CN116042844A - 影响猪生长性状的snp分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了猪生长性状相关的SNP分子标记，含有该SNP分子标记的基因片段如SEQ ID NO:1所示，在该基因片段中包括3个与猪生长性状相关的SNP位点，包括：在SEQ ID NO:1所示序列中位于第85位点的用R表示的G＞A突变，位于第565位点的用S表示的A＞G突变，位于第1206位点的用K表示的T＞A突变。通过将获得的SNP分子标记应用于选育具备优势生长性状的猪、培育具备优势生长性状种猪品系、猪生长性状遗传改良等领域，可以提高猪的生长性能、并大大缩短育种年限，提高育种效率，加快猪的遗传改良进程。

Description

影响猪生长性状的SNP分子标记及应用

技术领域

本发明涉及分子遗传及动物繁殖育种领域，特别涉及一种影响猪生长性状的SNP分子标记及应用。

背景技术

卵泡抑制素(follistatin,FST)是一种单链糖蛋白，也被称为卵泡休止素或者性激素抑制蛋白。1987年UENO等和ROBERTGSON等分别从猪和牛的卵泡液中获取了FST。FST是性腺功能的局部调节剂，是促卵泡激素(FSH)分泌的有力抑制剂。有研究证明FST基因在断奶-发情间隔期间是卵泡生长和功能的负调控因子；在围生期小鼠卵巢中的卵泡以及正在生长的卵泡的立方颗粒细胞中FST基因持续表达，FST288处理可延迟生殖细胞巢的分解，尤其是在卵巢周围附近，并显着降低原始卵泡的百分比，同时FST被证实在促进猪早期胚胎发育中起作用，通过促进初始卵裂时间并提高胚泡形成率，还可以提高胚泡质量。

近年来，关于FST在猪生长性状和繁殖方面均有一定研究，但在猪上的表达及多态性的研究并不多见，特别是尚未发现有关FST基因多态性与猪生长性状关联分析的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种影响猪生长性状的SNP分子标记及应用，以解决上述问题。

根据本发明的第一个方面，提供了一种影响猪生长性状的SNP分子标记，含有该SNP分子标记的基因片段如SEQ ID NO:1所示，在该基因片段中包括3个与猪生长性状相关的SNP位点：在如SEQ ID NO:1所示序列中位于第85位点的用R表示的G＞A突变，位于第565位点的用S表示的A＞G突变，位于第1206位点的用K表示的T＞A突变。

在某些实施方式中，所述的3个SNP位点为完全连锁遗传。

在某些实施方式中，所述的生长性状包括大白母猪如下性状：100千克眼肌厚、100千克背膘厚。

根据本发明的第二个方面，提供了一种SNP分子标记在选育具备优势生长性状的猪上的应用，含有该SNP分子标记的基因片段如SEQ ID NO:1所示，在该基因片段中包括3个与猪生长性状相关的SNP位点：在如SEQ ID NO:1所示序列中位于第85位点的用R表示的G＞A突变，位于第565位点的用S表示的A＞G突变，位于第1206位点的用K表示的T＞A突变。

在某些实施方式中，在选育具备优势生长性状的猪上的应用的方法包括：

1)对猪仔检测如SEQ ID NO:1所示序列中第85、565和1206位点的SNP分子标记；

2)选留步骤1)中检测得到的第85、565和1206的3个位点等位基因型为GG/AA/TT基因型的个体，进行繁育，即可得到具备优势生长性状的猪。

根据本发明的第三个方面，提供了一种SNP分子标记在培育具备优势生长性状种猪品系上的应用，含有该SNP分子标记的基因片段如SEQ ID NO:1所示，在该基因片段中包括3个与猪生长性状相关的SNP位点：在如SEQ ID NO:1所示序列中位于第85位点的用R表示的G＞A突变，位于第565位点的用S表示的A＞G突变，位于第1206位点的用K表示的T＞A突变。

在某些实施方式中，在培育具备优势生长性状种猪品系上应用的方法包括：

1)对待留种的备选种猪检测如SEQ ID NO:1所示序列中第85、565和1206位点的分子标记；

2)选留步骤1)中检测得到的第85、565和1206的3个位点等位基因型为GG/AA/TT基因型的个体；

3)将步骤2)选留的个体作为种猪配种，进行繁育，培育出具备优势生长性状种猪品系。

根据本发明的第四个方面，提供了一种SNP分子标记猪生长性状遗传改良上的应用，含有该SNP分子标记的基因片段如SEQ ID NO:1所示，在该基因片段中包括3个与猪生长性状相关的SNP位点：在如SEQ ID NO:1所示序列中位于第85位点的用R表示的G＞A突变，位于第565位点的用S表示的A＞G突变，位于第1206位点的用K表示的T＞A突变。

在某些实施方式中，猪生长性状遗传改良上的应用的方法包括：

1)对待留种的备选种猪检测如SEQ ID NO:1所示序列中第85、565和1206位点的分子标记；

2)选留步骤1)中检测得到的第85、565和1206的3个位点等位基因型为GG/AA/TT基因型的个体；

3)将步骤2)选留的个体作为种猪配种，后代继续选留GG/AA/TT基因型的猪，淘汰其他基因型猪，以逐代提高GG/AA/TT优势等位基因型的频率，从而改良和提高后代猪的生长性状。

本发明的有益效果：

1、获得在FST基因上与猪生长性状相关的3个SNP位点，为后续的基因芯片研究和遗传育种奠定了应用基础。

2、将获得的3个SNP位点应用于选育具备优势生长性状母猪上，可以在仔猪时期就可通过检测相应的SNP位点碱基突变情况来选育具备优势生长性状母猪，可以大大提高选育效率，节约生产成本。

3、将获得的3个SNP位点应用于培育具备优势生长性状种猪品系上，可以大大缩短育种年限，高效地获得具备相应优势生长性状种猪品系。

4、将获得的3个SNP位点应用于生长性状遗传改良，可以改良猪品种尤其大白猪品种的生长性状，提高该品种猪的竞争力。

5、第85、565和1206位点的3个SNP分子标记为完全连锁遗传，在基因芯片研究和后续遗传育种研究时，可以作为一个整体来进行研究，节约时间，加快效率。

附图说明

图1为FST基因SNP位点峰图；

图2为FST基因SNP基因连锁遗传分析；

图3为FST基因mRNA二级结构预测图。

具体实施方式

下面结合附图对发明作进一步详细的说明。

1、试验材料

试验猪均来源新疆五家渠天康畜牧种猪场(316头大白母猪)，饲养管理条件一致、健康无病。采集耳组织样，放入含75％乙醇的1.5ml离心管中，于冰盒中带回实验室-20℃冰箱保存，以备后续进行样本组织DNA的提取。并整理好相关生长性状数据，备用。

2、DNA提取

剪少许猪耳组织样于无菌的1.5ml离心管中剪碎，参照北京天根生物化学有限公司血液、细胞和组织DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取。采用Nano2000测定DNA浓度,筛选260/280值在1.7～2.0之间、浓度大于50ng/μL的样品，保存于-20℃冰箱中，以备后续使用。

3、引物设计

根据Ensembl数据库提供的猪FST(Ensembl号：ENSSSCG00000016892)基因全长序列，采用PrimerPrimier5.0进行PCR扩增引物设计，引物由上海生工合成，引物序列见(表1)。

表1引物序列

4、混池测序

随机选取经检测合格的DNA样品40个，每个样品取10μl构建DNA混池进行PCR扩增。PCR反应程序：94℃预变性10min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸60s，共35个循环；72℃终延伸10min；4℃保存。经电泳检测为目标条带大小后，送至上海生工生物进行测序，测序结果经chromas2.6.5软件进行分析(如图1所示的位点峰图)，将正反向测序序列与Ensembl所得序列通过DNAMAN6.0软件进行比对，检测基因的SNPs位点。

5、多态位点分型

对筛查到的多态位点委托石家庄博瑞迪公司利用

基于多重PCR的靶向测序基因型分型技术对候选的SNPs进行基因分型。

6、数据获取

记录受试猪群100kg背膘厚和100kg眼肌厚，并参照《种猪生产性能测定规程》(NY/T822-2004)计算上述表型的校正数据。

7、数据统计与分析

使用Excel2016对数据进行整理并统计各分型结果，参照文献(侯浩宾,李海静,杨莉,等.德州驴NCAPG-DCAF16基因区域多态性与生长性状的关联分析[J].畜牧兽医学报,2019,50(02):302-313)的方法分析各位点的基因型频率、基因频率、遗传纯合度(Ho)、遗传杂合度(He)、有效等为基因数(Ne)、多态信息含量(PIC)、Hardy-Weinberg检验，并利用在线软件RNA fold web server对外显子区突变前后的mRNA二级结构进行预测并利用Haploview 4.2进行连锁不平衡分析。利用SPSS 26.0单因素方差分析(One-wayANOVA)对受试猪群各基因型与其余生产性状进行关联分型，SPSS26.0不同基因型对应的性状用“平均值±标准差”的形式表示，以P＜0.05为差异显著性判断。

8、试验结果

8.1FST有效SNPs位点信息

通过上述试验方法及分析，获得如表2中3个SNPs位点，其中g.32808636发生G＞A的单碱基突变；g.32809116发生A＞G的单碱基突变，不改变其编码的Glu；g.32809757发生T＞A的单碱基突变；分别命名为P1、P2和P3。该3个SNPs位点所在核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：CTCAGCTTCCCCACTGCCCAGCTGGCGTTTGTTTGAGCCTGGGAGAGCTTTGTTGGTGGGTTCCCCCTAACTGCCTCCAGCCCCR[A/G]GTAAGCCATTGGCGTTGAATTTTGGCAGTCGTATACCACAGGCAAAACAAGATCTGCAGAGGTTCGCTGACCTCTTAGCCAAATGCGGTGGTGACACCAGCCAGCCCTCTCACTTTGAGAGAGATTTGGGTATGGGAACACAAATCTGTCCCCCACCCCTCCTCAATTTCTGGGCGAGAGCCTAGACCCCTCAGGCTTGAACTCCCGGCTGCGCGATTGCGCAAGGCACCCGAAGCCCTCCTGGCTGACCTGTTTGGTGCCTGGCCCTGGTTTTAATCCCCTGCCTCTTTCCAACTCTTAGAAACGTGCGAGAACGTGGACTGTGGGCCCGGGAAAAAATGCCGAATGAACAAGAAGAACAAACCCCGCTGCGTCTGCGCCCCGGATTGTTCTAACATCACCTGGAAAGGCCCAGTCTGTGGGCTGGATGGGAAAACCTACCGCAACGAATGTGCTCTCCTCAAGGCCAGATGTAAAGAS[G/A]CAGCCGGAACTGGAAGTCCAGTACCAAGGCAAATGTAAAAGTAGGTCACCCCTCCTCCAGCTTTCAACCTGAGGTAGTCCCGCAGCAAGACCCCTGGGGTTTGGTGTAGTCACAGTAAGAGCCTAATGATATCAAATAAAGGAACCCTTTTCTAATGACTCCTTAAGAACGCTGAAGGCAACCCAGAGGCACAGGGTTTTTTTTTTTTTGAAAACCACAGCGTTCCCAAAATAAATTTTTGAAAGCTGGATGCTTCCATTCATGATTTCCTTGATAGTATCAAATGCTGAGTCCCAAAGTACAGGAAGGTGCCTATTAACGTGTGTTTCTCTCTTTGTTTCAGAGACCTGTCGGGATGTTTTCTGTCCAGGCAGCTCCACATGTGTGGTGGACCAGACTAATAATGCCTACTGTGTGACATGTAACCGCATTTGCCCAGAGCCCACCTCCTCAGAACAGTATCTCTGTGGGAATGATGGAGTGACCTACTCCAGTGCCTGTCACCTGAGAAAGGCTACCTGCCTACTGGGCAGATCTATTGGATTGGCCTATGAGGGAAAGTGTATCAGTAGGTATTCTGGATTGAGAAAGGAAAAGAAATAAATGGGAAAAGGGAAAAAGGCTAATTCTGTCATTAAAAK[A/T]AAGCCTAAAGCCTCCCCAAACACATAGCTTCAGCAAAGGGAGAAATATTCTCCAGTTTGGGTAAACTGTCCTGCTCACAGCACTGTCTTCCAGAAGCATCAGCACATATATTGAAATGGCAGCAAGACACAGGAAACAATTTTCCTTCATAGAAACC

其中，第85位点(P1)用R表示的G＞A突变，第565位点(P2)的用S表示的A＞G突变，第1206位点(P3)的用K表示的T＞A突变。

表2FST基因SNPs位点信息

8.2、FST基因多态信息含量、杂合度、有效等位基因数及卡方检验

通过对上述3个SNPs进行分型检测，3个候选位点均在大白母猪群中检测到3种基因型(如表3所示)，316个样本中有2个样本分型失败，成功率大于99.36％。其中，P1在大白猪群表现为GG＞AG＞AA，G为优势基因；P2在大白猪群表现为AA＞GA＞GG，A为优势基因；P3在大白猪群表现为TT＞AT＞AA，T为优势基因。卡方结果检验表明，3个SNPs在大白猪群均符合哈代-温伯格平衡定律，多态性分析表明：P1、P2和P3在大白猪群体处于低度多态。

表3FST基因多态信息含量、杂合度、有效等位基因数及卡方检验

注：df＝2，P＝0.05时χ²＝5.99；P＝0.01，χ²＝9.21；df＝1，P＝0.05时χ²＝3.84，P＝0.01，χ²＝6.63；PIC＜0.25为低度多态；0.25≤PIC＜0.5为中度多态；PIC≥0.5为高度多态。

8.3、FST基因连锁不平衡分析

根据FST基因SNPs信息，利用Haploview4.2软件进行连锁分析。如图2所示，FST基因P1、P2和P3三个位点在大白母猪群均处于完全连锁(D’＝1，R²＝1)(如图2)所示。

8.4、FST基因外显子突变后二级结构预测

由图3可知，当FST基因(CDS)区发生P2同义突变后，FST基因mRNA二级结构未发生变化(图3)，但野生型的最小自由能为-1752.37kcal/mol，而突变型的最小自由能为-1763.62kcal/mol，野生型的mRNA自由能高于突变型。

8.5、FST基因多态位点对母猪生长性状的影响

P1/P2/P3位点在100千克背膘厚上GG/AA/TT基因型极显著高于AG/GA/AT基因型(P＜0.01)，在100千克眼肌厚上GG/AA/TT基因型显著高于AG/GA/AT和AA/GG/AA基因型(P＜0.05)(如表4所示)。

表4FST基因多态位点对母猪生长性状的影响

注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)；肩标不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)。

8.6、FST基因多态性状分子标记在选育具备优势生长性状猪上的应用

对猪仔检测FST基因上P1/P2/P3位点的SNP分子标记；

选留在P1/P2/P3位点的等位基因型为GG/AA/TT基因型的个体，进行繁育，即可得到具备优势生长性状的猪。

8.7、FST基因多态性状分子标记在培育具备优势生长性状种猪品系上的应用

对待留种的备选种猪检测FST基因上P1/P2/P3位点的SNP分子标记；选留P1/P2/P3位点等位基因型为GG/AA/TT基因型的个体；

将上述选留的个体作为种猪配种，进行繁育，培育出具备优势生长性状种猪品系。

8.8、FST基因多态性状分子标记在猪生长性状遗传改良上的应用

对待留种的备选种猪检测FST基因上P1/P2/P3位点的SNP分子标记；

选留P1/P2/P3位点等位基因型为GG/AA/TT基因型的个体；

将上述选留的个体作为种猪配种，后代继续选留GG/AA/TT基因型猪，淘汰其他基因型猪，以逐代提高GG/AA/TT优势等位基因型的频率，从而改良和提高后代猪的生长性状。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于发明的保护范围。

Claims (9)

1.影响猪生长性状的SNP分子标记，其中，含有所述SNP分子标记的基因片段如SEQ IDNO:1所示，在所述的基因片段中包括3个与猪生长性状相关的SNP位点：在如SEQ ID NO:1所示序列中位于第85位点的用R表示的G＞A突变，位于第565位点的用S表示的A＞G突变，位于第1206位点的用K表示的T＞A突变。

2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其中，所述的3个SNP位点为完全连锁遗传。

3.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其中，所述的生长性状包括大白母猪如下性状中的一种或者多种的组合：100千克眼肌厚、100千克背膘厚。

4.权利要求1-3任一项所述的SNP分子标记在选育具备优势生长性状的猪上的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述应用的方法包括：

1)对猪仔检测如权利要求1中所述的SNP分子标记；

2)选留步骤1)中检测得到的第85、565和1206的3个位点等位基因型为GG/AA/TT基因型的个体，进行繁育，即可得到具备优势生长性状的猪。

6.权利要求1-3任一项所述的SNP分子标记在培育具备优势生长性状种猪品系上的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述应用的方法包括：

1)对待留种的备选种猪检测如权利要求1中所述的SNP分子标记；

2)选留步骤1)中检测得到的第85、565和1206的3个位点等位基因型为GG/AA/TT基因型的个体；

3)将步骤2)选留的个体作为种猪配种，进行繁育，培育出具备优势生长性状种猪品系。

8.权利要求1-3任一项所述的SNP分子标记在猪生长性状遗传改良上的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述应用的方法包括：

1)对待留种的备选种猪检测如权利要求1中所述的分子标记；

2)选留步骤1)中检测得到第85、565和1206的3个位点等位基因型为GG/AA/TT基因型的个体；

3)将步骤2)选留的个体作为种猪配种，后代继续选留GG/AA/TT基因型猪，淘汰其他基因型的猪，以逐代提高GG/AA/TT优势等位基因型的频率，从而改良和提高后代猪的生长性状。

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