

一种检测人ApoE基因突变的引物探针组及试剂盒

技术领域

本发明属于基因检测领域，涉及一种检测人ApoE基因突变的引物探针组及试剂盒。

背景技术

ApoE是人体载脂蛋白之一。载脂蛋白是脂蛋白颗粒成分，参与脂蛋白合成、分泌、加工和代谢，在血液脂质代谢中有重要作用。ApoE基因多态性在高血脂症、动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病早期及发展过程中发挥重要作用。另外，有研究表明，ApoE基因是目前已知的阿尔茨海默病最密切的遗传标志物，其多态性与阿尔茨海默病的易感性显著相关。

对于ApoE的基因检测主要是位于112位氨基酸的碱基(C.388T>C，Cys130Arg)和158位氨基酸的碱基(C.526C>T，Arg176Cys)。依据112和158位氨基酸的不同组合，形成三种ApoE，即E2、E3和E4，在人群占比分别为8％，78％，14％，其中ApoE3是野生型基因，E3的112、158位氨基酸分别是半胱氨酸和精氨酸，Apo E2、E4分别是突变型，E2在112位和158氨基酸都是半胱氨酸，E4的112位和158位氨基酸都是精氨酸。根据2个SNP基因的不同，ApoE基因可以产生6种常见基因型，包括3种纯合型(E2/E2、E3/E3、E4/E4)和三种杂合型(E2/E3、E2/E4、E3/E4)。自然人群中，E3基因频率分布最高，在中国人群中，ApoE3/E3表型分布约占70％。

目前对于ApoE这两个位点的检测主要有直接测序法、基因芯片杂交法、PCR-Taqman MGB探针分型法、ARMS-PCR法和PCR-熔解曲线法。

直接测序法是SNP分型的“金标准”，但是操作复杂、周期长、通量低、成本高；

芯片杂交法操作复杂，需要经PCR后的产物与探针杂交，辨别颜色变化进行基因分型，需要开盖操作、容易污染；人眼识别，容易出错；实验周期也较长；

Taqman(MGB)探针分型通过对一个位点设以对特异性引物及两个探针(一个探针对应一种基因突变)，实现基因分型，是目前CFDA批准试剂盒主要的检测方法。但是该方法需要针对一个位点设计两个探针，成本较高，并且MGB探针有专利保护，使用受限。

ARMS-PCR，等位基因特异性扩增法，也称扩增阻碍突变系统，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3’端引物进行平行PCR，只有突变DNA完全互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物，由于错配位于引物的3’端则导致PCR不能延伸，则称为ARMS。该方法通过采用PCR反应结束后进行电泳，从有无扩增条带来判断结果，这种方法虽然不需要昂贵的一起，但电泳操作，增加了PCR污染的结汇，而且耗时费力。

基于不对称PCR的熔解曲线法也是目前常用的基因检测方法，将不对称PCR技术与溶解曲线技术相结合，针对ApoE基因的2个SNP位点，分别设计一对引物和一条探针。使用不同浓度的上下游引物进行不对称扩增，随着循环的增加，量少的引物被逐渐耗尽，而超量的引物则继续进行线性扩增，富集到了大量的含有C.388T>C和C.526C>T的DNA单链。经熔解曲线分析，两个位点探针与对应序列结合，突变与野生型序列退火温度存在差异，进而可以区分两个位点基因型。发明CN111269978B提供了一种通过熔解曲线法进行ApoE基因分型的引物探针及其试剂盒。其对两个位点进行了同种荧光标记并添加PCR增效剂进行扩增反应。通过其公布的技术发现，E2位点两个基因型退火温度分别为57.5℃和61.5℃，另一个位点退火温度为63℃和67.5℃，其中E2位点的61.5℃和E4位点的63℃温度差异很小，实际检测中由于退火温度偏差而导致判断错误；另外，其发明中添加的增效剂虽然有可增加其反应效果，但是额外试剂的添加一方面增加了反应成本，另一方面也使得反应操作更加复杂。

综上所述，现有ApoE基因分型检测方法都或多或少存在操作复杂、检测成本高、周期长、易产生污染及产生一定假阳性等缺陷。

发明内容

为了改善现有技术缺陷，本发明提供了一种检测人ApoE基因突变的引物探针组及试剂盒，通过对ApoE突变位点设计特异性引物、探针，并对其浓度比例进行反复测试优化，可准确区分两个位点的基因型。没有其他增效剂的存在，同时针对两个位点探针进行不同荧光标记(退火温度差一个位点大于5℃，一个位点大于10℃)，操作更简便，分析也更简便、容易、明了。

本发明基于taqman探针熔解曲线法对ApoE基因多态性进行检测。通过对ApoE突变位点设计特异性引物、探针，并对其浓度比例进行优化，可实现对这两个位点的准确分型。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种检测人ApoE基因突变的引物探针组，包括检测ApoE T388C引物对与探针以及检测ApoE C526T引物对与探针；

所述检测ApoE T388C引物对与探针包括：388F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，388R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，探针388P的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述检测ApoE C526T引物对与探针包括：526F的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，526R的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，探针526P的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

在本发明中，本发明基于taqman探针熔解曲线法对ApoE基因多态性进行检测。通过对ApoE突变位点设计特异性引物、探针，并对其浓度比例进行优化，可实现对这两个位点的准确分型。

根据NCBI dbSNP网站下载的目标SNP C.388T>C和C.526C>T附近序列，利用Primer5.0和Oligo6.0，分别设计针对APOE基因两个位点特异扩增引物和探针，并对引物、探针进行序列比对，选取特异性高的序列。

同时，为保证统一位点不同基因型能够很好区分开，对探针序列、长度及SNP位置进行优化设计，使其两种基因型对应的温度差异尽可能大。

作为本发明的一种优选方案，所述的检测探针5’端标记荧光基团修饰，3’端标记淬灭基团修饰。

作为本发明的一种优选方案，所述荧光基团选自ROX、FAM、HEX、VIC、NED、TET、JOE、CY3、CY5、CY7或AMCA中的一种，淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL或QYS-7中的一种。

作为本发明的一种优选方案，探针388P的荧光基团为FAM，猝灭基团为BHQ1；探针526P的荧光基团为ROX，猝灭基团为BHQ2。

本发明还提供了包含上述一种引物探针组的检测人ApoE基因突变的试剂盒。

作为本发明的一种优选方案，所述试剂盒还包括PCR反应液，在反应体系中，F端引物浓度为0.01-4μM，R端引物浓度为0.01-4μM，探针浓度为0.01-0.5μM，MgCl₂浓度为1.5-2.25mM，等浓度的四种脱氧核糖核苷酸混合液终浓度为0.1-0.2mM，Taq酶的浓度为1-2U/反应。

作为本发明的一种优选方案，还包括UNG酶，UNG酶的浓度为0.5-1U/反应。

作为本发明的一种优选方案，在反应体系中，F端引物浓度为0.1-2μM，R端引物浓度为0.1-2μM，探针浓度为0.01-0.2μM。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明通过UNG酶的加入，可避免污染风险，提高检测的准确性。

2)本发明设计多对引物、探针并进行测试，挑选最优引物、探针组合，检测限更低；此外，本发明提供的引物探针组合，不需要额外添加剂，如PCR稳定剂、增效剂等，试剂成分更简单，操作更简便，成本更低。

3)对目标位点分别设计不同荧光标记的自猝灭探针(一端荧光基团，一端猝灭基团)，不同荧光基团的加入使得熔解曲线分析阶段两个位点基因型辨别更简便、准确。

附图说明

图1是杂合样本不同浓度时ApoE T388C和C526T位点扩增曲线。

图2是杂合样本不同浓度时ApoE T388C和C526T位点熔解曲线。

图1与图2中，实线为T388C扩增曲线，虚线为C526T位点扩增曲线，从左至右浓度分别为0.05ng/μL、0.5ng/μL、5ng/μL。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据荧光PCR探针熔解曲线技术的特点，合理搭配各对引物和探针的浓度，通过大量的实验优化最终确立的引物和探针组合。

ApoE T388C引物对及探针序列如下：

SEQ ID No.1：388F：CTGTCCAAGGAGCTGCAGG。

SEQ ID No.2：388R：GAGCATGGCCTGCACCTCG。

SEQ ID No.3：388P：FAM-ACATGGAGGACGTGCGCGGCCGCCTG-BHQ1。

ApoE C526T引物对及探针序列如下：

SEQ ID No.4：526F：TAAGCGGCTCCTCCGCGAT。

SEQ ID No.5：526R：ACGCGGCCCTGTTCCACCA。

SEQ ID No.6：526P：ROX-CCTGCAGAAGCGCCTGGCA-BHQ2。

SEQ ID No.7：ApoE基因序列T388C、C526T野生型基因序列：

CCTCGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTAGAGGCATGAGCCACCTTGCCCGGCCTCCTAGCTCCTTCTTCGTCTCTGCCTCTGCCCTCTGCATCTGCTCTCTGCATCTGTCTCTGTCTCCTTCTCTCGGCCTCTGCCCCGTTCCTTCTCTCCCTCTTGGGTCTCTCTGGCTCATCCCCATCTCGCCCGCCCCATCCCAGCCCTTCTCCCCGCCTCCCACTGTGCGACACCCTCCCGCCCTCTCGGCCGCAGGGCGCTGATGGACGAGACCATGAAGGAGTTGAAGGCCTACAAATCGGAACTGGAGGAACAACTGACCCCGGTGGCGGAGGAGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCATGCTCGGCCAGAGCACCGAGGAGCTGCGGGTGCGCCTCGCCTCCCACCTGCGCAAGCTGCGTAAGCGGCTCCTCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGCGCCTGGCAGTGTACCAGGCCGGGGCCCGCGAGGGCGCCGAGCGCGGCCTCAGCGCCATCCGCGAGCGCCTGGGGCCCCTGGTGGAACAGGGCCGCGTGCGGGCCGCCACTGTGGGCTCCCTGGCCGGCCAGCCGCTACAGGAGCGGGCCCAGGCCTGGGGCGAGCGGCTGCGCGCGCGGATGGAGGAGATGGGCAGCCGGACCCGCGACCGCCTGGACGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCGGAGGTGCGCGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATACGCCTGCAGGCCGAGGCCTTCCAGGCCCGCCTCAAGAGCTGGTTCGAGCCCCTGGTGGAAGACATGCAGCGCCAGTGGGCCGGGCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCCGTGGGCACCAGCGCCGCCCCTGTGCCCAGCGACAATCACTGAACGCCGAAGCCTGCAGCCATGCGACCCCACGCCACCCCGTGCCTCCTGCCTCCGCGCAGCCTGCAGCGGGAG。

SEQ ID No.8：ApoE基因序列T388C、C526T突变型基因序列：

CCTCGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTAGAGGCATGAGCCACCTTGCCCGGCCTCCTAGCTCCTTCTTCGTCTCTGCCTCTGCCCTCTGCATCTGCTCTCTGCATCTGTCTCTGTCTCCTTCTCTCGGCCTCTGCCCCGTTCCTTCTCTCCCTCTTGGGTCTCTCTGGCTCATCCCCATCTCGCCCGCCCCATCCCAGCCCTTCTCCCCGCCTCCCACTGTGCGACACCCTCCCGCCCTCTCGGCCGCAGGGCGCTGATGGACGAGACCATGAAGGAGTTGAAGGCCTACAAATCGGAACTGGAGGAACAACTGACCCCGGTGGCGGAGGAGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGCGCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCATGCTCGGCCAGAGCACCGAGGAGCTGCGGGTGCGCCTCGCCTCCCACCTGCGCAAGCTGCGTAAGCGGCTCCTCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGTGCCTGGCAGTGTACCAGGCCGGGGCCCGCGAGGGCGCCGAGCGCGGCCTCAGCGCCATCCGCGAGCGCCTGGGGCCCCTGGTGGAACAGGGCCGCGTGCGGGCCGCCACTGTGGGCTCCCTGGCCGGCCAGCCGCTACAGGAGCGGGCCCAGGCCTGGGGCGAGCGGCTGCGCGCGCGGATGGAGGAGATGGGCAGCCGGACCCGCGACCGCCTGGACGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCGGAGGTGCGCGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATACGCCTGCAGGCCGAGGCCTTCCAGGCCCGCCTCAAGAGCTGGTTCGAGCCCCTGGTGGAAGACATGCAGCGCCAGTGGGCCGGGCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCCGTGGGCACCAGCGCCGCCCCTGTGCCCAGCGACAATCACTGAACGCCGAAGCCTGCAGCCATGCGACCCCACGCCACCCCGTGCCTCCTGCCTCCGCGCAGCCTGCAGCGGGAG。

引物、探针组合及测试

组合不同引物、探针并对其浓度进行优化，使其能准确区分基因型。设计出最优组合，25μL反应体系中，各成分浓度范围：

F端引物浓度及范围0.01-4uM，优选0.1-2uM；

R端引物浓度及范围0.01-4uM，优选0.1-2uM；

探针浓度及范围0.01-0.5uM，优选0.01-0.2uM；

MgCl2浓度范围1.5-2.25mM；

Taq酶1-2U；

等浓度的四种脱氧核糖核苷酸混合液(dNTP)终浓度为0.1-0.2mM；

dUTP浓度0.3-0.6mM；

UNG酶0.5-1U；

通过大量优化实验确定的最优扩增体系见表1所示。

表1本发明最优扩增体系

本发明PCR总反应体积为25μL，反应过程中需加入待检测DNA量为2μL。

检测程序见表2所示。

表2 PCR扩增条件及荧光收集

实施例1

基于qPC-熔解曲线法ApoE基于分型检测：

1)样本处理：

根据样本类型不同，选取对应的试剂盒进行全基因组DNA提取并对提取的DNA浓度、纯度进行检测。

2)试剂配置及加样

本发明PCR扩增反应总体积为25μL，按照表1比例配置反应体系并在每个反应体系中加入2μL步骤1提取的基因组DNA。同时，设置一阴一阳质控样本对检测过程进行监控。

3)PCR扩增及荧光收集

将加样后的反应管放入PCR仪中，根据探针荧光基团，选择仪器的FAM和ROX通道进行荧光信号收集，按照优化后的反应程序进行扩增及信号收集。

4)结果分析及基因型判断

a)阴性对照应无明显熔解峰，若分析后出现熔解峰，可能为操作过程或试剂受到污染，需排除污染源后重新检测。

b)阳性对照在熔解曲线分析后应每个荧光通道都有2个熔解峰，若阳性对照管无熔解峰或只出现1个熔解峰，需排查原因，如所使用的试剂是否仍在有效期内、操作是否严格按照说明书进行等，并重新进行检测。

c)样本基因型判读方法按照表3标准进行。

表3本发明ApoE基因分型结果对照表

+表示该处有熔解峰；-表示该处无熔解峰。

实施例2

扩增效率及检测限验测试：

1)选取3个样本，涵盖ApoE两个位点野生型、突变杂合和突变纯合基因型(ApoE388TT、TC、CT和526CC、CT、TT)，对样本进行梯度稀释，浓度涵盖0.05ng/μL–5ng/μL。

2)试剂配置及加样：

按照优化后的扩增体系配置反应液，然后将配置好的反应液加入8连管中，每个管中加23μL，然后将稀释好的样本DNA加入反应体系。

3)PCR扩增及荧光信号收集：

4)结果分析：

对于两位点均为杂合样本PCR扩增曲线及熔解曲线如图1与图2所示，在浓度为0.05ng/μL时仍能进行基因型准确检测。

图1与图2中，实线为T388C扩增曲线及熔解曲线，虚线为C526T位点扩增曲线及熔解曲线，从左至右浓度分别为0.05ng/μL、0.5ng/μL、5ng/μL。

实施例3

全血样本ApoE基因型检测：

1)采集6名受试者全血样本2mL，全血基因组DNA提取采用常规全血DNA提取试剂盒进行提取。

2)按照表1配置PCR扩增体系，向每个反应体系中加入2μL步骤1提取的全血DNA，进行PCR扩增反应，反应条件如表2所示。

3)扩增结束后获得熔解曲线，根据表3判断每个样本的基因型。

表4受试者全血样本ApoE基因分型检测结果

同时，对受试者的血液DNA样本进行Sanger测序，将本实施例试剂盒检测的基因分型与测序结果进行比较，结果如表4所示。根据对比结果可以看到，本发明提供的试剂盒检测的受试者ApoE分型与基因测序结果一致，说明本发明提供的试剂盒检测准确性高。

实施例4

唾液样本ApoE基因型检测：

1)对实施例3中的6名受试者，采集2mL唾液样本，采样常规唾液DNA提取试剂盒进行DNA提取。

2)按照表1配置PCR扩增体系，向每个反应体系中加入2μL步骤1提取的唾液DNA，进行PCR扩增反应，反应条件如表2所示。

表5受试者唾液样本ApoE基因分型检测结果

实施例5

口腔拭子样本ApoE基因型检测：

1)对实施例3中的6名受试者，采集口腔拭子样本，采样常规口腔拭子DNA提取试剂盒进行DNA提取。

2)按照表1配置PCR扩增体系，向每个反应体系中加入2μL步骤1提取的口腔拭子DNA，进行PCR扩增反应，反应条件如表2所示。

表6受试者口腔拭子样本ApoE基因分型检测结果

以上结果说明本发明试剂盒可对人全血、口腔拭子、唾液等提取的DNA进行ApoE基因分型检测，检测结果准确。

由此可见，本发明设计多对引物、探针并进行测试，挑选最优引物、探针组合，检测限更低；此外，本发明提供的引物探针组合，不需要额外添加剂，如PCR稳定剂、增效剂等，试剂成分更简单，操作更简便，成本更低；对目标位点分别设计不同荧光标记的自猝灭探针(一端荧光基团，一端猝灭基团)，不同荧光基团的加入使得熔解曲线分析阶段两个位点基因型辨别更简便、准确。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.一种检测人ApoE基因突变的引物探针组，其特征在于，包括检测ApoE T388C引物对与探针以及检测ApoE C526T引物对与探针；

2.根据权利要求1所述的一种检测人ApoE基因突变的引物探针组，其特征在于，所述的检测探针5’端标记荧光基团修饰，3’端标记淬灭基团修饰。

3.根据权利要求2所述的一种检测人ApoE基因突变的引物探针组，其特征在于，所述荧光基团选自ROX、FAM、HEX、VIC、NED、TET、JOE、CY3、CY5、CY7或AMCA中的一种，淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL或QYS-7中的一种。

4.根据权利要求3所述的一种检测人ApoE基因突变的引物探针组，其特征在于，探针388P的荧光基团为FAM，猝灭基团为BHQ1；探针526P的荧光基团为ROX，猝灭基团为BHQ2。

5.一种检测人ApoE基因突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的检测人ApoE基因突变的引物探针组。

6.根据权利要求5所述的一种检测人ApoE基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应液，在反应体系中，F端引物浓度为0.01-4μM，R端引物浓度为0.01-4μM，探针浓度为0.01-0.5μM，MgCl₂浓度为1.5-2.25mM，等浓度的四种脱氧核糖核苷酸混合液终浓度为0.1-0.2mM，Taq酶的浓度为1-2U/反应。

7.根据权利要求6所述的一种检测人ApoE基因突变的试剂盒，其特征在于，还包括UNG酶，UNG酶的浓度为0.5-1U/反应。

8.根据权利要求7所述的一种检测人ApoE基因突变的试剂盒，其特征在于，在反应体系中，F端引物浓度为0.1-2μM，R端引物浓度为0.1-2μM，探针浓度为0.01-0.2μM。