CN115772573A - 一种与绵羊体尺性状相关的分子标记、其检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种与绵羊体尺性状相关的分子标记，其检测方法及应用，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第327bp位的Y表示T或C。本发明通过对湖羊PLEC基因进行PCR扩增和序列分析，发现在扩增片段的第327位，即PLEC基因的第23157位存在一个T/C多态性位点，进一步使用KASPar引物对1313只湖羊的多态性位点进行检测和建立最小二乘模型，对基因型与生长性状进行关联分析，最终确定了本发明扩增的CC基因片段可以作为与绵羊体尺性状相关的分子标记。本发明通过检测该分子标记，可用于选留基因为CC纯合型绵羊进入核心群作为种羊，以提高绵羊的体尺性状，有助于增加经济效益。

Description

一种与绵羊体尺性状相关的分子标记、其检测方法及应用

技术领域

本发明属于分子标记的技术领域，具体涉及PLEC基因片段作为影响绵羊体尺性状的分子标记、其检测方法及应用。

背景技术

PLEC编码Plectin。Plectin即PLEC，是一种具有约4500个氨基酸残基的多肽链长度的巨大细胞骨架蛋白。PLEC对所有类型的介导中间丝(IF)亚单位蛋白质都有结合位点，并且在连接和锚定细胞的组织和性能方面发挥着重要作用(Wiche G，2011)。PLEC广泛分布于人体内，主要存在于骨骼肌中，发挥其生理功能。据报道，其错义、移码和剪接位点突变将导致近100种人类疾病(Zrelski MM，2021)。此外，一些研究表明，PLEC可以促进肌肉细胞分化和增殖，抑制其凋亡，并调节骨骼肌发育(Huadong Yin,2021)。但是PLEC基因在绵羊上的研究较少，具体对绵羊的有何作用，尤其是在生产实践中的影响并不清楚。

绵羊是肉、奶制品和羊毛的重要来源，在全球农业经济中起着至关重要的作用。体型是绵羊产业的关键特征(Tao L et al，2020.)。湖羊是著名的多产品种，四季发情，生长快，性成熟早，产羔数高(Feng et al.，2018)。湖羊主要分布在长江一带。错义突变发生在编码区，导致翻译缺陷蛋白，并与许多疾病有关(Lee et al.，2008)。同义突变在非编码区域并不产生改变的蛋白质，而是改变DNA和RNA序列，有被视为沉默突变，因此很容易被忽略(Sharma et al.)。然而，同义突变可以改变mRNA的稳定性、剪接调节位点、miRNA结合位点或翻译效率，从而导致蛋白质水平或蛋白质构象的改变(Sauna et al，2011)。本发明通过对PLEC基因进行测序和分析，探讨其不同基因型与绵羊体尺之间的关联，旨在为提高绵羊体尺的遗传改良方面提供基因素材，加速自主知识产权的快速生长型优质肉羊新品种的培育进程。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种作为与绵羊体尺性状相关的分子标记、其检测方法及应用。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种与绵羊体尺性状相关的分子标记，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第327bp位的Y表示T或C；由于上述序列在第327位，即PLEC基因的第23157位碱基处有一个T/C突变，从而导致了绵羊PLEC基因在该位点的T/C多态性。

用于检测上述分子标记的引物对，任何可特异性扩增本发明上述分子标记或包含上述多态性位点的片段的引物均适用于对该分子标记进行检测，优选地，其包括引物M-F和引物M-R，所述引物M-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，引物M-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

用于检测上述分子标记的引物对，优选为KASPar引物对，其包括用于检测AlleleC的正向引物A1、用于检测AlleleT的正向引物A2和通用反向引物C，所述检测AlleleC的正向引物A1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述检测AlleleT的正向引物A2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述通用反向引物C的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

一种用于检测上述分子标记的检测试剂盒，所述试剂盒中包含了检测上述分子标记的引物对或KASPar引物对。

一种用于检测与绵羊体尺性状相关的分子标记的方法，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第327bp位的Y表示T或C，所述方法包括利用上述的引物对或试剂盒对绵羊的基因组DNA进行检测具体检测方法包括如下步骤：

S1、使用上述的引物对、KASPar引物对或包含上述引物对的试剂盒，对绵羊基因组DNA进行扩增；

S2、对步骤S1获得的扩增产物的多态性位点进行鉴定。

其中，在步骤S2中，上述分型鉴定的方法包括但不限于直接测序法、探针法、基因芯片法、高分辨率溶解曲线法。

优选地，具体检测方法包括如下步骤：A)以绵羊血液为样品提取基因组DNA，利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对绵羊基因组DNA进行PCR扩增；

B)对上述PCR扩增产物进行测序和序列分析，从而通过多态性位点的碱基类型确定基因型。

进一步优选地，利用上述引物对检测与绵羊体尺性状相关分子标记的方法，包括如下步骤：

a)以绵羊血液为样品提取基因组DNA，利用核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示的KASPar引物对进行高通量水浴PCR扩增；

b)扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型结果。

如上述所述的分子标记、引物对或试剂盒的检测方法在绵羊体尺性状检测中的应用，通过在待测绵羊的基因组DNA中检测本发明的分子标记，并分析多态性位点的类型，从而可以确定绵羊的生长性状的高低，进而筛选出快速生长型的绵羊。

如上所述的分子标记、引物对或试剂盒的检测方法在绵羊育种中的应用，通过利用上述的引物对或试剂盒对绵羊的基因组DNA中进行扩增和检测，确定待测样品的PLEC基因的基因型，从而可以从中选育出快速生长型的绵羊品种。

寻找基因的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。本发明通过对湖羊代表品种绵羊的PLEC基因进行PCR扩增和测序，发现在扩增片段的第327位存在一个T/C多态性位点，并通过检测1313只湖羊多态性和建立的最小二乘模型，确定了一种与绵羊体尺性状相关的分子标记，该分子标记可以用于优质肉羊新品种的培育，为绵羊体尺性状的遗传改良提供了有效的基因工程手段，具有重大的实际应用价值。

本发明通过设计竞争性等位基因特异性PCR(KASP)所需的KASPar引物对上述分子标记进行检测，该检测方法不需要针对每个SNP位点都去合成特异的荧光探针，而是基于自己独特的ARM PCR原理，让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增，大大降低了试剂的成本，并具有较高的准确性，为本发明的分子标记的检测提供了一种简便、准确、低成本的操作方法。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了与绵羊体尺性状相关的分子标记，具体为如SEQ ID NO.1所示片段的第327位的T/C的多态性位点，通过测定该多态性的基因型，能有效鉴别是否为快速生长型的绵羊，为快速生长型绵羊的选育提供有效的检测手段。

本发明通过对分子标记及导致该多态性位点的检测，可用于选留基因为CC纯合型绵羊作为种羊，用于育种，用以提高绵羊的生长性状，有助于提高绵羊养殖业的经济效益。

附图说明

图1为本发明中用于作为分子标记的绵羊PLEC基因片段的凝胶电泳图。

图2为本发明中绵羊PLEC基因突变位点的测序结果。

图3为本发明中绵羊扩增片段SEQ ID NO.1中第327位的所示的T/C多态性位点的KASPar SNP分型结果。

具体实施方式

本发明的分子标记是从湖羊PLEC基因中扩增得到，其具体核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。通过扩增湖羊PLEC基因的DNA序列并测序，寻找PLEC基因的多态性位点，分析不同的基因型与绵羊体尺性状相关性，并建立含多态性位点的分子标记的检测方法，并可将该分子标记应用于新型优质肉羊新品种的培育中。

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本发明所用试剂均为分析纯或以上规格。

实施例1PLEC基因的扩增

以湖羊PLEC基因DNA(GenBank收录号：NC_040260.1)为模板，利用Oligo7.0软件设计一对引物：正向引物M-F和反向引物M-R，引物序列如下：

M-F(SEQ ID NO.2)：5’-GCTGCATTCAGTCCCTAGTCA-3’

M-R(SEQ ID NO.3)：5’-CTAATCGTACGGTAACCTGCT-3’

(2)PLEC基因的扩增和测序

PCR扩增的反应总体积为35μL，包括DNA模板1.5μL，2×PCR Master Mix 17.5μL，M-F 1μL(浓度为10μmol/L)，M-R 1μL(浓度为10μmol/L)，和ddH₂O 14μL。其中，DNA模板为对绵羊全血细胞提取的基因组DNA作为DNA模板。

PCR扩增反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min。

对PCR扩增反应产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳结果如图1所示，图中，M泳道：DL 2000Marker，1-10泳道：PLEC基因扩增的结果。将扩增得到的PCR片段进行测序，测序的结果显示得到880bp特异扩增片段。该扩增片段的具体核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，其中在该片段(SEQ ID NO.1)中存在一个多态性位点，具体在第327bp位点的Y是T或C，即在PLEC基因的第23157bp位点存在T/C多态性(见图2)。

其中，SEQ ID NO.1如下：

GCTGCATTCAGTCCCTAGTCAGGAAACTAGGTCTGACAGGCCCCAGTGGAAACCTGGCACAGCCAAATTAAATGAAGAAATAAATACTTTAAAAGTTATCCAGCGATGTGCCACACAGACCCCTCACTTGCTCACAGCATCGCCCCTCTGGTCCATCTGCAGAAGGGAAGGTCAGCACGTGGGCCCAGCCCGCCACACTCGTCACAGCGGCCTTGCTCAGGTGGACCGCCTCTGCCCGGCCAGCCCTCGCCAGGGAGCTGCGGACCCCTTCCCCCGTGCCCTGGTGGTCTGCTCATCCGTGTGGGAAGGTGTCCACTTGCTTGTTCYGCCACTTACCAGTCAGTTCCAGGCTGAGTCCCTGGCTGGAGGCCCCCAGCATGTGGGATGGATGGGCTGGGTGAAGAGCGAGTGGTCTGGGAGGGCCCCTGTGAGAGACGCCCTGAGCTGAGCCCTGACCGAGGAGGACAGCGCTCAGAGAGCTGCCAGGAGGTCCGACAGGGGTCCTCTGGGGTTACTGGAGAGATGGACCCGGGGGAGTGGGTTTCATACATGAATTTCATTTCTCAATGAGCCTGGCTCAAAATTCAGAAAGAACTAGAACTTCAGTAGAAAAGAAGTGCTGTCCGAACACGCTCACCCCTGTGCTCCAGCAGCCTCTATGCTGTGGGTGCAGGTGCCCTGCAAGGCTGGCTGCTCCTGGCCATGCCGTGCACCTGACTGTCCCACGGGCTTGTCCGCAGGCGCAGAGCCCTGCCGCTCCCTTTCACGGCACGTGGCGCCCCTGCCAGCCCTCCATTAGTCTCCAGTTTTGTGTCTGGTTATCTGCGGGGAGACGCGTAGAACTCTGGCGGGTTTTCTAAGCAGGTTACCGTACGATTAG。

DNA序列同源性检索鉴定：

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for BiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool)软件，将测序后获得的DNA序列(SEQ ID NO.1)与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与湖羊PLEC基因DNA(GenBank收录号：NC_040260.1)的部分序列同源性达99％。

实施例2基因分型检测方法的建立

(1)引物序列设计

针对实施例1中扩增片段SEQ ID NO.1中所示的T/C多态性位点设计KASPar引物对，从而用于该多态性位点的特异性检测，设计的KASPar引物对的核苷酸序列为：

用于检测AlleleC的正向引物A1(SEQ ID NO.4)：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAGGTGTCCACTTGCTTGTTCC-3’；

用于检测AlleleT的正向引物A2(SEQ ID NO.5)：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAAGGTGTCCACTTGCTTGTTCT-3’；

通用反向引物C，通用反向引物C(SEQ ID NO.6)：

5’-GACTCAGCCTGGAACTGACTGGT-3’。

以上引物委托北京生工生物工程有限公司合成。上述将KASPar引物对中各组引物均稀释成10μmol/L，并按照体积比为12:12:30的正向引物A1：正向引物A2：通用反向引物C的比例混匀备用。

(2)DNA质控

对绵羊的全血进行基因组DNA的提取，可采用DNA提取试剂盒进行。对提取得到的基因组DNA进行质量检测，采用1％琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别检测，合格的DNA要求到达：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；Nanodrop2100检测A260/280介于1.8-2.0之间(即说明DNA样品没有蛋白污染)；A260/230介于1.8-2.0之间(即说明DNA样品盐离子浓度低)；270nm没有明显的光吸收(即说明DNA样品没有酚污染)。并根据英国LPLEC公司的KASPar检测技术和基因组大小换算出DNA用量为10～20ng/每样品，将提取的基因组DNA稀释浓度成为10～20ng/μL作为DNA模板备用。

(3)基因分型检测

首先利用K-pette分液工作站将稀释好的待测DNA模板(10～20ng/μL)1.5μL和空白对照(No template control，NTC，采用灭菌水)分别加入384孔反应板中，60℃烘干30min(干燥箱，LPLEC公司)，DNA变成干粉备用。

将上述KASPar引物对中各引物均稀释成10μmol/L，并按照体积比为12:12:30的正向引物A1：正向引物A2：通用反向引物C的比例混匀作为引物混合液备用。

然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站分别向每个反应孔中加入1×Master mix(1536微孔板，货号：Part No.KBS-1016-011)与引物混合液，Mix分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪及Fusion激光封膜仪上进行封膜，利用Hydrocyler进行高通量水浴PCR扩增。PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序为：

94℃预变性，15分钟；

94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸)，以touch down序扩增10个循环，每循环降低0.6℃；

94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。

扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况，具体结果如图3所示。图中每个圆点代表一份待测材料，其中靠近左侧的红色圆点，表示该位点是纯合基因型“TT”；靠近右侧的蓝色圆点，表示该位点是纯合基因型“CC”；靠近中间的绿色圆点，表示该位点是杂合基因型“TC”或“CT”。

(4)与绵羊体尺性状关联分析中的应用

试验共检测了1313只湖羊的多态性，确定其基因型，并建立如下所述的最小二乘模型，进行基因型与体尺性状进行关联分析。

Y_ijk＝μ+Genotype_i+P_j+S_k+ε_ijk

其中，Y_ijk为体尺的观察值，μ为总体均数，Genotype_i为基因型效应，P_j为批次效应，S_k为季节效应，ε_ijk为随机误差，假定ε_ijk相互独立，服从N(0，σ2)分布。

基因型检测结果表明在1313个个体中TT因型有89个，CT基因型有500个个体，CC基因型有724个个体。基因型与性状关联分析的结果如表1所示，其中，表中Hight表示体高(即绵羊肩胛骨顶端到站立地面的垂直距离)、Length表示体长(即绵羊从肩关节到坐骨结节后缘距离)，单位为cm。Hight80表示第80天时1313只湖羊的平均体高；Length 80表示第80天时1313只湖羊平均体长；以此类推。

表1湖羊PLEC基因多态性与生长性状关联分析

注：同行数据间角标不同字母表示差异显著(P<0.05)，标相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。

结果显示，随着测定周期的延长，扩增片段SEQ ID NO.1中第327位，即PLEC基因第23157位的所示的T/C多态性位点与绵羊体尺显著相关。结果表明携带CC基因型羊的体高和体长均要优于携带TT基因型的羊(P<0.05)。由此可知C等位基因为优势等位基因。在育种时选择CC基因型进行保种，繁育时以CC基因型作为种羊，与其它羊进行杂交。尤其是采用CC基因型种公羊精液进行人工授精，可以极大提升繁育效率，得到生长速度具有优势的羊群，在生产中一定程度上能够改良绵羊的胴体性状，使绵羊养殖有更大的经济收益。

Claims (10)

1.一种与绵羊体尺性状相关的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第327bp处的Y表示T或C，该突变导致分子标记的T/C多态性。

2.用于检测权利要求1所述的分子标记的引物对，其特征在于，其包括引物M-F和引物M-R，所述引物M-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，引物M-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.用于检测权利要求1所述的分子标记的KASPar引物对，其特征在于，其包括用于检测AlleleC的正向引物A1、用于检测AlleleT的正向引物A2和通用反向引物C，所述检测AlleleC的正向引物A1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述检测AlleleT的正向引物A2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述通用反向引物C的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

4.用于检测权利要求1所述的分子标记的检测试剂盒，其特征在于，其包含权利要求2所述的引物对或权利要求3所述的KASPar引物对。

5.用于检测权利要求1所述的分子标记的方法，其包括如下步骤：

S1、使用权利要求2的PCR引物对或权利要求3所述的KASPar引物对，或者使用权利要求4所述的试剂盒，对绵羊的基因组DNA进行扩增；

S2、对步骤S1获得扩增产物的多态性位点进行分型鉴定。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S2中的分型鉴定方法为测序法、荧光探针法、基因芯片法或高分辨率溶解曲线法。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，利用权利要求3所述的KASPar引物对进行PCR扩增，扩增结束后，再通过检测荧光信号确定分型结果。

8.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物对或权利要求3所述的KASPar引物对，或权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5-7任一项所述的方法在绵羊体尺性状检测中的应用。

9.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物对或权利要求3所述的KASPar引物对，或权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5-7任一项所述的方法在绵羊育种中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，其育种目的是为挑选出快速生长型绵羊。

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