CN112858436B - 一种生物传感器电极及其制备方法和葡萄糖生物传感器 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种生物传感器电极，包括导电电极基材和设置在导电电极基材上的修饰层；修饰层包括生物酶和聚(N‑苯基甘氨酸)衍生物，生物酶和聚(N‑苯基甘氨酸)衍生物通过酰胺键连接；聚(N‑苯基甘氨酸)衍生物包括如式(Ⅰ)所示的结构单元A：
Figure DDA0002937306370000011
该生物传感器电极具有良好的结构稳定性和生物相容性，将其作为葡萄糖生物传感器的工作电极时，可提高葡萄糖生物传感器的灵敏度、增强抗干扰性，降低检测限、增大浓度检测范围。本申请还提供了一种生物传感器电极的制备方法和葡萄糖生物传感器。

Description

一种生物传感器电极及其制备方法和葡萄糖生物传感器
技术领域
本申请涉及电化学传感器技术领域，具体涉及一种生物传感器电极及其制备方法和葡萄糖生物传感器。
背景技术
糖尿病是一种由葡萄糖代谢紊乱引起的慢性疾病。对于糖尿病患者来说，血糖的检测对糖尿病的诊断、治疗和管理具有重要的意义。葡萄糖生物传感器是将酶固定在电极上形成生物传感器电极，利用酶的催化反应将体内血糖的浓度信息转变为电流信号，从而实现对血糖的检测。然而，目前现有的生物传感器电极仍存在着工作电位高，易受其它物质干扰，检测灵敏度低、结构稳定性差以及生物相容性差的问题。因此，有必要提供一种具有低工作电位，抗干扰性强、高灵敏度、良好稳定性和生物相容性的生物传感器电极，以实现对血糖灵敏而准确的检测。
发明内容
有鉴于此，本申请提供了一种生物传感器电极，该生物传感器电极的工作电位低，具有良好的结构稳定性和生物相容性，将其作为葡萄糖生物传感器的工作电极时，可提高葡萄糖生物传感器的灵敏度、增强抗干扰性，降低检测限、增大浓度检测范围。本申请还提供了一种生物传感器电极的制备方法。
本申请第一方面提供了一种生物传感器电极，所述生物传感器电极包括导电电极基材和设置在所述导电电极基材上的修饰层；所述修饰层包括生物酶和聚(N-苯基甘氨酸)衍生物，所述生物酶和所述聚(N-苯基甘氨酸)衍生物通过酰胺键连接；所述聚(N-苯基甘氨酸)衍生物包括如式(Ⅰ)所示的结构单元A：
Figure BDA0002937306350000021
本申请的生物传感器电极在导电电极基材上设置修饰层，修饰层中的生物酶起到物质识别的作用，生物酶能够催化葡萄糖发生酶促反应，酶促反应过程会产生电活性物质，从而将葡萄糖的含量信息转变为电信号。修饰层中的聚(N-苯基甘氨酸)衍生物能够与生物酶形成酰胺键，从而固定生物酶，增强生物传感器电极的稳定性；并且聚(N-苯基甘氨酸)衍生物能够作为分子导线使电子在生物酶与导电电极基材之间传递，提高生物传感器电极的导电性；除此之外，聚(N-苯基甘氨酸)衍生物的结构中还含有联吡啶钌，联吡啶钌能够有效地降低生物传感器电极的工作电位，从而减少测量过程中其他物质的干扰，提高葡萄糖测量的准确性；最后，聚(N-苯基甘氨酸)衍生物还具有良好的生物相容性，有利于生物传感器电极在生物体中的应用。
可选地，所述聚(N-苯基甘氨酸)衍生物的聚合度为10-100。
可选地，所述结构单元A在所述聚(N-苯基甘氨酸)衍生物中的摩尔占比为1％-3％。
可选地，所述生物酶包括葡萄糖氧化酶或葡萄糖脱氢酶中的任意一种。
可选地，所述聚(N-苯基甘氨酸)衍生物与所述生物酶的质量比为1∶(0.1-10)。
可选地，所述生物传感器电极还包括保护层；所述保护层覆盖在所述修饰层表面。
可选地，所述保护层的材质包括Nafion、聚乙烯基吡啶、聚氨基甲酸酯和聚氨基甲酸酯改性材料中的一种或多种。
可选地，所述导电电极基材包括玻碳电极、金电极、银电极、铂电极、石墨电极或碳糊电极中的任意一种。
本申请第二方面提供了一种生物传感器电极的制备方法，包括以下步骤：
将聚(N-苯基甘氨酸)、三(2,2'-联吡啶)二氯化钌与第一溶剂混合，经络合反应后得到聚(N-苯基甘氨酸)衍生物；
将所述聚(N-苯基甘氨酸)衍生物、生物酶与第二溶剂混合得到修饰层溶液；
将所述修饰层溶液涂覆在导电电极基材表面，干燥后得到所述生物传感器电极。
可选地，所述聚(N-苯基甘氨酸)与所述三(2,2'-联吡啶)二氯化钌的质量比为1∶(0.1-0.7)。
可选地，所述第一溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯、四氢呋喃、1,4-二氧六环、乙二醇甲醚、乙二醇二甲醚、二乙二醇甲醚、二乙二醇二甲醚、冰乙酸和水中的一种或多种。
可选地，所述络合反应的反应温度为50℃-120℃。进一步地，所述络合反应的反应温度为80℃-100℃。
可选地，所述络合反应的反应时间为3h-72h。进一步地，所述络合反应的反应时间为10h-30h。
可选地，所述第二溶剂包括水或磷酸盐缓冲液的任意一种。
可选地，所述修饰层溶液中，所述聚(N-苯基甘氨酸)衍生物的浓度为5mg/mL-100mg/mL。
可选地，所述修饰层溶液中，所述生物酶的浓度为5mg/mL-100mg/mL。
可选地，所述聚(N-苯基甘氨酸)衍生物与所述生物酶的质量比为1∶(0.1-10)。
可选地，将所述修饰层溶液涂覆在所述导电电极基材表面时，所述修饰层溶液在所述导电电极基材表面的涂覆量为0.3μL/mm2-0.7μL/mm2。
本申请第二方面提供的生物传感器电极的制备方法，工艺简单，成本较低，制备得到的生物传感器电极具有良好的稳定性和生物相容性，对葡萄糖具有良好的响应，可作为葡萄糖生物传感器的工作电极，提高葡萄糖生物传感器的灵敏度、增强抗干扰性、降低检测限、增大浓度检测范围。
本申请第三方面提供了一种葡萄糖生物传感器，包括由工作电极、对电极和参比电极组成的三电极体系，所述工作电极包括本申请第一方面所述的生物传感器电极。
本申请第三方面提供的葡萄糖生物传感器具有良好的抗干扰性能、较高的灵敏度、较宽的线性范围以及良好稳定性和生物相容性，该葡萄糖生物传感器能够很好地应用在葡萄糖检测领域中。
附图说明
图1为本申请一实施例提供的聚(N-苯基甘氨酸)衍生物降低生物传感器电极工作电位的原理图；
图2为本申请实施例1提供的聚(N-苯基甘氨酸)的红外谱图；
图3为本申请实施例1提供的聚(N-苯基甘氨酸)衍生物的红外谱图；
图4为本申请实施例1提供的聚(N-苯基甘氨酸)的X射线荧光光谱图；
图5为本申请实施例1提供的聚(N-苯基甘氨酸)衍生物的X射线荧光光谱图；
图6为本申请实施例1提供的生物传感器电极的扫描电镜图；
图7为本申请实施例1提供的生物传感器电极的抗干扰实验结果图；
图8为本申请实施例1提供的生物传感器电极在不同浓度葡萄糖溶液中的时间-电流密度响应曲线。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请提供了一种生物传感器电极，包括导电电极基材和设置在导电电极基材表面的修饰层。本申请实施方式中，导电电极基材包括玻碳电极(GCE)、金电极、银电极、铂电极、石墨电极或碳糊电极中的任意一种。本申请一些实施方式中，导电电极基材为玻碳电极，玻碳电极具有良好的机械稳定性和高导电性。
本申请中，修饰层包括生物酶和聚(N-苯基甘氨酸)衍生物，生物酶能够催化葡萄糖发生酶促反应，酶促反应的过程中会产生电活性物质，从而将葡萄糖的含量信息转变为电信号。本申请实施方式中，生物酶包括葡萄糖氧化酶(GOx)和葡萄糖脱氢酶(GDH)。
本申请中，聚(N-苯基甘氨酸)衍生物包括如式(Ⅰ)所示的结构单元A：
Figure BDA0002937306350000051
本申请实施方式中，结构单元A在聚(N-苯基甘氨酸)衍生物中的摩尔占比为1％-3％。结构单元A在聚(N-苯基甘氨酸)衍生物中的摩尔占比具体可以但不限于为1％、1.5％、2％或3％。
本申请实施方式中，聚(N-苯基甘氨酸)衍生物是由聚(N-苯基甘氨酸)(Poly(N-phenylglycine),PPG)与三(2,2'-联吡啶)二氯化钌(联吡啶钌)络合得到的，其中，聚(N-苯基甘氨酸)的分子式为(C8H9NO2)n，聚(N-苯基甘氨酸)的结构式如下：
Figure BDA0002937306350000052
其中，n表示聚合度，n的值为10-100。本申请中，控制聚(N-苯基甘氨酸)衍生物的聚合度可以保证聚(N-苯基甘氨酸)衍生物同时具有良好的水溶性和丰富的羧基官能团。本申请实施方式中，聚(N-苯基甘氨酸)衍生物的聚合度为10-100。聚(N-苯基甘氨酸)衍生物的聚合度具体可以但不限于为10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100。聚(N-苯基甘氨酸)衍生物的聚合度过低时不利于在电极表面形成纤维状三维网络结构，不利于固定生物酶以及在电极表面形成修饰层，当聚合度过高时，聚(N-苯基甘氨酸)衍生物的水溶性差，导致生物传感器电极制备步骤繁琐，不利于电极的大规模制备。本申请一些实施方式中，聚(N-苯基甘氨酸)衍生物的聚合度为40-80。
本申请中，聚(N-苯基甘氨酸)衍生物为π-π共轭型导电聚合物，具有稳定的长链结构和良好的导电性，能够作为电子传递中介促进电子在生物酶与导电电极基材之间传递，增强电极的导电性；并且聚(N-苯基甘氨酸)衍生物具有丰富的羧基官能团，能够与生物酶充分交联，从而将生物酶固定在导电电极基材上，提高电极的结构稳定性；更重要的是，聚(N-苯基甘氨酸)衍生物中的联吡啶钌能够降低生物传感器电极的工作电位，从而提高电极的抗干扰性。除此之外，聚(N-苯基甘氨酸)衍生物还具有良好的水溶性，有利于提高工作电极的生物相容性。
本申请实施方式中，聚(N-苯基甘氨酸)衍生物的电导率为2S/cm-8×103S/cm。良好的导电性有利于电子在生物酶与导电电极基材之间传递，从而提高葡萄糖生物传感器的灵敏度。本申请中，聚(N-苯基甘氨酸)衍生物能够与生物酶在电极表面形成纤维状三维网络结构的修饰层，纤维状三维网络结构具有较大的比表面积，能够提高生物传感器电极对生物酶的负载量；并且三维网络结构有利于葡萄糖分子的扩散和传输，大大提高了柔性传感器电极的灵敏度并缩短了电极响应时间。
当生物传感器电极用于测量人体中葡萄糖浓度时，由于人体中存在多种干扰物如水杨酸、尿酸和多巴胺等，若电极的工作电位过高会导致干扰物参与到电极反应中，产生干扰信号，降低电极测量的准确性。本申请中，将聚(N-苯基甘氨酸)与联吡啶钌络合得到的聚(N-苯基甘氨酸)衍生物能够降低生物传感器电极的工作电位，从而提高电极的抗干扰性，增强测量的准确性。具体地，聚(N-苯基甘氨酸)衍生物中的联吡啶钌可作为电子媒介体参与到生物酶催化葡萄糖的酶促反应中，由于联吡啶钌的氧化还原电势低、电子传递快，从而降低了生物传感器电极的工作电位并缩短了电极的响应时间。请参阅图1，图1为本申请一实施例提供的聚(N-苯基甘氨酸)衍生物降低生物传感器电极工作电位的原理图，其中，生物传感器电极的生物酶可以是葡萄糖氧化酶(GOx)，也可以是葡萄糖脱氢酶(GDH)，Ru指的是金属钌离子，Ru(Ⅱ)表示Ru2+,Ru(Ⅲ)表示Ru3+。具体地，生物酶与葡萄糖发生酶促反应时，生物酶得电子后将电子供给氧化型的Ru3+，使Ru3+变为还原型的Ru2+，还原型的Ru2+在电极表面被电氧化为氧化型的Ru3+。在这个过程中，由于电子媒介体参与到反应中大大提高了生物酶的再生速度，并且由于钌的氧化还原电势低，其电化学再生只需要较低的电位，因此生物酶能够以较低的工作电位实现再生，从而降低生物传感器电极的工作电位。
本申请一些实施方式中，聚(N-苯基甘氨酸)衍生物中，聚(N-苯基甘氨酸)与联吡啶钌络合形成如式(Ⅰ)所示的结构单元A，聚(N-苯基甘氨酸)未与联吡啶钌络合的部位为如式(Ⅱ)所示的结构单元B：
Figure BDA0002937306350000071
本申请实施方式中，结构单元B与结构单元A的摩尔比为1∶(0.01-0.3)。结构单元B与结构单元A的摩尔比具体可以但不限于为1∶0.01、1∶0.5、1∶0.1、1∶0.15、1∶0.2、1∶0.25或1∶0.3。控制结构单元B与结构单元A的摩尔比能够保证聚(N-苯基甘氨酸)衍生物可以有效降低电极的工作电位，并且聚(N-苯基甘氨酸)衍生物能够有效地固定生物酶，提高酶的负载量。
本申请中，聚(N-苯基甘氨酸)衍生物含有大量的羧基，羧基能够与生物酶的氨基反应形成酰胺键，从而有效地固定生物酶。本申请实施方式中，聚(N-苯基甘氨酸)衍生物与生物酶的质量比为1∶(0.1-10)。聚(N-苯基甘氨酸)衍生物与生物酶的质量比具体可以但不限于为1:0.1、1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:5、1:7或1:10。本申请一些实施方式中，聚(N-苯基甘氨酸)衍生物与生物酶的质量比为1：(0.2-2)。控制聚(N-苯基甘氨酸)衍生物与生物酶的质量比能够保证聚(N-苯基甘氨酸)衍生物与生物酶充分交联，从而有效地固定生物酶，并且不影响生物酶与葡萄糖的结合，保证生物传感器电极能够快速、准确地检测葡萄糖浓度。
本申请实施方式中，修饰层的厚度为5μm-100μm。修饰层的厚度具体可以但不限于为5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm或100μm。控制修饰层的厚度能够保证生物传感器电极具有良好的导电性和较高的生物酶负载量。
本申请一些实施方式中，生物传感器电极还包括保护层。在修饰层表面设置保护层能够进一步提高电极结构的稳定性并且增强葡萄糖生物传感器的抗干扰性。本申请实施方式中，保护层的材质包括Nafion(聚四氟乙烯和全氟-3,6-二环氧-4-甲基-7-癸烯-硫酸的共聚物)、聚乙烯基吡啶(PVP)、聚氨基甲酸酯(PU)和聚氨基甲酸酯改性材料中的一种或多种。采用上述材质制得的保护层能够将组织液或血液中的干扰物阻挡在保护层外，而葡萄糖则可以透过保护层，从而减少其它物质对传感器的干扰，提高生物传感器电极测量的准确度，并延长传感器电极的使用寿命。进一步地，常见的干扰物包括尿酸、抗坏血酸、多巴胺等。本申请一些实施方式中，保护层的材质为Nafion。采用Nafion制得的保护膜具有良好的化学稳定性和机械强度，可以有效提高生物传感器电极的结构稳定性。
本申请以聚(N-苯基甘氨酸)衍生物和生物酶作为修饰层设计得到一种生物传感器电极，该生物传感器电极具有良好的稳定性和生物相容性，对葡萄糖具有良好的响应，将其作为葡萄糖生物传感器的工作电极时，可提高葡萄糖生物传感器的灵敏度、增强抗干扰性、降低检测限、缩短响应时间、扩大浓度检测范围，实现对葡萄糖浓度快速、准确的检测。
本申请还提供了上述生物传感器电极的制备方法，包括如下步骤：
步骤100：将聚(N-苯基甘氨酸)、三(2,2'-联吡啶)二氯化钌与第一溶剂混合得到反应液，经络合反应后得到聚(N-苯基甘氨酸)衍生物；
步骤200：将聚(N-苯基甘氨酸)衍生物、生物酶与第二溶剂混合得到修饰层溶液；
步骤300：将修饰层溶液涂覆在导电电极基材表面，干燥后得到生物传感器电极。
本申请中，步骤100为聚(N-苯基甘氨酸)衍生物(PPG@Ru)的制备方法。本申请实施方式中，第一溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯、四氢呋喃、1,4-二氧六环、乙二醇甲醚、乙二醇二甲醚、二乙二醇甲醚、二乙二醇二甲醚、冰乙酸和水中的一种或多种。本申请一些实施方式中，第一溶剂为乙醇。乙醇的沸点适中，反应过程具有良好的稳定性，并且易于从反应体系中除去。
本申请实施方式中，聚(N-苯基甘氨酸)在反应液中的质量百分含量为5％-50％，三(2,2'-联吡啶)二氯化钌在反应液中的质量百分含量为0.5％-30％。本申请一些实施方式中，聚(N-苯基甘氨酸)在反应液中的质量百分含量为10％-20％，三(2,2'-联吡啶)二氯化钌在反应液中的质量百分含量为1.25％-16.7％。本申请实施方式中，聚(N-苯基甘氨酸)与三(2,2'-联吡啶)二氯化钌的质量比为1∶(0.1-0.7)。聚(N-苯基甘氨酸)与三(2,2'-联吡啶)二氯化钌的质量比具体可以但不限于为1∶0.1、1∶0.2、1∶0.3、1∶0.4、1∶0.5或1∶0.7。在上述质量比范围下，所形成的聚(N-苯基甘氨酸)衍生物不仅能有效降低电极的工作电位，并且还能够有效地固定生物酶，提高酶的负载量。
本申请实施方式中，络合反应是在惰性气体保护下进行的，惰性气体可以是氮气、氦气和氩气中的一种或多种。本申请实施方式中，络合反应的反应温度为50℃-120℃。控制反应温度能够调节络合反应的反应速率。本申请实施方式中，络合反应的反应温度具体可以但不限于为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃或120℃。本申请一些实施方式中，络合反应的反应温度为80℃-100℃，在80℃-100℃的温度下，络合反应的速率适中，能够更好地控制反应进程。本申请实施方式中，络合反应的反应时间为3h-72h。络合反应的反应时间具体可以但不限于为3h、5h、10h、12h、15h、20h、24h、30h、40h、50h、60h或72h。本申请一些实施方式中，络合反应的反应时间为14h-24h。控制反应时间在上述范围内，能够保证聚(N-苯基甘氨酸)与三(2,2'-联吡啶)二氯化钌充分反应。
本申请实施方式中，在络合反应结束后将反应液冷却至室温，然后将反应液进行过滤，过滤后将滤渣用水反复洗涤，再将滤渣进行真空干燥即可得到聚(N-苯基甘氨酸)衍生物。
本申请实施方式中，制备聚(N-苯基甘氨酸)衍生物的原料中，聚(N-苯基甘氨酸)的聚合度为10-100。本申请一些实施方式中，聚(N-苯基甘氨酸)是采用以下方法制备得到的：将N-苯基甘氨酸溶于酸性水溶液中，加入引发剂和乳化剂，经聚合反应后得到聚(N-苯基甘氨酸)。其中，酸性水溶液的pH为0.1-5，引发剂包括过氧化氢、过氧化苯甲酰和过硫酸铵中的一种或多种；乳化剂包括四丁基溴化铵、四丁基氢氧化铵、聚乙二醇400、聚乙二醇1000和聚(4-苯乙烯磺酸钠)中的一种或多种。本申请实施方式中，聚(N-苯基甘氨酸)与引发剂的摩尔比为1∶(0.7-2)，聚(N-苯基甘氨酸)与乳化剂的质量比为1∶(1-50)。本申请实施方式中，聚合反应的反应温度为0℃-100℃，聚合反应的反应时间为1h-48h。
本申请实施方式中，步骤200为生物传感器电极修饰层溶液(PPG@Ru@GOx)的制备。电极修饰层溶液的制备方法具体为：将聚(N-苯基甘氨酸)衍生物和生物酶分别溶解在水或磷酸盐缓冲液(PBS)中，将两种溶液混合后静置得到修饰层溶液。采用混合和静置的方法能够使生物酶均匀地分布在聚(N-苯基甘氨酸)衍生物的三维网络结构中，从而提高生物传感器电极的灵敏度。本申请实施方式中，修饰层溶液中聚(N-苯基甘氨酸)衍生物的浓度为1mg/mL-100mg/mL，聚(N-苯基甘氨酸)衍生物的浓度具体可以但不限于为1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL或100mg/mL。
本申请实施方式中，生物酶包括葡萄糖氧化酶(GOx)和葡萄糖脱氢酶(GDH)中的任意一种。本申请实施方式中，混合溶液中生物酶的浓度为1mg/mL-100mg/mL。生物酶的浓度具体可以但不限于为1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL或100mg/mL。控制生物酶的浓度能够保证制备得到的生物传感器电极具有较高的灵敏度并且生物酶能够与聚(N-苯基甘氨酸)衍生物充分结合，不影响电极的导电性，从而保证葡萄糖生物传感器能够快速、准确地检测葡萄糖浓度。
本申请实施方式中，聚(N-苯基甘氨酸)衍生物与生物酶的质量比为1∶(0.1-10)。聚(N-苯基甘氨酸)衍生物与生物酶的质量比具体可以但不限于为1∶0.1、1∶0.5、1∶1、1∶3、1∶5、1∶7或1∶10。控制聚(N-苯基甘氨酸)衍生物与生物酶的质量比能够保证聚(N-苯基甘氨酸)衍生物与生物酶充分反应，从而有效地固定生物酶，并且不影响生物酶与葡萄糖的结合，保证葡萄糖生物传感器能够快速、准确地检测葡萄糖浓度。
本申请实施方式中，将聚(N-苯基甘氨酸)衍生物与生物酶混合后得到混合溶液，将混合溶液在0℃-30℃下静置1-15h后得到修饰层溶液。本申请一些实施方式中，混合溶液在15℃下静置2h。将聚(N-苯基甘氨酸)衍生物与生物酶的混合溶液进行静置可以使聚(N-苯基甘氨酸)衍生物与生物酶充分反应，使生物酶与聚(N-苯基甘氨酸)衍生物牢固结合，有利于形成结构稳定性良好的传感器电极。
本申请中，步骤300为生物传感器电极的制备。本申请实施方式中，导电电极基材包括玻碳电极(GCE)、金电极、银电极、铂电极、石墨电极或碳糊电极中的任意一种。本申请一些实施方式中，导电电极基材为玻碳电极，玻碳电极具有良好的机械稳定性和高导电性。
本申请实施方式中，将修饰层溶液涂覆在导电电极基材表面时，修饰层溶液在导电电极基材表面的涂覆量为0.3μL/mm2-0.7μL/mm2。本申请一些实施方式中，导电电极基材的表面积为30mm2，修饰层溶液在导电电极基材表面的涂覆量为15μL。本申请实施方式中，涂覆的方式包括滴涂或喷涂。本申请实施方式中，修饰层溶液干燥后所形成的修饰层厚度为5μm-100μm。修饰层的厚度具体可以但不限于为5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm或30μm。控制修饰层的厚度能够保证生物传感器电极具有良好的导电性和较高的生物酶负载量。本申请实施方式中，修饰层溶液干燥的温度为15℃-30℃，干燥的时间为12h-24h。
本申请一些实施方式中，在导电电极基材表面形成修饰层后还可以在修饰层表面制备保护层。在修饰层表面设置保护层能够进一步提高电极结构的稳定性并且增强葡萄糖生物传感器的抗干扰性。本申请实施方式中，保护层的材质包括Nafion(聚四氟乙烯和全氟-3,6-二环氧-4-甲基-7-癸烯-硫酸的共聚物)、聚乙烯基吡啶(PVP)、聚氨基甲酸酯(PU)和聚氨基甲酸酯改性材料中的一种或多种。本申请实施方式中，保护层的制备方法具体为：以水作为溶剂，配制质量分数为0.5wt％-2wt％的保护层溶液，将保护层溶液涂覆在修饰层表面，干燥后得到生物传感器电极。本申请实施方式中，干燥的温度为15℃-35℃，干燥的时间为10h-24h。
本申请采用聚(N-苯基甘氨酸)衍生物和生物酶作为电极修饰材料来制备生物传感器电极，由于聚(N-苯基甘氨酸)衍生物具有良好的水溶性并且能够直接与生物酶发生交联实现酶的固化，减少了添加交联剂的步骤，因此节约了工艺时间，降低了制备成本。本申请提供的生物传感器电极的制备方法操作简单，所制备出的生物传感器电极酶负载量高，具有良好的结构稳定性，将其作为工作电极应用在葡萄糖传感器时，能够实现对葡萄糖浓度快速、准确的检测，有利于实现对糖尿病患者的诊断、治疗和管理。
本申请还提供了一种葡萄糖生物传感器，该葡萄糖生物传感器采用三电极电化学体系，包括工作电极、参比电极和对电极。其中，工作电极包括本申请的生物传感器电极，参比电极包括银/氯化银电极和饱和甘汞电极，对电极为铂电极。
本申请实施方式中，葡萄糖生物传感器检测葡萄糖的线性范围是5×10-5mol/L-1×10-2mol/L。本申请实施方式中，葡萄糖生物传感器对葡萄糖的检测限为1×10-6mol/L-1×10-5mol/L。本申请一些实施方式中，葡萄糖生物传感器对葡萄糖的检测限为7×10-6mol/L。本申请实施方式中，葡萄糖生物传感器对葡萄糖的检测灵敏度为1μA·mM-1·cm-2-100μA·mM-1·cm-2。葡萄糖生物传感器对葡萄糖的检测灵敏度具体可以但不限于为1μA·mM-1·cm-2、5μA·mM-1·cm-2、10μA·mM-1·cm-2、20μA·mM-1·cm-2、30μA·mM-1·cm-2、40μA·mM-1·cm-2、50μA·mM-1·cm-2、70μA·mM-1·cm-2、80μA·mM-1·cm-2或100μA·mM-1·cm-2。本申请实施方式中，葡萄糖生物传感器检测葡萄糖的响应时间为1s-10s。葡萄糖生物传感器检测葡萄糖的响应时间具体可以但不限于为1s、2s、3.5s、5s、6s、8s或10s。
本申请提供的葡萄糖生物传感器的灵敏度高、检测范围广、响应时间短、抗干扰性强，能够实现对葡萄糖浓度快速、准确的检测，有利于实现对糖尿病患者的诊断、治疗和管理。
下面分多个实施例对本申请技术方案进行进一步的说明。
实施例1
一种葡萄糖生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
1)制备聚(N-苯基甘氨酸)
配制200mL浓度为0.5mol/L的硫酸水溶液，分别将1.15g N-苯基甘氨酸、0.65g聚乙二醇400和1.02g过氧化苯甲酰加入硫酸溶液中，在30℃下搅拌反应24h。将反应液加入透析袋，在纯化水中透析24h除去无机盐的低聚物，然后过滤除去高聚物，采用薄膜蒸发法除去滤液中的水，得到聚(N-苯基甘氨酸)，产率为85％。
2)制备聚(N-苯基甘氨酸)衍生物
将26.2mg聚(N-苯基甘氨酸)和17.2mg三(2,2'-联吡啶)二氯化钌加入200mL无水乙醇中，在氩气保护下，调节温度为85℃，回流反应12h。反应结束后将反应液降至室温，将反应液过滤后干燥得到聚(N-苯基甘氨酸)衍生物。
3)制备生物传感器电极
将20mg葡萄糖氧化酶溶解于1mL水中，加入1mL浓度为10mg/mL的聚(N-苯基甘氨酸)衍生物水溶液，充分混合后获得聚(N-苯基甘氨酸)衍生物-葡萄糖氧化酶混悬液，在4℃下放置12h；
取5μL混悬液涂覆在石墨烯电极表面(电极表面积为3.14mm2)，在25℃下自然干燥12h，用蒸馏水冲洗电极除去未结合的酶和杂质，得到生物传感器电极。
4)制备葡萄糖生物传感器
以生物传感器电极作为工作电极，铂电极作为对电极，银/氯化银电极作为参比电极组成三电极体系，再与电化学工作站相连形成葡萄糖生物传感器。
实施例2
一种葡萄糖生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
1)制备聚(N-苯基甘氨酸)
同实施例1；
2)制备聚(N-苯基甘氨酸)衍生物
将41.9mg聚(N-苯基甘氨酸)和27.5mg三(2,2'-联吡啶)二氯化钌加入100mLN-甲基吡咯烷酮中，在氩气保护下，调节温度为120℃，反应3h。反应结束后将反应液冷却至室温，将反应液过滤后干燥得到聚(N-苯基甘氨酸)衍生物。
3)制备生物传感器电极
将10mg葡萄糖氧化酶溶解于1mL磷酸盐缓冲液中，加入1mL浓度为15mg/mL的聚(N-苯基甘氨酸)衍生物水溶液，充分混合后获得聚(N-苯基甘氨酸)衍生物-葡萄糖氧化酶混悬液，在10℃下放置15h；
取4μL混悬液涂覆在石墨烯电极表面(电极表面积为3.14mm2)，在25℃下自然干燥12h，形成修饰层，然后将1wt％的聚氨基甲酸酯溶液滴覆于修饰层表面，在20℃下干燥12h，形成保护层，用蒸馏水冲洗电极除去未结合的酶和杂质，得到生物传感器电极。
4)制备葡萄糖生物传感器
以生物传感器电极作为工作电极，铂电极作为对电极，银/氯化银电极作为参比电极组成三电极体系，再与电化学工作站相连形成葡萄糖生物传感器。
实施例3
一种葡萄糖生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
1)制备聚(N-苯基甘氨酸)
同实施例1；
2)制备聚(N-苯基甘氨酸)衍生物
将100mL1,4-二氧六环和50mL水混合得到混合溶液，将20.9mg聚(N-苯基甘氨酸)和13.6mg三(2,2'-联吡啶)二氯化钌加入混合溶液中，在氩气保护下，调节温度为50℃，反应72h。反应结束后将反应液冷却至室温，将反应液过滤后干燥得到聚(N-苯基甘氨酸)衍生物。
3)制备生物传感器电极
将5mg葡萄糖氧化酶溶解于1mL水中，加入1mL浓度为10mg/mL的聚(N-苯基甘氨酸)衍生物水溶液，充分混合后获得聚(N-苯基甘氨酸)衍生物-葡萄糖氧化酶混悬液，在5℃下放置12h；
取4μL混悬液涂覆在玻碳电极表面(电极表面积为3.14mm2)，在25℃下自然干燥12h，形成修饰层，然后将1wt％的Nafion溶液滴覆于修饰层表面，在20℃下干燥12h，形成保护层，用蒸馏水冲洗电极除去未结合的酶和杂质，得到生物传感器电极。
4)制备葡萄糖生物传感器
以生物传感器电极作为工作电极，铂电极作为对电极，银/氯化银电极作为参比电极组成三电极体系，再与电化学工作站相连形成葡萄糖生物传感器。
为突出本申请的有益效果，设置以下对比例。
对比例1
1)制备生物传感器电极
将5mg葡萄糖氧化酶溶解于1mL水中，加入1mL浓度为15mg/mL的聚(N-苯基甘氨酸)水溶液，充分混合后获得聚(N-苯基甘氨酸)-葡萄糖氧化酶混合溶液，在10℃下放置10h得到修饰层溶液；
取3μL修饰层溶液涂覆在石墨烯电极表面(电极表面积为3.14mm2)，在25℃下自然干燥12h，形成修饰层，用蒸馏水冲洗电极除去未结合的酶和杂质，得到生物传感器电极。
2)制备葡萄糖生物传感器
以生物传感器电极作为工作电极，铂电极作为对电极，银/氯化银电极作为参比电极组成三电极体系，再与电化学工作站相连形成葡萄糖生物传感器。
对比例2
1)制备生物传感器电极
将20mg葡萄糖氧化酶溶解于1mL磷酸盐缓冲液中，加入1mL浓度为5mg/mL的聚苯胺混悬液，充分混合后获得聚苯胺-葡萄糖氧化酶混合溶液，在4℃下放置12h得到修饰层溶液；
取5μL修饰层溶液涂覆在石墨烯电极表面(电极表面积为3.14mm2)，在20℃下自然干燥12h，形成修饰层，然后将1wt％的Nafion溶液滴覆于修饰层表面，在20℃下干燥12h，形成保护层，用蒸馏水冲洗电极除去未结合的酶和杂质，得到生物传感器电极。不使用时，将生物传感器电极在4℃条件下保存。
2)制备葡萄糖生物传感器
以生物传感器电极作为工作电极，铂电极作为对电极，银/氯化银电极作为参比电极组成三电极体系，再与电化学工作站相连形成葡萄糖生物传感器。
效果实施例
为验证本申请制得的生物传感器电极的形貌和性能，本申请还提供了效果实施例。
1)对实施例1制得的聚(N-苯基甘氨酸)和聚(N-苯基甘氨酸)衍生物进行红外光谱表征，请参阅图2和图3，图2为本申请实施例1制得的聚(N-苯基甘氨酸)的红外谱图，图3为本申请实施例1制得的聚(N-苯基甘氨酸)衍生物的红外谱图。在图2中，2500cm-1-3500cm-1为聚(N-苯基甘氨酸)中羧酸上羟基的吸收带；1660cm-1为羰基的伸缩振动；1506cm-1和1481cm-1处的特征峰对应醌型和苯环的伸缩振动；1305cm-1处的吸收峰对应亚胺带，图2表明实施例1成功制备出了聚(N-苯基甘氨酸)。在图3中，3000cm-1-3500cm-1为聚(N-苯基甘氨酸)衍生物中羧酸上羟基的吸收带；1660cm-1为羰基的伸缩振动；660cm-1和790cm-1处的特征峰为联吡啶钌的吸收峰，图3表明实施例1成功制备出了聚(N-苯基甘氨酸)衍生物。
2)对实施例1制得的聚(N-苯基甘氨酸)和聚(N-苯基甘氨酸)衍生物进行X射线荧光光谱表征，请参阅图4和图5，图4为本申请实施例1制得的聚(N-苯基甘氨酸)的X射线荧光光谱图，图5为本申请实施例1制得的聚(N-苯基甘氨酸)衍生物的X射线荧光光谱图。由图4和图5可以看出，实施例1制得的聚(N-苯基甘氨酸)衍生物相比于聚(N-苯基甘氨酸)多了钌元素的发射峰，这表明实施例1成功制备出了聚(N-苯基甘氨酸)衍生物。
3)采用扫描电镜对实施例1中的生物传感器电极进行形貌表征，请参阅图6，图6为本申请实施例1提供的生物传感器电极的扫描电镜图，由图6可以看出生物传感器电极的修饰层为纤维状聚(N-苯基甘氨酸)衍生物交织形成的三维网络结构，该结构有利于提高生物传感器电极对生物酶的负载量，从而提高生物传感器电极的灵敏度。
4)采用循环伏安法对实施例1-3和对比例1-2的生物传感器电极的工作电位进行测定，测定结果请参阅表1。
5)通过时间电流法测定实施例1-3和对比例1-2的生物传感器电极的抗干扰性能，具体测定方法如下：取实施例1-3和对比例1-2的葡萄糖生物传感器，以pH7.0的PBS缓冲液为电解液，当电流趋于平稳时，向电解液分别加入葡萄糖(Glu)、抗坏血酸(AA)、多巴胺(DA)和尿酸(UA)，请参阅图7，图7为本申请实施例1提供的葡萄糖生物传感器的抗干扰实验结果图，由图像可以看出加入尿酸、抗坏血酸和多巴胺时，电流基本不变，而加入葡萄糖后电流信号明显增大，这表明生物传感器电极具有良好的抗干扰性能，对葡萄糖的具有良好的选择性。
6)通过计时电流法测定实施例1-3和对比例1-2的生物传感器电极的检测限。具体测定方法如下：取实施例1-3和对比例1-2的葡萄糖生物传感器，以pH7.0的PBS缓冲液为电解液，当电流趋于平稳时，向电解液体系加入低浓度的葡萄糖溶液，当电流出现变化，且电流变化值大于电流基线的波动值3倍，即信噪比大于3时，认为传感器电极对该浓度的葡萄糖有响应，依次对不同浓度的葡萄糖进行检测，将有响应的最低葡萄糖浓度设为最低检测限，结果请参阅表1。
7)通过时间电流法测定实施例1-3和对比例1-2的生物传感器电极的响应时间，具体测定方法如下：取实施例1-3和对比例1-2的葡萄糖生物传感器，以pH7.0的PBS缓冲液为电解液，在-0.35V的工作电位下通电，记录从葡萄糖溶液加入到电流变化达到峰值又落回稳态的时间间隔，该间隔即为生物传感器电极的响应时间，结果请参阅表1。
8)通过时间电流法测定实施例1-3和对比例1-2的生物传感器电极的回归曲线，具体测定方法如下：取实施例1-3和对比例1-2的葡萄糖生物传感器，以pH7.0的PBS缓冲液为电解液，在0.2V的工作电位下通电，观察电极对不同浓度葡萄糖溶液响应的电流变化，根据图像拟合回归曲线并计算线性相关系数，结果请参阅表1和图8。图8为本申请实施例1提供的生物传感器电极在不同浓度葡萄糖溶液中的时间-电流密度响应曲线，由图像拟合得到的回归方程为y＝0.674x+1.415(R2＝0.997)。
表1实施例1-3和对比例1-2葡萄糖生物传感器的性能参数表
Figure BDA0002937306350000181
由表1可以看出，本申请的葡萄糖生物传感器测定的重复性好(标准差均小于8％)，并且葡萄糖生物传感器的抗干扰性能好、灵敏度高、检测范围广、响应时间短，能够实现对葡萄糖浓度快速、准确的检测。
以上所述是本申请的优选实施方式，但并不能因此而理解为对本申请范围的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本申请的保护范围。

Claims (10)

1.一种生物传感器电极，其特征在于，所述生物传感器电极包括导电电极基材和设置在所述导电电极基材上的修饰层；所述修饰层包括生物酶和聚(N-苯基甘氨酸)衍生物，所述生物酶和所述聚(N-苯基甘氨酸)衍生物通过酰胺键连接；所述聚(N-苯基甘氨酸)衍生物包括如式(Ⅰ)所示的结构单元A：
Figure 832928DEST_PATH_IMAGE001
式(Ⅰ)。
2.如权利要求1所述的生物传感器电极，其特征在于，所述聚(N-苯基甘氨酸)衍生物的聚合度为10-100。
3.如权利要求1或2所述的生物传感器电极，其特征在于，所述结构单元A在所述聚(N-苯基甘氨酸)衍生物中的摩尔占比为1%-3%。
4.如权利要求1所述的生物传感器电极，其特征在于，所述生物酶包括葡萄糖氧化酶或葡萄糖脱氢酶中的任意一种；所述聚(N-苯基甘氨酸)衍生物与所述生物酶的质量比为1∶(0.1-10)。
5.如权利要求1所述的生物传感器电极，其特征在于，所述生物传感器电极还包括保护层；所述保护层覆盖在所述修饰层表面；所述保护层的材质包括Nafion、聚乙烯基吡啶、聚氨基甲酸酯和聚氨基甲酸酯改性材料中的一种或多种。
6.一种生物传感器电极的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将聚(N-苯基甘氨酸)、三(2,2'-联吡啶)二氯化钌与第一溶剂混合，经络合反应后得到聚(N-苯基甘氨酸)衍生物；
将所述聚(N-苯基甘氨酸)衍生物、生物酶与第二溶剂混合得到修饰层溶液；
将所述修饰层溶液涂覆在导电电极基材表面，干燥后得到所述生物传感器电极。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述聚(N-苯基甘氨酸)与所述三(2,2'-联吡啶)二氯化钌的质量比为1∶(0.1-0.7)。
8.如权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述络合反应的反应温度为50℃-120℃；所述络合反应的反应时间为3h-72h。
9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述修饰层溶液中，所述聚(N-苯基甘氨酸)衍生物的浓度为5mg/mL-100mg/mL；所述修饰层溶液中，所述生物酶的浓度为5mg/mL-100mg/mL。
10.一种葡萄糖生物传感器，包括由工作电极、对电极和参比电极组成的三电极体系，其特征在于，所述工作电极包括如权利要求1-5任一项所述的生物传感器电极。
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