CN116087286B - 生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物传感器及其制备方法和应用。上述生物传感器包括：基底、工作电极和对电极；工作电极和对电极均形成在基底表面；工作电极的制备原料包括导电浆料、金属配合物、多糖分子及生物酶，金属配合物具有氨基和含氮杂环基团，多糖分子具有羧基，氨基与羧基缩合形成肽键以连接金属配合物和多糖分子，金属配合物与生物酶之间通过氢键连接。上述生物传感器能够使生物酶分布均匀、降低毒性。
Description
技术领域
本发明涉及传感器领域，特别是涉及一种生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
生物传感器是一种利用固定化的生物分子作为识别元件，对特定生物物质敏感并将其种类、浓度等性质通过换能器产生响应而检测的仪器。根据生物传感器中分子识别元件即敏感元件可分为酶传感器、微生物传感器、细胞传感器、组织传感器和免疫传感器等。可以根据生物传感器的换能器即信号转换器分为电化学传感器、光学传感器、热学传感器及压电晶体传感器等。根据目标物与分子识别元件的相互作用方式可分为亲和型传感器、代谢型传感器和催化型传感器等。另外根据生物传感器的检测物质也可分为葡萄糖传感器、乳酸传感器和乙醇传感器等。而市场上最成功的生物传感器是葡萄糖传感器，用于监测人体血液、组织间液等体液中的葡萄糖。
大多数葡萄糖传感器是通过在传感器电极外涂覆葡萄糖氧化酶溶液形成一层膜实现葡萄糖氧化酶的固定，利用葡萄糖氧化酶作为识别物质，通过电化学反应将葡萄糖浓度转化为电流，这种固定方式可能存在膜层不均一而导致葡萄糖氧化酶的含量在电极表面不同位置存在差异，从而影响传感器性能。另外，葡萄糖氧化酶溶液中常使用金属配合物作为媒介与葡萄糖氧化酶相连，若固酶不完全，可能使得金属配合物渗出，产生微量毒性。且该方法需要进行反复涂覆以及长时间的控温控湿的固化等待时间，对涂覆设备和反应条件的要求较高。
发明内容
基于此，有必要提供一种工艺要求降低或使生物酶分布均匀或降低毒性的生物传感器及其制备方法。
此外，还提供一种生物传感器的应用。
一种生物传感器，包括：基底、工作电极和对电极；
所述工作电极和所述对电极均形成在所述基底表面；
所述工作电极的制备原料包括导电浆料、生物酶、金属配合物及多糖分子，所述金属配合物具有氨基和含氮杂环基团，所述多糖分子具有羧基，所述氨基与所述羧基缩合形成肽键以连接所述金属配合物和所述多糖分子，所述金属配合物与所述生物酶之间通过氢键连接。
在其中一个实施例中，所述多糖分子选自氧化纤维素纳米晶体、氧化葡聚糖及氧化琼脂糖中的任一种或几种。
在其中一个实施例中，所述金属配合物满足以下条件中的任一个或几个：
(1)所述金属配合物中的金属原子选自铁、钌及锇中的任一种或几种的组合；和
(2)所述含氮杂环基团与所述氨基之间至少间隔6个碳原子；
(3)所述金属配合物中的含氮杂环基团选自2,2’-联咪唑、2,2’-联吡啶、2-(咪唑-2-基)吡啶及1,10-邻二氮杂菲中的任一种或几种。
在其中一个实施例中，所述金属配合物包括
在其中一个实施例中，所述生物酶包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸氧化酶、酮脱氢酶、酒精脱氢酶及尿酸氧化酶中的任一种。
在其中一个实施例中，按质量百分比计，所述工作电极的制备原料包括：导电浆料80％～90％、多糖分子8％～16％、生物酶1％～2％及金属配合物1％～2％。
在其中一个实施例中，还包括功能膜层，所述功能膜层形成在所述工作电极表面，所述功能膜层的材料选自醋酸纤维素、醋酸纤维素改性物、壳聚糖、聚氨酯、聚4-乙烯基吡啶及4-乙烯基吡啶的共聚物中的任一种或几种。
在其中一个实施例中，所述多糖分子包括氧化纤维素纳米晶体，所述功能膜层的材料包括醋酸纤维素及醋酸纤维素改性物中的任一种或两种。
一种生物传感器的制备方法，所述生物传感器为上述的生物传感器，所述制备方法包括如下步骤：
将所述多糖分子与所述金属配合物进行缩合反应；
将缩合反应产物与所述生物酶、所述导电浆料混合，制备混合浆料；
在基底表面布上所述混合浆料，然后在40℃～60℃下干燥15min～60min，制备所述工作电极；及
在所述基底表面形成对电极，制备所述生物传感器。
在其中一个实施例中，所述缩合反应满足以下条件中的任一个或几个：
(1)缩合反应的温度为10℃～30℃；
(2)缩合反应的时间为12h～36h。
在其中一个实施例中，将缩合反应产物与所述生物酶、所述导电浆料混合的步骤包括：先将所述缩合反应产物与所述生物酶在10℃～30℃下混合36h～72h，然后再与所述导电浆料混合。
在其中一个实施例中，还包括：将含有功能材料的溶液涂覆在所述工作电极表面，每次涂覆5s～20s，累计涂覆4次～10次，每次涂覆后在20℃～40℃下干燥5min～30min，最后一次涂覆后，在20℃～40℃下干燥12h～36h，以在所述工作电极表面形成功能膜层；
在含有功能材料的溶液中，所述功能材料的质量百分浓度为2.5％～15％。
在其中一个实施例中，所述功能膜层的厚度为2μm～10μm。
如上述的生物传感器在检测葡萄糖、乳酸、酮体、酒精或尿酸中的应用。
上述生物传感器的工作电极的制备原料包括导电浆料、金属配合物、多糖分子和生物酶，金属配合物的氨基与多糖分子的羧基缩合通过肽键连接，金属配合物与生物酶之间通过氢键连接，一方面金属配合物与多糖分子通过肽键固定，防止其渗出对人体造成毒性，另一方面，金属配合物所含有的含氮杂环基团能够与生物酶所含有的氨基形成氢键，多糖分子的规则排列使得金属配合物也能够实现规则排列，进而实现生物酶的规则分布，实现电极中生物酶分布的均一化，提高电子间传递效应，最终提升传感性能。此外，缩合反应产物不仅能够固定生物酶，提高生物传感器电极的结构稳定性；还能够作为电子传递中介促进电子在生物酶与电极之间传递，提高传感器的性能。
上述生物传感器的制备方法将生物酶与导电浆料低温干燥固化，实现生物酶在工作电极的制作过程中固定，代替传统在工作电极上涂覆传感层的步骤，工艺更为简单，通过低温固化不但能够保存生物酶的生物活性，使其结构不受高温损坏，而且利于导电浆料的固化成膜。此外，通过先将多糖分子与金属配合物进行缩合反应，然后与生物酶、导电浆料混合，一方面使金属配合物的氨基与多糖分子的羧基通过肽键固定，防止其渗出对人体造成毒性，另一方面，金属配合物所含有的含氮杂环基团能够与生物酶所含有的氨基形成氢键，多糖分子的规则排列使得金属配合物也能够实现规则排列，进而实现生物酶的规则分布，实现电极中生物酶分布的均一化，提高电子间传递效应，最终提升传感性能。此外，缩合反应产物不仅能够固定生物酶，提高生物传感器电极的结构稳定性；还能够作为电子传递中介促进电子在生物酶与电极之间传递，提高传感器的性能。
附图说明
图1为一实施方式的生物传感器的制备方法的工艺流程图；
图2为多糖分子与金属配合物所形成的一种结构示意图；
图3为图1所示的工艺流程图中步骤S140的一种示意图；
图4为实施例1所得到的扫描电镜图；
图5a为对比例1的导电浆料印刷干燥后所形成的电极结构的扫描电镜图；
图5b为在对比例1的电极结构表面涂覆生物酶后电极表面的扫描电镜图；
图6为对比例2所得到的扫描电镜图；
图7为实施例1的生物传感器对葡萄糖响应阶梯图；
图8为实施例1的生物传感器的电流与葡萄糖浓度线性关系图；
图9为实施例1的生物传感器的抗干扰测试结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将结合具体实施方式对本发明进行更全面的描述。具体实施方式中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体地实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明中，“一种或几种”指所列项目的任一种、任两种或任两种以上。其中，“几种”指任两种或任两种以上。
本发明中，涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
本发明中的词语“优选地”、“更优选地”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
当本发明中公开一个数值范围时，上述范围视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明实施例中的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或组件。
在本发明中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本发明所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
请参阅图1，一实施方式的生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
步骤S110：将多糖分子与金属配合物进行缩合反应。
其中，多糖分子具有羧基。在其中一些实施中，多糖分子选自氧化纤维素纳米晶体、氧化葡聚糖及氧化琼脂糖中的任一种或几种的组合。优选地，多糖分子为氧化纤维素纳米晶体。一方面，氧化纤维素纳米晶体的结构排列更加规律整齐，可以更好地实现金属配合物的规则摆放，进而实现生物酶的规则摆放。另一方面，纤维素纳米晶体的生物相容性较葡聚糖和琼脂糖更好，更利于应用在植入式传感器中。可以理解，在本实施方式中，对氧化纤维素纳米晶体的粒径并无特定限定。例如，氧化纤维素纳米晶体的粒径为100nm。
在一些实施例中，金属配合物具有氨基和含氮杂环基团。进一步地，金属配合物的配体具有氨基和含氮杂环基团。金属配合物中的氨基能够与多糖分子进行缩合反应，实现金属配合物的固定和规则摆放，避免金属配合物的析出，金属配合物中的含氮杂环基团能够与生物酶的氨基形成氢键，从而实现生物酶的规则摆放，分布均匀。
优选地，含氮杂环基团与氨基之间至少间隔6个碳原子。金属配合物还具有至少6个碳原子的支链取代基。金属配合物的长支链能够伸入到生物酶的活性中心，使酶反应过程中产生的电子从酶反应中心转移到电极表面，进一步提高生物传感器的性能。
在其中一些实施例中，金属配合物中的金属元素选自铁、锇及钌中的任一种或几种。上述金属元素具备6个价电子，可以与配位体形成含有6个共价键的六边形电子传递平台。
在其中一些实施例中，金属配合物中的含氮杂环基团选自2,2’-联咪唑、2,2’-联吡啶、2-(咪唑-2-基)吡啶及1,10-邻二氮杂菲中的任一种或几种。
在一个具体的示例中，金属配合物包括
具体地，金属配合物可以通过文献《Long Tethers Binding Redox Centers toPolymer Backbones Enhance Electron Transport in Enzyme“Wiring”Hydrogels》(DOI:10.1021/ja029510e)中所记载的方法制备得到。
在其中一些实施例中，先将多糖分子与金属配合物进行缩合反应的步骤中，反应温度为室温，例如室温可以为10℃～30℃。反应时间为12h～36h。
在一些实施例中，多糖分子与金属配合物的质量比为(8～16)：(1～2)。
请参阅图2，以多糖分子为氧化纤维素纳米晶体为例，多糖分子与金属配合物所形成的结构如图2所示。在图2中，A代表金属配合物中心金属原子，B代表金属配合物含氮杂环，C代表金属配合物支链，D代表氧化纤维素纳米晶体支链。
步骤S120：将缩合反应产物与生物酶、导电浆料混合，制备混合浆料。
其中，导电浆料可以为本领域常用的制备生物传感器工作电极的浆料，例如，在一个具体的示例中，导电浆料为碳浆，碳浆中含有交联剂，交联剂可以是多官能团小分子化合物，包括但不限于包括双异氰酸酯基、多异氰酸酯基的小分子化合物，或者包括双环氧基和多环氧基的小分子化合物的至少一种。具体地，导电浆料的导电物质可以为炭、石墨等。导电浆料起到传递由酶催化的待测物质氧化还原反应过程中产生的电子，从而达到测量电流值反应待测物浓度的作用。
在一些实施例中，按质量百分比计，制备混合浆料的原料包括：导电浆料80％～90％、多糖分子8％～16％、生物酶1％～2％及金属配合物1％～2％。
在一些实施例中，在混合浆料的制备原料中，导电浆料的质量百分比为80％～90％。在一个具体的示例中，导电浆料的质量百分比可以但不限于为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％或这些取值中任意两者所组成的范围。
在一些实施例中，在混合浆料的制备原料中，多糖分子的质量百分比为8％～16％。在一个具体的示例中，多糖分子的质量百分比可以但不限于为8％、9％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％、16％或这些取值中任意两者所组成的范围。
在一些实施例中，在混合浆料的制备原料中，生物酶的质量百分比为1％～2％。在一个具体的示例中，生物酶的质量百分比可以但不限于为1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％或这些取值中任意两者所组成的范围。
在一些实施例中，生物酶可以但不限于为葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸氧化酶、酮脱氢酶、酒精脱氢酶及尿酸氧化酶中的任一种。在一个具体的示例中，生物酶为葡萄糖氧化酶。生物酶的具体种类可以根据待测目标物确定。例如待测目标物为葡萄糖时，生物酶为葡萄糖氧化酶或葡萄糖脱氢酶。待测目标物为乳酸时，生物酶为乳酸氧化酶。待测目标物为酮体时，生物酶为酮脱氢酶。当待测目标物为酒精时，生物酶为酒精脱氢酶。待测目标物为尿酸时，生物酶为尿酸氧化酶。
在一些实施例中，在混合浆料的制备原料中，金属配合物的质量百分比为1％～2％。在一个具体的示例中，金属配合物的质量百分比可以但不限于为1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％或这些取值中任意两者所组成的范围。
在其中一些实施例中，步骤S120包括：先将缩合反应产物与生物酶在10℃～30℃下混合36h～72h，然后再与导电浆料混合。
通过先将金属配合物与多糖分子进行缩合反应，然后再利用金属配合物中的含氮杂环基团与生物酶的氨基形成氢键，一方面，能够实现金属配合物的固定和规则摆放，避免金属配合物的析出，进而实现生物酶的规则摆放，分布均匀。另一方面，还能够避免将金属配合物、多糖分子与生物酶同时混合，多糖分子与生物酶反应而使生物酶失活。
步骤S130：在基底表面布上混合浆料，然后在40℃～60℃下干燥15min～60min，制备工作电极。
在一些实施例中，通过丝网印刷的方式在基底表面布上混合浆料。
在传统的生物传感器的制备方法中，工作电极通常仅为在导电浆料印刷干燥后形成的电极结构上涂覆含有生物酶的传感层。一方面，该方法可能存在膜层不均一而使生物酶的含量在电极表面不同位置存在差异，从而影响传感器性能。若固酶不完全，可能使得含金属元素的小分子及有机溶剂渗出，产生微量毒性。另一方面，该传统的制备方法需进行反复涂覆以及长时间的控温控湿的固化等待时间，例如温度40℃，相对湿度90％，固化24小时。
而在本实施方式中，将生物酶和金属配合物在电极制造工艺中加以固定，低温固化不但能够保存酶的生物活性，使其结构不受高温损坏，而且利于导电浆料的固化成膜。通过先将多糖分子与金属配合物进行缩合反应，然后与生物酶、导电浆料混合，一方面使金属配合物与多糖分子通过肽键固定，防止其渗出对人体造成毒性，另一方面，金属配合物所含有的含氮杂环基团能够与生物酶所含有的氨基形成氢键，多糖分子的规则排列使得金属配合物也能够实现规则排列，进而实现生物酶的规则分布，实现电极中生物酶分布的均一化，提高电子间传递效应，提升传感性能。此外，缩合反应产物不仅能够固定生物酶，提高生物传感器电极的结构稳定性；还能够作为电子传递中介促进电子在生物酶与电极之间传递，提高传感器的性能。
在步骤S130中，生物酶作为蛋白类生物活性物质，在高温条件下会出现变性，因此其固化温度不宜过高。若浆料的固化条件需要高温，则应考虑酶的活性，调整为以保证酶生物活性的温度下，固化更长时间。若固化温度过低，或时间过短，则容易出现浆料无法固化完全的情况，从而在植入体内后容易出现物质溶解以及滤出的情况，产生一定的生物毒性，因此，在本实施方式中，在40℃～60℃下干燥15min～60min。
步骤S140：在基底表面形成对电极。
在一些实施例中，在步骤S140中，还在基底表面形成参比电极。
请一并参阅图3，在其中一些实施例中，步骤S140包括：在第一导电层212远离基底211的一侧表面形成第一绝缘层213，第一绝缘层213遮蔽部分第一导电层212，第一导电层212未被第一绝缘层213遮蔽的部分形成工作电极2201。在第一绝缘层213表面形成第二导电层214，在第二导电层214的部分表面形成第三导电层2203，在第二导电层214表面形成第二绝缘层215，并使第二导电层214的一部分区域裸露以形成对电极2202，且使第三导电层2203的至少一部分区域裸露以形成参比电极。
可以理解，在本实施方式中，对第一绝缘层、第二绝缘层的材料并无特别限定，可以为本领域常用的绝缘层材料。对第二导电层和第三导电层的材料也无特别限定，可以为本领域常用的对电极和参比电极的材料。例如，第二导电层的材料为石墨，第三导电层的材料为银/氯化银。
在一个具体的示例中，第一绝缘层、第二绝缘层、第二导电层和第三导电层可以通过将浆料进行丝网印刷的方式形成，在印刷结束后干燥固化即可。可以理解，第一绝缘层、第二绝缘层、第二导电层和第三导电层的形成方式不限于此，还可以为本领域常用的其他方式。可选地，在形成第三导电层之后还可以在第三导电层远离基底的一侧表面形成第三绝缘层。
步骤S150：在工作电极表面形成功能膜层，制备生物传感器。
在一些实施例中，功能膜层的材料选自醋酸纤维素、醋酸纤维素改性物、壳聚糖、聚氨酯、聚4-乙烯基吡啶及4-乙烯基吡啶的共聚物中的任一种或几种。
传统的生物传感器在涂覆传感层之后，还需要涂覆一层生物相容性好的抗干扰层实现对目标分子的特定识别。若生物相容性不佳，在植入人皮下后，就容易使得修复蛋白在传感器电极表面聚集，从而阻碍目标分子穿过外膜抵达内部传感层。另外，抗干扰层的抗干扰性能差，容易使得其他非目标分子的物质透过外膜，被传感识别物质识别，造成误差。在本实施方式中，由上述材料组成的功能膜层具有较好的生物相容性和抗干扰性。
优选地，功能膜层的材料选自醋酸纤维素及醋酸纤维素改性物中的任一种或两种。醋酸纤维素的改性物可以为利用醋酸纤维素中的羧基的反应接枝其他支链的改性物。醋酸纤维素具备良好的抗干扰性以及优秀的生物相容性，且能更好地与多糖分子配合。此外，以醋酸纤维素及其改性物为功能膜层的材料，醋酸纤维素的孔径易调节，在合成过程中通过调整功能化支链的链长从而能够根据检测物质的大小进行定制，从而控制物质扩散，应用场景广泛。因此，以醋酸纤维素及其改性物为材料的功能膜层同时具备抗干扰、控制物质扩散和生物相容的作用。
在其中一些实施例中，步骤S150包括：在工作电极远离基底的一侧布上含有功能材料的溶液，然后干燥，制备功能膜层。进一步地，将含有功能材料的溶液涂覆在工作电极远离基底的一侧表面，每次涂覆5s～20s，累计涂覆4次～10次，每次涂覆后在20℃～40℃下干燥5min～30min。最后一次涂覆后，在20℃～40℃下干燥12h～35h。在其中一些实施例中，在含有功能材料的溶液中，功能材料的质量百分浓度为2.5％～15％。
在一个具体的示例中，含有功能试剂的溶液所用的溶剂为乙酸和水的混合溶剂，例如，乙酸与水体积比为1:1的混合溶剂。
在其中一些实施例中，功能膜层的厚度为2μm～10μm。在一个具体的示例中，功能膜层的厚度为2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm或这些取值中任意两者所组成的范围。
可以理解，功能膜层不限于形成在工作电极表面，还可以同时形成在对电极和参比电极表面，遮蔽对电极和参比电极。
上述生物传感器的制备方法至少具有以下优点：
(1)上述生物传感器的制备方法将生物酶与导电浆料低温干燥固化，实现生物酶在工作电极的制作过程中固定，代替传统在工作电极上涂覆传感层的步骤，通过低温固化不但能够保存生物酶的生物活性，使其结构不受高温损坏，而且利于导电浆料的固化成膜。且通过先将多糖分子与金属配合物进行缩合反应，然后与生物酶、导电浆料混合，一方面使金属配合物与多糖分子通过钛肽键固定，防止其渗出对人体造成毒性，另一方面，金属配合物所含有的含氮杂环基团能够与生物酶所含有的氨基形成氢键，多糖分子的规则排列使得金属配合物也能够实现规则排列，进而实现生物酶的规则分布，实现电极中生物酶分布的均一化，提高电子间传递效应，最终提升传感性能。此外，缩合反应产物不仅能够固定生物酶，提高生物传感器电极的结构稳定性；还能够作为电子传递中介促进电子在生物酶与电极之间传递，提高传感器的性能。
(2)上述生物传感器的功能膜层使用以醋酸纤维素为主链的聚合物，具备良好的抗干扰性以及优秀的生物相容性，且能更好地与多糖分子配合。此外，以醋酸纤维素及其改性物为功能膜层的材料，醋酸纤维素的孔径易调节，在合成过程中通过调整功能化支链的链长从而能够根据检测物质的大小进行定制，应用场景广泛。
(3)上述生物传感器的制备方法将生物酶和金属配合物在电极制造工艺中加以固定，且避免了反复涂覆生物酶的操作步骤，简化了工艺，对工艺设备的要求降低。同时，由于生物酶直接混合到导电浆料中，相比反复涂覆降低了生物酶的损耗率。制备过程中，可以批量制备混合浆料，根据需要分批次取用，避免了反复涂覆工艺需要频繁启动设备和创造制备环境的弊端。
本发明提供一实施方式的生物传感器，包括：基底、工作电极和对电极。
其中，工作电极和对电极均形成在基底表面。工作电极的材料包括导电物质、金属配合物、多糖分子及生物酶。金属配合物具有氨基和含氮杂环基团，多糖分子具有氨基，金属配合物与多糖分子之间通过肽键连接，金属配合物与生物酶之间通过氢键连接。
具体的金属配合物、多糖分子及生物酶与前述相同，不再赘述。
在一些实施例中，生物传感器还包括参比电极。参比电极形成在基底表面。进一步地，工作电极、对电极和参比电极间隔分布在基底表面。
在其中一些实施例中，生物传感器的工作电极、对电极和参比电极通过如下方式形成：
在基底表面形成第一导电层，在第一导电层表面形成第一绝缘层，第一绝缘层使所述第一导电层的一部分区域裸露，第一导电层的裸露部分形成工作电极。
在第一绝缘层表面形成第二导电层，在第二导电层的部分表面形成第三导电层，在第二导电层表面形成第二绝缘层，并使所述第二导电层的一部分区域裸露以形成对电极，且使第三导电层的至少一部分区域裸露以形成参比电极。
可以理解，第一导电层的材料与工作电极的材料相同。
在一些实施例中，生物传感器还包括功能膜层。功能膜层至少形成在工作电极表面。功能膜层的材料选自醋酸纤维素、醋酸纤维素改性物、壳聚糖、聚氨酯、聚4-乙烯基吡啶及聚4-乙烯基吡啶的改性共聚物中的任一种或几种。优选地，功能膜层的材料为醋酸纤维素或醋酸纤维素改性物。
具体地，生物传感器可以通过上述实施方式的制备方法制备得到，不再赘述。
上述生物传感器至少具有以下优点：
上述生物传感器的工作电极的制备原料包括导电浆料、金属配合物、多糖分子和生物酶，金属配合物与多糖分子之间通过肽键连接，金属配合物与生物酶之间通过氢键连接，一方面金属配合物与多糖分子通过肽键固定，防止其渗出对人体造成毒性，另一方面，金属配合物所含有的含氮杂环基团能够与生物酶所含有的氨基形成氢键，多糖分子的规则排列使得金属配合物也能够实现规则排列，进而实现生物酶的规则分布，实现电极中生物酶分布的均一化，提高电子间传递效应，最终提升传感性能。此外，缩合反应产物不仅能够固定生物酶，提高生物传感器电极的结构稳定性；还能够作为电子传递中介促进电子在生物酶与电极之间传递，提高传感器的性能。
上述生物传感器具有良好的生物相容性、灵敏度、线性和抗干扰性。
本发明还提供一实施方式的生物传感器在检测葡萄糖、乳酸、酮体、酒精或尿酸中的应用。
上述生物传感器具有良好的生物相容性、灵敏度、线性和抗干扰性，可以通过调整生物传感器中生物酶的种类，用于检测葡萄糖、乳酸、酮体、酒精或尿酸等物质。
为了使本发明的目的以及优点更加清楚，以下结合具体实施例对本发明的生物传感器及其效果做进一步详细的说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不得用以限定本发明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
本实施例提供一种生物传感器，其具体的制备过程如下：
(1)按质量百分比计，称取如下原料：氧化纤维素纳米晶体：葡萄糖氧化酶：金属配合物＝80:10:10。金属配合物的结构式为
(2)将氧化纤维素纳米晶体与金属配合物混合，在常温下反应24h，然后提纯。再向提纯后的产物中加入葡萄糖氧化酶，在常温下反应48h，得到CNC导电聚合物。最后与石墨浆料混合，使混合后的石墨浆料中，CNC导电聚合物的质量百分比为10％，在基底(聚亚胺薄膜)表面进行丝网印刷，印刷结束后，在50℃下干燥30min，得到第一导电层。
(3)在第一导电层上通过丝网印刷方式的依次形成第一绝缘层(印刷浆料为UV绝缘浆料)、第二导电层(印刷浆料为石墨浆料)、第三导电层(印刷浆料为银/氯化银浆料)和第二绝缘层(印刷浆料为UV绝缘浆料)，第一绝缘层遮蔽部分第一导电层，第一导电层裸露部分形成工作电极。第二导电层形成于第一绝缘层上，第三导电层形成于第二导电层的部分区域上。第二绝缘层至少形成于第二导电层上，并使第二导电层的一部分区域裸露以形成对电极，且使第三导电层的至少一部分区域裸露以形成参比电极。
(4)将醋酸纤维素溶于乙酸/水＝1:1(体积比)的溶剂中，使醋酸纤维素的质量百分浓度为10％，涂覆10秒×6次，每次于37℃环境干燥10分钟。最后一次结束后于37℃干燥24小时，得到厚度约为5微米的功能膜层，得到本实施例的生物传感器。
实施例2
本实施例提供一种生物传感器，其具体的制备过程与实施例1相似，区别在于，在步骤(1)和步骤(2)中用氧化葡聚糖替换氧化纤维素纳米晶体。
实施例3
本实施例提供一种生物传感器，其具体的制备过程与实施例1相似，区别在于，在步骤(4)中用壳聚糖代替醋酸纤维素。
对比例1
对比例1提供一种生物传感器，其具体的制备过程如下：
(1)在基底上通过丝网印刷的方式依次形成第一导电层(材料为石墨)、第一绝缘层(印刷浆料为UV绝缘浆料)、第二导电层(材料为石墨)、第三导电层(材料为银/氯化银)和第二绝缘层(印刷浆料为UV绝缘浆料)，第一绝缘层遮蔽部分第一导电层，第一导电层裸露部分形成工作电极。第二导电层形成于所述第一绝缘层上，第三导电层形成于所述第二导电层的部分区域上。所述第二绝缘层至少形成于所述第二导电层上，并使所述第二导电层的一部分区域裸露以形成对电极，且使所述第三导电层的至少一部分区域裸露以形成参比电极。
(2)按质量百分比计，将葡萄糖氧化酶15％、金属配合物(与实施例1相同)15％和有机溶剂(具体为乙醇：水＝4:1)70％混合均匀，然后涂覆在工作电极表面，控制温度为40℃，湿度为90％，固化24h，得到厚度为3微米的传感层。
(3)将醋酸纤维素溶于乙酸/水＝1:1(体积比)的溶剂中，使醋酸纤维素的质量百分浓度为10％，涂覆10秒×6次，每次于37℃环境干燥10分钟。最后一次结束后于37℃干燥24小时，在传感层表面形成厚度约为5微米的功能膜层，得到对比例1的生物传感器。
对比例1为传统葡萄糖传感器制备方法，即前述的工作电极通常仅为在导电浆料印刷干燥后形成的电极结构上涂覆含有生物酶的传感层的传统制备方法。具体地，参见图4中显示的实施例1得到的扫描电镜图，其酶矩阵排列较为规则，反观对比例1的导电浆料仅为石墨浆料(如图5a所示)，需在电极结构上进一步实施多次涂酶工艺，对涂酶设备的一致性有很高要求，而且对于酶液的物料消耗也比较大，且由于涂覆过程中溶剂挥发等现象，无法形成均匀的膜,如图5b所示的电极表面显示的不均匀的界面。
对比例2
对比例2提供一种生物传感器，其具体的制备过程与实施例1相似，区别在于，步骤(1)和步骤(2)与实施例1不同，对比例2的步骤(1)和步骤(2)为：
(1)按质量百分比计，称取如下原料：葡萄糖氧化酶：金属配合物：交联剂＝45:45:10，金属配合物与实施例1相同，交联剂与本申请各实施例中可使用的类型一致。
(2)将金属配合物与葡萄糖氧化酶混合，在常温下反应48h。然后与石墨浆料混合，使混合后的石墨浆料中金属配合物与葡萄糖氧化酶混合产物的质量百分比为10％，在基底(聚亚胺薄膜)表面进行丝网印刷，印刷结束后，在50℃下干燥30min，得到第一导电层。
对比例2中，在混合浆料中没有加入多糖分子(如：氧化纤维素纳米晶体)，则无法形成酶矩阵，进而无法实现酶的规则排列，因此容易出现浆料中酶成分与浆料成分分散程度不均的情况，无法有效地实现对于待测物质(如：葡萄糖)的检测，即便可以获取到电化学信号，样品间一致性也无法得到有效保证。具体地，参见图4中显示的实施例1得到的扫描电镜图，其酶矩阵排列较为规则，反观图6显示的根据对比例2得到的扫描电镜图，其因无法形成酶矩阵，酶颗粒便离散不规则分布，对待测物质的检测结果无法有效获取。
对比例3
对比例3提供一种生物传感器，其具体的制备过程与实施例1相似，区别在于，步骤(1)和步骤(2)不同，对比例3的步骤(1)和步骤(2)如下：
(1)按质量百分比计，称取如下原料：氧化纤维素纳米晶体：葡萄糖氧化酶：金属配合物＝80:10:10。
(2)将氧化纤维素纳米晶体、金属配合物和葡萄糖氧化酶在常温下反应48h，得到CNC导电聚合物。然后与石墨浆料混合，使混合后的石墨浆料中，导电聚合物的质量百分比为10％，在基底(聚亚胺薄膜)表面进行丝网印刷，印刷结束后，在50℃下干燥30min，得到第一导电层。
对比例3中，同时将氧化纤维素纳米晶体、金属配合物和葡萄糖氧化酶混合反应，容易出现无法形成含有长支链的酶矩阵(如图2)的结构的情况。因此无法有效实现电子从酶的反应中心通过导电聚合物的长支链抵达电极表面，从而影响电化学信号采集。
对比例4
对比例4提供一种生物传感器，其具体的制备过程与实施例1相似，区别在于，步骤(1)和步骤(2)中所用的金属配合物不同，对比例4的金属配合物为
对比例4中，金属配合物不含有含氮杂环，不具备交替出现的单双键，无法形成能够稳定电子的共轭结构，则无法实现有效的电子传递，进而无法完成待测物质(如：葡萄糖)的检测。
对比例5
对比例5提供一种生物传感器，其具体的制备过程与实施例1相似，区别在于，步骤(2)干燥固化的工艺不同，在对比例5的步骤(2)中，在37℃下固化24h。
对比例5中，生物酶作为蛋白类生物活性物质，干燥固化的工艺中固化时间较长，容易出现生物酶变性的问题。
对上述实施例所制备的生物传感器进行测试，测试方法如下：
1、灵敏度和线性测试
将实施例1的生物传感器浸没于标准PBS缓冲液中30min，接着在0V电压下对生物传感器进行如下测量。等待10分钟，以使生物传感器达到恒定背景，然后每隔5分钟向标准PBS缓冲液中加入一定浓度葡萄糖(例：5mM葡萄糖溶液)，使被测试溶液内的葡萄糖含量依次为0mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM，测量生物传感器反应的线性。每次加入葡萄糖后使溶液平衡5分钟，且在测量过程中应连续搅拌溶液以使测量溶液的浓度均匀。测试结果如图7及图8所示。
图7中为在0V电位下，向被测试溶液中连续加入不同浓度的葡萄糖时，实施例1的生物传感器对葡萄糖响应的电流曲线，相邻两次采样间隔时间为10秒。图7中，每条曲线代表一个样品，图7中共体现了6个样品对电流的响应情况。由图7可以看出，氧化峰电流随葡萄糖的加入呈台阶式增加，每个梯度的葡萄糖响应明显且平滑，每次加样后的电流响应达到平衡的时间均小于1分钟，且不同样本间电流响应差异不大(灵敏度变异系数<10％)，侧面表明本申请的功能膜层对葡萄糖具有良好的调节扩散能力，工作电极对葡萄糖具有良好的催化氧化性能，可迅速建立氧化还原平衡。且6个样品的响应速度差异较小，说明采用实施例1的制备方案制得的生物传感器的结构稳定性良好，生物酶分布的均一化程度较高。
图8为根据图7的生物传感器对葡萄糖响应的电流曲线，所制作的生物传感器的响应电流与葡萄糖浓度的线性关系。图8中，有两个样品的线性曲线有重合。由图8可以看出，在测试浓度范围内，实施例1生物传感器的响应电流与葡萄糖的浓度呈线性关系，线性拟合度R2＞0.996。
2、抗干扰测试
将实施例1所制备的生物传感器浸没于标准PBS缓冲液中30min，接着在0V电压下对生物传感器进行如下测量。等待10分钟，以使生物传感器达到恒定背景，然后每隔5分钟向标准PBS缓冲液中加入一定浓度葡萄糖，使被测溶液内的葡萄糖浓度依次达到0mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM，记录生物传感器的响应电流。每次加入葡萄糖后使溶液平衡5分钟。记录完成后向同一溶液内加入一定浓度的干扰物质使得溶液内醋氨酚(或抗坏血酸)的浓度达到1mM(或0.2mM)，平衡5分钟后记录其响应电流。
图9为实施例1的生物传感器的抗干扰测试结果图。从图中可以看出，实施例1所制备的生物传感器对于葡萄糖响应灵敏且信号明显，而对于潜在干扰物几乎没有响应。
需要说明的是，以上测试均采用的是实施例1所制备的生物传感器，实施例2～3所制备的生物传感器具有与实施例1相当的性能，在此不再重复提供。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (14)
1.一种生物传感器，其特征在于，包括：基底、工作电极和对电极；
所述工作电极和所述对电极均形成在所述基底表面；
所述工作电极的制备原料包括导电浆料、金属配合物、多糖分子及生物酶，所述金属配合物具有氨基和含氮杂环基团，所述多糖分子具有羧基，所述氨基与所述羧基缩合形成肽键以连接所述金属配合物和所述多糖分子，所述金属配合物与所述生物酶之间通过氢键连接；
所述工作电极通过如下步骤制备：
将所述多糖分子与所述金属配合物进行缩合反应；
将缩合反应产物与所述生物酶、所述导电浆料混合，制备混合浆料；
在基底表面布上所述混合浆料以形成所述工作电极；
所述多糖分子包括氧化纤维素纳米晶体；
所述金属配合物中的含氮杂环基团选自2,2’-联咪唑、2,2’-联吡啶、2-(咪唑-2-基)吡啶及1,10-邻二氮杂菲中的任一种或几种。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述多糖分子与所述金属配合物的质量比为（8~16）：（1~2）。
3.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述金属配合物满足以下条件中的任一个或几个：
（1）所述金属配合物中的金属原子选自铁、钌及锇中的任一种或几种的组合；
（2）所述含氮杂环基团与所述氨基之间至少间隔6个碳原子。
4.根据权利要求3所述的生物传感器，其特征在于，所述金属配合物包括
。
5.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述生物酶包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸氧化酶、酮脱氢酶、酒精脱氢酶及尿酸氧化酶中的任一种。
6.根据权利要求1~5任一项所述的生物传感器，其特征在于，按质量百分比计，所述工作电极的制备原料包括：导电浆料80%~90%、多糖分子8%~16%、生物酶1%~2%及金属配合物1%~2%。
7.根据权利要求1~5任一项所述的生物传感器，其特征在于，还包括功能膜层，所述功能膜层形成在所述工作电极表面，所述功能膜层的材料选自醋酸纤维素、醋酸纤维素改性物、壳聚糖、聚氨酯、聚4-乙烯基吡啶及4-乙烯基吡啶的共聚物中的任一种或几种。
8.根据权利要求7所述的生物传感器，其特征在于，所述多糖分子包括氧化纤维素纳米晶体，所述功能膜层的材料包括醋酸纤维素及醋酸纤维素改性物中的任一种或两种。
9.一种生物传感器的制备方法，其特征在于，所述生物传感器为权利要求1~8任一项所述的生物传感器，所述制备方法包括如下步骤：
将所述多糖分子与所述金属配合物进行缩合反应；
将缩合反应产物与所述生物酶、所述导电浆料混合，制备混合浆料；
在基底表面布上所述混合浆料，然后在40℃~60℃下干燥15min~60min，制备所述工作电极；及
在所述基底表面形成所述对电极，制备所述生物传感器。
10.根据权利要求9所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述缩合反应满足以下条件中的任一个或几个：
（1）所述缩合反应的温度为10℃~30℃；
（2）所述缩合反应的时间为12h~36h。
11.根据权利要求9所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，将缩合反应产物与所述生物酶、所述导电浆料混合的步骤包括：先将所述缩合反应产物与所述生物酶在10℃~30℃下混合36h~72h，然后再与所述导电浆料混合。
12.根据权利要求9~11任一项所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，还包括：将含有功能材料的溶液涂覆在所述工作电极表面，每次涂覆5s~20s，累计涂覆4次~10次，每次涂覆后在20℃~40℃下干燥5min~30min，最后一次涂覆后，在20℃~40℃下干燥12h~36h，以在所述工作电极表面形成功能膜层；
在含有功能材料的溶液中，所述功能材料的质量百分浓度为2.5%~15%。
13.根据权利要求12所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述功能膜层的厚度为2μm~10μm。
14.如权利要求1~8任一项所述的生物传感器在检测葡萄糖、乳酸、酮体、酒精或尿酸中的应用。
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