CN116076364A - 一种淫羊藿不定芽诱导及快速增殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种淫羊藿不定芽诱导及快速增殖的方法，包括以下步骤：S1.种子萌发；S2.幼苗获得；S3.子叶节消毒；S4.不定芽诱导培养；S5.芽增殖培养.本发明采用淫羊藿的子叶节为外植体，不经过愈伤组织，通过丛生芽途径建立淫羊藿的快速增殖体系；结合种子萌发、消毒、诱导培养与增殖培养建立淫羊藿的快速增殖无菌体系，降低污染率，提高淫羊藿的产量及质量；整个流程简单，繁殖周期短，种子发芽率最高可达97%，诱导率最高可达68.75%，增殖系数最高可达2.33，为淫羊藿种苗繁育及规模化繁殖提供技术指导，解决了淫羊藿种子发芽率低，发芽周期长而导致的育苗难的问题，对保护淫羊藿野生资源，实现可持续利用具有积极作用。
Description
技术领域
本发明属于药用植物组织培养技术领域，具体涉及一种淫羊藿不定芽诱导及快速增殖的方法。
背景技术
淫羊藿（Epimedium brevicornum）又名仙灵脾、三枝九叶草、羊合草，为双子叶植物类群小檗科淫羊藿属植物，全草均具有药用价值，其味辛、甘，性温，是中国传统的补益类中药材，具有温补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效。现代医学研究发现了其许多新的药理作用，比如抗衰老、促进骨骼生长、改善造血系统障碍、增强机体免疫力、抗肿瘤、抗病毒等作用，极具开发价值。当前淫羊藿的市场需求量巨大，主要以采挖野生资源方式获得，随着采挖量增大，野生淫羊藿资源不断减少，非常不利于资源的再生和可持续利用。因此建立淫羊藿人工栽培和快速繁殖技术就显得迫在眉睫。
自然条件下，淫羊藿主要以种子繁殖和分株繁殖为主。种子繁殖萌发率极低且发芽周期长，分株繁殖容易导致品种退化，两者都非常不利于淫羊藿的规模化种植。采用组织培养的方式，在保留母本优良性状的同时能够大量繁殖，有利于保护淫羊藿野生种质资源。相关技术中，可利用淫羊藿外植体诱导出愈伤组织，通过愈伤组织诱导不定芽从而获得淫羊藿的组培苗。但是，通过愈伤组织诱导不定芽获得淫羊藿的组培苗的方式，遗传稳定性不佳，容易发生变异，不利于保持药用植物的特定性状。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于，提供一种淫羊藿不定芽诱导及快速增殖的方法，通过该方法以淫羊藿幼苗子叶节为外植体进行组织培养，使用淫羊藿的直接器官发生途径，不经过愈伤组织，直接诱导不定芽，进而增殖培养获得丛生芽，不仅能够大量繁殖淫羊藿，而且具有良好的遗传稳定性，不容易发生变异，能够有效地保持淫羊藿的特定药用性状。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种淫羊藿不定芽诱导及快速增殖的方法，包括以下步骤：
S1.种子萌发：将淫羊藿种子去除杂质，然后选择充分成熟、饱满完整的种子，用流水冲洗1h之后，将种子消毒后沙藏保鲜，期间注意保湿和消毒，3-5个月种子陆续发芽。
S2.幼苗获得：将萌发的淫羊藿种子播于腐殖土的小花盆培养，待淫羊藿幼苗长出真叶，备用。
S3.子叶节消毒：将幼苗切去子叶，（截）取子叶附着点以下长度为0.5 cm的子叶节作为外植体，用流水冲洗30 min后，在超净工作台中，消毒处理。
S4.不定芽诱导培养：将消毒的子叶节接种到诱导培养基上培养，在温度为25 ℃，光照强度为2300-2500 lx，光照时长为12 h/d的条件下培养，得到淫羊藿不定芽。
S5.芽增殖培养：切取单个芽点，接种到增殖培养基上培养，在温度为25℃，光照强度为2300-2500 lx，光照时长为12 h/d的条件下培养，得到淫羊藿丛生芽。
进一步的，在步骤S1中，所述将种子消毒后沙藏保鲜的步骤为：喷洒0.1 %多菌灵对种子消毒后，将种子与含水率为55 %-60 %细河沙按1：3的比例混匀，之后在4 ℃的冷藏室内沙藏保鲜。
进一步的，在步骤S2中，所述淫羊藿种子播入小花盆内后，在环境温度为20 ℃，土壤湿度为25 %-30 %，空气相对湿度为70 %-80 %，光照强度为2000 lx，光照时长为12 h/d的条件下培养。
进一步的，在步骤S3中，所述消毒处理具体为：将取得的子叶节，先用75 %酒精消毒30 s，无菌水冲洗3次，再用0.1 %氯化汞消毒5 min，无菌水冲洗5次。
进一步的，在步骤S4中，所述诱导培养基为：MS/WPM/B5 +0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L6-BA+7 g/L琼脂+30 g/L蔗糖，调节pH为5 .8。
进一步的，在步骤S5中，所述增殖培养基为：MS/WPM/B5+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L6-BA + 0.5 mg/L GA3+7 g/L琼脂+30g/L蔗糖，调节pH为5.8。
在本发明中：
所述MS是指多数植物组织培养快速繁殖用的基本培养基。
所述WPM是指根据MS培养基改良的培养基，使用了硫酸钾替换了KNO3，NH4NO3的含量也降低到了MS培养基的1/4，氮盐也主要以硝酸钙的形式供应。
所述B5是指含有较低的铵，主要用于培养双子叶植物的培养基。
所述NAA是指a-萘乙酸，能促进细胞分裂与伸长。
所述6-BA是指6-苄氨基嘌呤，促进芽的形成。
所述GA3是指赤霉素，能促进植株生长，同时对植株的增殖倍数等方面也有一定的促进作用。
另：
种子发芽率=发芽种子粒数/供试种子粒数×100%。
不定芽诱导率=诱导不定芽数/接种子叶节数×100%。
丛生芽增殖系数=增殖芽数/接种芽数。
本发明采用淫羊藿的子叶节为外植体，不经过愈伤组织，通过丛生芽途径建立淫羊藿的快速增殖体系；结合种子萌发、消毒、诱导培养与增殖培养建立淫羊藿的快速增殖无菌体系，降低污染率，提高淫羊藿的产量及质量；整个流程简单，繁殖周期短，种子发芽率最高可达97 %，诱导率最高可达68.75%，增殖系数最高可达2.33，为淫羊藿种苗繁育及规模化繁殖提供技术指导，解决了淫羊藿种子发芽率低，发芽周期长而导致的育苗难的问题，对保护淫羊藿野生资源，实现可持续利用具有积极作用。
附图说明
图1为本发明淫羊藿低温沙藏种子萌发时的示意图；
图2为本发明淫羊藿实生苗的示意图；
图3为本发明外植体淫羊藿子叶节的示意图；
图4为本发明淫羊藿不定芽诱导情况的示意图；
图5为本发明淫羊藿丛生芽增殖情况的示意图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
需要说明的是，术语“包括”或者任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包含一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
实施例：
本实施例提供一种淫羊藿不定芽诱导及快速增殖的方法，包括以下步骤：
S1.种子萌发：将淫羊藿种子去除杂质，然后选择充分成熟、饱满完整的种子，用流水冲洗1h之后，喷洒0.1 %多菌灵对种子消毒，然后将消毒后的种子分成三组，即A组、B组、C组，将三组种子分别与含水率为55 %-60 %细河沙混匀，其中A组与细河沙的混匀比例为1：3，B组与细河沙的混匀比例为1：4，C组与细河沙的混匀比例为1：5，之后分别放入4 ℃的冷藏室内沙藏保鲜（如图1所示），期间注意保湿和消毒，3-5个月种子陆续发芽，5个月后统计各组种子发芽率。
统计结果见表1：
表1种子发芽率统计
| 序号 | 种子沙藏保鲜条件， | 发芽率（%） |
| A组 | 消毒后的种子与含水率为55 %-60 %细河沙的比例为1：3，温度4℃ | 97.0 |
| B组 | 消毒后的种子与含水率为55 %-60 %细河沙的比例为1：4，温度4℃ | 85.91 |
| C组 | 消毒后的种子与含水率为55 %-60 %细河沙的比例为1：5，温度4℃ | 72.52 |
由表1可知，A组的种子发芽率最高，达到了97.0%，效果最佳，故采用将消毒后的种子与含水率为55 %-60 %细河沙按1：3的比例混匀，之后在4 ℃的冷藏室内沙藏保鲜。
S2.幼苗获得：将萌发的淫羊藿种子播于腐殖土的小花盆内，在环境温度为20 ℃，土壤湿度为25 %-30 %，空气相对湿度为70 %-80 %，光照强度为2000 lx，光照时长为12 h/d的条件下培养，待淫羊藿幼苗长出真叶（如图2所示），备用。
S3.子叶节消毒：将幼苗切去子叶，（截）取子叶附着点以下长度为0.5 cm的子叶节作为外植体（幼苗子叶节如图3所示），用流水冲洗30 min后，在超净工作台中，先用75 %酒精消毒30 s，无菌水冲洗3次，再用0.1 %氯化汞消毒5 min，无菌水冲洗5次。
S4.不定芽诱导培养：
预制三组诱导培养基，即1号诱导培养基、2号诱导培养基、3号诱导培养基备用，其中，
1号诱导培养基为：MS+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+7 g/L琼脂+30 g/L蔗糖，调节pH为5 .8；
2号诱导培养基为：WPM+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+7 g/L琼脂+30 g/L蔗糖，调节pH为5 .8；
3号诱导培养基为：B5+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+7 g/L琼脂+30 g/L蔗糖，调节pH为5 .8；
接着将消毒的子叶节分别接种到上述三组诱导培养基上，然后都在温度为25 ℃，光照强度为2300-2500 lx，光照时长为12 h/d的条件下培养，以得到淫羊藿不定芽（如图4所示），接种21 d后统计诱导率。
统计结果表2所示：
表2 不同诱导培养基结果统计
| 序号 | 培养基配方 | 诱导率（%） |
| 1 | MS +0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+7 g/L琼脂+30 g/L蔗糖L | 68.75 |
| 2 | WPM+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+7 g/L琼脂+30 g/L蔗糖 | 61.11 |
| 3 | B5+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+7 g/L琼脂+30 g/L蔗糖 | 43.75 |
由表2可知，1号诱导培养基的诱导率最高，达到了68.75%，其不定芽诱导培养效果最佳，故不定芽诱导培养选用1号诱导培养基。
S5.芽增殖培养：
预制三组增殖培养基，即1号增殖培养基、2号增殖培养基、3号增殖培养基备用，其中，
1号增殖培养基为：MS+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L GA3+7 g/L琼脂+30g/L蔗糖，调节pH为5 .8；
2号增殖培养基为：WPM+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L GA3+7 g/L琼脂+30g/L蔗糖，调节pH为5 .8；
3号增殖培养基为：B5+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L GA3+7 g/L琼脂+30g/L蔗糖，调节pH为5 .8；
接着切取1号诱导培养基培养的淫羊藿不定芽的单个芽点，并分别接种到三组增殖培养基上，然后在温度为25℃，光照强度为2300-2500 lx，光照时长为12 h/d的条件下培养，以得到淫羊藿丛生芽（如图5所示），接种21 d后统计增殖系数。
结果如表3所示：
表3不同增殖培养基结果统计
| 序号 | 培养基配方 | 增殖系数 |
| 1 | <![CDATA[MS+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L GA<sub>3</sub>+7 g/L琼脂+30g/L蔗糖]]> | 2.33 |
| 2 | <![CDATA[WPM+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L GA<sub>3</sub>+7 g/L琼脂+30g/L蔗糖]]> | 2.14 |
| 3 | <![CDATA[B5+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L GA<sub>3</sub>+7 g/L琼脂+30g/L蔗糖]]> | 1.4 |
由表3可知，1号增殖培养基增殖系数最高，达到了2.33，其芽增殖培养效果最佳，故芽增殖培养选用1号增殖培养基。
本发明其他未详尽之处均为本领域技术人员所公知的常规技术。
本发明的保护范围不限于具体实施方式所公开的技术方案，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何修改、等同替换、改进等，均落入本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种淫羊藿不定芽诱导及快速增殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.种子萌发：将淫羊藿种子去除杂质，然后选择充分成熟、饱满完整的种子，用流水冲洗1h之后，将种子消毒后沙藏保鲜，期间注意保湿和消毒，3-5个月种子陆续发芽；
S2.幼苗获得：将萌发的淫羊藿种子播于腐殖土的小花盆培养，待淫羊藿幼苗长出真叶，备用；
S3.子叶节消毒：将幼苗切去子叶，取子叶附着点以下长度为0.5 cm的子叶节作为外植体，用流水冲洗30 min后，在超净工作台中，消毒处理；
S4.不定芽诱导培养：将消毒的子叶节接种到诱导培养基上培养，在温度为25 ℃，光照强度为2300-2500 lx，光照时长为12 h/d的条件下培养，得到淫羊藿不定芽；
S5.芽增殖培养：切取单个芽点，接种到增殖培养基上培养，在温度为25℃，光照强度为2300-2500 lx，光照时长为12 h/d的条件下培养，得到淫羊藿丛生芽。
2. 根据权利要求1所述淫羊藿不定芽诱导及快速增殖的方法，其特征在于，在步骤S1中，所述将种子消毒后沙藏保鲜的步骤为：喷洒0.1 %多菌灵对种子消毒后，将种子与含水率为55 %-60 %细河沙按1：3的比例混匀，之后在4 ℃的冷藏室内沙藏保鲜。
3. 根据权利要求1所述淫羊藿不定芽诱导及快速增殖的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述淫羊藿种子播入小花盆内后，在环境温度为20 ℃，土壤湿度为25 %-30 %，空气相对湿度为70 %-80 %，光照强度为2000 lx，光照时长为12 h/d的条件下培养。
4. 根据权利要求1所述淫羊藿不定芽诱导及快速增殖的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述消毒处理具体为：将取得的子叶节，先用75 %酒精消毒30 s，无菌水冲洗3次，再用0.1 %氯化汞消毒5 min，无菌水冲洗5次。
5. 根据权利要求1所述淫羊藿不定芽诱导及快速增殖的方法，其特征在于，在步骤S4中，所述诱导培养基为：MS/WPM/B5 +0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+7 g/L琼脂+30 g/L蔗糖，调节pH为5 .8。
6. 根据权利要求1所述淫羊藿不定芽诱导及快速增殖的方法，其特征在于，在步骤S5中，所述增殖培养基为：MS/WPM/B5+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L GA3+7 g/L琼脂+30g/L蔗糖，调节pH为5.8。
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| CN116897776B (zh) * | 2023-06-25 | 2024-03-29 | 神农架林区中医药产业协会 | 一种淫羊藿种子的贮存方法、培养方法和种植方法 |
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