CN115961103A - 一种不扩增病毒核酸检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种不扩增病毒核酸检测方法及其应用，其中，检测该方法为：依靠连续的两条长短引物与病毒核酸结合后，先形成稳定的引物与模板型式的PCR扩增结构，再在DNA聚合酶的作用下以长链引物为模板进行扩增反应，并释放荧光信号，进而确定核酸检测结果。本发明检测方法不需要对RNA病毒核酸进行反转录反应获得cDNA,直接就可以对DNA和RNA病毒核酸进行检测，简便病毒检测操作，节省检测成本和反应时间；本发明检测方法不对病毒核酸进行扩增反应，因此不会有扩增产物污染；本发明检测方法对病毒核酸特异性结合位点较多且为连续性结合位点，检测特异性高，极大程度上避免了由于检测试剂灵敏度过高出现的假阳性情况。

Description

一种不扩增病毒核酸检测方法及其应用

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种不扩增病毒核酸检测方法及其应用。

背景技术

病毒(Biological virus)是一种非细胞生命形态体，其结构简单，由蛋白质外壳和遗传物质所组成，必须寄生在活细胞内以复制方式增殖。2019年由新型冠状病毒引起的疫情对每个人日常生活和全国公共卫生及经济发展造成了巨大影响。因此能否快速、准确、高通量的进行大范围病毒检测排查和控制继发性传播极为关键。常用病毒的检测技术有病毒核酸检测、IgM抗体检测、中和抗体检测和病毒分离培养检测等，由于操作性和成本优势主要以病毒核酸检测为主，包括RNA病毒核酸和DNA病毒核酸检测，其中DNA病毒核酸可以直接进行实时荧光定量PCR(qPCR)检测，RNA病毒需要先逆转录成cDNA然后在进行检测，常见DNA病毒有人乳头瘤病毒、乙肝病毒等，RNA病毒有艾滋病毒、新型冠状病毒等。

病毒快速检测一般情况不需要进行定量分析，定性检测就可以用于初步诊断。一些常见病毒，如HPV病毒等，在临床上并没有直接证说明病毒含量高低与病情严重程度、病情进展情况及用药剂量有直接关系，往往只需要检测结果展示阴性和阳性即可。传统qPCR病毒检测是以病毒核酸为模板，依靠靶向引物进行模板扩增和荧光探针(染料)将扩增信号逐级放大，进而反馈出病毒样本检测结果。在判定结果前需要先设定CT值的标准范围(一般情况为23-35CT值)和扩增曲线状况(标准S型曲线)，检测结果与预先设定的标准值进行比较从而判定检测样本的阴阳性。对于靶向引物不够特异、反应体系扩增效率和病毒核酸质量较差的情况容易出现高CT值，对于CT值超过标准值情况，需要判定扩增曲线形状和重新进行样本检测及重新判定结果。同时，对于扩增产物污染带来的假阳性，传统qPCR病毒检测无法消除。此外，传统qPCR病毒检测通过扩增曲线和CT值来判定结果，对于微流控芯片等大通量的微机电检测设备较难运用该技术。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种不扩增病毒核酸检测方法，解决了现有技术中时常需要依靠预先设定的标准曲线和CT值进行检测，导致检测速率慢的问题。

为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是：一种不扩增病毒核酸检测方法，该方法为：依靠连续的两条长短引物与病毒核酸结合后，先形成稳定的引物与模板型式的PCR扩增结构，再在DNA聚合酶的作用下以长链引物为模板进行扩增反应，并释放荧光信号，进而确定核酸检测结果。

优选地，该方法具体包括以下步骤：

S1、根据病毒核酸序列设计一条F1单链引物，所述F1单链引物的长度为145～155bp；

S2、根据病毒序列设计一条F2引物，所述F2引物的长为20～28bp；

S3、根据所述F1单链引物序列、所述F2引物序列分别设计T4探针和R3引物；

S4、在所述F2引物扩增延伸的作用下，DNA聚合酶将所述F1单链引物上的探针T4切割释放荧光信号，确定核酸检测结果。

优选地，所述S1中，所述F1单链引物3’端与病毒核酸序列特异性结合，结合位点为5-30bp。

优选地，所述S1中，所述F1单链引物3’端以外的其它碱基序列要避免与病毒核酸序列配对结合，致使F1引物中间序列和5’端序列能够暴露在反应体系中。

优选地，所述S2中，所述F2引物5’端与病毒核酸特异性结合，结合位点为15～25bp；所述F2引物3’端与所述F1单链引物特异性结合，结合位点为3～6bp。

优选地，所述F1单链引物和所述F2引物与病毒核酸结合位点是连续结合位点。

优选地，所述S3中，所述T4探针结合位点为所述F1单链引物中间位置，所述R3引物是所述F1单链引物和所述F2引物形成PCR扩增结构后的下游引物。

本发明的另一个技术方案是这样实现的：一种上述的不扩增病毒核酸检测方法在非诊断目的的核酸快检中的应用。

优选地，所述核酸快检包括人体中的病毒核酸检测或环境中的病毒核酸检测。

与现有技术相比，本发明检测方法不需要对RNA病毒核酸进行反转录反应获得cDNA,直接就可以对DNA和RNA病毒核酸进行检测，简便病毒检测操作，节省检测成本和反应时间；本发明检测方法不对病毒核酸进行扩增反应，因此不会有扩增产物污染；本发明检测方法对病毒核酸特异性结合位点较多且为连续性结合位点，检测特异性高，极大程度上避免了由于检测试剂灵敏度过高出现的假阳性情况；本发明检测方法对病毒核酸结合位点为40-50bp连续碱基序列，因此对于病毒质量较差或者病毒核酸降解严重依然有很强的检测能力；本发明检测过程不需要依靠S型荧光扩增曲线来判定，能否检测到反应体系的荧光即可判定病毒检测结果，因此，本发明检测方法更容易适配微流控芯片等大通量的微机电检测设备的运用。

附图说明

图1为病毒检测技术原理示意图；

图2为实例1中内参基因globin检测体系和其反应扩增程序及扩增结果示意图；

图3为实例1中内参基因globin检测荧光信号强度量化图；

图4为实例1中检测反应体系优化结果示意图；

图5为实例1中检测反应体系优化结果荧光信号强度量化图；

图6为实施2中DNA病毒HPV16的检测反应及结果示意图；

图7为实例2中DNA病毒HPV16的检测结果的荧光信号强度量化图；

图8为实施3中RNA病毒SARS-CoV-2N蛋白基因的检测反应及结果示意图；

图9为实例3中RNA病毒SARS-CoV-2N检测结果的荧光信号强度量化图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供了一种不扩增病毒核酸检测方法，该方法为：依靠连续的特性结合病毒核酸的两条长短引物与病毒核酸结合后，先形成稳定的引物与模板型式的PCR扩增结构，再在DNA聚合酶的作用下以长链引物为模板进行扩增反应，并释放荧光信号，进而确定核酸检测结果。

在具体的实施过程中，该方法具体包括以下步骤：

S1、根据病毒核酸序列设计一条F1单链引物，所述F1单链引物的长度为145～155bp；

S2、根据病毒序列设计一条F2引物，所述F2引物的长为20～28bp；

S3、根据所述F1单链引物序列、所述F2引物序列分别设计T4探针和R3引物；

S4、在所述F2引物延伸的作用下，DNA聚合酶将所述F1单链引物上的探针T4切割释放荧光信号，确定核酸检测结果。

在具体的实施过程中，所述S1中，所述F1单链引物3’端与病毒核酸序列特异性结合，结合位点为5-30bp。

在具体的实施过程中，所述S1中，所述F1单链引物3’端以外的其它碱基序列要避免与病毒核酸序列配对结合，致使F1引物中间序列和5’端序列能够暴露在反应体系中。

在具体的实施过程中，所述S2中，所述F2引物5’端与病毒核酸特异性结合，结合位点为15～25bp；所述F2引物3’端与所述F1单链引物特异性结合，结合位点为3～6bp。

在具体的实施过程中，所述F1单链引物和所述F2引物与病毒核酸结合位点是连续结合位点。

在具体的实施过程中，所述S3中，所述T4探针结合位点为所述F1单链引物中间位置，所述R3引物是所述F1单链引物和所述F2引物形成PCR扩增结构后的下游引物。

本发明实施例提供的病毒检测方法的具体原理为：

PCR扩增体系中存在目的病毒核酸时，首先F1引物3’端与病毒核酸序列特异性结合，同时F1引物中间序列和5’端序列不与病毒核酸结合而暴露在PCR反应体系中。其次F2引物5’端序列与病毒核酸序列特异性结合，由于F1和F2引物与病毒核酸结合序列为连续性结合位点，使得F2引物在结合病毒核酸同时也能与F1引物特异性结合，形成以F1为扩增模板，F2为上游引物的PCR反应扩增结构。再者PCR扩增体系中有5'→3'外切活性的DNA聚合酶能将特异性靶向在F1上的探针T4切割释放荧光基团，产生荧光信号。最后随着PCR的循环数的增加荧光信号逐渐增加，从而荧光检测设备可以检测到反应体系的荧光信号，如图1所示。

当反应体系中不存在目的病毒核酸时，F1和F2引物不会相互靠近结合形以F1为扩增模板，F2为上游引物的PCR反应扩增结构，致使探针T4不会被切割释放荧光信号，从而荧光检测设备不能检测到反应体系的荧光信号。

本发明实施例提供了一种不扩增病毒核酸检测方法具体包括以下步骤：

1、根据NCBI数据库获取目的病毒核酸序列，使用DNAman软件分析和获取不同病毒型号的特异性序列；

2、使用Snapgene和NTI Vector软件，根据所需要检测目的病毒核酸序列设计F1引物的3’端和F2引物5’端的特异性结合序列，同时要确保F1引物中间和5’端序列及F2引物3’端序列与病毒核酸不结合及自身不形成二聚体结构。R3和T4探针根据F1引物序列设计，T4探针为MGB探针。

3.反应体系：

优先采用F1引物浓度为0.4μM。4.反应程序：(50循环数)

1.预变性：94℃，3分钟；

2.变性：94℃，10秒；

3.退火/延伸：68℃，30秒。

6.结果判定：

检测到荧光信号即反应体系中有目的检测核酸，所检测结果为阳性；未检测到荧光信号，即反应体系中没有目的检测核酸，所检测结果为阴性。

以下为具体检测实例

实例1：内参基因的检测及检测体系优化

珠蛋白基因(globin)由α链珠蛋白和β链珠蛋白组成，α链和β链基因在结构上相似，都有2个内含子和3个外显子。globin是人体中的管家基因，其中β-globin在涉及人源样本的检测和定量中常被用作内参对照。

1.内参globin基因DNA序列信息：

ATTGGTCTATTTTCCCACCCTTAGGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTGGCTCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCACACTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGATCCTGAGAACTTCAGG

2.内参基因globin检测引物和探针信息：(5’→3’)

3.内参基因globin检测体系和其反应扩增程序及扩增结果

采用反应体系20ul，globin-F1浓度0.3μM，globin-F2浓度0.3μM，globin-R3浓度0.2μM，globin-FAM-T4浓度0.3μM，2X qPCR SuperMix反应液10ul，人源基因组样本2ul，余下用ddH₂O补足20ul。所用反应程序为两步法扩增反应程序，其步骤为预变性94℃，3分钟；变性94℃，10秒；退火/延伸68℃，30秒；共45循环。

所用引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；人源基因组样本来自香港大学深圳医院；核酸提取试剂盒为北京雅安达生物科技有限公司DP705磁珠法基因组提取试剂盒；qPCR反应缓冲液为全式金生物科技有限公司

II Probe qPCRSuperMix产品。

结果含有F1和F2引物及人源globin基因核酸样本的检测反应中能检测到荧光信号，不含人源globin基因核酸样本(H₂O)的检测反应不能检测到荧光信号；含有F1引物和人源globin基因核酸样本检测体系中不能检测到荧光信号；含有F2引物和人源globin基因核酸样本检测体系中不能检测到荧光信号，综上结果如图2所示。

此外与阴性对照性比较，当检测反应到10个循环时就能明显检测到荧光信号差异，结果如图3所示。

4.检测反应体系优化

采用反应体系20ul，其中globin-F1引物浓度分别为0.2μM、0.4μM和0.6μM,globin-F2浓度0.3μM，globin-R3浓度0.2μM，globin-FAM-T4浓度0.3μM，2X qPCR SuperMix反应液10ul，宫颈上皮脱落液基因组2ul，余下用ddH₂O补足20ul。所用反应程序为两步法扩增反应程序，其步骤为预变性94℃，3分钟；

变性94℃，10秒；退火/延伸68℃，30秒。共55循环。

结果globin-F1引物浓度为0.2μM、0.4μM和0.6μM的反应体系均能检测荧光信号，其中globin-F1引物浓度为0.4μM反应体系中扩增信号较优，具体如图4和图5所示。

实例2：DNA病毒HPV16的检测反应及结果

1.HPV16病毒L1蛋白基因序列：

AGCAAATGCAGGTGTGGATAATAGAGAATGTATATCTATGGATTACAAACAAACACAATTGTGTTTAATTGGTTGCAAACCACCTATAGGGGAACACTGGGGCAAAGGATCCCCATGTACCAATGTTGCAGTAAATCCAGGTGATTGTCCACCATTAGAGTTAATAAACACAGTTATTCAGGATGGTGATATGGTTCATACTGGCTTTGGTGCTATGGACTTTACTACATTACAGGCTAACAAAAGTGAAGTTCCACTGG

2.引物和探针信息：(5’→3’)

3.反应体系：

对DNA病毒HPV16核酸检测所用的反应体系为20ul，其中，HPV16-F1引物0.4μM，HPV16-F2引物0.3μM，HPV16-R3引物0.2μM，HPV16-Hex-T4 MGB探针0.3μM，Q-pcr反应缓冲液10ul(母液为2X qPCR SuperMix缓冲液)，宫颈上皮细胞脱落液提取HPV16病毒核酸样本2ul，剩余用ddH₂O补足至20ul。

所用引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；HPV16宫颈上皮细胞脱落液来自香港大学深圳医院；核酸提取试剂盒为北京雅安达生物科技有限公司DP705磁珠法基因组提取试剂盒；Q-pcr反应缓冲液为全式金生物科技有限公司

IIProbe qPCR SuperMix产品。所用反应程序为两步法扩增反应程序，其步骤为预变性94℃，3分钟；变性94℃，10秒；退火/延伸68℃，30秒；共50循环。

结果含有F1和F2引物及HPV16基因组样本的检测反应中能检测到荧光信号，其检测结果为阳性；不含HPV16基因组样本(H₂O)的检测反应不能检测到荧光信号，检测结果为阴性；含有F1引物和HPV16基因组样本的检测体系中不能检测到荧光信号，检测结果为阴性；含有F2引物和HPV16基因组样本的检测体系中不能检测到荧光信号，检测结果为阴性，具体如图6所示。此外与阴性对照性比较，当检测反应到10个循环时就能明显检测到荧光信号差异，如图7所示。

实例3：RNA病毒SARS-CoV-2N蛋白基因的检测反应及结果

1.SARS-CoV-2N蛋白基因序列：

TGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTA

2.引物和探针信息：(5’→3’)

3反应体系：

对RNA病毒SARS-CoV-2核酸检测所用的反应体系为20ul，其中Cov19-F1引物0.4μM，Cov19-F2引物0.3μM，Cov19-R3引物0.2μM，Cov19-ROX-T4 MGB探针0.3μM，Q-pcr反应缓冲液10ul(母液为2X qPCR SuperMix缓冲液)，SARS-CoV-2病毒核酸样本2ul，剩余用ddH₂O补足至20ul。所用引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；SARS-CoV-2病毒样本为金唯智生物科技有限公司合成一段单链DNA经与正常人口腔上皮刮起液混合所提取所得核酸样本；核酸提取试剂盒为北京雅安达生物科技有限公司DP705磁珠法基因组提取试剂盒；Q-pcr反应缓冲液为全式金生物科技有限公司

II Probe qPCRSuperMix产品。所用反应程序为两步法扩增反应程序，其步骤为预变性94℃，3分钟；变性94℃，10秒；退火/延伸68℃，30秒；共50循环。

结果含有F1和F2引物及SARS-CoV-2基因组样本的检测反应中能检测到荧光信号，其检测结果为阳性；不含SARS-CoV-2基因组样本(H2O)的检测反应不能检测到荧光信号，检测结果为阴性；含有F1引物和SARS-CoV-2基因组样本的检测体系中不能检测到荧光信号，检测结果为阴性；含有F2引物和SARS-CoV-2基因组样本的检测体系中不能检测到荧光信号，检测结果为阴性，具体如下图8所示。

此外，与阴性对照性比较，当检测反应到10个循环时就能明显检测到荧光信号差异，结果如图9所示。

综上所述，本发明检测方法不需要对RNA病毒核酸进行反转录反应获得cDNA,直接就可以对DNA和RNA病毒核酸进行检测，简便病毒检测操作，节省检测成本和反应时间；本发明检测方法不对病毒核酸进行扩增反应，因此不会有扩增产物污染；本发明检测方法对病毒核酸特异性结合位点较多且为连续性结合位点，检测特异性高，极大程度上避免了由于检测试剂灵敏度过高出现的假阳性情况；本发明检测方法对病毒核酸结合位点为40-50bp连续碱基序列，因此对于病毒质量较差或者病毒核酸降解严重依然有很强的检测能力；本发明检测过程不需要依靠S型荧光扩增曲线来判定，能否检测到反应体系的荧光即可判定病毒检测结果，因此，本发明检测方法更容易适配微流控芯片等大通量的微机电检测设备的运用。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种不扩增病毒核酸检测方法，其特征在于，该方法为：依靠连续的两条长短引物与病毒核酸结合后，先形成稳定的引物与模板型式的PCR扩增结构，再在DNA聚合酶的作用下以长链引物为模板进行扩增反应，并释放荧光信号，进而确定核酸检测结果。

2.根据权利要求1所述的一种不扩增病毒核酸检测方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：

S1、根据病毒核酸序列设计一条F1单链引物，所述F1单链引物的长度为145～155bp；

S2、根据病毒序列设计一条F2引物，所述F2引物的长为20～28bp；

S3、根据所述F1单链引物序列、所述F2引物序列分别设计T4探针和R3引物；

S4、在所述F2引物扩增延伸的作用下，DNA聚合酶将所述F1单链引物上的探针T4切割释放荧光信号，确定核酸检测结果。

3.根据权利要求1所述的一种不扩增病毒核酸检测方法，其特征在于，所述S1中，所述F1单链引物3’端与病毒核酸序列特异性结合，结合位点为5-30bp。

4.根据权利要求3所述的一种不扩增病毒核酸检测方法，其特征在于，所述S1中，所述F1单链引物3’端以外的其它碱基序列要避免与病毒核酸序列配对结合，致使F1引物中间序列和5’端序列能够暴露在反应体系中。

5.根据权利要求1所述的一种不扩增病毒核酸检测方法，其特征在于，所述S2中，所述F2引物5’端与病毒核酸特异性结合，结合位点为15～25bp；所述F2引物3’端与所述F1单链引物特异性结合，结合位点为3～6bp。

6.根据权利要求1所述的一种不扩增病毒核酸检测方法，其特征在于，所述F1单链引物和所述F2引物与病毒核酸结合位点是连续结合位点。

7.根据权利要求1所述的一种不扩增病毒核酸检测方法，其特征在于，所述S3中，所述T4探针结合位点为所述F1单链引物中间位置，所述R3引物是所述F1单链引物和所述F2引物形成PCR扩增结构后的下游引物。

8.一种权利要求1-7任意一项所述的不扩增病毒核酸检测方法在非诊断目的的核酸快检中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述核酸快检包括人体中的病毒核酸检测或环境中的病毒核酸检测。

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