CN116083432A

CN116083432A - 桑树u6启动子及其应用

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Publication number: CN116083432A
Application number: CN202310263091.7A
Authority: CN
Inventors: 何宁佳; 曾其伟; 王守长; 徐小祥; 陈苗
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2023-03-17
Filing date: 2023-03-17
Publication date: 2023-05-09
Anticipated expiration: 2043-03-17
Also published as: CN116083432B

Abstract

本发明公开了一种桑树U6启动子及其应用，所述桑树U6启动子为序列如SEQ ID NO.1所示的启动子Ma01b、序列如SEQ ID NO.2所示的启动子Ma04a、或序列如SEQ ID NO.3所示的启动子Ma04b。本发明首次从垂桑基因组中克隆得到三个桑树U6启动子，发现三个U6启动子都具有转录活性，由启动子Ma01b驱动的重组表达载体的转录活性最高，编辑效率可达11％。本发明中发现的桑树U6启动子对于构建桑树CRISPR/Cas9基因编辑体系，创制优良性状的桑树种质资源具有重要意义。

Description

桑树U6启动子及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种桑树U6启动子及其应用。

背景技术

CRISPR/Cas技术是一种广泛应用的基因编辑技术，其通过sgRNA(single guideRNA)引导特异识别基因组上的靶序列，并切割DNA产生双链断裂(DNA double-strandbreaks,DSBs)，DSBs发生后细胞通过非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)和同源重组介导的修复(homologous-directed,repair,HDR)等多种方式进行修复。在修复的过程中，大多数情况下将发生若干核苷酸的缺失或插入，是一种不精确的修改机制。人们因此是利用细胞NHEJ或HDR机制实现定点基因编辑，基因编辑技术已经成为研究基因功能和生物体改造的重要工具。

CRISPR/Cas9系统是最常用的II型CRISPR系统，识别3’端带有NGG的原间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif，PAM)基序，对特异靶序列进行平末端切割。常规的基因编辑体系由具有双链断裂能力的Cas9蛋白和人工融合的sgRNA构成，sgRNA和Cas9的表达水平显著影响基因编辑的效率。Cas9的表达一般由II型RNA聚合酶启动子如CaMV35启动子和植物泛素启动子等驱动，而sgRNA的表达则一般由III型RNA聚合酶启动子(Pol IIIpromoter of small nuclear RNA genes)如U6等启动。

U6启动子具有明确的转录启动位点，识别G开始的高度保守位点，是sgRNA表达的首选，如拟南芥、水稻、小麦、大豆、玉米、棉花、番茄、苹果、金银花等植物均已利用物种本身的U6启动子进行基因编辑。

基因组测序分析表明，物种基因组内存在多个不同的U6基因，其表达水平各不相同，并非所有U6启动子都能驱动基因表达，可见U6启动子的转录效率存在差异。U6启动子的高度保守性使其在不同的物种之间仍具转录活性，比如拟南芥U6启动子能驱动烟草sgRNA的表达，但在同源关系较远的不同物种之间转录活性存在差异。研究表明，物种内源性U6启动子能增加sgRNA表达提高基因编辑效率，如大豆U6启动子Gm6-10的对大豆基因的编辑效率远高于拟南芥AtU6启动子，棉花U6启动子GhU6.3驱动sgRNA的表达量是AtU6的6倍多，编辑效率高4倍多。

桑树是我国的乡土树种，是我国的传统中药。桑树作为一种重要的生态经济型林木，具有重要的经济价值、生态价值和医疗价值，在生态建设、乡村振兴中发挥着重要的功能。随着桑树染色体水平基因组的完成，桑树研究已进入后基因组时代，急需利用基因编辑技术阐明桑树富含脱氧野尻霉素(Deoxynojirimycin，DNJ)、花青素、蛋白质等重要性状的分子机理，创制优质种质资源实现蚕桑产业提质增效。然而，关于桑树U6启动子的研究尚未见报道，严重制约着桑树基因编辑。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种桑树U6启动子及其应用。

实现上述发明目的的技术方案包括如下。

本发明的第一方面，提供了一种桑树U6启动子，所述桑树U6启动子为序列如SEQID NO.1所示的启动子Ma01b、序列如SEQ ID NO.2所示的启动子Ma04a、或序列如SEQ IDNO.3所示的启动子Ma04b。

本发明的第二方面，提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体携带有上述桑树U6启动子。

本发明的第三方面，提供了一种转化有上述重组表达载体的工程菌。

本发明的第四方面，提供了一种桑树CRISPR/Cas9编辑载体，所述编辑载体的启动子为桑树U6启动子，所述桑树U6启动子为序列如SEQ ID NO.1所示的启动子Ma01b。

本发明的第五方面，提供了上述桑树U6启动子、重组表达载体、桑树CRISPR/Cas9编辑载体、工程菌在基因编辑或桑树育种中的应用。

本发明首次从垂桑基因组中克隆得到三个桑树U6启动子，首先构建重组表达载体，再通过农杆菌瞬时法转化烟草和桑树叶片，对叶片进行sgRNA定量表达测定，发现三个U6启动子都具有转录活性，其中Ma01b在桑树叶片中的转录活性显著高于对照AtU6-26(拟南芥启动子)，高出4倍以上。进一步通过基因编辑检测，发现由启动子Ma01b驱动的重组表达载体的转录活性最高，编辑效率可达11％。因此，本发明中发现的桑树U6启动子对于构建桑树CRISPR/Cas9基因编辑体系，创制优良性状的桑树种质资源具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例2中桑树不同MaU6启动子驱动的重组表达载体的图谱。

图2为本发明实施例3中不同MaU6启动子驱动sgRNA在烟草及桑树叶片中的瞬时表达测定结果。

图3为本发明实施例4中桑树叶片的基因编辑酶切检测结果，其中，M：BM5000+DNA标准分子量；其他泳道为样品编号。

图4为本发明实施例4中基因编辑位点的测序检测结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook等人，分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

本发明以垂桑基因组DNA为模板，采用PCR方法，从垂桑基因组中克隆并筛选出三个桑树MaU6启动子，长度分别为575bp、614bp、666bp(核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示)，从拟南芥基因组中扩增拟南芥AtU6-26启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，作为实验对照，克隆产物经验证后，将MaU6启动子连接2x35S-Cas9-2022载体，成功构建2x35S-Cas9-2022-Ma01b-MaANS、2x35S-Cas9-2022-Ma04a-MaANS、2x35S-Cas9-2022-Ma04b-MaANS和2x35S-Cas9-2022-AtU626-MaANS重组植物表达载体。通过农杆菌瞬时转化法转化烟草及桑树叶片，对叶片进行sgRNA定量PCR分析，结果表明克隆的3个桑树U6启动子在烟草及桑树叶片中的转录效率各不相同——在烟草叶片中，Ma04a、Ma04b转录活性相当，明显高于Ma01b及对照组AtU626；在桑树叶片中，Ma01b显著高于Ma04a、Ma04b和AtU626，Ma04b转录活性最低，与AtU626无明显差异，这种现象可能源于启动子在不同物种间及同一物种内的转录活性差异。进一步用筛选出的Ma01b启动子构建载体，通过农杆菌瞬时转化桑树叶片探究其在桑树中的基因编辑效率，发现基因编辑效率达到11％。因此，启动子Ma01b适用于桑树CRISPR/Cas9编辑系统，可用于启动sgRNA引导序列的表达。

Ma01b(SEQ ID NO.1)

GCAAATAAAAGAAGCAGGGGACCAAAAACAAGCAAGAGGAAGAAAAGTAAGAAATAGTAAAAAAAATAAAAAACTTTTTTTTTTAAATAAAAAACCTAGGAAACAAAGAAGCAAAAAGGTAGGAGAACCTAGAAAGCAAAAGGGAGAAAAACAAAAACAAAAATAAGGGCCTAAATGATACTAAAATTAAATAAGGGTTAGAGAGAAAAAAATAAAAATTAGAGGCTAAAAAAGTAAATAAAAGAAGAAGAGGATCAAAAAGAAGCGAGAAAGAAAAGCATAAAAAAAAAAAAAAAATGTAAAAAAAATGAAAGGAAAACGTTTTTTACTTTAAAAAAATTGGGACGAACCCTTCGGGGCTTTTATATATCATTTAGATTATATTAGATAAGAGGATGTCATGTGTAAATTTTGCGTGCAAATATTAAGTGTTGGTTCAAGGCTGATTTAGTAAGCCCATAGTATTACGGGCTATTTGGCCCATTAAGAGTTGTTGATAAGGCATGAAACTCCCACATTGCTTAGCTTCTGGGGAATCTTAGACTTTATATAGCATCGTCCTGGACACTTAGAGC

Ma04a(SEQ ID NO.2)

GATTATCACTGGTACACCATAAGTTTAAAAGCACTTATTTTGTCTTCTTGAATTTTAAATTATTTCTTATTAATTATTTTGTTGTAATTTTTGTTATAGTCAGATATAAAAAAAGAGAGTAATAATCTTTTTATTTTAATTTATACTAAAAATAAACAGATAAAAATTATATGATTACACGTAATTATTTTTTTTTTTGGTTCAGAATTCATTAAAAATACTTATAAAGATCTTAAATTGGATAAATTTTTCCGGAGTAAAATGAGACTTCTTAAAATTTAAGAGAAAAGGCGGAAATAATTCTAAAGTTAGAGATTAATCCTATGAAATATAAAGGATGAGCGTGGAATAGCGTGTGTGGCCTTGAGTCCGCTTAAAGCCCATTAGTACTGTATAGTCTCTCGGCCCATTAAAAGTCCACTATTATTAAAGCTTTTACGCAAAAAGAGTCCCACATTGCTCAACTACAGAACATTTTTAGTCTTTATATACAATCGCGTGGAGTTAGACGTTCGTCCCTTCGGGGACATCCGATAAAATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGGATGACACGCACAAATCGAGAACTAGTGGTCTCG

Ma04b(SEQ ID NO.3)

GTCATGACTATAGTCTTGCTCTTTAATCTTTATTTTTATTGTTTCAATTACCATACTTTAAAGATACATTTATATATTAATTGCATACTAAAATTTTGAAATCATATAAAAGAATGAATTCGGTTCATACTGATATAAAATTATTGTCTAATTTAATAACATTACGTACTAATAATATCTACCTAAAAATGAAGAAATATTCGTAATAAGAATTTTATTAAAGAAAGTCGAGTTAGTGGAACATCAGAATAATACACTTAGCAACCAATAAACAAAAAGAGATAAAAGGGAAAAATAAAAAATAAAAAAAGAGAGACCTGGCAGCTTATGCAACAATCTAAGGTTTGCACATAAACAAAGGAAGACACGTGCAAGCTCATGCAATATTTTTATATATCTATAGATAAAGATATAGATATAGATATGTTTTAGGAGAAAAGGCCGAAATAATCCTAAAGTTATACCAATGAGATTAATCTTATGAAATAAAAGGATGGGCGTGGAATAGCGTGTGTGGCCAGTCTGCTTAAAGCCCATCAGTGCTGTATAGTTCTCGGCCCATTAAATGTCCACTGTTGTTAAAGCTTTTACGCAAAAAGAGTCCCACATTGCTCAACTACAGAACATTTTTAGTTTTTATATACAATCGCGTGGAGTTGGACGTTC

AtU626(SEQ ID NO.4)

CGACTTGCCTTCCGCACAATACATCATTTCTTCTTAGCTTTTTTTCTTCTTCTTCGTTCATACAGTTTTTTTTTGTTTATCAGCTTACATTTTCTTGAACCGTAGCTTTCGTTTTCTTCTTTTTAACTTTCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACCTTCAAGAATTTGATTGAATAAAACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAAGGCCCCTGGGAATCTGAAAGAAGAGAAGCAGGCCCATTTATATGGGAAAGAACAATAGTATTTCTTATATAGGCCCATTTAAGTTGAAAACAATCTTCAAAAGTCCCACATCGCTTAGATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTG

在本发明的其中一些实施例中，提供了一种桑树U6启动子，所述桑树U6启动子包括序列如SEQ ID NO.1所示的启动子Ma01b、序列如SEQ ID NO.2所示的启动子Ma04a、或序列如SEQ ID NO.3所示的启动子Ma04b。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种桑树U6启动子在基因编辑或桑树育种中的应用。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种携带有上述桑树U6启动子的重组表达载体，所述桑树U6启动子用于驱动sgRNA的表达。

在其中一些实施例中，所述桑树U6启动子为Ma01b。

在其中一些实施例中，所述重组表达载体中的表达载体为2x35S-Cas9-2022。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种桑树CRISPR/Cas9编辑载体，所述载体携带上述桑树U6启动子，所述桑树U6启动子为Ma01b。

在本发明的另一些实施例中，公开了上述重组表达载体在基因编辑或桑树育种中的应用。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种转化有上述重组表达载体的工程菌。

在本发明的另一些实施例中，公开了上述工程菌在基因编辑或桑树育种中的应用。

以下实施例中所使用桑树和烟草均栽培于西南大学，鉴定为垂桑Morus albavar.Pendula、烟草Nicotiana benthamiana。实验所用2x35S-Cas9-2022载体来源于pHEE2A-TRI载体(详见“Egg cell-specific promoter-controlled CRISPR/Cas9efficiently generates homozygous mutants for multiple target genes inArabidopsis in a single generation”)，pLGNL、pGN-pcoCas9-MCS载体均来源于pCas9-GN载体(详见“Engineering canker-resistant plants through CRISPR/Cas9-targetedediting of the susceptibility gene CsLOB1 promoter in citrus”)；植物基因组DNA提取试剂盒、通用型DNA纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自广州飞扬生物工程有限公司；RNA prep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒、SuperReal荧光定量预混试剂增强版购自天根生化科技(北京)有限公司；DNA分子量MakerBM 5000+购自北京博迈德基因技术有限公司；pMD^TM19-T Vector Cloning Kit购自宝日医生物技术(北京)有限公司；Trans1-T1Phage Resistant Chemically Competent Cell购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶HindⅢ、SalI、SacII购自赛默飞世尔科技；限制性内切酶BsaI购自NEB北京有限公司；

-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit购自北京全式金生物技术有限公司；GV3101Chemically Competent Cell购自上海唯地生物技术有限公司；引物由北京擎科生物科技有限公司负责合成。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

实施例1桑树U6启动子的克隆

包括以下步骤：

1、取垂桑叶片，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取垂桑基因组DNA，分别利用设计的U6启动子引物1(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)、引物2(SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8)、引物3(SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10)(具体引物序列如表1)，进行PCR扩增。

表1

PCR反应程序为：98℃2min；98℃15s，55℃15s，72℃30s，31个循环；72℃2min；12℃保存。

反应体系为：ddH₂O 7μL、2×PrimeSTAR HS DNA Polymerase 10μL、DNA模板1μL、上下游引物(10μM)各1μL，共20μL体系。

2、采用1.1％琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，切胶回收获得目的DNA片段，分别为启动子片段Ma01b、Ma04a、Ma04b。

3、将启动子片段分别与pMD^TM19-T Vector Cloning Kit连接，T克隆反应体系为启动子片段4.5μL、pMD19-T simple vector 0.5μL、Solution I 5μL，共20μL体系，连接条件：16℃连接过夜(8h以上)。

4、转化Trans1-T1感受态细胞后挑取单克隆菌落做PCR检测，将阳性菌液送擎科生物科技有限公司测序验证，测序结果经序列比对分析，正确的质粒分别命名为pMD19-Ma01b、pMD19-Ma04a、pMD19-Ma04b。

实施例2植物重组表达载体的构建

以实施例1的质粒pMD19-Ma01b、pMD19-Ma04a、pMD19-Ma04b以及2x35S-Cas9-2022为模板，分别使用引物4(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)、引物5(SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14)、引物6(SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16)、引物7(SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18)(具体引物序列如表2所示)，扩增得到包含桑树靶基因MaANS的sgRNA的启动子序列，分别命名为Ma01bANS、Ma04aANS、Ma04bANS，以及含拟南芥启动子序列的AtU626ANS。其中，扩增体系及反应程序同实施例1。

表2

分别用HindⅢ和BsaI对载体2x35S-Cas9-2022进行双酶切，切胶回收目的载体片段，将克隆的得到的Ma01bANS、Ma04aANS、Ma04bANS和AtU626ANS通过

-BasicSeamless Cloning and Assembly Kit与回收的载体片段进行同源重组，取代2x35S-Cas9-2022载体中原来的CaMV35S启动子，分别构建得到2x35S-Cas9-2022-Ma01b-MaANS、2x35S-Cas9-2022-Ma04a-MaANS、2x35S-Cas9-2022-Ma04b-MaANS及2x35S-Cas9-2022-AtU626-MaANS重组表达载体，不同启动子驱动的重组表达载体的图谱如图1所示。

其中，同源重组反应体系为：2×BasicAssemblyMix2μL、2x35S-Cas9-2022载体1μL、启动子片段1μL，50℃反应20min后将重组产物转化Trans1-T1感受态细胞。一天后挑取单克隆菌落做PCR检测，送公司测序验证后，扩大培养正确菌液提取质粒。质粒转入农杆菌感受态GV3101，28℃倒置培养两天，挑取单克隆于YEB液体培养基(Kan50μg/mL，Rif50μg/mL)进行一次活化培养，通过菌液PCR检测质粒是否转入农杆菌中，验证正确的农杆菌菌株(即转化有重组表达载体的农杆菌)用于后续实验，并将其用50％甘油保存置于-80℃冰箱备用。

实施例3不同启动子在烟草及桑树叶片中的瞬时表达分析

取实施例2中构建的转化有2x35S-Cas9-2022-Ma01b-MaANS、2x35S-Cas9-2022-Ma04a-MaANS、2x35S-Cas9-2022-Ma04b-MaANS及2x35S-Cas9-2022-AtU626-MaANS重组表达载体的农杆菌液各100μL，于15mLYEB液体培养基中(Kan50μg/mL，Rif50μg/mL)，28℃，220rpm活化培养至菌液OD₆₀₀约0.6～0.8；5000rpm离心10min收集菌体，弃上清液，重悬于Buffer(10mmol/LMgCl₂、10mmol/LMES、200mmol/L乙酰丁香酮)，调整OD₆₀₀为1.0，室温黑暗放置3h后用1mL无针头注射器分别渗透注射到生长4～6叶期的烟草叶背面中，暗培养一天后转移到培养箱中正常生长。同时，用重悬菌液真空渗透垂桑第一对真叶(0.6kg/cm²，10min)，随后用蒸馏水洗去残留菌液，放置于培养皿中保湿黑暗培养3天。每种重组表达载体均进行3次技术重复和3次生物学重复。

三天后提取烟草、桑树叶片总mRNA，反转录后进行定量PCR分析，定量分析所用引物包括：pU-ANS、烟草内参NbGAPDH、桑树内参MaActin，具体引物序列如表3所示。

表3

结果如图2所示。在桑树实验组中，Ma04bANS与对照组相比无明显差异，Ma01bANS、Ma04aANS表达量更高，特别是Ma01bANS，与对照组相比，高出4倍以上(图2中的A)。表明启动子Ma01b显著高于Ma04a、Ma04b和AtU626，其中启动子Ma04b的转录活性最低，与拟南芥启动子AtU626无明显差异。

在烟草实验组中，Ma04aANS、Ma04bANS的表达量均显著高于对照组AtU626ANS，Ma01bANS则与对照组AtU626ANS的差别不大(图2中的B)。表明启动子Ma04a、Ma04b的转录活性相当，明显高于启动子Ma01b及拟南芥启动子AtU626。

该实施例的结果说明，克隆的3个桑树MaU6启动子均能驱动sgRNA的表达，且转录活性各不相同，其中启动子Ma01b在桑树中的转录活性最高，选择其进行后续研究。

实施例4桑树基因编辑检测

为了进一步测试筛选的启动子Ma01b对桑树基因编辑效率的影响，构建表达载体PGN-pcocas9-Ma01bANS(图谱如图1所示)，构建步骤如下：以重组表达载体2x35S-Cas9-2022-Ma01b-MaANS为模板，Ma01b-ANS-907作为引物(上游引物SEQ ID NO.25：AAGCAGGGAATTCCTGCAGGTCGA；下游引物SEQ ID NO.26：ACATGAGAATTGGGGATCCTATTGGTTTATCTCATCGG)，扩增得到Ma01b-ANS-tU626元件；将载体pGN-pcoCas9-MCS质粒用BamHI和SalI切开后，与Ma01b-ANS-tU626元件进行同源重组后转化Trans1-T1感受态细胞。测序验证后转化农杆菌GV3101，按照实施例3的方法培养并配制重悬液注射垂桑子叶和第一对真叶，用吸水纸擦去多余菌液，黑暗培养一天后正常培养。

三天后提取注射叶片基因组DNA(共34个样品)，用引物ANS(上游引物SEQ IDNO.27：CGCAAATAAAAGAAGCAGG；下游引物SEQ ID NO.28：TTGGGGGTGTGAATGAAACT)扩增目的基因MaANS的部分基因组序列，进而用限制性内切酶SacII对扩增片段进行酶切后电泳检测。如果是野生型，则该片段含有SacII酶切位点，酶切后电泳将出现141bp和467bp两条带；若发生基因编辑则该酶切位点可能会因为序列发生突变而消失，导致无法切开，电泳后呈现608bp的条带。

其中，酶切体系为：10×Fast Digest Green Buffer 2μL、SacII 0.5μL、MaANS部分基因序列PCR产物17.5μL，37℃酶切40min。

为进一步分析基因编辑的效率，选取部分未切开样品片段，切胶回收PCR产物，T克隆到pMD18载体中用于测序分析，步骤同实施例1。连接产物转化Trans1-T1感受态细胞后，挑取单克隆菌落，用引物ANS进行菌落PCR检测阳性克隆，随后用M13F通用引物送公司测序检测目标产物基因组序列。

34个叶片样品的扩增目的片段的PCR产物经SacII酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，部分样品的检测结果如图3所示，其中样品编号对应的泳道为样品PCR产物，右边泳道为对应PCR产物的SacII酶切产物。其中4个样品PCR产物(泳道19、20、D、L)未能完全切开，表明叶片中部分细胞基因组可能发生了基因编辑。

进一步用T克隆检测PCR产物序列，结果如图4所示，4个样品PCR产物(即19、20、D、L)均发生不同程度的碱基替换，编辑效率为11％(图4)。

该实施例的结果说明桑树自身启动子Ma01b具有较高的转录活性，适合用于桑树基因编辑，对于桑树CRISPR/Cas9基因组编辑体系的建立有着重要意义。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种桑树U6启动子，其特征在于，所述桑树U6启动子为序列如SEQ IDNO.1所示的启动子Ma01b、序列如SEQ ID NO.2所示的启动子Ma04a或序列如SEQ ID NO.3所示的启动子Ma04b。

2.权利要求1所述的桑树U6启动子在植物基因编辑或桑树育种中的应用。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体携带有如权利要求1所述的桑树U6启动子。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述桑树U6启动子为启动子Ma01b。

5.权利要求3或4所述的重组表达载体在植物基因编辑或桑树育种中的应用。

6.一种桑树CRISPR/Cas9编辑载体，其特征在于，所述编辑载体的启动子为桑树U6启动子，所述桑树U6启动子为序列如SEQ ID NO.1所示的启动子Ma01b、序列如SEQ ID NO.2所示的启动子Ma04a或序列如SEQ ID NO.3所示的启动子Ma04b。

7.根据权利要求6所述的桑树CRISPR/Cas9编辑载体，其特征在于，所述桑树U6启动子为启动子Ma01b。

8.权利要求6或7所述的桑树CRISPR/Cas9编辑载体在桑树基因编辑中的应用。

9.一种转化有权利要求3或4所述的重组表达载体的工程菌。

10.权利要求9所述的工程菌在植物基因编辑或桑树育种中的应用。