CN115322999A - 一种提高茄子基因编辑效率的CRISPR/Cas9载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高茄子基因编辑效率的CRISPR/Cas9载体，属于生物技术领域。本发明构建了能高效表达sgRNA的CRISPR/Cas9载体，建立了一套提高茄子基因编辑效率的CRISPR/Cas9体系。相对于现有的茄子编辑载体，本发明所构建的基因编辑载体能够更高效地对茄子基因进行定向编辑，能在茄子育种改良和基因功能研究中得以运用。

Description

一种提高茄子基因编辑效率的CRISPR/Cas9载体

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高茄子基因编辑效率的CRISPR/Cas9载体。

背景技术

茄子是我国主要的茄果类蔬菜之一。随着栽培设施和栽培技术的不断改进，现有的茄子品种已不能满足人们的需求，亟需有针对性地开展茄子新种质创制。传统的杂交育种和现代分子育种手段因育种周期长等缺点不能快速实现茄子的遗传改良。

作为基因功能研究和精准分子育种的重要手段，CRISPR/Cas9基因编辑技术已受到越来越多的关注。该技术具有操作简单，靶位点的识别广泛，灵活高效，可同时对多个靶位点进行编辑等多个优点。U6 RNA是一种小的非编码RNA，其对应的U6启动子对sgRNA的驱动转录是CRISPR/Cas9系统成功发挥编辑作用的前提之一，即U6启动子的转录活性直接影响sgRNA的表达，从而影响基因编辑效率。目前已有多个物种的U6启动子在CRISPR/Cas9系统中得到了应用。研究表明同样的U6启动子不适用于所有物种，特别是在亲缘关系较远的物种中编辑效率较低，甚至直接不适用。到目前为止尚未见适用于茄子的U6启动子的研究报道。

因此本发明克隆具有高效转录活性的茄子内源U6启动子并构建相应的CRISPR/Cas9编辑载体，从而建立高效的茄子CRISPR/Cas9基因编辑体系，对茄子的基因功能研究和遗传育种具有重要价值。

发明内容

针对上述问题，本发明探索了利用茄子U6启动子特异性的基因编辑系统对茄子实施定点编辑的技术，提供一种提高茄子基因编辑效率的CRISPR/Cas9载体。

技术方案

本发明提供了一种提高茄子基因编辑效率的CRISPR/Cas9载体，包括以下步骤：利用有较高转录活性的茄子U6-1启动子驱动sgRNA表达，得到用于编辑茄子基因的重组载体pSmP1C；所述茄子U6-1启动子序列如SEQ ID NO:1所述。

所述的U6-1启动子驱动sgRNA表达是将茄子U6-1启动子扩增后与骨架载体pP1C.4分别进行EcoRI和XbaI双酶切，双酶切后的启动子片段与载体片段经连接得到新的重组载体pSmP1C。

所述的扩增茄子U6-1启动子是将克隆出的U6-1启动子两端加上EcoRI和XbaI接头，引物为：

F2:5’_CGGAATTCGACAACATCTGCCATTGGA_3’

R2:5’_GCTCTAGAGAACTCATTACTTCGCTAGG_3’

所述的CRISPR/Cas9介导的茄子基因编辑载体中U6-1启动子可以高效启动gRNA的转录，是本发明鉴定出的具有高转录活性的茄子U6启动子。

所述的具有高转录活性的茄子U6-1启动子是构建SmU6::GUS载体，检测U6启动子的转录活性，筛选出高转录活性的U6-1启动子。

有益效果

本发明提供了一种用于转录gRNA的茄子U6启动子，这种启动子是从茄子基因组内获得的拟南芥U6基因的同源基因的启动子，可以高效地启动gRNA转录；本发明提供了一种基因编辑工具，可以对茄子进行基因编辑，与拟南芥U6-1启动子相比具有更高的编辑效率。

附图说明

图1为pSmP1C载体示意图；

图2为骨架载体pP1C.4示意图；

图3为茄子U6基因启动子的PCR扩增电泳图；

图4为实施例中WRKY4基因的一代测序图；

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案以及优点更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

S1、茄子U6启动子的克隆，其包括以下步骤：

S1-1、本发明利用拟南芥U6 RNA序列在茄子基因组中搜索U6 RNA，并找到其对应的U6启动子，设计特异性引物，引物序列为：SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:11。

S1-2、配制PCR扩增的反应体系，并按照预设反应程序完成U6启动子的扩增：具体的，所述PCR反应体系总体积为50μl，具体组成如下：

Max DNA Polymerase(TaKaRa)25μl、上下游引物(10μM)各2μl、DNA模板3μl和ddH₂O 18μl。PCR反应程序为：预变性98℃，3min；变性98℃，10s；退火56℃，10s；延伸72℃，10s；共35个循环；最后72℃延伸5min；4℃保存。

S2、茄子U6启动子转录活性鉴定，其包括以下步骤：

S2-1、利用含酶切位点为接头的引物进行U6启动子片段扩增并进行纯化，引物序列如SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:11；参照S1-2进行PCR扩增。

S2-2、对扩增到的片段和载体35S::GUS进行HindIII和BamHI双酶切。具体的酶切体系如下：HindIII和BamHI各1.5μl，10×FastDigest Buffer 5μl，PCR产物和载体质粒2μg，加水至50μl。酶切条件：37℃反应2小时，回收酶切产物。

S2-3、对酶切产物连接后利用SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:11进行菌液PCR检测和测序，测序引物为SEQ ID NO:12，即获得SmU6-1::GUS-SmU6-5::GUS。具体的连接体系如下：片段和载体酶切产物分别以5:1的摩尔比进行混合，加入1μl T4连接酶和1μl连接酶buffer，16℃过夜。

S2-4、利用电击法将构建好的SmU6::GUS融合载体转入GV3101农杆菌，并利用SEQID NO:2-SEQ ID NO:11进行菌液PCR鉴定，得到含有融合载体的菌液。

S2-5、利用注射器将菌液注射进入烟草中，共培养24h后取样。将样品放置在GUS染色液中振荡染色12h。

S2-6、用75％乙醇对染色完的叶片进行脱色，每3-4h更换一次脱色液，直至叶片绿色完全褪去。根据叶片染色情况筛选出高效转录的启动子SmU6-1。

S3、替换pP1C.4中的AtU6启动子

S3-1、扩增SmU6-1启动子，具体的，利用含酶切位点为接头的引物进行U6启动子片段扩增并进行纯化，引物序列为：SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；参照S1-2进行PCR扩增。

S3-2、对扩增到的片段和载体pP1C.4进行EcoRI和XbaI双酶切。具体的酶切体系如下：EcoRI和XbaI各1.5μl，10×FastDigest Buffer 5μl，PCR产物和载体质粒2μg，加水至50μl。酶切条件：37℃反应2小时，回收酶切产物。

S3-3、对酶切产物连接后菌液PCR和测序，测序引物为SEQ ID NO:15，进行筛选，即获得编辑载体pSmP1C。

S4、SmWRKY4靶位点引物设计

S4-1、根据CRISRP/Cas9技术的靶位点设计原则，在SmWRKY4基因第一个外显子选择gRNA靶位点，序列为：5’-CAGCTCCAAATCAGCCGTAC-3’。

S4-2、根据靶位点序列设计用于扩增以拟南芥U6启动子驱动sgRNA表达的sgRNA克隆框引物为：SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17。

S4-3、根据靶位点序列设计用于扩增以茄子内源U6启动子驱动sgRNA表达的sgRNA克隆框引物为：SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19。

S5、使用高保真DNA聚合酶，以pSmP1C载体为模板，SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17为引物，PCR扩增获得含有AtU6启动子、SmWRKY4靶位点的sgRNA的克隆框。

S6、使用高保真DNA聚合酶，以pSmP1C载体为模板，SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19为引物，PCR扩增获得含有SmU6启动子、SmWRKY4靶位点的sgRNA的克隆框。

S7、将两种sgRNA克隆框产物进行纯化后，对产物和pSmP1C进行EcoRI和XbaI双酶切，凝胶电泳后割胶回收酶切产物。

S8、利用重组酶将线性化载体和回收到的sgRNA克隆框片段进行重组，菌液PCR检测并送测序，测序所用引物为SEQ ID NO:15，得到针对SmWRKY4基因的载体pP1C.4-SmWRKY4载体和pSmP1C-SmWRKY4载体。

S9、利用电击转化法分别将pP1C.4-SmWRKY4和pSmP1C-SmWRKY4转化至农杆菌株系EHA105感受态细胞，并进行筛选鉴定。

S10、在超净工作台上，先用75％的乙醇浸泡茄子种子30s后，用10％NaClO消毒20min，无菌水冲洗种子5次，确保洗去残留消毒液。将茄子种子接种于1/2MS培养基中，28℃黑暗条件下培养至萌发，转入光照培养。

S11、种子萌发后10天子叶完全展开，用刀片将子叶切成4mm×4mm的外植体小段，将子叶正面朝上置于共培养培养基中预培养1d。

S12、将含有编辑载体的农杆菌在含抗生素的YEP培养基上划板，挑取单菌落接种于含有抗生素的YEP液体培养基中，28℃，200r/min过夜培养至OD₆₀₀为1.0。4000r/min离心10min，倒出上清，加入含有200μM乙酰丁香酮的液体培养基进行重悬至OD₆₀₀为0.2-0.3。

S13、将外植体浸泡在悬浮液中，并轻轻晃动培养皿，暗下侵染5min。待外植体表面残留的菌液吸干，将外植体背面朝上置于共培养培养基，避光共培养2d。

S14、共培养2d后，将外植体转入愈伤诱导培养基上，诱导愈伤。

S15、2周后将愈伤组织转入芽诱导培养基上进行芽诱导，直至芽伸长至1cm，将芽切下放入RMS培养基进行生根。诱导芽期间每2周进行一次继代。最终得到17株基于茄子U6驱动sgRNA的再生植株，18株基于拟南芥U6启动子驱动sgRNA的再生植株。

S16、利用CTAB法提取再生植株基因组DNA，进行PCR验证和测序；具体步骤如下：利用Cas9的检测引物Cas9-F:5’_AAGCCCATCAGAGAGCAGG_3’和Cas9-R:5’_TGTCGCCTCCCAGCTGAG_3’进行PCR反应，反应体系：PCR mix 10μl,引物各1μl，DNA 1μl，ddH₂O 7μl；反应程序为：94℃，3min；94℃，30s，56℃，30s，72℃，20s，28个循环；72℃延伸5min，4℃保存；最终获得15株基于茄子U6驱动sgRNA的阳性再生植株，14株基于拟南芥U6启动子驱动sgRNA的阳性再生植株。

S17、在靶位点上下游分别设计引物SmWRKY4-F:5’_CGGCATTGAACAGTACCAGA_3’和SmWRKY4-R:5’_CCAGATGTCAGCCTCCATTT_3’，进行PCR反应，反应体系和程序同S1-2，将PCR产物纯化后送样测序，测序结果显示在基于茄子U6驱动sgRNA的阳性再生植株中有4株为基因编辑植株，因此编辑效率为27％，而基于拟南芥U6启动子驱动sgRNA的阳性再生植株中3株为基因编辑植株，编辑效率为21％。如图所示部分测序结果，经分析发现，基于茄子U6驱动sgRNA的突变株系1#和2#分别存在1bp碱基和2bp碱基缺失，株系3#存在1bp插入，而株系4既有缺失又有置换。此结果说明相对于拟南芥U6启动子，茄子内源U6启动子更能高效驱动sgRNA，从而得到更多的gRNA靶位点定点突变的植株。

以上所述仅为本发明专利的具体实施案例，但任何参照本发明申请专利所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。

　序列表

江苏省农业科学院

一种提高茄子基因编辑效率的CRISPR/Cas9载体

　　SEQ ID NO: 1

　　茄子U6-1 启动子序列

　　GACAACATCTGCCATTGGATGACATAATGTTTATTTGTCTAGCTTGTATTTTTTTTTAACTCCTTTTAAAAATATTCATTTCATTAATTATATTTTAAAATTTTAATTAGATTATTAGAAAGTATAAAAATAATTATTTAATATTAAAGGTAGAATAAAGGACTTAGTTCTTTCTCAATTTGTAAAAATAAGTAAGTAAAATAATTTTTTTTTTTTTTTAGTATTCTAAACAAATAAATAAAAAAAGAAATGTGGAAGTTGGTCCTTGCGGAATTGTTTATGTTGAGTCTTTATAGGACGAAATGTTTTGTTTCGGAAACTTAAGGACCACATTTAGTTTCTTTTAGTTTCTCCCACATCGAGTCTGGAGAGAAGTTTACAGCACGATAAGAAACCCTAGCGAAGTAATGAGTTC

　　SEQ ID NO: 2

　　茄子U6-1克隆正向引物：

　　5’_CCCAAGCTTGACAACATCTGCCATTGGA_3’

　　SEQ ID NO: 3

　　茄子U6-1克隆反向引物：

　　5’_CGGGATCCGAACTCATTACTTCGCTAGG_3’

　　SEQ ID NO: 4

　　茄子U6-2克隆正向引物：

　　5’_CCCAAGCTTTCTCATTGTATTGCGTCGAA_3’

　　SEQ ID NO: 5

　　茄子U6-2克隆反向引物：

　　5’_CGGGATCCGAACTCCTTTACTTCGCTAA_3’

　　SEQ ID NO: 6

　　茄子U6-3克隆正向引物：

　　5’_CCCAAGCTTACGAACCAATTGATGCACAC_3’

　　SEQ ID NO: 7

　　茄子U6-3克隆反向引物：

　　5’_CGGGATCCGAACTCATTACTTCGCTAGG_3’

　　SEQ ID NO: 8

　　茄子U6-4克隆正向引物：

　　5’_CCCAAGCTTGTACTAGATCAGCGAGATC_3’

　　SEQ ID NO: 9

　　茄子U6-4克隆反向引物：

　　5’_CGGGATCCGAACTCCAATACTTCGCTAG_3’

　　SEQ ID NO: 10

　　茄子U6-5克隆正向引物：

　　5’_CCCAAGCTTCACGATGCCCTAT_3’

　　SEQ ID NO: 11

　　茄子U6-5克隆反向引物：

　　5’_CGGGATCCCGATACGTAACGCCTGGC_3’

　　SEQ ID NO: 12

　　用于构建SmU6-P::GUS载体的测序引物

　　GUS5’-reverse：5’_AATATCTGCATCGGCGAACT_3’

　　SEQ ID NO: 13

　　茄子U6-1替换AtU6扩增所用正向引物F2：

　　5’_CGGAATTCGACAACATCTGCCATTGGA_3’

　　SEQ ID NO: 14

　　茄子U6-1替换AtU6扩增所用正向引物R2：

　　5’_GCTCTAGAGAACTCATTACTTCGCTAGG_3’

　　SEQ ID NO: 15

　　茄子U6-1替换AtU6后载体测序引物和靶序列插入后的测序引物

　　gRNA-R：5’_AGCACCGACTCGGTGCCAC_3’

　　SEQ ID NO: 16

　　基于AtU6的sgRNA扩增所用正向引物：

　　5’_CAGGAAACAGCTATGACCATATTCATTCGGAGTTTTTGTATC_3’

　　SEQ ID NO: 17

　　基于AtU6的sgRNA扩增所用反向引物：

　　5’_GCTATTTCTAGCTCTAAAACGTACGGCTGATTTGGAGCTGCAATCACTACTTCGACTCT_3’

　　SEQ ID NO: 18

　　基于SmU6-1的sgRNA扩增所用正向引物：

　　5’_CAGGAAACAGCTATGACCATATTCGACAACATCTGCCATTGG_3’

　　SEQ ID NO: 19

　　基于SmU6-1的sgRNA扩增所用反向引物：

　　5’_GCTATTTCTAGCTCTAAAACGTACGGCTGATTTGGAGCTGCGAACTCATTACTTCGCTA_3’

　　SEQ ID NO: 20

　　用于遗传转化植株Cas9检测正向引物

　　Cas9-F: 5’_AAGCCCATCAGAGAGCAGG_3’

　　SEQ ID NO: 21

　　用于遗传转化植株Cas9检测反向引物

　　Cas9-R: 5’_TGTCGCCTCCCAGCTGAG_3’

　　SEQ ID NO: 22

　　用于遗传转化植株目的基因WRKY4扩增的正向引物

　　SmWRKY4-F: 5’_CGGCATTGAACAGTACCAGA_3’

　　SEQ ID NO: 23

　　用于遗传转化植株目的基因WRKY4扩增的反向引物

　　SmWRKY4-R: 5’_CCAGATGTCAGCCTCCATTT_3’

Claims (4)

1.一种提高茄子基因编辑效率的CRISPR/Cas9载体，其特征在于，茄子内源U6-1启动子驱动sgRNA的表达。

2.根据权利要求1所述，载体构建步骤如下：以pP1C.4载体为骨架，将SmU6-1启动子替换pP1C.4中的拟南芥U6启动子，得到适用于茄子的基因编辑载体，命名为pSmP1C，茄子U6-1启动子的序列如SEQ ID NO:1所示，所述的茄子U6-1启动子是与拟南芥U6基因同源的茄子U6-1基因启动子序列进行再克隆得到的序列，所述克隆过程中引物序列为：

F1:5’_GACAACATCTGCCATTGGA_3’

R1:5’_GAACTCATTACTTCGCTAGG_3 。

3.根据权利要求2所述的方法，茄子U6-1启动子替换pP1C.4中的拟南芥U6启动子，具体步骤是扩增茄子U6-1启动子后对扩增产物和pP1C.4载体分别进行EcoRI和XbaI酶切，酶切产物连接，得到编辑载体pSmP1C；茄子U6-1启动子扩增引物：

F2:5’_CGgaattcGACAACATCTGCCATTGGA_3’

R2:5’_GCtctagaGAACTCATTACTTCGCTAGG_3’。

4.权利要求1所述的提高茄子基因编辑效率的CRISPR/Cas9载体在茄子中进行基因编辑的应用。

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