CN115944739A

CN115944739A - Rna解旋酶dhx33抑制剂在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的应用

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Publication number: CN115944739A
Application number: CN202211720322.4A
Authority: CN
Inventors: 张严冬; 梁盈莹; 代正兰; 温馥瑜
Original assignee: Shenzhen Keye Health Co ltd
Current assignee: Shenzhen Keye Health Co ltd
Priority date: 2022-12-30
Filing date: 2022-12-30
Publication date: 2023-04-11
Anticipated expiration: 2042-12-30
Also published as: CN115944739B

Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗或者辅助治疗黑色素瘤的药物中的应用。本发明确立了DHX33蛋白在黑色素瘤发展中的重要作用，提供的抑制剂具有抑制DHX33解旋酶活力的作用，进而导致由DHX33功能缺失所介导的脂质过氧化，该抑制剂可以快速诱导经由脂类代谢异常所导致的癌细胞铁死亡，对黑色素瘤细胞具有显著的抑制性，因此具有重要的医药开发价值。

Description

RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，涉及RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的应用。

背景技术

黑色素瘤是指黑色素细胞发生异常且侵袭和转移率高的一种恶性肿瘤。黑色素瘤是较常见皮肤癌症之一，虽然黑色素瘤的发病率不高，仅占皮肤癌的3％，但死亡率占皮肤癌的47％。大量研究表明，黑色素瘤多数是由紫外线暴露频繁引发癌症基因的突变，或者由家族遗传导致。黑色素瘤中经常发生几种基因突变包括CDKN2A基因种系突变、BRAF和NRAS突变、KIT突变、GNAQ和GNA11突变。依据基因突变的不同类型，患者可以使用不同类型的靶向药物进行针对性治疗。

手术是黑色素瘤各期的主要治疗方式，初期多数可经过手术治疗进行痊愈。但初期不易被患者发现，发现时多数诊断为晚期。对于转移性的黑色素瘤，则需要根据病理情况进行治疗，大部分药物治疗形式主要包括放疗、化疗和生物治疗。

达卡巴嗪是美国FDA批准的第一代用于治疗黑色素瘤的药物，达卡巴嗪的中位生存期也能达到8个月。其他化疗药物替莫唑胺和福莫司汀也被用于转移性黑色素瘤患者的姑息治疗；然而这些药物没有随机对照试验证明整体存活期的改善。总体这些化疗药物对晚期转移性的黑色素瘤的治疗效果是有限的。

靶向药物的治疗中，针对BRAF基因突变的靶向治疗，是优先于MEK抑制剂的治疗。已经广泛应用的是两种口服BRAF抑制剂(威罗菲尼和达拉菲尼)，用于BRAFV600突变的转移性黑色素瘤。两种BRAF抑制剂均表现出相似的反应率和无进展生存期改善率，两者均减少超过70％进展风险，并可以降低患者的死亡风险。

MEK是BRAF信号通路中下游的一个重要激酶，同时也是NRAS信号通路中重要的蛋白质。MEK的抑制剂曲美替尼可以减少BRAFV600突变或者NRAS突变黑色素瘤细胞增殖，可改善无进展生存期和总生存期。

BRAF抑制剂和MEK抑制剂联合治疗相比BRAF抑制剂单药治疗具有优势。2014年美国批准达拉菲尼和曲美替尼联合应用于BRAF突变的晚期黑色素瘤。

免疫治疗中，抗PD1或PDL1抗体具有高的、持久的肿瘤反应率。Nivolumab已在包括黑色素瘤在内的多种癌症中进行试验，用于晚期黑色素瘤患者的反应率为31％，1年和2年生存率分别为62％和43％。

综上，临床上有针对不同各种治疗黑色素瘤的方案，但大都不够完善，临床治疗出现的耐药性和副作用有待解决，总体针对黑色素瘤的治疗方面依然期待研发出安全更有效的药物。

发明内容

本发明的目的是，提供RNA解旋酶DHX33抑制剂及其在制备用于治疗或者辅助治疗黑色素瘤的药物或组合物中的应用。

为实现本发明的目的，在第一方面，本发明提供了用于治疗或辅助治疗黑色素瘤的RNA解旋酶DHX33抑制剂。在本发明中，RNA解旋酶DHX33抑制剂(即DHX33蛋白抑制剂)选自化合物A、B、C或其药学上可接受的盐或者前药中的至少一种：

本发明首次公开了DHX33蛋白质可以作为靶点进行黑色素瘤的治疗，因此在第二方面，本发明提供了上述RNA解旋酶DHX33作为新型黑色素瘤治疗靶点的应用。

在第三方面，本发明提供了RNA解旋酶DHX33作为一种新型的黑色素瘤病理组织的诊断及检测标志物的应用。

在第四方面，本发明提供了一种用于治疗或者辅助治疗黑色素瘤的靶向药物，其中所述药物的靶点是RNA解旋酶DHX33，该靶向药物可以抑制DHX33解旋酶的活力，进而影响由DHX33蛋白所调控的癌细胞铁死亡过程。该靶向药物的有效成分为化合物A、B、C或者其药学上可接受的盐或者前药中的至少一种。

在第五方面，本发明提供了RNA解旋酶抑制剂在抑制黑色素瘤细胞中脂肪酸代谢去饱和酶SCD1、FADS1、FADS2中的应用。

在第六方面，本发明提供了上述RNA解旋酶DHX33抑制剂作为由DHX33(DHX33基因)调控的黑色素瘤细胞铁死亡诱导剂的应用，即DHX33抑制剂可以快速诱导黑色素瘤细胞的铁死亡。铁死亡(ferroptosis)是铁离子依赖性的细胞死亡，是不同于细胞凋亡、细胞自噬的新型细胞死亡方式。脂肪酸代谢与细胞的铁死亡密切关联。脂肪酸代谢主要包括脂肪酸从头合成、脂肪酸氧化、脂肪酸的去饱和及加长而生成不同饱和程度和不同碳链长度的脂肪酸，其中，脂肪酸的去饱和酶主要包括：SCD、FADS1、FADS2，而SCD是其中的限速步骤酶。研究表明，脂肪酸代谢在癌症细胞中出现异常，很多癌症细胞有这几个脂肪酸去饱和酶的过表达。抑制SCD可以导致细胞质膜的脂类过氧化物生成，并进一步诱导细胞进入铁死亡。这一过程伴随铁离子的蓄积，是铁离子依赖的。

DHX33基因在NCBI上的参考序列编号为：NM_020162.4。

在第七方面，本发明提供了上述RNA解旋酶DHX33抑制剂在治疗或者辅助治疗黑色素瘤中的应用。

在第八方面，本发明提供了上述RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗或者辅助治疗黑色素瘤的药物或药物组合物中的应用。

在本发明的实施方案中，黑色素瘤为DHX33蛋白表达阳性的。在本发明的实施方案中，黑色素瘤可以由基因突变导致，例如BRAF和NRAS突变、KIT突变、CDKN2A基因种系突变、GNAQ和GNA11突变。在本发明的实施方案中，黑色素瘤可以为前期化疗或者BRAF、NRAS等靶向药耐药性肿瘤。

在第九方面，本发明提供了上述RNA解旋酶DHX33抑制剂作为黑色素瘤治疗中的癌细胞铁死亡诱导剂的应用，其中，癌细胞铁死亡是DHX33解旋酶依赖型。

在本发明的实施方案中，RNA解旋酶DHX33抑制剂的摄入频率或剂量可以由医师根据个体的身体状况、年龄、性别、体重等因素来确定。在具体实施方案中，摄入频率范围可以是一天一次到三次。在本发明的实施方案中，RNA解旋酶DHX33抑制剂的摄入剂量需要保证药物的有效暴露量达到每天4000-7500ng·h/mL。在具体实施方案中，在小鼠中，RNA解旋酶DHX33抑制剂的口服剂量可以为25mg-300mg/kg一次，静脉注射剂量可以为每次2.5mg-25mg/kg。在具体实施方案中，在小鼠中，RNA解旋酶DHX33抑制剂的口服摄入剂量可以为每次例如35mg-290m/kg，45mg-280mg/kg，55mg-270mg/kg，65mg-260mg/kg，75mg-250mg/kg，85mg-240mg/kg，95mg-230mg/kg，105mg-220mg/kg，115mg-210mg/kg，125mg-200mg/kg，135mg-190mg/kg，145mg-180mg/kg，或155mg-170mg/kg。当通过静脉注射施用时，在小鼠中，RNA解旋酶DHX33抑制剂注射一次的剂量可以为例如3.0mg-24.5mg/kg、3.5mg-24mg/kg、4.0mg-23.5mg/kg、4.5mg-23mg/kg、5.0mg-22.5mg/kg、5.5mg-22mg/kg、6.0mg-21.5mg/kg、6.5mg-21mg/kg、7.0mg-20.5mg/kg、7.5mg-20mg/kg、8.0mg-19.5mg/kg、8.5mg-19mg/kg、9.0mg-18.5mg/kg、9.5mg-18mg/kg、10.0mg-17.5mg/kg、10.5mg-17.0mg/kg、11.0mg-16.5mg/kg、11.5mg-16mg/kg、12.0mg-15.5mg/kg、12.5mg-15.0mg/kg或13.0mg-14.5mg/kg。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明确立了DHX33蛋白在黑色素瘤发生发展中的重要作用，提供的DHX33抑制剂具有抑制DHX33解旋酶活力的作用，进而诱导癌细胞铁死亡。该DHX33抑制剂可以在体外和体内显著地抑制皮肤黑色素瘤细胞的生长，从而达到治疗黑色素瘤的目的，并因此具有重要的医药开发价值。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中代表性人类黑色素瘤癌组织相比于正常皮肤组织的DHX33蛋白表达量明显偏高。

图2为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂A-C处理后的A875细胞半抑制浓度分析，其中，图2-1：化合物A的半抑制浓度10.2nM，图2-2：化合物B的半抑制浓度20.2nM，图2-3：化合物C的半抑制浓度78.8nM。

图3为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂A-C处理后的A375细胞半抑制浓度分析，其中，图3-1：化合物A的半抑制浓度13.1nM，图3-2：化合物B的半抑制浓度23.9nM，图3-3：化合物C的半抑制浓度61.2nM。

图4为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂A-C处理后的MeWo细胞半抑制浓度分析，其中，图4-1：化合物A的半抑制浓度12.3nM，图4-2：化合物B的半抑制浓度35.4nM，图4-3：化合物C的半抑制浓度130.9nM。

图5为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂B处理后的A375细胞克隆生长的分析结果。

图6为本发明较佳实施例中用DHX33子抑制剂B处理后的A875细胞克隆生长的分析结果。

图7为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂B处理后的A875细胞软琼脂生长的分析结果。

图8为本发明较佳实施例中A875细胞用DHX33抑制剂B(50nM)处理24h后的流式细胞点状图和用AnnexinV(膜联蛋白V)染色的流式细胞凋亡比率分析结果。

图9为本发明较佳实施例中A875细胞用DHX33抑制剂B(50nM)处理48h后的流式细胞点状图和用AnnexinV染色的流式细胞凋亡比率分析结果。

图10为本发明较佳实施例中A375细胞用DHX33抑制剂B(25nM)处理24h后的流式细胞点状图和用AnnexinV染色的流式细胞凋亡比率分析结果。

图11为本发明较佳实施例中A375细胞用DHX33抑制剂B(25nM)处理48h后的流式细胞点状图和用AnnexinV染色的流式细胞凋亡比率分析结果。

图12为本发明较佳实施例中MeWo细胞用DHX33抑制剂B(50nM)处理24h后的流式细胞点状图和用AnnexinV染色的流式细胞凋亡比率分析结果。

图13为本发明较佳实施例中MeWo细胞用DHX33抑制剂B(50nM)处理48h后的流式细胞点状图和用AnnexinV染色的流式细胞凋亡比率分析结果。

图14为本发明较佳实施例中用RNA-测序方法通过大数据对比DHX33抑制剂B处理A875黑色素瘤细胞8h后分析的脂质代谢去饱和酶基因的转录水平的差异分析。

图15为本发明较佳实施例中分析的不同时间下用DHX33抑制剂B(25nM)处理黑色素瘤细胞A875后分析的脂质代谢去饱和酶基因的转录水平变化。

图16为本发明较佳实施例中分析的在不同时间用DHX33抑制剂B(25nM)处理的黑色素瘤细胞A375中脂质代谢去饱和酶基因的转录水平变化。

图17为本发明较佳实施例中分析的在不同剂量用DHX33抑制剂B处理的黑色素瘤细胞A375中脂质代谢去饱和酶基因FADS2的蛋白水平变化。

图18为本发明较佳实施例中分析A375细胞用DHX33抑制剂B处理16h后的细胞活性氧ROS的定量分析图。

图19为本发明较佳实施例中分析A375细胞用DHX33抑制剂B处理8h后的细胞活性氧ROS的定量分析图。

图20为本发明较佳实施例中分析A875细胞用DHX33抑制剂B处理8h后的细胞活性氧ROS的定量分析图。

图21为本发明较佳实施例中分析A375细胞用DHX33抑制剂B处理16h后的细胞脂类过氧化物(LPO)的定量分析图。

图22为本发明实施例中分析DHX33抑制剂B口服后的小鼠药物代谢暴露量分析数据。

图23为本发明实施例中分析DHX33抑制剂B对人黑色素荷瘤生长的抑制性。

图24为本发明实施例中DHX33抑制剂B口服后分析的人黑色素瘤荷瘤在实验终点的重量图。

图25为本发明实施例中对DHX33抑制剂B处理小鼠的体重监测分析。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

1.细胞培养

人黑色素瘤细胞株MeWo、A875、A375等购自碧云天生物技术有限公司(上海)。MeWo细胞用RPMI-1640培养基培养，其含有10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、非必须氨基酸和链霉素、青霉素。培养A875所用的完全培养基是添加了10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、非必须氨基酸和链霉素、青霉素的MEM培养基。A375细胞用含有上述成份的DMEM培养基培养维持。

2.实时定量PCR

为了分析DHX33蛋白促进黑色素瘤细胞生长的分子机理，使用定量PCR(SYBRgreen supermix(Bio-Rad))分析黑色素瘤细胞中重要基因的表达变化。将待分析的细胞以合适的密度铺到6孔板，第二天将适当浓度的化合物加入培养基，化合物处理细胞的时间为0h、4h、6h或者8h，然后收获细胞，提取RNA。之后对RNA样本进行定量PCR分析。待分析的目的基因为FADS1、FADS2和SCD。引物均由IDT(http：//sg.idtdna.com/site)在线“realtimePCRtool”设计，购自BGI(深圳)公司。

针对人体细胞中参与细胞铁死亡基因的引物序列如下(所有引物都从5'-3')：

引物名称	序列
		H3.3-Forward	TGTGGCGCTCCGTGAAATTAG
H3.3-Reverse	CTGCAAAGCACCGATAGCTG
		SCD-Forward	CCTGGTTTCACTTGGAGCTGTG
SCD-Reverse	TGTGGTGAAGTTGATGTGCCAGC
		FADS1-Forward	CTGTCGGTCTTCAGCACCTCAA
FADS1-Reverse	CTGGGTCTTTGCGGAAGCAGTT
		FADS2-Forward	TGCAACGTGGAGCAGTCCTTCT
FADS2-Reverse	GGCACATAGAGACTTCACCAGC

3.细胞半抑制浓度IC₅₀值测定

将黑色素瘤细胞株A875、MeWo细胞以1X10⁴个细胞/100μL/孔铺到96孔板上，等待细胞贴壁完全，将本发明的化合物以19nM、39nM、78nM、156nM、312nM、625nM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM的浓度添加到细胞培养基中，用多通道排枪混合均匀。待化合物和细胞的孵育时间达到72h后，用CCK-8试剂(上海翊圣生物科技有限公司)按照标准流程添加到96孔板的培养基中，孵育1h后，用酶标仪读板(OD_450nm)，将实验重复3次，并绘制化合物在不同浓度下的抑制曲线(如图2所示)，计算化合物的细胞半抑制浓度(IC₅₀)。图中曲线的纵坐标是细胞活度指数，横坐标是化合物浓度(μM)的LOG10值。

4.免疫组化分析

黑色素瘤组织芯片购自上海威奥生物科技有限公司。芯片一共有44列，为皮肤恶性黑色素瘤，用五例正常组织作对照。根据说明书中的免疫组化(IHC)染色进行处理。具体而言，将组织在组织透明脱蜡液(索莱宝生物技术有限公司)中脱石蜡并在一系列乙醇浓度逐渐降低的溶液中再水合。在蒸汽器中用Tris缓冲液(pH9.0)呈现抗原。然后将组织在含有1％H₂O₂的甲醇溶液中孵育以灭活内源性过氧化物酶。在室温下用10％FBS封闭1h后，将组织与第一抗体在4℃孵育过夜。然后根据制造商的建议使用DAKO试剂盒(丹麦DAKO公司)按照说明书进行。使用的抗体来源如下：anti-DHX33、Santa Cruz(购自Santa Cruz生物技术公司)。实验结果(图1中染色的暗色区域)显示DHX33蛋白在多种人类黑色素瘤组织(尤其在细胞核中)发生高表达。

5.活性氧检测(ROS)

将癌细胞株A875细胞以1×10⁵个细胞/2ml/孔铺到6孔板上，等待细胞完全贴壁，将化合物以不同的浓度添加到培养基中，利用

活性氧荧光法检测试剂盒(Elabscience公司)中提供的阳性(Positive)参考(铁死亡诱导剂作为阳性参考)。待化合物孵育时间达到16h后，用

活性氧荧光法检测试剂盒进行活性氧检测，设置3个复孔，试剂DCFH-DA经过一系列的化学反应成为不能透过细胞膜的荧光物质DCF，用多功能酶标仪(PerkinElmer)绘制化合物在不同浓度下的活性氧含量的柱状图，通过OD值分析癌细胞的活性氧情况。DHX33抑制剂能够增加ROS含量，从而损害细胞甚至诱导细胞死亡。

6.细胞亚铁离子检测

将细胞用胰蛋白酶消化后，低速离心(4℃，1200rpm)5min收集细胞，加入300-500μL的PBS(0.01M，pH 7.4)，进行超声破碎，于4℃条件下高速离心，10000×g离心10min，取上清置于冰上待测，留取部分上清用于蛋白浓度测定。根据

细胞亚铁比色法检测试剂盒(购自Elabscience公司)的流程进行亚铁离子检测，用酶标仪读板(OD590nm)，根据绘制的亚铁离子标准曲线计算细胞样本的亚铁离子含量。

7.脂质过氧化物(LPO)

脂质过氧化物比色法检测试剂盒(购自Elabscience公司)说明书进行脂质过氧化物含量的检测，用酶标仪读板(OD _590nm)，通过LPO的标准曲线测定LPO在细胞样本的含量，经过总蛋白校准后计算LPO含量。

8.软琼脂试验

将1.0×10⁴个细胞用4.0mL含0.3％琼脂和10％FBS的DMEM培养基中混合，并加在基础琼脂上(4.0mL凝固的含0.6％琼脂和10％FBS的DMEM培养基)。将平板在37℃下孵育，每周补充2.0mL含0.3％琼脂和10％FBS的DMEM培养基。观察细胞三维克隆生长情况，2-3周后拍照记录统计。

9.细胞的克隆生长(Foci)

将2.0×10³个细胞用10.0mL添加或者不添加抑制剂的完全培养基种培养(100mm细胞培养皿)，在37℃的二氧化碳培养箱种培养，每周更新培养基。观察细胞克隆生长情况，2-3周后，待细胞克隆长到足够大小，采用吉姆萨染色(Geimsa staining)，拍照记录统计。

10.小鼠异种移植模型

所有小鼠实验均遵循广东省实验动物操作标准指南。SPF级别的Balb/cNude雌性小鼠购自北京维多利华实验动物有限公司并接受标准的机构护理。待接种的细胞用胰蛋白酶消化并用PBS重悬至终浓度为每毫升1×10⁸个细胞。对6周龄裸鼠(Balb/c)小鼠进行皮下注射，沿其侧翼注射1×10⁷个细胞。待肿瘤生长到一定大小，小鼠经药物处理一段时间后，处死小鼠并解剖肿瘤进行拍照。

11.RNA测序

RNA测序的具体方案可以参见Yuan B,Wang X,Fan C,You J,Liu Y,Weber JD,Zhong H,and Zhang Y.DHX33 Transcriptionally Controls Genes Involved in theCell Cycle.Molecular and cellular biology.2016；36(23):2903-17。经过药物处理的待测细胞用RNA提取试剂盒(上海Yeasen)提取总RNA。然后在变性后用磁性oligo-dT珠进一步纯化RNA样品。将纯化的mRNA样品逆转录成第一链cDNA，并进一步合成第二互补DNA。片段化的DNA样品是平端的并且在3'末端腺苷酸化。用适配子连接，然后构建文库。通过Qubit(Invitrogen)定量DNA。在cBot簇生成后，然后通过来自GenergyBio(晶能生物技术(上海)有限公司)的IluminaHiSeq2500 SBS对DNA样品进行测序。原始数据转换为Fastq格式。每个样品中的转录物的量基于FPKM-片段每千碱基转录物的每百万个片段计算，使用Cuffnorm软件计算每个样品的FPKM值并应用log2值。Cuffdiff软件用于计算不同样品之间的差异基因转录物。

12.细胞凋亡分析

根据制造商的方案用Vybrant凋亡试剂盒#2(Molecular Probes)进行凋亡测定。将细胞用胰蛋白酶消化并重悬浮于细胞培养基中以产生单细胞悬浮液，进行细胞计数。每个样本计数100万个细胞，沉淀细胞并用磷酸缓冲液洗涤两次，然后用试剂盒中的结合液重悬。然后重悬于含有Annexin V的工作溶液中，避光孵育15min，然后用低速离心(1000rpm离心5min)，用磷酸缓冲液清洗一次。将细胞通过35μm过滤膜(Becton Dickinson)过滤，然后进行流式细胞分选仪(FACS)分析。

13.蛋白质印迹分析

用添加有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Thermo Fisher)的RIPA缓冲液裂解细胞。在冰上孵育10min后，通过超声处理进一步破坏细胞裂解物。然后将全细胞提取物进行SDS-PAGE凝胶，每个样品的加载量为50μg蛋白质。然后将蛋白质转印到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。将膜在5％脱脂奶中封闭，将其在1×TBST缓冲液中在室温下培育1h。在5％FBS中稀释一抗(用1×TBST稀释)，使之与膜在4℃孵育过夜。然后将膜用1×TBST缓冲液冲洗多次，并在室温下与5％FBS(用1×TBST稀释)中的HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗一起孵育2h。用ECL试剂盒(Thermo Fisher)显示印迹。抗体如下：抗GAPDH，Absin(abs830030)；抗FADS2，ABclonal(A10270)。

14.本发明化合物A、B、C的合成

本发明化合物B的合成方法可参见中国专利申请第2021062902433420号，化合物A和C的制备方法介绍如下。

化合物A(AB29588)的合成

(1)化合物2的合成

将化合物1(350mg,2.52mmol,1.00eq)溶解到乙醇(2.00mL)和水(0.40mL)中，在20℃下将溴化氰(0.26g,2.45mmol,180μL,1.10eq)慢慢加入到上述混合液中。将反应液在70℃下搅拌2h。LCMS显示出化合物1被消耗完，并检测到所需的化合物分子量。将反应液在真空下浓缩。通过薄层色谱(二氯甲烷：甲醇＝5：1，2.00mL氨水)进行纯化。得到化合物2(80.0mg,487μmol,产率19.3％)为褐色油。LCMS:Ms：M+H⁺＝165。

(2)化合物A(AB29558)的合成

将化合物2(69.3mg,266μmol,1.00eq)溶解到N,N-二甲基甲酰胺(2.00mL)中，加入化合物5(70.0mg)和N,N-二异丙基乙胺(137mg,1.07mmol,185μL,4.00eq)，将六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷(152mg,293μmol,1.10eq)加入到反应液中，将反应混合液在100℃下搅拌12h。LCMS显示原料消耗完，并检测到所需的化合物分子量。将反应液在真空下浓缩。通过高效液相色谱进行第一次纯化(column:Welch Xtimate C18150*25mm*5μm；流动相：[water(NH₃H₂O)-ACN]；B％:25％-55％，8min)。通过高效液相色谱进行第二次纯化(column:WelchXtimate C18150*25mm*5μm；流动相：[water(HCl)-ACN]；B％:16％-46％,8min)。得到化合物AB29558(8.68mg,19.4μmol,产率：7.28％，纯度：99％，盐酸盐)为白色固体。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 11.68-11.92(m,1.00H),8.27(br s,1.00H),7.25(d,J＝1.13Hz,1.00H),6.96-7.06(m,1.00H),6.86(s,1.00H),3.89(s,3.00H),2.44(d,J＝1.00Hz,3.00H),2.31(s,3.00H),1.97(s,3.00H).LCMS:Ms：M+H⁺＝407。

化合物C(AB29564)和化合物AB29565的合成

在化合物1(100mg,246μmol,1.00eq)中加入二甲基亚砜(1.00mL)，将叔丁醇钾(60.9mg,542μmol,2.20eq)加入到反应液中，然后将三甲基氯乙酸氯甲酯(74.3mg,493μmol,71.4μL,2.00eq)加入到反应液中，反应液在30℃下搅拌反应5h。LCMS显示有5％左右的原料剩余，检测到目标产物主峰生成。反应液中加入水(10.0mL)，用乙酸乙酯萃取两次(20.0mL*2)，合并有机相用饱和食盐水反洗一次(10.0mL)，分出有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩。粗品通过高效液相色谱分离纯化(column:Welch Xtimate C18150*25mm*5μm；流动相：[water(NH3H2O)-ACN]；B％:55％-85％，8min)，得到的产物再经SFC分离(column:DAICEL CHIRALCEL OD(250mm*30mm,10μm)；流动相：[0.1％NH₃H₂O MeOH]；B％：35％-35％,C7.5；60min)，得到化合物AB29564(5.36mg,9.62μmol,收率3.90％，纯度93.2％)为灰白色固体，并且得到化合物AB29565(5.39mg,9.81μmol，收率3.98％，纯度94.6％)为灰白色固体。

化合物AB29564：¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δppm 7.38(br d,J＝8.63Hz,1H),7.25(s,1H),7.12(s,1H),6.79-6.94(m,1H),6.52(s,1H),6.06-6.30(m,2H),3.82(s,3H),2.55(s,3H),2.49(br s,3H),2.07(s,3H),1.14(s,9H).LCMS:Ms:M+H⁺＝520。

15.化合物针对靶点的抑制性分析

使用一系列浓度的化合物(浓度范围设定为1nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM、250nM、500nM、1000nM)进行体外DHX33蛋白解旋酶活力测定。DHX33蛋白的提取、解旋酶活力分析的具体方法参见CN112661754A。使用上述方法进一步分析化合物对DHX33解旋酶活力的抑制性。

本发明的化合物对DHX33解旋酶活力的半抑制浓度如表1所示。从表1可以看出，本发明的化合物对DHX33蛋白解旋酶的活力具有显著的抑制作用。

表1：化合物A、化合物B和化合物C对DHX33蛋白解旋酶活力的抑制性分析

*代表半抑制浓度≥400nM；**代表100nM≤半抑制浓度＜400nM；***代表20nM≤半抑制浓度＜100nM；****代表半抑制浓度＜20nM。

16.数据统计分析

数据表示为平均值+SD。使用斯氏t检验(Student’s test)确定统计学显著性，P值<0.05表示差异显著，用*标示；如果P值<0.01，用**标示；如果P值<0.001，用***标示。

实施例1.DHX33蛋白在多种黑色素瘤中高效表达

免疫组织化学分析DHX33蛋白在人黑色素瘤组织中的表达

从上海威奥生物科技有限公司(货号ZL-MEL962)购买了人黑色素瘤组织的石蜡组织切片的微列阵，一共包括44种不同的人体黑色素瘤组织，用五例正常的皮肤组织作为正常组织对照。将石蜡包埋的组织芯片首先在60℃烘箱中培育30min，然后迅速在组织透明脱蜡液中脱石蜡，并在一系列乙醇浓度(100％、95％、70％、50％和25％)逐渐降低的溶液中逐渐水合(每次轻轻摇动5min，每个浓度的乙醇溶液重复处理一次)，最后在蒸馏水中继续水合10min。然后在蒸汽器中用50mM的Tris盐酸缓冲液(pH9.0)呈现抗原，蒸汽加热40min，随后冷却到室温。然后将组织在含1％H₂O₂的甲醇溶液中孵育以灭活内源性过氧化物酶。在室温下用10％FBS封闭1h后，将组织与一抗在4℃孵育过夜。然后根据制造商的建议使用DAKO试剂盒(丹麦DAKO公司)进行标准方案。使用的抗体来源如下：anti-DHX33、Santa Cruz(Santa Cruz生物技术公司)。实验结果(图1中显示染色的暗色圆形区域)显示DHX33蛋白在多种人类黑色素瘤组织(尤其在细胞核中)发生高表达。下文的表2同时提供了针对44种癌组织和5种人正常皮肤组织的数据，从这个统计数据可见，大概有38.6％的黑色素瘤病人的病理组织中有DHX33蛋白的高效表达。从病理切片的分析结果看，非肿瘤的组织区域和正常皮肤组织中，DHX33表达是阴性的。

表2：44种人恶性黑色素瘤病理组织的病理信息及DHX33蛋白的免疫组化分析

实施例2.DHX33抑制剂可以有效抑制黑色素瘤细胞的生长增殖

为了分析DHX33蛋白对黑色素瘤细胞的抑制作用，我们选择了三种不同的DHX33抑制剂(化合物A、B和C)来处理不同的人体黑色素瘤细胞。这几种化合物的合成方法和针对DHX33解旋酶活力的抑制数据如前所述。我们分别选择三种不同的代表性黑色素瘤细胞株，A875(NGF受体阳性)、A375(N-RAS突变)、MeWo(CDKN2A/p53/FGRF突变)开展化合物的细胞抑制性试验。如图2-4所示，DHX33抑制剂即化合物A-C对前述的三种不同的黑色素瘤细胞均具有纳摩尔级别的细胞抑制性，而且细胞的抑制曲线显示下降幅度均可以超过50％。在这三种化合物中，化合物A具有相对较高的细胞抑制性，即活性较高，化合物C的活性最低，但也可以达到100纳摩尔左右的半抑制浓度。对于后期代表性的分析，我们主要选择化合物B开展后续的代表性分析，化合物B的活性排在化合物A和化合物C中间。除了细胞的半抑制浓度之外，我们也进行了细胞的克隆生长的测试分析，其具体方法如前所述，我们选择了两种代表性的黑色素瘤细胞开展实验，即A875和A375细胞。在采用25nM的浓度下，我们发现DHX33抑制剂化合物B可以显著抑制这两种黑色素瘤细胞的生长(图5-6)。除了这些细胞二维培养体系的分析之外，我们也在三维细胞培养体系中分析DHX33抑制剂化合物B对黑色素瘤细胞的抑制性，这个实验是在软琼脂体系中开展的，如前所述。悬浮独立生长是癌细胞的一个主要特征，在DHX33抑制剂化合物B(20nM)的处理下，我们发现A375细胞几乎完全丧失了在软琼脂中进行悬浮独立生长的能力，不能形成聚集性增殖或者克隆(图7)。以上实验的结果表明，DHX33的抑制剂对黑色素瘤细胞具有显著的抑制作用。

实施例3.DHX33抑制剂可以部分诱导黑色素瘤细胞的凋亡

为了分析DHX33抑制剂对黑色素瘤细胞抑制性的分子机理，首先我们用不同浓度的化合物B处理黑色素瘤细胞，分析细胞的凋亡指数。将癌细胞分别用0、50nM的化合物B处理A875细胞24h或48h，收获细胞后，用凋亡染色试剂盒(上海Yeasen公司)分析细胞的凋亡比率。如图8(24h处理，上面为阴性对照，下面为化合物B处理)和图9(48h处理，上面为阴性对照，下面为化合物B处理)所示，实验数据显示，抑制DHX33蛋白后，A875细胞发生细胞凋亡，但是在长时间药物处理，即48h处理可以看到有显著的凋亡(增加30％左右)，而在药物处理的早期时间点，如24h，没有看到显著的凋亡。此外，在另外的两种黑色素瘤细胞A375和MeWo中，均未看到明显的细胞凋亡。图10-11针对A375细胞，图10为24h处理(上面为阴性对照，下面为药物处理，图11为48h处理(上面为阴性对照，下面为药物处理)。图12-13中的数据针对MeWo细胞，图12为24h处理(上面为阴性对照，下面为药物处理，图13为48h处理(上面为阴性对照，下面为药物处理)。数据分别呈现了细胞的散点图和凋亡细胞集群比率(不同样品的细胞在图上标示了不同浓度或者处理时间)。凋亡比率用表格标示出来，表格中记录了分析的总体细胞数和凋亡的细胞数，以及凋亡细胞占总细胞的比率。

上述实验结果证明，DHX33抑制剂对个别黑色素瘤细胞具有一定的诱导凋亡作用，而在另外一些癌细胞中则没有显著的凋亡诱导作用。

实施例4.DHX33抑制剂可以调控黑色素瘤细胞中的脂肪酸代谢酶---脂肪酸去饱和酶的表达

细胞生长离不开细胞膜的合成，尤其在癌细胞中，膜生成效率显著提高。研究表明，脂肪酸代谢对癌细胞的增殖至关重要。在多种癌细胞中，脂肪酸的合成异常活跃，尤其是细胞中脂肪酸的一些重要调控酶，例如脂肪酸去饱和酶，例如SCD1、FADS1、FADS2，都有高表达现象。为了分析DHX33抑制剂是否可以调控这些重要基因的表达，我们对DHX33抑制剂处理的细胞进行了转录组的RNA测序分析。将黑色素瘤细胞A875用DHX33抑制剂(化合物B，25nM)处理8h，从细胞中提取总RNA后进行RNA测序，如图14所示，在DHX33受到抑制的黑色素瘤细胞A875内，受到显著影响的基因参与的信号通路有细胞周期等，这些在之前的研究中已经揭示(参见Yuan B,Wang X,Fan C,You J,Liu Y,Weber JD,Zhong H,and ZhangY.DHX33 Transcriptionally Controls Genes Involvedin the Cell Cycle.Molecularand cellular biology.2016；36(23):2903-17)。在黑色素瘤细胞中，我们发现除了上述基因发生显著变化之外，几个参与脂肪酸代谢的酶，特别是脂肪酸合成中的限速步骤酶SCD1和FADS1及FADS2，均发生了基因表达的下调。这一信号通路在现在技术中是没有报道过的。为了确定DHX33蛋白的抑制是否是影响脂肪酸去饱和过程的重要因素，我们利用实时定量PCR技术，用逆转录酶转换成其互补DNA分子，然后用这些DNA作为模板分析上述各种基因的转录本水平，引物的序列如前述。分析了抑制剂处理短时间后(即化合物B,25nM处理4h、6h、8h)的SCD1、FADS1、FADS2的转录本水平。如图15-16所示，人黑色素瘤细胞(A875和A375)在DHX33抑制剂B的处理下，SCD1、FADS1、FADS2的转录本均发生了显著的表达抑制。为了验证DHX33抑制剂可以在蛋白水平抑制这些酶的表达，我们采用westernblot方法分析了A375在DHX33抑制剂B处理下的一个代表性脂肪酸代谢酶FADS2的蛋白水平，如图17所示，随着化合物B的剂量增加，FADS2的表达量下降。

实施例5.DHX33抑制剂可以诱导黑色素瘤细胞的铁死亡

铁死亡，最早于2012年由Scott JDixon提出，是一种铁依赖的区别于细胞凋亡、细胞坏死和细胞自噬的新的细胞程序性死亡模式，具有铁死亡特征的细胞死亡的报道可以追溯到上世纪50年代。铁死亡的敏感性与许多生物过程紧密相关，例如，与多不饱和脂肪酸代谢有密切关联。近期数据指向铁死亡中磷脂/脂质过氧化是主要的发生因素。所以多不饱和脂肪酸的代谢与癌细胞铁死亡的特殊敏感性密切关联。前期研究中也发现SCD1、FADS等基因的表达可以保护癌细胞铁死亡的影响。而我们已经发现DHX33促进黑色素瘤细胞中多种重要的脂肪酸去饱和酶的高表达，DHX33抑制剂处理后的癌细胞其SCD1、FADS1、FADS2表达降低，所以这些基因的表达下调可能会诱导癌细胞的铁死亡。为了分析有关DHX33抑制剂是否引发黑色素瘤细胞的铁死亡相关通路，我们开展了几个代表性的分析测试。首先，在铁死亡途径中，标志性的物质是活性氧(ROS)的指标有显著的上升。我们用化合物B处理A875和A375两种细胞，首先用不同剂量的化合物B，包括0nM、10nM、20nM、30nM、40nM，处理A375细胞16h，与阳性参照对比，我们发现按照同等数量的癌细胞计算，DHX33抑制剂即化合物B可以显著诱导ROS的生成(图18)。我们进一步缩短了药物处理的时间，即从16h降到8h，分别处理A375细胞和A875细胞，发现DHX33抑制剂同样可以导致ROS的上升(图19针对A375细胞，图20针对A875细胞)。铁死亡途径的主要因素是脂类过氧化物的生成和积累导致的，所以我们继续分析了DHX33抑制剂处理之下的细胞质膜中脂类过氧化物(LPO)的含量。在这个实验中，我们使用了LPO的检测试剂盒(ELABSCIENCE公司)，如图21所示，用化合物B处理A375细胞16h后，LPO的水平有显著的提高。由此，我们得出结论，DHX33的抑制剂可以诱导黑色素瘤细胞的脂类过氧化物的生成，进而导致细胞的铁死亡。

实施例6.DHX33抑制剂的动物体内药代动力学分析

本发明的化合物虽然可以在体外明显抑制癌的细胞生长，但是其在体内的药效发挥会受到体内药代动力学的影响，选择化合物B进行药代动力学分析。针对化合物B，进行小鼠体内的药物代谢动力学分析。静脉注射用化合物样品的制备：用PEG400溶解化合物B，然后加入HS-15(BASF)，混合为均一溶液后，再加入无菌生理盐水配成澄清的溶液，最终的化合物B的浓度为0.5mg/ml，各物质的比例为：8％PEG400，2％HS-15,90％生理盐水。药物制剂澄清后，用于小鼠尾静脉注射，注射剂量为5mg/kg。灌胃化合物样品的制备：将化合物B溶解PEG400中，加入Phorsal 50PG(购自上海新睿生物科技有限公司)，使得最终辅料比率为20％PEG400+80％Phorsal 50PG，用于小鼠的灌胃，灌胃剂量为50ml/kg。小鼠来源：北京维通利华实验动物技术有限公司(中国北京)。

小鼠数量：共6只，3只用于静脉注射，3只用于口服灌胃。

血浆样品收集：

静脉注射：注射后0.083h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h和24h。

口服灌胃：口服后0.25h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h和24h。

血浆样品收集及操作步骤：小鼠给药后进行静脉取血，每个时间点取血0.2mL。将血液样品放置于冰上含有EDTA的小管中，直至离心。血液样品在取血后的1h内用离心机以6800g离心6min，然后迅速置于-80℃冰箱内，剩余的血液处理掉。

样品分析和数据处理：

分析结果通过质量检验后确定。大于66.7％的质量检验的样品的准确度应该保持在已知数据的80-120％范围内。

标准参数，包括曲线下面积(AUC(0-t)和AUC(0-∞))通过FDA认证的药代程序Phoenix WinNonlin 7.0(Pharsight,USA)进行分析。图22显示了DHX33抑制剂B在小鼠给药后的各种药物暴露量，按照50mg/kg的口服给药剂量，其暴露量大约为2000ng*h/ml。从图22可见，化合物B在摄入小鼠体内后，具有一定的生物吸收度，口服的生物利用度平均为10％。

实施例7.DHX33抑制剂可以有效抑制黑色素肿瘤的生长和增殖。

1、动物信息

种属及品系：Balb/c Nude小鼠。

性别及周龄：雌性，6周龄。

体重：18-22g，偏差约为体重均值的±20％。

接种动物数：10只。

动物来源：浙江维通利华实验动物技术有限公司。

2、动物饲养

居住条件：SPF环境，IVC小鼠笼，每笼4只。

温度：20-26℃。

湿度：40-70％。

光照：12h昼夜交替。

饲料：辐照大小鼠饲料，购自北京科澳协力饲料有限公司，自由进食。

饮用水：城市自来水，经过滤、高压灭菌后饮用。

垫料：玉米芯，购自北京科澳协力饲料有限公司，经高压灭菌后使用，每周更换一次。

适应性饲养：实验前给予小鼠不低于7天的适应性饲养期。

动物识别：每个鼠笼均挂有实验信息标示卡，其中包括小鼠信息、细胞接种信息、动物实验信息及实验人员信息等，小鼠用耳标法进行标记。

所有实验动物的操作和管理均严格遵守实验动物使用和管理指导原则。

3、溶媒处方及给药溶液储存条件

(1)受试物(化合物B)

化合物配置：称取适量粉末状态药物，溶解在含有20％PEG400+80％Phorsal 50PG辅料的溶液中，获得5mg/ml的溶液。

给药溶液保存条件：-20℃保存(一次配置7天的药物，14天的实验周期内一共配制2次药物。需要分装好，放置在-20℃冰箱)。

(2)细胞株

人黑色素瘤细胞A375购自碧云天(上海)生物技术有限公司。

(3)培养基

DMEM培养基和胎牛血清(FBS)均购自GIBCO公司(Grand Island,NY,USA)，基质胶(Matrigel)购自BD公司(Franklin lake,NJ,USA)。

4、实验设计

实验设计如表3所示：

表3.受试物对人黑色素瘤细胞A375 Balb/c裸鼠异种移植瘤生长抑制作用研究方案

注：NA表示不适用，PO表示灌胃，BID表示一天两次灌胃，Vehicle表示溶媒组。

5、实验方法

(1)模型建立

A375细胞培养于含10％FBS的DMEM培养基，维持在含5％CO₂的37℃饱和湿度培养箱中。收集对数生长期A375细胞，调整细胞浓度至每毫升5×10⁷个细胞。在无菌条件下，接种0.1mL细胞悬液至小鼠右侧背部皮下，接种浓度为5×10⁶个细胞/0.1mL/小鼠。

(2)分组及给药观察

在肿瘤平均体积达到80mm³时，将动物按肿瘤体积随机分组，使各组肿瘤体积差异小于均值的10％，分组当日记为Day 0，并按照动物体重开始给药。给药期间，每周2次测定动物体重，每日观察记录动物临床症状。个别动物体重如果与Day 0相比下降超过15％(BWL≥15％)，将做停药处理，直至动物体重恢复后(BWL<15％)，恢复给药。

实验终点最后一次称量结束后，用CO₂安乐死处死剩余动物，取瘤称重并拍照记录。

从图23～图24可见，DHX33抑制剂即化合物B处理后的小鼠肿瘤，与对照组相比，有明显的抑制现象。对照组和实验组小鼠在起始时间点(即开始分组，化合物B处理之前)的肿瘤平均体积都是80mm³左右，但在14天药物处理之后，肿瘤的增长指数对照组明显大于给药组小鼠。值得一提的是，本实验中使用的化合物B的体内药物代谢数据不是在最佳条件下获得的。针对该化合物的机体摄入频率和剂量没有进行最佳组合分析，显示生物利用度偏低，但依然可以检测到化合物B在体内对肿瘤的抑制性。

用较高剂量(50mg/kg，一天两次)的DHX33抑制剂(化合物B)处理小鼠14天的过程中，也对各组小鼠的体重进行跟踪监测。检测结果显示(图25)，小鼠没有明显的体重减低现象。与对照组相比，小鼠的行为和体重正常。以上实验数据表明，本发明中DHX33抑制剂对人体的黑色素细胞瘤具有显著的体内和体外抑制性，并且在使用的剂量范围内，没有看到对个体有明显毒副作用。DHX33抑制剂可以作为治疗人黑色素瘤的一种新型的治疗手段。

Claims

1.RNA解旋酶DHX33作为新型黑色素瘤治疗靶点的应用。

2.RNA解旋酶DHX33作为一种新型的黑色素瘤病理组织的诊断及检测标志物的应用。

3.用于治疗或辅助治疗黑色素瘤的RNA解旋酶DHX33抑制剂，其特征在于，所述抑制剂选自化合物A、B、C或其药学上可接受的盐或者前药中的至少一种，

化合物C

4.RNA解旋酶抑制剂在抑制黑色素瘤细胞中脂肪酸代谢去饱和酶SCD1、FADS1、FADS2中的应用，其中，所述抑制剂如权利要求3所述。

5.RNA解旋酶抑制剂作为诱导黑色素瘤细胞铁死亡的诱导剂的应用，其中，所述抑制剂如权利要求3所述。

6.RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗或者辅助黑色素瘤的药物或者药物组合物中的应用，其中，所述抑制剂如权利要求3所述。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述黑色素瘤为DHX33蛋白表达阳性的。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述黑色素瘤可以由基因突变导致，例如BRAF和NRAS突变、KIT突变、CDKN2A突变。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述黑色素瘤可以为前期化疗或者BRAF、NRAS等靶向药耐药性肿瘤。

10.RNA解旋酶DHX33抑制剂作为黑色素瘤治疗中的癌细胞铁死亡诱导剂的应用，其中，所述癌细胞铁死亡是DHX33解旋酶依赖型，且所述RNA解旋酶DHX33抑制剂如权利要求3所述。