CN116115656A - 同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法、提取物质和银杏提取物制剂 - Google Patents

同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法、提取物质和银杏提取物制剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及天然产物提取技术领域，具体而言，涉及同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法、提取物质和银杏提取物制剂。方法包括：浓缩吸附有银杏叶提取液的大孔吸附树脂的醇洗脱液至无醇味；而后，加水稀释形成稀释药液，其中，每升所述稀释药液对应3‑4Kg银杏叶原药；接着，所述稀释药液在10℃以下冷藏24小时；而后，取上清液并进行浓缩形成浓缩液，其中，每升所述浓缩液对应5.5‑8.5Kg银杏叶原药；接着，常压加热沸腾1‑3小时后降温，并在10℃以下冷藏48小时以上，而后过滤。该方法不仅仅可以同时得到银杏黄铜和银杏内酯，同时二者的收率和纯度均较高。

Description

同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法、提取物质和银杏提取物制剂
技术领域
本发明涉及天然产物提取技术领域，具体而言，涉及同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法、提取物质和银杏提取物制剂。
背景技术
银杏叶提取物是《中国药典》品种，本品主要是用于含有银杏叶提取物的相关制剂的原料。关于银杏叶提取物的药用效果研究很多。银杏叶提取物中主要包含两类成分，一类为银杏黄酮，一类为银杏内酯。其中银杏黄酮类成分具有扩张血管、抑制血小板活化因子、抗氧化、调血脂等药理作用,对心脑血管和神经系统具有保护作用；银杏内酯类成分是血小板活化因子强有力的拮抗剂，具有抗血小板聚集、抗血栓、防治动脉粥样硬化、抗炎症和抗过敏等作用。
现有的银杏内酯的提取方法有超临界萃取法、溶剂萃取法。其中，超临界萃取法，提取成本高；采用溶剂萃取法需要大量的有机溶剂，容易污染环境，并且提取成本也较高。现有的银杏黄酮的提取方法为银杏叶经乙醇回流提取后，浓缩，稀释后用大孔吸附树脂纯化，浓缩，即得。制备银杏黄酮时是对银杏叶中黄酮类成分的纯化，但其提取物中含有大量的银杏内酯，因此一般银杏叶提取物总黄酮醇苷的含量为24％。而在分离纯化提取物制备银杏黄酮时，银杏内酯不易被分离得到。可见，现有的提取方法不能同时高效的制备银杏内酯和银杏黄酮。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法、提取物质和银杏提取物制剂。本发明实施例提供的提取方法不仅仅可以同时得到银杏黄铜和银杏内酯，同时二者的收率和纯度均较高。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法，包括：浓缩吸附有银杏叶提取液的大孔吸附树脂的醇洗脱液至无醇味；
而后，加水稀释形成稀释药液，其中，每升所述稀释药液对应3-4Kg银杏叶原药；
接着，所述稀释药液在10℃以下冷藏24小时以上；
而后，取上清液并进行浓缩形成浓缩液，其中，每升所述浓缩液对应5.5-8.5Kg银杏叶原药；
接着，常压加热沸腾1-3小时后降温，并在10℃以下冷藏48小时以上，而后过滤。
在可选的实施方式中，所述银杏叶提取液的制备步骤包括：利用醇溶剂回流提取银杏叶原药，收集回流的乙醇溶液，而后浓缩至无醇味，接着加水稀释并静置后取上层清液。
在可选的实施方式中，所述银杏叶提取液的制备步骤包括：将破碎的银杏叶原药与70-80％乙醇混合回流提取3-4次，每次1-2小时，而后收集回流乙醇溶液并浓缩至无醇味，而后加水稀释形成稀释液，静置24-36小时，取上层清液，其中，银杏叶与乙醇的质量比为1:3-5，每kg所述银杏叶原药对应30-60升所述稀释液。
在可选的实施方式中，所述醇洗脱液的制备步骤包括：将所述银杏叶提取液通过大孔吸附树脂，而后先预洗再用醇溶剂再次洗脱。
在可选的实施方式中，所述醇洗脱液的制备步骤包括：将所述银杏叶提取液通过大孔吸附树脂，而后12-15％的乙醇进行预洗，而后再用50-80％乙醇再次洗脱形成醇洗脱液。
在可选的实施方式中，所述大孔吸附树脂选用D101大孔吸附树脂柱。
在可选的实施方式中，预洗和再次洗脱分别为等梯度洗脱。
在可选的实施方式中，分别对过滤形成的过滤固体和滤过液进行干燥，分别得到银杏内酯和银杏黄酮。
第二方面，本发明提供一种提取物质，其通过前述实施方式任一项所述的同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法制备得到。
第三方面，本发明提供一种银杏提取物制剂，其包括前述实施方式任一项所述的同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法制备得到的银杏内酯和/或银杏黄酮或前述实施方式所述的提取物质。
本发明具有以下有益效果：本发明实力通过对银杏叶提取液的大孔吸附树脂的醇洗脱液进行浓缩，后再加水稀释，而后冷藏、浓缩、加热以及冷却，能够有效提升提取得到的银杏黄酮和银杏内酯的纯度和收率，且银杏黄酮内的银杏内酯降低至极低的含量，提升了银杏黄酮和银杏内酯的功效。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例提供的同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法的流程工艺图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例提供一种同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法，该方法的工艺流程参见图1，具体包括：
取银杏叶原药即银杏叶，破碎，与乙醇(例如70％乙醇、75％乙醇和80％乙醇等70-80％乙醇)混合回流提取3-4次，每次1-2小时，而后收集并混合每次的回流乙醇溶液，浓缩至无醇味，加水稀释形成稀释液，静置24-36小时，取上层清液即银杏叶提取液，其中，银杏叶与乙醇的质量比为1:3-5，例如1:3、1:3.5、1:4、1:4.5以及1:5等1:3-5之间的任意数值；每kg所述银杏叶原药对应30-60升所述稀释液，例如每Kg对应30升、35升、40升、45升、50升、55升以及60升等30-60升之间的任意数值。
上述上清液通过大孔吸附树脂，该大孔吸附树脂为经D101大孔吸附树脂柱(树脂200Kg，径高比1:5-1:10)进行吸附，弃去从树脂柱上流出的水液，而后用乙醇(例如12％乙醇、13％乙醇、14％乙醇以及15％乙醇等10-15％乙醇)洗脱大孔吸附树脂柱子，弃去。即对吸附有银杏黄酮和银杏内酯的大孔吸附树脂进行预洗，进行预洗能除去了极性较大的鞣制成分，提升黄酮的含量，且采用上述浓度的乙醇能够进一步提升得到的银杏黄酮的含量。
再用50-80％乙醇(例如50％乙醇、55％乙醇、60％乙醇、65％乙醇、70％乙醇、75％乙醇以及80％乙醇等50-80％乙醇之间的任意数值的乙醇)再次洗脱。上述洗脱均为等梯度洗脱。
收集上述醇洗脱液浓缩至无醇味，而后加水稀释形成稀释药液，其中，每升所述稀释药液对应3-4Kg银杏叶原药；而后再将稀释药液在10℃以下冷藏24小时以上；此步骤能够使得一些杂质析出，而内酯以及黄酮则不会析出，提升银杏内酯和银杏黄酮的纯度和收率。同时，上述步骤控制稀释药液的浓度有利于提升制备得到的银杏内酯的含量，若更改此配比可能导致银杏内酯产量降低。
取上清液并进行浓缩形成浓缩液，其中，每升所述浓缩液对应5.5-8.5Kg银杏叶原药；控制浓缩液的浓度保证了浓缩液中银杏内酯成分的浓度，有利于该银杏内酯成分析出，但在该浓度下黄酮类成分不会析出；保证银杏内酯和银杏黄酮的产量。
接着常压加热沸腾1-3小时后降温，并在10以下冷藏48小时以上，而后过滤。常压加热沸腾1-3小时后在该浓度下，银杏内酯成分容易形成均匀的胶体溶液，利用胶体热不稳定原理，加速银杏内酯成分析出结晶；10℃以下冷藏48小时以上，其目的是给银杏内酯析出结晶充足的时间，有利于提高银杏内酯的产率。
本发明采用加水稀释，控制稀释药液的浓度，在冷却、过滤、加热和冷藏，能够提升提取得到的银杏内酯和银杏黄酮产量和纯度。
分别对过滤形成的过滤固体和滤过液进行干燥，分别得到银杏内酯和银杏黄酮。
本发明实施例制备得到的银杏内酯含量高，银杏内酯A含量约25％，银杏内酯B含量约15％，银杏内酯C含量约14％，从银杏叶到银杏内酯，三个银杏内酯A、B、C总和转移率可达到71％。而得到的银杏黄酮中总黄酮醇苷含量大于28％，银杏黄酮中银杏内酯A、B、C的含量，分别为：0.22％，0.21％，0，可见，银杏黄酮中杂质少，从银杏叶到银杏黄酮，总黄酮醇苷的收率达到85％以上。
本发明实施例还提供提取物质，其通过前述实施方式任一项所述的同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法制备得到。
本发明提供一种银杏提取物制剂，其包括前述实施方式任一项所述的同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法制备得到的银杏内酯和/或银杏黄酮或前述实施方式所述的提取物质。该银杏提取物制剂可以是现有技术的片剂、胶囊剂和注射剂等。
参照下述方法对提取得到的银杏内酯和银杏黄酮进行检测：
(1)银杏内酯
银杏内酯中银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C的含量测定
色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-四氢呋喃-水(1:15:84)为流动相；用蒸发光散射检测器测定。
对照品溶液的制备：精密称取银杏内酯A对照品、银杏内酯B对照品、银杏内酯C对照品适量，加丙酮溶解稀释制成每1ml分别含1.5mg、0.5mg、0.5mg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本品约50mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液5μl、10μl，供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程分别计算银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C的含量，即得。
(2)银杏黄酮
总黄酮醇苷的含量测定
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液(50：50)为流动相；检测波长为360nm；理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500；分离度按山柰素与异鼠李素峰计算，应大于1.5。
对照品溶液的制备：取槲皮素对照品适量，精密称定加甲醇制成每1ml含30μg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备：取本品约30mg，精密称定，加甲醇-25％盐酸溶液(4：1)的混合溶液25ml，置水浴中加热回流30分钟，迅速冷却至室温，转移至50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，以槲皮素对照品的峰面积为对照，分别按下表相对应的校正因子计算槲皮素、山奈素和异鼠李素的含量，用待测成分色谱峰与槲皮素色谱峰的相对保留时间确定槲皮素、山奈素和异鼠李素的峰位，其相对保留时间应在规定值的±5％范围内(若相对保留时间偏离超过5％，则应以相应的被替代对照品确证为准)，即得。相对保留时间及校正因子(F)见下表：
Figure BDA0004067602710000071
总黄酮醇苷含量＝(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)×2.51
银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C的含量测定(在检测银杏黄铜时检测银杏内酯，可以充分说明银杏黄酮内银杏内酯含量极低，证明通过本申请的方法充分将银杏内酯和银杏黄酮分开，银杏黄酮内银杏内酯被大量去除)
色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-四氢呋喃-水(1:15:84)为流动相；用蒸发光散射检测器测定。
对照品溶液的制备：取银杏叶总内酯对照提取物适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含2.5mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本品约1.2g，精密称定，加水50ml，置水浴中温热使溶散，加2％盐酸溶液10滴，用乙酸乙酯振摇提取4次(100ml、50ml、50ml、50ml)，合并提取液，用5％醋酸钠溶液100ml洗涤，分取醋酸钠液，再用乙酸乙酯50ml洗涤。合并乙酸乙酯提取液及洗涤液，用水洗涤2次，每次50ml，分取水液，用乙酸乙酯50ml洗涤，合并乙酸乙酯液，回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液5μl、10μl，供试品溶液5～10μl，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程分别计算银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C的含量，即得。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法，包括：
取银杏叶100Kg，破碎，用80％乙醇500Kg，回流提取3次，每次1小时；收集回流乙醇溶液，浓缩至无醇味状态，加水稀释至6000L,静置24小时，取上清液，经D101大孔吸附树脂柱(树脂200Kg，径高比1:5)吸附，弃去从树脂柱上流出的水液，再用15％乙醇(600L)洗脱大孔吸附树脂柱子，弃去，再用80％乙醇(1500L)，洗脱大孔吸附树脂树脂柱，收集，浓缩至无醇味，加水稀释，使稀释药液为25L，4℃冷藏24小时，取上清液浓缩至12.5L，常压加热沸腾3小时，降温，4℃冷藏48小时，过滤，收集过滤析出物，干燥即得银杏内酯提取物；滤过液经干燥，即得银杏黄酮提取物。
实施例2
本实施例提供一种同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法，包括：
取银杏叶100Kg，破碎，用80％乙醇300Kg，回流提取4次，每次2小时；收集回流乙醇溶液，浓缩至无醇味状态，加水将浓缩液稀释至3000L,静置24小时，取上清液，经D101大孔吸附树脂柱(树脂200Kg，径高比1:10)吸附，弃去从树脂柱上流出的水液，再用15％乙醇(600L)洗脱大孔吸附树脂柱子，弃去，再用50％乙醇(1000L)，洗脱大孔吸附树脂树脂柱，收集，浓缩至无醇味，加水稀释，使稀释药液在33L，0℃冷藏36小时，取上清液浓缩至15L，常压加热沸腾2小时，降温，0℃冷藏50小时，过滤，收集过滤析出物，干燥即得银杏内酯；滤过液经干燥，即得银杏黄酮。
实施例3
本实施例提供一种同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法，包括：
取银杏叶100Kg，破碎，用80％乙醇400Kg，回流提取4次，每次1.5小时；收集回流乙醇溶液，浓缩至无醇味状态，加水将浓缩液稀释至4000L,静置24小时，取上清液，经D101大孔吸附树脂柱(树脂200Kg，径高比1:8)吸附，弃去从树脂柱上流出的水液，再用15％乙醇(600L)洗脱大孔吸附树脂柱子，弃去，再用70％乙醇(1200L)，洗脱大孔吸附树脂树脂柱，收集，浓缩至无醇味，加水稀释，使稀释药液在25L，0℃冷藏36小时，取上清液浓缩至18L，常压加热沸腾3小时，降温，0℃冷藏50小时，过滤，收集过滤析出物，干燥即得银杏内酯；滤过液经干燥，即得银杏黄酮。
按照实施例1的方法重复3个批次，并对3个批次的银杏内酯和银杏黄酮进行检测，具体如表1-表2：
表1银杏黄酮提取物检测结果
Figure BDA0004067602710000091
根据上述结果可知，通过本发明实施例提供的方法制备得到的银杏黄酮提取物中总黄酮醇苷的含量可达到28％以上，而提取物中内酯含量被去除的很低的水平。
表2银杏内酯提取物检测数据
Figure BDA0004067602710000092
Figure BDA0004067602710000101
根据上述表格可知，通过本发明实施例提供的方法制备得到的银杏内酯提取物中三个银杏内酯的含量高，其中银杏内酯A的含量能达到25.4％，内酯B的含量能达到14.8％，内酯C的含量能达到14.2％；并且本方法所的银杏内酯提取物从药材到成品的三个银杏内酯总量转移率能达到70％的水平。
工艺优化
(1)预洗条件优化
照本发明实施例1提供的制备方法，实验室开展预洗脱对最终银杏黄酮对总黄酮醇苷含量的影响的研究。设计三种影响条件，即：15％乙醇预洗、10％乙醇预洗、不预洗。结果见下表。
条件 总黄酮醇苷含量(n＝3)
15％乙醇预洗 28.1％±0.33％
10％乙醇预洗 24.3％±0.47％
不预洗 23.1％±0.98％
从表中可知采用15％乙醇预洗大孔吸附树脂柱，可以有效提高银杏黄酮提取物总黄酮醇苷的含量。
需要说明的是，实验室研究中操作条件和配比与实施例1一致，只是各物质的用量等条件比例缩小。
(2)稀释药液浓度的优化
照本发明实施例1提供的制备方法，实验室开展稀释药液浓度对银杏内酯产量的影响效果的评价。取大孔吸附树脂醇洗脱液的浓缩液120g(重复3次)，平均分成3份(40g/份)，按照设计的三个影响条件，根据工艺路线制备银杏内酯，称所得银杏内酯的重量。结果见下表。
Figure BDA0004067602710000111
从表中可以看出，加水稀释至120ml的条件下，银杏内酯提取物的重量最高。其主要原因可能是稀释至240ml条件的样品，除杂效果不佳，导致在煮沸冷藏阶段析出银杏内酯量较少；而稀释至48ml条件的样品，水沉过程析出了大量的沉淀，沉淀中吸附了大量的银杏内酯被除掉，导致内酯产量低。
(3)加热处理(常压加热沸腾)优化
照本发明实施例1提供的制备方法，实验室开展加热处理(常压加热沸腾)工艺对银杏内酯产量的影响效果的评价。取稀释药液冷藏后的上清液500ml(重复3次)，平均分成5份(100ml/份)，减压浓缩至60ml左右，按照设计的五个影响条件，根据工艺路线制备银杏内酯，称所得银杏内酯的重量。结果见下表。
Figure BDA0004067602710000112
从表中可以看出，煮沸1小时和5小时工艺，获得的银杏内酯提取物含量无显著差异，但煮沸5小时的药液颜色明显加深，破坏了药液中的黄酮成分；而没有热处理的药液，没有得到银杏内酯；煮沸0.5小时工艺，也能获得内酯，但是产量波动较大。
(4)不同浓度浓缩液的优化(上清液浓缩成浓缩液)
照本发明实施例1提供的制备方法，实验室开展不同浓度浓缩液工艺对银杏内酯和银杏黄酮含量的影响效果的评价。取稀释药液冷藏后形成的上清液450ml，平均分成3份(150ml/份)，按照设计的三个影响条件，根据工艺路线制备银杏内酯提取物，检测影响内酯含量并观察银杏内酯颜色。
结果见下表。
Figure BDA0004067602710000121
从表中可以看出，浓缩至75ml条件下分离得到的银杏内酯提取物，含量最高，且提取物外观性状近白色，说明在该药液浓度是最佳浓缩。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法，其特征在于，包括：浓缩吸附有银杏叶提取液的大孔吸附树脂的醇洗脱液至无醇味；
而后，加水稀释形成稀释药液，其中，每升所述稀释药液对应3-4Kg银杏叶原药；
接着，所述稀释药液在10℃以下冷藏24小时以上；
而后，取上清液并进行浓缩形成浓缩液，其中，每升所述浓缩液对应5.5-8.5Kg银杏叶原药；
接着，常压加热沸腾1-3小时后降温，并在10℃以下冷藏48小时以上，而后过滤。
2.根据权利要求1所述的同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法，其特征在于，所述银杏叶提取液的制备步骤包括：利用醇溶剂回流提取银杏叶原药，收集回流的乙醇溶液，而后浓缩至无醇味，接着加水稀释并静置后取上层清液。
3.根据权利要求2所述的同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法，其特征在于，所述银杏叶提取液的制备步骤包括：将破碎的银杏叶原药与70-80％乙醇混合回流提取3-4次，每次1-2小时，而后收集回流乙醇溶液并浓缩至无醇味，而后加水稀释形成稀释液，静置24-36小时，取上层清液，其中，银杏叶与乙醇的质量比为1:3-5，每kg所述银杏叶原药对应30-60升所述稀释液。
4.根据权利要求1所述的同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法，其特征在于，所述醇洗脱液的制备步骤包括：将所述银杏叶提取液通过大孔吸附树脂，而后先预洗再用醇溶剂再次洗脱。
5.根据权利要求4所述的同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法，其特征在于，所述醇洗脱液的制备步骤包括：将所述银杏叶提取液通过大孔吸附树脂，而后12-15％的乙醇进行预洗，而后再用50-80％乙醇再次洗脱形成醇洗脱液。
6.根据权利要求4或5所述的同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂选用D101大孔吸附树脂柱。
7.根据权利要求4或5所述的同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法，其特征在于，预洗和再次洗脱分别为等梯度洗脱。
8.根据权利要求1所述的同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法，其特征在于，分别对过滤形成的过滤固体和滤过液进行干燥，分别得到银杏内酯和银杏黄酮。
9.一种提取物质，其特征在于，其通过权利要求1-8任一项所述的同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法制备得到。
10.一种银杏提取物制剂，其特征在于，其包括权利要求1-8任一项所述的同时提取银杏黄铜和银杏内酯的方法制备得到的银杏内酯和/或银杏黄酮或权利要求9所述的提取物质。
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