CN115896158A - 一种植物基因编辑中的重组载体以及利用其筛除假阳性愈伤组织的方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物基因编辑中的重组载体以及利用其筛除假阳性愈伤组织的方法和应用。该重组载体可筛除假阳性愈伤组织，重组载体中包含Rose1基因元件，是将一个AtUbi10驱动，NOS终止的含有Rose1基因元件的ARS表达框加入到T‑DNA中，与基因编辑其他元件形成一个连锁的重组载体；整个表达框序列为SEQ ID No.1。采用本发明的方案进行植物基因编辑技术创制突变体时，在抗性愈伤组织阶段通过肉眼可辨的深紫色即可判定愈伤组织是否为假阳性。假阳性愈伤组织的筛除减少了假阳性植株的出现，降低了后期对假阳性植株的栽培、检测等步骤的投入，使有效发生基因编辑植株出现的概率也进一步提高。

Description

一种植物基因编辑中的重组载体以及利用其筛除假阳性愈伤组织的方法和应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，特别涉及一种植物基因编辑中的重组载体以及利用其筛除假阳性愈伤组织的方法和应用。

背景技术

CRISPR/Cas9技术自2012年开发至今，已在基因编辑领域得到广泛应用。其构成包含人工改造的引导RNA(sgRNA)和Cas9核酸酶两个部分。基因编辑原理是在Cas9核酸酶表达框中加入核定位信号(NLS)，Cas9在细胞质中翻译后由核定位信号引导进入细胞核与sgRNA结合，sgRNA中加入20nt序列特异的引导序列，二者形成复合体，识别sgRNA中20nt特异序列互补的DNA位点，切割形成DNA双链断裂。通常情况下DNA的修复以非同源末端连接(NHEJ)方式为主，会形成短片段的Indel(碱基插入或删除)，造成靶基因的移码突变。

在植物基因编辑的实施过程中一般需要组织培养形成抗性愈伤组织，抗性愈伤组织分化形成抗性植株。组织培养过程中会存在假阳性抗性愈伤组织，假阳性抗性愈伤组织会进一步分化成假阳性植株，在大规模突变体创制中假阳性愈伤组织的出现，增加了编辑植株的筛选范围和难度，使得检测成本大幅提升。

目前现有传统的荧光蛋白、GUS、荧光素酶等基因也可以用于假阳性愈伤组织的排除筛选和T1代无T-DNA植株筛选。这些基因的检测要么需要借助昂贵仪器，要么需要特异底物做催化反应，都不适合在大规模突变体创制中的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种植物基因编辑中的重组载体以及利用其筛除假阳性愈伤组织的方法和应用，其克服了现有技术的上述缺陷,解决组培阶段存在假阳性愈伤组织的问题，促进利用基因编辑技术的大规模突变体创制。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种植物基因编辑中的重组载体，所述重组载体可筛除假阳性愈伤组织及转化株，所述重组载体中包含Rose1基因元件，是将一个AtUbi10驱动，NOS终止的含有Rose1基因元件的ARS表达框加入到T-DNA中，与基因编辑其他元件形成一个连锁的重组载体；整个表达框序列为SEQ ID No.1。

优选地，基因元件能行使基因编辑功能，Rose1基因是来源于金鱼草的MYB转录因子，用于促进植物花青素的合成。

优选地，ARS表达框能表达产生调控花青素合成的蛋白，导致植物愈伤组织中大量积累花青素，产生肉眼可见的紫色，使整个愈伤组织呈现深紫色。

一种植物基因编辑中的重组载体在筛除假阳性愈伤组织中的应用。

一种植物基因编辑中的重组载体在筛除假阳性愈伤组织中的应用，包括以下步骤：

(1)Rose1基因元件及表达框的制备：Rose1基因由AtUbi10启动子驱动，NOS终止子终止，并利用上下游各含有骨架载体两端15bp同源序列的引物PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化，获得该表达框线性化DNA片段；

(2)重组载体的构建：利用限制性内切酶KasI和HindIII双酶切骨架载体pORE-Cas9，琼脂糖凝胶电泳切胶回收纯化的线性化骨架DNA，将Rose1表达框线性化DNA与纯化的线性化骨架DNA进行重组反应；将重组产物转化进入大肠杆菌，经筛选、测序获得基因编辑重组载体pORE-Cas9/Rose1；

(3)基因敲除载体库的构建：根据靶基因的序列特异性设计出23nt特异序列以及上下游引物，PCR退火连接并转化农杆菌；

(4)基因敲除载体库转化植物外植体及抗性愈伤组织获得：利用制备的农杆菌侵染野生型烟草，诱导形成抗性愈伤组织；

(5)抗性愈伤组织的T-DNA标签筛选：提取抗性愈伤组织的基因组DNA，利用NOS终止子的特异引物进行PCR扩增，鉴定T-DNA的存在。

本发明上述技术方案，具有如下有益效果：

(1)本发明的基因编辑重组载体中包含Rose1基因元件，采用本发明的方案进行植物基因编辑技术创制突变体时，在抗性愈伤组织阶段通过肉眼可辨的深紫色即可判定愈伤组织是否为假阳性，即深紫色愈伤组织是含有T-DNA转入的阳性愈伤组织，绿色愈伤组织是无T-DNA转入的假阳性愈伤组织。假阳性愈伤组织的筛除减少了假阳性植株的出现，降低了后期对假阳性植株的栽培、检测等步骤的投入，使有效发生基因编辑植株出现的概率也进一步提高。

附图说明

被结合在说明书中并构成说明书的一部分的附图示出了本发明的实施例，并且连同其说明一起用于解释本发明的原理。

图1为本发明的Rose1基因的编辑载体培养的愈伤组织图，其中A是含Rose1基因的编辑载体培养的愈伤组织，阳性呈现紫色，假阳性呈现绿色；B是对照组培养出的愈伤组织，对照组只能生长绿色愈伤组织，不能区分阳性和假阳性。

具体实施方式

现在将参照附图来详细描述本发明的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。

以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

本发明是将一个AtUbi10驱动，NOS终止的含有Rose1基因元件的表达框(命名为ARS)加入到T-DNA中，与基因编辑其他元件形成一个连锁重组载体。基因编辑元件可以行使基因编辑功能，Rose1基因是一种金鱼草来源的MYB转录因子，它可以促进植物花青素的合成，因此ARS表达框的存在能够使整个植物体呈现深紫色，由于ARS表达框与T-DNA其他元件形成一个紧密连锁的系统，愈伤组织或植物体深紫色的有和无就能间接代表T-DNA的转入或者被筛除，ARS的应用就可以同时解决植物大规模突变体创制过程中组培阶段存在假阳性愈伤组织和T1代植株T-DNA难检测两个问题。

实施例1Rose1基因元件及表达框的制备

用于本实例1的重组载体构建的骨架载体pORE-Cas9(来自西南大学)。

Rose1基因元件及表达框的制备：

Rose1基因由AtUbi10启动子驱动，NOS终止子终止，整个表达框序列为SEQ IDNo.1，由南京金斯瑞公司合成。并利用上下游各含有骨架载体两端15bp同源序列的引物PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化，获得该表达框线性化DNA片段。

实施例2重组载体的构建

(1)利用限制性内切酶KasI和HindIII双酶切骨架载体pORE-Cas9，琼脂糖凝胶电泳切胶回收纯化的线性化骨架DNA。

(2)将实施例1中的Rose1表达框线性化DNA与(1)中纯化的线性化骨架DNA进行重组反应，反应体系如下：

(3)重组反应条件：37℃反应30min；降至4℃或立即置于冰上冷却。

(4)将重组产物转化进入大肠杆菌，经筛选、测序获得基因编辑重组载体pORE-Cas9/Rose1。

实施例3基因敲除载体库的构建

(1)靶向引物设计

根据靶基因的序列特异性设计出23nt特异序列(sgRNA)，设计方法可参照以下网站的指导说明http://crispor.tefor.net/crispor.py。分别合成上游引物(5’-GATTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’)和下游引物(5’-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’)。也就是sgRNA是任意20个碱基的序列，上游引物序列5'端接头序列是gattg(SEQ ID No.2)，下游引物5'端接头序列是aaac(SEQ ID No.3)。

(2)退火

将合成的引物稀释成浓度为100ng/μL后，上下游引物各取5μL混合至PCR管中，PCR仪退火程序为：95℃5min，-0.1℃/8s，退火至25℃。退火产物加水稀释10倍-20℃冰箱保存备用。

pORE-Cas9/Rose1骨架酶切

酶切体系(50μL)：

37℃过夜酶切，1.5％琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒(E.Z.N.A.Gel ExtractionKit)回收骨架片段。

(3)连接

退火稀释后的产物一一混合，形成混合退火产物，与酶切的pORE-Cas9/Rose1骨架载体连接，连接体系(10μL)：

16℃连接2小时，使用胶回收试剂盒(E.Z.N.A.Gel Extraction Kit)纯化连接产物，经电转化转入大肠杆菌中，形成基因敲除载体库，大量摇菌提质粒备用。

(4)转化农杆菌制备

基因敲除载体库质粒经电转化转入农杆菌LBA4404中，转化后的农杆菌均匀涂布在YEB固体培养基中，过夜培养后获得转化农杆菌。

实施例4基因敲除载体库转化植物外植体及抗性愈伤组织获得

利用制备的农杆菌侵染野生型红花大金元烟草，诱导形成抗性愈伤组织。

抗性愈伤组织的T-DNA标签筛选：提取抗性愈伤组织的基因组DNA，利用NOS终止子的特异引物进行PCR扩增，鉴定T-DNA的存在。NOS引物序列如下：

NOS-F：5’-gattgaatcctgttgccggt-3’(SEQ ID No.4)；

NOS-R:5’-gtaacatagatgacaccgcg-3’(SEQ ID No.5)。

PCR产物经1.5％浓度的琼脂糖凝胶电泳，分析是否含有NOS终止子特异213bp的条带，检测结果如下表所示：

检测结果显示：经过8个批次的转化，每个批次中都有一定比例的绿色愈伤组织出现，可能是伴随深紫色愈伤组织形成的假阳性抗性愈伤组织，这些绿色愈伤组织经检测都是阴性，深紫色愈伤组织都是阳性，说明通过PCR检测的结果与通过颜色判定的结果一致。PCR检测与颜色判定两种方法都能判定愈伤组织中是否有T-DNA插入，但通过颜色判定的方法在实际的实验操作中即可实现，更加简单、方便，几乎不存在检测成本。另外，在愈伤组织阶段排除掉假阳性愈伤组织，就会避免假阳性再生植株的出现，后期对靶位点的检测成本也会相应降低。

虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (5)

1.一种植物基因编辑中的重组载体，所述重组载体可筛除假阳性愈伤组织及转化株，其特征在于，所述重组载体中包含Rose1基因元件，是将一个AtUbi10驱动，NOS终止的含有Rose1基因元件的ARS表达框加入到T-DNA中，与基因编辑其他元件形成一个连锁的重组载体；整个表达框序列为SEQ ID No.1。

2.根据权利要求1所述的植物基因编辑中的重组载体，其特征在于，基因元件能行使基因编辑功能，Rose1基因是来源于金鱼草的MYB转录因子，用于促进植物花青素的合成。

3.根据权利要求2所述的植物基因编辑中的重组载体，其特征在于，ARS表达框能表达产生调控花青素合成的蛋白，导致植物愈伤组织中大量积累花青素，肉眼能够区分阳性愈伤组织和假阳性愈伤组织，将假阳性愈伤组织剔除能提升基因编辑素材创制效率。

4.根据权利要求1-3任一所述的植物基因编辑中的重组载体在筛除假阳性愈伤组织中的应用。

5.根据权利要求4所述的植物基因编辑中的重组载体在筛除假阳性愈伤组织中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)Rose1基因元件及表达框的制备：Rose1基因由AtUbi10启动子驱动，NOS终止子终止，并利用上下游各含有骨架载体两端15bp同源序列的引物PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化，获得该表达框线性化DNA片段；

(2)重组载体的构建：利用限制性内切酶KasI和HindIII双酶切骨架载体pORE-Cas9，琼脂糖凝胶电泳切胶回收纯化的线性化骨架DNA，将Rose1表达框线性化DNA与纯化的线性化骨架DNA进行重组反应；将重组产物转化进入大肠杆菌，经筛选、测序获得基因编辑重组载体pORE-Cas9/Rose1；

(3)基因敲除载体库的构建：根据靶基因的序列特异性设计出23nt特异序列以及上下游引物，PCR退火连接并转化农杆菌；

(4)基因敲除载体库转化植物外植体及抗性愈伤组织获得：利用制备的农杆菌侵染野生型烟草，诱导形成抗性愈伤组织；

(5)抗性愈伤组织的T-DNA标签筛选：提取抗性愈伤组织的基因组DNA，利用NOS终止子的特异引物进行PCR扩增，鉴定T-DNA的存在。

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