CN115948564A - 与绵羊生长性状相关的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种与绵羊生长性状相关的分子标记及其应用。本发明通过对绵羊FADS3基因进行PCR扩增和序列分析，发现在扩增片段的第111位存在一个A/C多态性位点，进一步使用KASPar引物对1195只绵羊的多态性位点进行检测和建立最小二乘模型，对基因型与生长性状进行关联分析，最终确定了本发明扩增的FADS3基因片段可以作为与绵羊生长性状相关的分子标记。本发明通过检测该分子标记，选留基因为AA纯合型绵羊进入核心群作为种羊，以改善绵羊的生长性状，可缩短培育过程，有助于提高生养殖业的经济效益。

Description

与绵羊生长性状相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子标记的技术领域，具体涉及FADS3基因片段作为影响绵羊生长性状的分子标记及其应用。

背景技术

目前关于绵羊FADS3基因的研究较少。FADS3(脂肪酸去饱和酶3)是一种蛋白质编码基因，属于脂肪酸去饱和酶(FADS)基因家族。在该基因家族中，FADS1和FADS2基因与必需脂肪酸代谢有关，而必需脂肪酸与动物的生长关系密切，并且FADS3基因与FADS1和FADS2基因具有高度同源性和结构相似性，因此FADS3基因可能具有相似的功能所以FADS3基因可能在生长发育中起重要作用。但是具体如何起作用并不清楚。

目前，我国已成为世界上最大的羊肉生产国之一，羊肉产业发展潜力巨大。其次，羊肉在市场上很受欢迎，因为它比猪肉脂肪和胆固醇含量更低，蛋白质含量更高，肉质更细腻，更容易消化。湖羊是最重要的绵羊品种之一，具有性成熟早、全年发情、泌乳性能好、生长快、抗粗饲料和抗逆能力强等优点。湖羊主要分布在长江一带。

本发明通过对FADS3基因进行测序和分析，探讨其不同基因型与绵羊生长之间的关联，旨在为提高绵羊生长的遗传改良方面提供基因素材，加速培育拥有自主知识产权的快速生长型优质肉羊新品种，缩短培育进程。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种作为与绵羊生长性状相关的分子标记及其应用。本发明的分子标记是从绵羊FADS3基因中扩增得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过扩增绵羊FADS3基因的DNA序列并测序，寻找FADS3基因的多态性位点，分析不同的基因型与绵羊生长性状相关性，并建立含多态性位点的分子标记的检测方法，并可将该分子标记应用于新型优质肉羊新品种的培育中。

本发明的一个目的是提供了一种与绵羊生长性状相关的分子标记，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第111位的M表示A或C，由于上述序列在第111位碱基处有一个A/C突变，从而导致了绵羊FADS3基因在该位点的A/C多态性。

其中，SEQ ID NO.1：TACTATGTGCCAGGCTCCGAATTCAGCGCTTGATTTATAGACAGTCCCTCTTTGAATCCTCATGATACCTCTATGGGACAGGTACTGTTATTATTTCCATTTTACAGATGMGAAAACAGACTCAGAGGGGCAAAATGACTTGAAATTAAGTGATGGGTCTCGGATTTGGATTCACAGCCCATGCTCTTAACCACCTGCTCCACTGCCCCTTAGCTGCTTATTTCATTCATTCATTCATTCTTCAATTATTGACTCACTAGATTCAACAGCAGATACCAGCAAGCATATCCCATGTGCGAAACCTTGACCTAACCTCTGAAGATACAGCTATGAACAGAAAATCTGCAGGGAGGGACTTCCCTGACAGTCCAGTGGTTAAGGCT

本发明的第二个目的是提供了用于检测上述分子标记的引物组，优选地，其包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列。

SEQ ID NO.2：TACTATGTGCCAGGCTCCGAA

SEQ ID NO.3：AGCCTTAACCACTGGACTGTCA

本发明的第三个目的是提供了用于检测上述分子标记的KASPar引物组，其包括两个正向引物和一个通用反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示。

SEQ ID NO.4：gaaggtgaccaagttcatgctttgcccctctgagtctgttttct

SEQ ID NO.5：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCCCCTCTGAGTCTGTTTTCG

SEQ ID NO.6：GACAGGTACTGTTATTATTTCCATTTTACAG

本发明的还提供了一种检测上述分子标记的试剂盒，所述试剂盒中包含了检测上述分子标记的PCR引物对或KASPar引物对。

本发明的第四个目的是提供了一种检测与绵羊生长性状相关的分子标记的方法，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第558bp位的W表示A或T，所述方法包括利用上述的引物对或试剂盒对绵羊的基因组DNA进行检测，具体检测方法包括如下步骤：

a)使用上述的引物对、KASPar引物对或包含上述引物对的试剂盒，对绵羊基因组DNA进行扩增；

b)对步骤a)获得的扩增产物的多态性位点进行鉴定。

其中，在步骤b)中，上述分型鉴定的方法包括但不限于直接测序法、探针法、基因芯片法、高分辨率溶解曲线法。

利用上述引物对检测与绵羊生长性状相关分子标记的方法，包括如下步骤：

a)以绵羊血液为样品提取基因组DNA，利用核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示的引物对进行高通量水浴PCR扩增；

b)扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型结果。

如上述所述的分子标记引物对或检测试剂盒的检测方法在绵羊生长性状检测中的应用，通过在待测绵羊的基因组DNA中检测上述的分子标记，并分析多态性位点的类型，从而可以确定绵羊的生长性状的高低，进而筛选出快速生长型绵羊。

本发明的第五个目的是提供了如上所述的分子标记、引物对或检测试剂盒的检测方法在绵羊育种中的应用，通过利用上述的引物对或试剂盒对绵羊的基因组DNA中进行扩增和检测，确定待测样品的FADS3基因的基因型，从而可以从中选育出快速生长型的绵羊品种。

寻找基因的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。

本发明通过对绵羊的代表品种湖羊的FADS3基因进行PCR扩增和测序，发现在扩增片段的第111位存在一个A/C多态性位点，并通过检测1195只湖羊多态性和建立的最小二乘模型，确定了与绵羊生长性状相关的分子标记，该分子标记可以用于快速生长型绵羊的培育，为绵羊生长性状的遗传改良提供了有效的基因工程手段，具有重大的实际应用价值。

本发明通过设计KASPar引物对分子标记进行检测，KASP是竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR)的缩写，该技术不需要针对每个SNP位点都去合成特异的荧光探针，而是基于自己独特的ARM PCR原理，让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增，大大降低了试剂的成本，同时还保留了Taqman探针标准的准确性，为本发明的分子标记的检测提供了一种简便、准确、低成本的操作方法。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了与绵羊生长性状相关的分子标记及其A/C的多态性位点，通过测定该多态性的基因型来有效鉴别是否为快速生长型的绵羊，为快速生长型绵羊的选育提供有效的检测手段。本发明通过对分子标记及导致多态性位点的检测，可用于选留基因为AA纯合型绵羊作为种羊用于育种，用以提高绵羊的生长性状，可缩短培育过程，有助于提高生养殖业的经济效益。

附图说明

图1为本发明中用于作为分子标记的绵羊FADS3基因片段的凝胶电泳图。

图2为本发明中绵羊FADS3基因突变位点的测序结果，方框处为突变位点。

图3为本发明中绵羊FADS3基因突变位点KASPar SNP分型结果。

具体实施方式

下面结合实例详细介绍本发明，本发明的优点将会随着描述而更为清楚。应理解，本发明要求保护的范围不受所述具体实施方式的限制，本发明提供的具体实例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制，本领域技术人员参照说明书的描述对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，这些无需创造性劳动的改进和替换也应落入本发明所附权利要求书的保护范围之内。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，实施例中所用试剂均为分析纯或以上规格。

实施例1FADS3基因的扩增

(1)引物设计

以绵羊FADS3基因DNA(GenBank收录号：NC_040272.1)为模板，利用Oligo7.0软件设计一对引物：上游引物和下游引物，引物序列如下：

上游引物(SEQ ID NO.2)：5’-TACTATGTGCCAGGCTCCGAA-3’

下游引物(SEQ ID NO.3)：5’-AGCCTTAACCACTGGACTGTCA-3’

(2)FADS3基因的扩增和测序

提取绵羊全血细胞的基因组DNA作为DNA模板进行PCR扩增。反应体系为35μL，其中2×PCR Master Mix 17.5μL，上游引物1μL(浓度为10μmol/L)，下游引物1μL(浓度为10μmol/L)，DNA模板1μL，用ddH₂O补足35μL。PCR扩增反应条件：94℃3min；

94℃30s，54.5℃30s，72℃30s，循环35次，

最后72℃10min。

PCR扩增反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，图中，M泳道：DL2000Marker，1-10泳道：FADS3基因扩增结果。将扩增得到的PCR片段进行测序，结果显示得到383bp特异扩增片段，其具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在该片段中存在一个多态性位点，具体在第111bp位点的M是A或C，即扩增的FADS3基因片段(SEQ ID NO.1)在第111bp位点存在A/C多态性(见图2)。

其中，SEQ ID NO.1：

TACTATGTGCCAGGCTCCGAATTCAGCGCTTGATTTATAGACAGTCCCTCTTTGAATCCTCATGATACCTCTATGGGACAGGTACTGTTATTATTTCCATTTTACAGATGMGAAAACAGACTCAGAGGGGCAAAATGACTTGAAATTAAGTGATGGGTCTCGGATTTGGATTCACAGCCCATGCTCTTAACCACCTGCTCCACTGCCCCTTAGCTGCTTATTTCATTCATTCATTCATTCTTCAATTATTGACTCACTAGATTCAACAGCAGATACCAGCAAGCATATCCCATGTGCGAAACCTTGACCTAACCTCTGAAGATACAGCTATGAACAGAAAATCTGCAGGGAGGGACTTCCCTGACAGTCCAGTGGTTAAGGCT

DNA序列同源性检索鉴定：

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for BiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与绵羊FADS3基因DNA(GenBank收录号：NC_040272.1)的部分序列同源性达99％。

实施例2基因分型检测方法的建立

1)引物序列设计

针对实施例1中扩增片段的A/C多态性位点设计KASPar引物对，从而用于该多态性位点的特异性检测，设计的KASPar引物对的核苷酸序列为：

用于检测Allele C的正向引物A1(SEQ ID NO.4)：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCGTTAAACATTTTTGGAAAAATTGCTTTTA-3’；

用于检测Allele A正向引物A2(SEQ ID NO.5)：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCCCCTCTGAGTCTGTTTTCG-3’；

通用反向引物C(SEQ ID NO.6)：5’-GACAGGTACTGTTATTATTTCCATTTTACAG-3’。

以上引物委托北京生工生物工程有限公司合成。将KASPar引物对中各组引物均稀释成10μmol/L，并按照正向引物A1：正向引物A2：反向引物C的体积比为12:12:30的比例混匀备用。

2)DNA质控

对绵羊的全血进行基因组DNA的提取，可采用DNA提取试剂盒进行。对提取得到的基因组DNA的进行质量检测，采用1％琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别检测，合格的DNA要求：(1)琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散。(2)Nanodrop2100检测A260/280介于1.8-2.0之间；A260/230介于1.8-2.0之间；270nm没有明显的光吸收。并根据英国LGC公司的KASPar检测技术和基因组大小换算出DNA用量为10～20ng/每样品，将提取的基因组DNA稀释浓度成为10～20ng/μL作为DNA模板备用。

3)基因分型

首先利用K-pette分液工作站将稀释好的待测DNA模板(10～20ng/μL)1.5uL和空白对照(No template control，NTC，采用灭菌水)分别加入384孔反应板中，60℃烘干30min(干燥箱，LGC公司)，DNA变成干粉备用。

将上述KASPar引物对中各引物均稀释成10μmol/L，并按照正向引物A1：正向引物A2：反向引物C的体积比为12:12:30的比例混匀作为引物混合液备用。

然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站分别向每个反应孔中加入1×Master mix(1536微孔板，货号：Part No.KBS-1016-011)与引物混合液，Mix分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪及Fusion激光封膜仪上进行封膜，利用Hydrocyler进行高通量水浴PCR扩增。PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序为：

94℃预变性，15分钟；

94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸)，以touch down序扩增10个循环，每循环降低0.6℃；

94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。

扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况，具体结果如图3所示。图中每个圆点代表一份待测材料，其中靠近左侧的红色圆点，表示该位点是纯合基因型“CC”；靠近中间的绿色圆点，表示该位点是杂合基因型“CA”或“AC”；靠近右侧的蓝色圆点，表示该位点是纯合基因型“AA”。

4)本发明的分子标记在绵羊生长性状关联分析中的应用

试验共检测了1195只湖羊的多态性，确定其基因型，并建立如下所述的最小二乘模型，进行基因型与生长性状关联分析。

Y_ijk＝μ+Genotype_i+P_j+S_k+ε_ijk

其中，Y_ijk是生长性状的观察值，μ为总体均数，Genotype_i为基因型效应，P_j为批次效应，S_k为季节效应，ε_ijk为随机误差，假定ε_ijk相互独立，服从N(0，σ2)分布。

在序列SEQ ID NO.5的第111处的基因型检测结果表明，在1195个个体中AA基因型有370个，AC基因型有590个个体，CC基因型有235个个体。基因型与性状关联分析的结果如表1所示(结果用平均值±标准差表示)。

表1湖羊FADS3基因多态性与生长性状关联分析

注：Weight表示体重，单位为kg；Height表示体高，Length表示体长；Chest表示胸围，单位均为cm。其中Weight80表示80天体重，Weight100表示100天体重，其他含义表示方法类似。同行数据间角标不同字母表示差异显著(P<0.05)，标相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。

结果显示，随着测定周期的延长，如SEQ ID NO.1所示的第111位处的A/C突变位点与绵羊生长性状显著相关。携带AA基因型羊的体重，体高，体重和胸围均要优于携带CC基因型的羊。由此可知A等位基因为优势等位基因。繁育时以AA基因型作为种羊，与其它羊进行杂交。尤其是采用AA基因型种公羊精液进行人工受精，可以极大提升繁育效率，得到在体重，体高，胸围和体长具有优势，并且生长速度快的羊群。

Claims (9)

1.一种与绵羊生长性状相关的分子标记，其特征在于，该分子标记为核苷酸序列如SEQID NO.1所示，其中第111位碱基处的M表示A或C，该突变导致分子标记的A/C多态性。

2.用于检测权利要求1所述分子标记的PCR引物组，其特征在于，其包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列。

3.用于检测权利要求1所述分子标记的KASPar引物组，其特征在于，其包括两个正向引物和一个通用反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

4.一种检测权利要求1所述分子标记的检测试剂盒，其特征在于，其包含权利要求2的PCR引物组或权利要求3所述的KASPar引物组。

5.一种检测权利要求1所述分子标记的方法，其包括如下步骤：

1)使用权利要求2的PCR引物组或权利要求3所述的KASPar引物组，或者使用权利要求4所述的试剂盒，对绵羊基因组DNA进行扩增；

2)对步骤1)获得扩增产物的多态性位点进行分型鉴定。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中的分型鉴定方法为直接测序法或荧光法。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，利用权利要求3所述的KASPar引物对进行PCR扩增，扩增结束后，再通过检测荧光信号确定分型结果。

8.权利要求1所述的分子标记或权利要求2或3所述的引物组，或权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5-7任一项所述的方法在绵羊生长性状相关检测中的应用。

9.权利要求1所述的分子标记或权利要求2或3所述的引物组，或权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5-7任一项所述的方法在绵羊育种中的应用，其特征在于，所述育种的是为了挑选出快速生长型绵羊。

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