CN117402990A - 一种用于弓形虫检测的RPA-CRISPR/Cas12a检测试剂盒 - Google Patents
一种用于弓形虫检测的RPA-CRISPR/Cas12a检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于弓形虫检测的RPA‑CRISPR/Cas12a检测试剂盒。包括RPA引物对和crRNA。通过RPA与CRISPR技术结合，并筛选优化检测用的RPA引物及crRNA序列以进一步提高检测弓形虫的灵敏度。本发明建立了一种基于RPA‑CRISPR/Cas12a诊断平台的弓形虫快速便捷检测系统，该系统将重组聚合酶预扩增(RPA)与CRISPR/Cas12a核酸检测系统相结合，可特异性识别弓形虫B1基因保守序列。同时，Cas12a核酸酶的协同切割活性被激活以降解作为报告基团的非靶向DNA，以此为基础对弓形虫的核酸样品进行便捷、灵敏且特异的核酸检测。本发明检测系统可在40℃下进行等温检测，该检测系统的最低检出限是弓形虫基因组DNA 31copies/μl，且与其他寄生虫没有交叉反应。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于弓形虫检测的RPA-CRISPR/Cas12a检测试剂盒。
背景技术
刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)属于顶端复合体门原虫，呈全球性分布。弓形虫感染可导致孕妇或母畜流产、死胎、弱胎等，这不仅对人类健康构成严重危害，对畜牧业的发展也造成了严重影响。因此，建立快速、准确的弓形虫检测方法，具有重要的公共卫生意义。
目前，弓形虫诊断主要有病原形态学、免疫学及分子生物学等检查方法。弓形虫病原学检查最为经典、能直接确认病原体存在，但有敏感性低、耗时长、易漏诊，难于实际操作等缺点，并不适用于产前辅助诊断；血清学方法具有灵敏度低、特异性差、结果判断主观性强等特点，它们在临床中的应用具有一定局限性；传统的PCR检测条件较为复杂，需要使用昂贵的仪器设备，目前仅限于实验室诊断且步骤繁琐耗时较长，无法用于现场即时的临床检测。
比如，公开号为CN 107916296 A的发明申请公开了一种弓形虫核酸快速检测引物组、试剂盒和检测方法，所述弓形虫核酸快速检测引物组包括检测弓形虫基因组B1基因序列的上、下游引物和探针；所述试剂盒包括以下内容：裂解液、稀释液、含引物的冻干酶管、阳性质控品、阴性质控品。所述检测包含使用所述试剂盒进行常温核酸扩增技术，通过DNA解旋酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶等多个酶促反应，可在37-45℃恒温条件下，10-30分钟内使目的DNA扩增数百万倍，配合荧光检测技术，可以实现对待检DNA的快速检定。
重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)是一种快速检测的新型等温核酸扩增方法，具有检测速度快，灵敏度高，特异性好，可以在37-40℃等温扩增等特点，可用于现场即时诊断。
比如，公开号为CN 114717346 A的发明申请公开了一种基于RPA的弓形虫核酸检测试剂盒及检测方法，试剂盒中包含：含RPA冻干颗粒的反应管、反应缓冲液、醋酸镁以及ddH2O；本发明是根据通过参考GenBank中弓形虫B1基因序列，选择特异性保守区域，设计大量RPA引物和探针，从中筛选出一套可快速有效检测出弓形虫B1基因的引物及探针组合，并通过建立实时荧光RPA方法，为样品中弓形虫的快速现场检测提供了有效的技术手段，尤其适用于实验设备较为落后的基层检测实验室和疫情突发现场。该发明的引物和探针特异性强，仅对弓形虫有特异性扩增曲线，而其它寄生虫、细菌、病毒均无扩增曲线，灵敏度高，检出限为102拷贝数/μl。
CRISPR/Cas12a系统具有在切割靶标DNA后，切割体系内ssDNA这一特性，将Cas12a和RPA等温扩增系统结合在一起，其中CRISPR/Cas12a系统可引导修饰特定的基因，而RPA技术则可以实现在样本中定量检测靶向基因的扩增产物，通过这种技术可以建立刚地弓形虫RPA-CRISPR/Cas12a检测技术，从而实现快速高效便捷的基因检测。
发明内容
本发明针对现有技术中RPA方法检测弓形虫时灵敏度还较低的问题，提供了一种用于弓形虫检测的RPA-CRISPR/Cas12a检测试剂盒，通过RPA与CRISPR技术结合，并筛选优化检测用的RPA引物及crRNA序列以进一步提高检测弓形虫的灵敏度。
本发明首先提供了一种用于弓形虫(Toxoplasma gondii)RPA-CRISPR/Cas12a检测的序列组合物，包括RPA引物对和crRNA，
RPA引物对序列为：
RPA-8-F：5’-GTGAAACAATAGAGAGTACTGGAACGTCGCCGC-3’，
RPA-8-R：5’-GCATGGTTTGCACTTTTGTGGTTTAGCCTCTCG-3’，
crRNA序列为：
crRNA-2：5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGGUUUAGCCUCUCGACCGG A-3’。
本发明又提供了一种用于弓形虫检测的RPA-CRISPR/Cas12a检测试剂盒，包括所述序列组合物。
优选的，所述的RPA-CRISPR/Cas12a检测试剂盒，还包括作为阳性对照的插入了B1基因的T载体。
优选的，所述的RPA-CRISPR/Cas12a检测试剂盒，还包括进行RPA-CRISPR/Ca s12a反应所需的酶和缓冲液。
本发明又提供了所述RPA-CRISPR/Cas12a检测试剂盒在非疾病诊断为目的检测弓形虫中的应用。
本发明还提供了一种非疾病诊断为目的检测弓形虫的方法，使用所述RPA-CRISPR/Cas12a检测试剂盒，所述方法包括以下步骤：
(1)提取待检测样品的基因组；
(2)以步骤(1)所得基因组作为模板，加入RPA引物对和crRNA进行RPA-CRISPR/Cas12a检测，
(3)分析检测结果，如果检测结果为阳性，则说明待检测样品中存在弓形虫。
本发明方法可以用于比如环境样本的检测，或者实验室一些研究中的检测，总之，本发明方法可以用于非疾病诊断为目的检测弓形虫。
优选的，步骤(2)中检测体系为：Detection Buffer 10μL；Core Mix 5μL；RPA-8-F0.5μL；RPA-8-R 0.5μL；crRNA-2 1μL；DNA模板1μL；Starter 2μL；用ddH2O补充至20μL。
优选的，步骤(2)中反应方法为：实时荧光定量PCR仪器温度为40℃，热盖温度为45℃，30s/cycle 120次，共反应60分钟。
优选的，使用弓形虫RPA-CRISPR/Cas12a消线法检测的试纸条进行检测结果的分析。
本发明建立了一种基于RPA-CRISPR/Cas12a诊断平台的弓形虫快速便捷检测系统，该系统将重组聚合酶预扩增(RPA)与CRISPR/Cas12a核酸检测系统相结合，可特异性识别弓形虫B1基因保守序列。同时，Cas12a核酸酶的协同切割活性被激活以降解作为报告基团的非靶向DNA，以此为基础对弓形虫的核酸样品进行便捷、灵敏且特异的核酸检测。本发明检测系统可在40℃下进行等温检测，该检测系统的最低检出限是弓形虫B1基因31copies/μl，且与其他寄生虫没有交叉反应。
总之，本发明提供了一种基于RPA和CRISPR-Cas12a相结合的简便、灵敏且特异的可视化弓形虫核酸RPA-CRISPR/Cas12a检测系统，该系统对弓形虫的早期检测及后期流行病学调查提供了技术支持，对该疾病的治疗和预防具有指导意义。
附图说明
图1为弓形虫B1基因的获取检测结果图。
图2为以弓形虫基因组为模板通过常规PCR筛选出RPA特异性引物，其中，图A和B为不同样本，泳道M为标准分子量Marker，泳道1～12为12对RPA引物，N为空白对照。
图3为通过CRISPR Cas12a DNA检测试剂盒进行RPA-CRISPR/Cas12a检测从而确定RPA-CRISPR/Cas12aRPA-CRISPR/Cas12a最佳引物与crRNA的结果示意图，其中个曲线分别为3：RPA-3-F/R-crRNA-1；4：RPA-4-F/R--crRNA-1；6：RPA-6-F/R-crRNA-1；7：RPA-7-F/R-crRNA-1；8：RPA-8-F/R-crRNA-2；9：RPA-9-F/R-crRNA-3；10：RPA-10-F/R-crRNA-2；12：RPA-12-F/R-crRNA-3；N：阴性对照。
图4为通过设置温度梯度从而确定RPA-CRISPR/Cas12a反应体系最佳反应温度的检测结果图，其中各曲线分别为1：37℃；2：28℃；3：39℃；4：40℃；N：阴性对照。
图5为RPA-CRISPR/Cas12a灵敏度分析和qPCR灵敏度分析结果图，其中，图A为RPA-CRISPR/Cas12a灵敏度分析，曲线1-9分别为：1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、100ag、10ag，曲线N：阴性对照；图B为qPCR灵敏度分析，各曲线分别为-3：1pg，-4：100fg，-5：10fg，-6：1fg，-7：100ag，NTC：阴性对照。
图6为特异性分析结果图，其中，曲线1-5分别为：刚地弓形虫，贾第鞭毛虫，隐孢子虫，毕氏肠微孢子虫，芽囊原虫；曲线N：阴性对照。
图7为Cas12/13专用核酸检测试纸条灵敏度分析和部分样本检测结果，其中，图A为灵敏度分析结果，N：阴性对照，1：10ag，2：100ag，3：1fg，4：10fg，5：100fg，6：1pg；图B为部分样本检测结果。
具体实施方式
主要试剂及样品：
地方流浪猫基因组由本发明人实验室保存，样品来自浙江德清、温州、丽水地区；贾第鞭毛虫，隐孢子虫，毕氏肠微孢子虫，芽囊原虫全基因组由浙江大学所赠。
动物基因组DNA快速抽提试剂盒购自碧云天生物技术公司；质粒DNA小量试剂盒购自爱思进生物技术有限公司；高保真酶KOD FX购自东洋纺(上海)有限公司；CRISPR/Cas12a检测试剂盒和Cas12a/13专用核酸检测试纸条购自易致生物有限公司，DEPC水购自诺唯赞生物科技有限公司。
实施例1：重组质粒pMD-19T-B1的构建、RPA引物及crRNA的筛选、RPA-CRISPR/Cas12a体系的优化与建立
(1)弓形虫B1基因的提取及重组质粒pMD-19T-B1的构建。
基于NCBI的弓形虫B1基因序列(GenBank：AF179871.1)，运用Primer Premier5设计B1基因引物，B1-F：5’-GAATTCGTTCGACAGAAAGGGAGCAAGAGTTGG-3’和B1-R：5’-AGCCGCGCACGAAAGGAGAATGAG-3’。在擎科生物合成引物，以弓形虫全基因组DNA为模板进行PCR扩增，体系如下：弓形虫全基因组DNA 1μL；2×PCR buffer for KOD FX 25μL；2mMdNTPs 10μL；B1-F(10mM)1.5μL；B1-R(10mM)1.5μL；KOD FX 1μL；ddH2O 10μL。
结果如图1所示。而后将得到的B1基因在TA克隆前，平末端用DNA A-Tailing Kit加碱基A，其次用A-Tailing DNA片段与T载体(pMD-19T)链接，将得到的连接产物进行TOP10感受态中进行转化，并于次日挑取单菌落培养后送至生工生物有限公司进行测序，将测序对的重组质粒转移至5mL LB培养基中，37℃培养9h后通过质粒提取试剂盒得到pMD-19T-B1重组质粒。
结果如图1所示，结合PCR条带和测序结果分析，成功构建重组质粒pMD-19T-B1，用紫外分光光度法测重组质粒pMD-19T-B1浓度，已知重组质粒pMD-19T-B1碱基数4907bp，克隆载体根据拷贝数(copies/μL)＝6.02×1023×质粒浓度(ng/μL)×10-9/(质粒碱基数×660)计算拷贝数。
(2)RPA引物及crRNA的设计。
针对NCBI的弓形虫B1基因序列(GenBank：AF179871.1)，运用Primer Premier5设计RPA特异性引物，在擎科生物合成引物，以弓形虫全基因组DNA为模板进行PCR扩增，确定RPA引物的特异性，引物序列如表1所示。
表1RPA引物序列
以弓形虫全基因组为模板，用上述RPA引物分别进行常规PCR反应，反应体系如下：弓形虫全基因组DNA 1μL；RPA-F(10mM)1μL；RPA-R(10mM)1μL；2×Taq PCR Mix 12.5μL；ddH2O 9.5μL。PCR产物用1％琼脂糖凝胶分析，选取条带单一清晰的结果，结果如图2所示，其中设计的12对引物中3、4、6、7、8、9、10、12号引物在100-200bp之间有单一清晰条带。
基于上述RPA引物扩增结果设计crRNA，在生工生物合成，crRNA序列如表2所示。
表2crRNA序列
| crRNA | 序列(5’-3’) |
| crRNA-1 | UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUUCUUUUAGCCUCAAUAGCAG |
| crRNA-2 | UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGGUUUAGCCUCUCGACCGGA |
| crRNA-3 | UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGAAGGAACUCGAGGCAACCA |
通过CRISPR/Cas12a检测试剂盒进行RPA-CRISPR/Cas12a反应，从而筛选出最佳RPA引物及crRNA，具体反应体系如下：Detection Buffer(2X)10μL；Core Mix(4X)5μL；RPA-F(20μM)0.5μL；RPA-R(20μM)0.5μL；crRNA(Cas12a)(2.5μM)1μL；pMD-19T-B1 0.6μL；Starter(10X)2μL；ddH2O 0.4μL。在实验前，提前打开实时荧光定量PCR仪并把温度设置为40℃，热盖温度设置为45℃，30s/cycle 120次，即反应60分钟。重组质粒pMD-19T-B1用DEPC水稀释至1.64×10-3ng/μL，根据上述反应体系可知，反应组分中pMD-19T-B1的量为1pg。以重组质粒pMD-19T-B1为模板，1％琼脂糖凝胶分析筛选出的的RPA特异引物，与对应的crRNA，在实时荧光定量PCR仪中反应60分钟，通过荧光曲线Cq值大小与峰值高度判定最佳RPA引物和crRNA，反应结果如图3所示。
如图3所示，其中编号8的RPA引物与其对应crRNA-2，起峰最早，Cq值最小，则RPA-CRISPR/Cas12a最佳引物为RPA-8-F/R，最佳crRNA为crRNA-2。
(3)RPA-CRISPR/Cas12a最佳反应温度的确立。
模板为1pg重组质粒pMD-19T-B1，引物为RPA-8-F/R，探针为crRNA-2，设置温度梯度(37、38、39、40℃)进行多组RPA-CRISPR/Cas12a反应，反应结果如图4所示。
如图4所示，当反应温度为40℃时，起峰最早，Cq值最低，则RPA-CRISPR/Cas12a最佳反应温度为40℃。
表3是筛选后最优的RPA引物和特异性的crRNA序列及本发明中应用的其他序列。
表3最优的RPA引物和特异性的crRNA序列
基于上述各项反应，已确定RPA-CRISPR/Cas12a检测试剂盒最佳反应引物和温度，具体反应体系和程序如下：Detection Buffer(2X)10μL；Core Mix(4X)5μL；RPA-8-F(20μM)0.5μL；RPA-8-R(20μM)0.5μL；crRNA-2(Cas12a)(2.5μM)1μL；DNA模板(浓度高推荐模板加样量为1μL，x≤5μL)；Starter(10X)2μL；用ddH2O补充至20μL。实时荧光定量PCR仪器温度为40℃，热盖温度为45℃，30s/cycle 120次，即反应60分钟。
实施例2：灵敏度检测
重组质粒pMD-19T-B1用DEPC水倍比稀释至1ng，100pg，10pg，1pg，100fg，10fg，1fg，100ag，10ag。用RPA-CRISPR/Cas12a检测技术进行检测，每个浓度重复3次，通过荧光曲线Cq值大小与峰值高度判定该检测方法的最低检测限，即灵敏度，所得结果与相同质粒浓度进行qPCR反应的结果进行对比，结果如图5所示。
以倍比稀释的重组质粒pMD-19T-B1为模板，引物为RPA-8-F/R，探针为crRNA-2，反应温度40℃，进行RPA-CRISPR/Cas12a反应，最低检测限为100ag重组质粒pMD-19T-B1，其灵敏度高于荧光定量PCR(1fg)，说明本方法灵敏度较好，最低检测限可达到弓形虫B1基因重组质粒(pMD-19T-B1)31copies/μL。
实施例3：特异性实验
用上述RPA-CRISPR/Cas12a反应体系，以刚地弓形虫(T.gondii)，贾第鞭毛虫(G.Lamblia)，隐孢子虫(C.Parvum)，毕氏肠微孢子虫(E.Bieneusi)，芽囊原虫(B.Hominis)的全基因组做模板进行RPA-CRISPR/Cas12a检测，同时设置阴性对照，验证该方法的特异性，结果如图6所示。
以刚地弓形虫(T.gondii)，贾第鞭毛虫(G.Lamblia)，隐孢子虫(C.Parvum)，毕氏肠微孢子虫(E.Bieneusi)，芽囊原虫(B.Hominis)的全基因组做模板进行RPA-CRISPR/Cas12a检测，只有刚地弓形虫检测结果为阳性，其他病原生物为阴性，说明RPA-CRISPR/Cas12a检测方法具有良好的特异性。
实施例4：消线法弓形虫核酸CRISPR-Cas12a横向流动检测系统分析
重组质粒pMD-19T-B1用DEPC水倍比稀释至1ng，100pg，10pg，1pg，100fg，10fg，1fg，100ag，10ag，通过Cas12/13专用核酸检测试纸条(购自深圳易致生物科技有限公司)进行检测。
为了在不具备仪器设备操作条件的室外使用，本发明建立了弓形虫CRISPR/Cas12a核酸检测试纸条(消线法)系统，对于不含有待测核酸的阴性样本，目标核酸无法激活CRISPR反应体系中的Cas12a蛋白的切割活性，则CRISPR检测系统中末端链接FITC基团和生物素的报告DNA不被Cas12a切割，当样品流过样品垫时，报告DNA的FITC端结合胶体金标记兔源抗FITC抗体，形成“生物素-FITC-抗FITC抗体-胶体金”聚合物，经过T线时与T线上的链霉亲和素结合，胶体金沉降从而在T线显色，经过C线时被C线抗体(山羊抗兔IgG-胶体金标记兔源抗FITC抗体-FITC基团-生物素)捕获后沉降，在C线显色；若待测样品中有目标核酸的阳性样本，则Cas12a蛋白酶会被激活从而切割报告DNA，反应体系在经过样品垫时，报告DNA的FITC端结合胶体金标记兔源抗FITC抗体，形成“FITC-抗FITC胶体-胶体金”聚合物，该聚合物经过T线时，不与链霉亲和素结合，T线不显色，经过C线时被C线抗体(山羊抗兔IgG-胶体金标记兔源抗FITC抗体-FITC基团)捕获后胶体金沉降，C线显色，判定结果为阳性。
如图7A所示，在100fg处出现阳性条带，故消线法弓形虫核酸CRISPR-Cas12a横向流动检测技术灵敏度为弓形虫DNA3.1×104copies/μl。并进行了部分样本检测，结果如图7B所示。
采用本方法构建的RPA及crRNA特异性引物，进一步对该消线法试纸条的灵敏性进行验证，结果显示该方法的最低检测限为100fg，并可进行样本检测。
实施例5：弓形虫样品检测
分别用荧光定量PCR上下游引物分别为F:5’-TCCTTCGTCCGTCGTAAT-3’和R:5’-TTCTTCAGCCGTCTTGTG-3’(朱祥明,杨通汉,杨国庆等.弓形虫SYBR-Green1荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J].中国病原生物学杂志,2007(06):428-432.DOI:10.13350/j.cjpb.2007.06.022.)，及本发明建立的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法对本实验室保存的浙江地区猫核酸样品进行检测，并比较检测结果，结果如表4所示。
表4弓形虫样品检测结果
根据表4数据可看出，本实验室建立的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法与荧光定量PCR方法检测结果吻合度较高，即本发明方法有效，可以通过后续进一步优化反应条件，进行大规模的现场诊断应用。
Claims (9)
1.一种用于弓形虫(Toxoplasma gondii)RPA-CRISPR/Cas12a检测的序列组合物，其特征在于，包括RPA引物对和crRNA，
RPA引物对序列为：
RPA-8-F：5’-GTGAAACAATAGAGAGTACTGGAACGTCGCCGC-3’，
RPA-8-R：5’-GCATGGTTTGCACTTTTGTGGTTTAGCCTCTCG-3’，
crRNA序列为：
crRNA-2：
5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGGUUUAGCCUCUCGACCGGA-3’。
2.一种用于弓形虫检测的RPA-CRISPR/Cas12a检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述序列组合物。
3.根据权利要求1所述的RPA-CRISPR/Cas12a检测试剂盒，其特征在于，还包括作为阳性对照的插入了B1基因的T载体。
4.根据权利要求1所述的RPA-CRISPR/Cas12a检测试剂盒，其特征在于，还包括进行RPA-CRISPR/Cas12a反应所需的酶和缓冲液。
5.权利要求2～4任一所述RPA-CRISPR/Cas12a检测试剂盒在非疾病诊断为目的检测弓形虫中的应用。
6.一种非疾病诊断为目的检测弓形虫的方法，其特征在于，使用权利要求2～4任一所述RPA-CRISPR/Cas12a检测试剂盒，所述方法包括以下步骤：
(1)提取待检测样品的基因组；
(2)以步骤(1)所得基因组作为模板，加入RPA引物对和crRNA进行RPA-CRISPR/Cas12a检测，
(3)分析检测结果，如果检测结果为阳性，则说明待检测样品中存在弓形虫。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，步骤(2)中检测体系为：Detection Buffer10μL；Core Mix 5μL；RPA-8-F 0.5μL；RPA-8-R 0.5μL；crRNA-2 1μL；DNA模板1μL；Starter 2μL；用ddH2O补充至20μL。
8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，步骤(2)中反应方法为：实时荧光定量PCR仪器温度为40℃，热盖温度为45℃，30s/cycle 120次，共反应60分钟。
9.根据权利要求6所述方法，其特征在于，使用弓形虫RPA-CRISPR/Cas12a消线法检测的试纸条进行检测结果的分析。
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