CN116359502A - Acss2作为治疗神经母细胞瘤的新靶点的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了ACSS2基因作为靶标在筛选/制备治疗神经母细胞瘤的药物中的应用，抑制ACSS2基因表达的试剂制备治疗神经母细胞瘤的药物中的应用，以及检测ACSS2表达的试剂在制备用于诊断神经母细胞瘤或者神经母细胞瘤预后的试剂盒中的用途。通过实验证明敲低ACSS2可以阻断MYCN转录，抑制神经母细胞瘤的生长，为神经母细胞瘤的治疗提供了新的靶点，可通过抑制细胞核中ACSS2介导乙酸生成乙酰辅酶A，减少组蛋白乙酰化，抑制MYCN的转录，从而达到缓解或者治疗神经母细胞瘤的目的。为神经母细胞瘤的治疗提供了新的方向和思路，有望应用在治疗神经母细胞瘤的新药研发中。

Description

ACSS2作为治疗神经母细胞瘤的新靶点的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及ACSS2作为治疗神经母细胞瘤的新靶点的应用。
背景技术
神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)是儿童最常见的实体肿瘤，约占儿童癌症相关死亡率的15％。研究发现，约20％的神经母细胞瘤为MYCN多拷贝突变，该突变在中晚期患者中甚至高于40％。MYCN多拷贝突变与神经母细胞瘤患者的不良预后密切相关。
MYCN(v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene neuroblastomaderived homolog)基因是MYC癌基因家族中的一员，它作为转录调节因子，控制细胞增殖、生长、蛋白质合成、代谢、凋亡和分化等靶基因的表达，在促进神经母细胞瘤的发生和发展中起着至关重要的作用。研究表明，缺失MYCN能明显抑制神经母细胞瘤的发展，这表明MYCN可成为治疗神经母细胞瘤的一个有前景的靶点。然而，由于MYCN缺乏小分子抑制剂的特定结合位点，用小分子或低分子量化合物(如IIA6B17,10058-F4)直接靶向MYCN效果并不理想。同时，目前技术也难以实现向细胞核递送特定抗体抑制MYCN活性。因此，针对MYCN上游调控因子的治疗策略已被开发作为治疗MYCN多拷贝突变神经母细胞瘤的新方法。
基因表达的表观遗传调控影响生长发育。表观遗传失调会导致包括癌症在内的多种人类疾病的发生。组蛋白乙酰化是一种重要的表观遗传修饰，通过组蛋白N-端赖氨酸残基上的乙酰化和去乙酰化来改变染色质结构并调节基因表达。这些反应分别由组蛋白乙酰转移酶和组蛋白脱乙酰酶共同调节。通常组蛋白乙酰转移酶和组蛋白脱乙酰酶保持着动态平衡，然而这种平衡一旦被破坏则会引起基因的表达改变，已成为公认的致癌机制。大量研究表明，新开发的组蛋白乙酰化酶抑制剂，如BF1、PU139和PU141，在体外可通过去组蛋白作用，阻断神经母细胞瘤细胞的生长，而体内实验也证明可阻断神经母细胞异种移植瘤的生长。因此，利用神经母细胞瘤对表观遗传调节剂的靶向易损性是治疗神经细胞瘤，特别是高风险MYCN多拷贝突变的神经母细瘤的另一种有效策略。
从表观遗传学角度看，肿瘤的发生也依赖于细胞代谢重编程。代谢改变可能对表观遗传和转录组调节有深远的影响。乙酸盐是一种丰富的碳源，可被肿瘤细胞用作支持脂质生物合成的重要生物能量燃料。此外，乙酸是组蛋白和非组蛋白乙酰化乙酰辅酶A的前体，可作为表观遗传代谢物。乙酰辅酶A合成酶短链家族成员2(Acyl-CoA synthetaseshort chainfamilymember2,ACSS2)是在细胞质和细胞核中将乙酸转化为乙酰辅酶A的关键酶。研究发现ACSS2的缺失对小鼠的生长发育没有影响，但可以显著抑制不同类型癌症的发展，如乳腺癌和肝细胞癌。此外，ACSS2在多种肿瘤中高表达，其表达水平与不良预后有关。
发明内容
本发明通过对神经母细胞瘤患者的临床病理资料进行整理研究，使用免疫测定方法中的免疫组织化学(IHC)检测ACSS2在癌组织和癌旁组织中的表达水平，并分析ACSS2的表达与神经母细胞瘤患者临床分期，通过构建Cox风险比例回归模型，进一步分析ACSS2在预判神经母细胞瘤患者的预后中的意义，为神经母细胞瘤的诊断及预后提供重要的理论依据。同时，又通过敲低神经母细胞瘤细胞系中ACSS2的表达，研究ACSS2对MYCN转录和神经母细胞瘤发生发展的影响，为神经母细胞瘤的治疗提供了新靶点。
基于此，本发明提供了如下技术方案：ACSS2基因作为靶标在筛选/制备治疗神经母细胞瘤的药物中的应用，调控ACSS2基因，ACSS2表达的降低缓解或抑制神经母细胞瘤的发展。
在上述的应用技术方案中，通过调控ACSS2基因，抑制ACSS2介导乙酸生成乙酰辅酶A，降低组蛋白乙酰化，进而减少MYCN的转录，达到缓解或抑制神经母细胞瘤发展的目的。
在上述的应用技术方案中，ACSS2通过CBP调控的组蛋白乙酰化来调控MYCN的转录。
本发明还提供了抑制ACSS2基因表达的试剂制备治疗神经母细胞瘤的药物中的应用。
在上述的应用技术方案中，抑制ACSS2基因表达的试剂抑制ACSS2表达，抑制ACSS2介导乙酸生成乙酰辅酶A，降低组蛋白乙酰化，进而减少MYCN的转录，达到缓解或抑制神经母细胞瘤发展的目的。
在上述的应用技术方案中，所述抑制ACSS2基因表达的试剂为小分子或低分子量化合物、ACSS2蛋白特异性结合剂或者核酸分子，所述ACSS2蛋白特异性结合剂包括针对ACSS2的抗体、肽抗体、凝集素、结合剂。
优选地，所述核酸分子为siRNA。
本发明还提供了检测ACSS2表达的试剂在制备用于诊断神经母细胞瘤或者神经母细胞瘤预后的试剂盒中的用途。
在上述的用途技术方案中，ACSS2的高表达预示患者患有神经母细胞瘤，或者预示神经母细胞瘤患者的预后不良。
本发明的有益效果是：通过实验证明敲低ACSS2可以阻断MYCN转录，抑制神经母细胞瘤的生长，为神经母细胞瘤的治疗提供了新的靶点，开发靶向ACSS2的药物，可通过抑制细胞核中ACSS2介导乙酸生成乙酰辅酶A，减少组蛋白乙酰化，抑制MYCN的转录，从而达到缓解或者治疗神经母细胞瘤的目的。为神经母细胞瘤的治疗提供了新的方向和思路，有望应用在治疗神经母细胞瘤的新药研发中。
附图说明
图1.ACSS2与MYCN表达及神经母细胞瘤患者预后相关：A.乙酰辅酶A在线粒体和核-细胞质中的代谢示意图；B.在GSE45547队列中，ACSS2的高表达与较低的总生存率和MYCN表达相关；C.在GSE49710队列中，ACSS2的高表达与较低的总生存率和MYCN表达相关；D.使用GraphPad软件定量分析MYCN多拷贝和非多拷贝时GSE45547中ACSS2的表达；E.神经母细胞瘤患者(n＝74)与周围正常神经组织(n＝14)中ACSS2和MYCN蛋白表达的IHC染色和定量分析的代表性图像；F.在神经母细胞瘤组织中，ACSS2蛋白水平与MYCN蛋白表达呈正相关；G.火山图显示了两组间基因上调或下调的差异；H.基因本体分析显示各组间生物过程变化最大；I.代谢过程基因集中显著上调和下调基因的热图；J-K.Western blot(J)和Real-time-PCR(K)分析转染ACSS2小干扰RNA(siACSS2)或scramble对照(siControl)的BE(2)-C和IMR32细胞中MYCN蛋白和mRNA的相关表达。
图2.ACSS2介导的醋酸代谢影响MYCN多拷贝突变的神经母细胞瘤的发生和增殖：A.采用CCK-8法检测乙酸钠、柠檬酸钠、丙酮酸钠、棕榈酸钠或谷氨酰胺对BE(2)-C和IMR32细胞生长的影响；B.用细胞增殖试验评价乙酸钠、柠檬酸钠、丙酮酸钠、棕榈酸钠或谷氨酰胺对细胞增殖的调节作用；C.采用CCK-8法检测ACSS1、ACSS2、ACSS3或MYCN缺失对BE(2)-C和IMR32细胞生长的影响；D.采用免疫印迹法检测稳定细胞株中ACSS2的下调效率和MYCN的表达；E.分析ACSS2或MYCN缺失对BE(2)-C和IMR32细胞生长的影响；F-G.ACSS2或MYCN缺乏抑制裸鼠肿瘤生长；H-I.通过IHC染色检测肿瘤中Ki67(H)或Cleavedcaspase-3(I)蛋白表达。
图3.ACSS2通过CBP介导的组蛋白乙酰化调控MYCN表达：A.ACSS2的抑制或缺失降低了BE(2)-C和IMR32细胞内乙酰辅酶a的水平；B.在小干扰RNA介导的ACSS2敲除治疗后，组蛋白乙酰化迅速而特异性地降低；C.ACSS2敲除抵消醋酸增加的组蛋白乙酰化；D-E.Western blot分析Flag-ACSS2与HA-CBP(D)和内源性ACSS2与CBP(E)的Co-IP；F.原位接近连接试验(PLA)分析BE(2)-C细胞中ACSS2和CBP相互作用；G.在BE(2)-C siControl和siACSS2细胞中使用抗CBP抗体进行ChIP-qPCR检测；H.Westernblot分析BE(2)-CsiControl和siACSS2细胞中CBP与NCOR1和NCOA1的Co-IP；I.使用抗H3K9/27或H4K5/12单抗在BE(2)-C siControl和siACSS2细胞中进行ChIP-qPCR检测。
图4.ACSS2高表达与NB患者不良预后密切相关：A.神经母细胞瘤患者不同阶段ACSS2和MYCN蛋白表达IHC分析的代表性图像；B.Westernblot分析SK-N-AS、BE(2)-C和IMR32细胞中相对ACSS2和MYCN蛋白表达。
图5.乙酸盐增加MYCN多拷贝神经母细胞瘤的增殖和致瘤性：A.乙酸钠、柠檬酸钠、丙酮酸钠、棕榈酸钠或谷氨酰胺处理NIH3T3细胞免疫荧光染色及Ki67阳性定量分析的代表性图像；B.分析乙酸钠、柠檬酸钠、丙酮酸钠、棕榈酸钠或谷氨酰胺对BE(2)-C和IMR32细胞不依赖贴壁生长的影响。
图6.ACSS2的缺失降低MYCN多拷贝突变的神经母细胞瘤的增殖和致瘤性：A.免疫印迹法检测BE(2)-C细胞中ACSS1和ACSS3表达的下调效率；B.采用CCK-8法检测ACSS2抑制或缺失对BE(2)-C和IMR32细胞生长的影响；C-D.CRISP-Control、CRISP-ACSS2和Lenti–shMYCN IMR32(C)和BE(2)-C(D)细胞经ACSS2抑制剂处理后悬浮于软琼脂培养基中，增殖14天；E-F.肿瘤中Ki67(E)或Cleaved caspase-3(F)蛋白表达IHC染色的代表性图像。
图7.ACSS2的缺失降低MYCN扩增细胞中组蛋白H3和H4的乙酰化：BE(2)-C和IMR32细胞中组蛋白3和组蛋白4乙酰化的免疫荧光染色和定量分析的代表性图像。
图8.ACSS1或ACSS3缺乏对MYCN扩增细胞的组蛋白乙酰化没有影响：A.ACSS1或ACSS3缺失对组蛋白H3和H4乙酰化的影响；B.ACSS2敲除取消醋酸增加组蛋白乙酰化。
图9.ACSS2在神经母细胞瘤细胞中与CBP相互作用：A.BE(2)-C细胞中PCAF、GCN5和ACSS2相互作用的Co-IP分析；B.原位接近连接试验(PLA)分析ACSS2和CBP在IMR32细胞中的相互作用。
图10.ACSS2缺陷阻断H3K9和H4K5乙酰化与MYCN启动子的结合：在IMR32siControl和siACSS2细胞中使用抗乙酰化H3K9/27和H4K5/12抗体进行ChIP-qPCR检测。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；所用化学、生物材料和试剂，如无特殊说明，均为本领域常规材料和试剂，均可商购获得。
实施例1
一、材料和方法
1.细胞培养
BE(2)-C和IMR32(MYCN多拷贝的人神经母细胞瘤细胞株)，Lenti-XTM293T(人胚肾细胞系)。BE(2)-C：完全培养基MEM+F12+10％FBS+100U/毫升青霉素和链霉素；IMR32：完全培养基MEM+10％FBS+100U/毫升青霉素和链霉素；Lenti-XTM293T：DMEM培养基+10％FBS+100U/毫升青霉素和链霉素。所有细胞都培养在37℃、5％CO2加湿的培养箱中。
2.转染
BE(2)-C和IMR32铺在6孔板，2mL培养基/孔，第二天按照Lipofectamine RNAiMAX(Thermo Fisher scientific,13778100，美国)说明书加入20nmol siRNA和2uLLipofectamineTM RNAiMAX转染试剂/孔，并将培养基换成opti-MEM。siRNA序列如下：
siACSS1(SEQ ID NO.1):5’-CCAGUUAAAUGUCUCUGUCAA-3’,
siACSS2(SEQ ID NO.2):5’-CAGGAUUGAUGACAUGCUCAA-3’，
siACSS3(SEQ ID NO.3):5’-GCCGUUGAUCGUCAUAUUGAA-3’。
3.CRISPR-Cas9敲除细胞系
sgRNA连接到LentiCRISPRv2质粒(Addgene，52961，美国)上，然后将连接好的质粒与包装质粒PAX2和VSVG转染Lenti-XTM 293T细胞。转染48h后，收集上清，即可得到慢病毒。shMYCN慢病毒从SigmaAldrich购买。
ACSS2 gRNA-1(SEQ ID NO.4):5’-ATTTCTGTTGCAGAATTCTG-3’；
ACSS2 gRNA-2(SEQ ID NO.5):5’-ATTCTGGGGAGACATTGCCA-3’；
ACSS2 gRNA-3(SEQ ID NO.6):5’-TACTGGAAGACTCCATGCCC-3’。
sgRNA序列在网站http://crispr.mit.edu/上设计。
4.免疫荧光
将培养于8孔小室的细胞用冷1×PBS洗涤，4％多聚甲醛固定10min,0.02％TritonX-100渗透性15min，然后在室温下用3％BSA封闭1h。用兔抗pan-ac-H3/H4多克隆抗体(Abcam公司，ab47915 and 177790，英国)孵育样品，4℃过夜。第二天，用Alexa Flour 488山羊抗小鼠(ThermoFisher Scientific,A10680)或Alexa Flour 546山羊抗兔IgG(ThermoFisher Scientific,A21069)室温孵育样品1h。接着用DAPI进行核染。在激光共聚焦扫描显微镜下观察细胞内定位。
5.免疫组织化学染色
人神经母细胞瘤组织和小鼠肿瘤组织在冷冻切片机上切成5μm厚的切片。石蜡切片在IHC染色前进行复水。切片在TBS+0.025％Triton X-100中浸泡2×5min，在室温下用含1％BSA的10％正常血清封闭1小时，然后在4℃下与1﹕100稀释的兔多克隆抗ACSS2(CellSignaling Technology，3658，美国)、MYCN(Cell Signaling Technology，84406)、Ki67和cleaved-caspase 3抗体(Cell Signaling Technology，34330、9661)孵育过夜。在PBS缓冲液中大量洗涤后，切片使用
Figure BDA0004156814440000041
EliteABC-HRP试剂盒按照试剂产品说明书孵育。最后，采用LiquidDAB+双组分系统(Agilent,K346811)检测信号。ImageJ法检测ACSS2和MYCN的表达。
6.免疫沉淀和免疫印迹
用PBS洗涤3次，再用RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH 7.4,0.5％脱氧胆酸钠，1％NP-40,0.1％SDS,1mM EDTA,10mM丁酸钠和蛋白酶抑制剂混合物)裂解细胞，随后通过离心清除裂解产物。使用指示的一抗将1mg蛋白质用于免疫沉淀抗ACSS2(CellSignaling Technology,3658)，CBP(Cell Signaling Technology,7389)抗体或抗Flag或HA抗体(M8823,SAE0197,SigmaAldrich)，然后用RIPA缓冲液洗涤3～5次，用SDS-PAGE凝胶分离免疫复合物。免疫印迹，用10％SDS-PAGE分离40μg蛋白并转移到NC膜上，然后按照试剂说明书与相应一抗4℃过夜孵育。采用LI-COR
Figure BDA0004156814440000042
CLx成像系统或BIO-RAD ChemiDoc与SuperSignalTMWest Pico PLUS化学发光衬底进行检测。
7.实时定量PCR和RNA测序
使用RNeasy Mid试剂盒(Qiagen，74106，德国)从细胞中分离总RNA，按照说明书的操作程序，使用iScriptTMcDNA Synthesis kit试剂盒(Bio-Rad,1708891，美国)反转录得到cDNA。使用iTaqTMUniversal
Figure BDA0004156814440000051
Green Supermix试剂盒(Bio-Rad,1725121)进行Real-time PCR(反应体系按照试剂盒说明书配制)，并在Bio-Rad CFX Real-time PCR检测系统上运行。actin作为内参，所使用的引物序列如表1中所示。为了揭示在神经母细胞瘤细胞中受ACSS2缺陷调控的差异表达基因，将RNA样本送到NOvogene公司进行RNA-seq，并用DEseq2进行差异基因表达分析。Real-time PCR的扩增程序是：95℃3分钟；95℃10秒，60℃30秒，72℃30秒，39个循环；65℃5秒，95℃5秒。
表1引物序列
Figure BDA0004156814440000052
8.基因集富集分析(GSEA)
利用基因集富集分析(GSEA)的信噪比排序指标，我们根据它们在BE(2)-C细胞(siACSS2 vs.siControl)中的关联基因进行了排序。采用GSEAV4.1.0进行GSEA分析。当错误发现率(FDR)小于0.25时，Geneset被认为是显著的。
9.邻近连接试验(PLA)
通过邻近连接实验检测ACSS2和CBP的相互作用。将细胞在NuncTMLab-TekTMII玻片中放置约12小时，然后在室温(RT)下用4％PFA在PBS中固定20分钟。用5mg/ml的WGA在PBS中染色细胞膜，并在黑暗中孵育5分钟。然后，在4℃的
Figure BDA0004156814440000061
抗体稀释缓冲液中，用一抗染色细胞过夜。将载玻片与原位PLA探针(#DUO92002 and#DUO92004,SigmaAldrich)在37℃孵育1小时。使用DuolinkTMIn Situ Detection reagent RedKit试剂盒(#DUO92008,SigmaAldrich)进行后续的连接和检测。用激光共聚焦扫描显微镜观察荧光图像，用ImageJ软件进行定量分析。
10.染色质免疫沉淀(ChIP)分析
根据说明书，使用
Figure BDA0004156814440000062
Plus Enzymatic Chromatin IP Kit试剂盒(CellSignaling technology,Danvers,MA,9004&9005)在神经母细胞瘤细胞中进行ChIP检测。将细胞在培养基中1％甲醛中在室温下交联10分钟，同时在振荡装置上缓慢振荡。将染色质超声剪切成0.5～1kb的片段，然后加入相应的抗体(ACSS2、CBP或SERBP-1)或正常IgG，在室温超声水浴中孵育15min。用1ml裂解缓冲液洗涤4次，用100l 10％Chelex 100重悬。用DNA纯化试剂盒纯化DNA，用10μl ddH2O溶解。最后，用相应引物对纯化的DNA进行定量PCR(使用表1中的引物)。以抗组蛋白H3抗体和抗IgG抗体分别作为阳性对照和阴性对照。
11.细胞活力测定
采用CCK-8试剂盒检测ACSS2或MYCN缺陷对细胞活力的影响。将1×103个细胞培养于96孔板中培养液中含有10％FBS，做6个复孔。每孔加入10μl CCK-8试剂，37℃孵育1.5h。分别在0、24、48、72、96、120和144h进行检测，用酶标仪在450nm处测定反应的吸光度。
12.细胞增殖测定
根据试剂说明书进行基于BrdU的细胞增殖实验。将1*104神经母细胞瘤细胞接种于96孔板中。在含1×BrdU溶液的2％FBS培养基中，分别用乙酸钠、丙酮酸钠、柠檬酸钠、棕榈酸钠或谷氨酰胺处理细胞24h。用固定/变性液室温孵育30min后，每孔加入100μl 1×BrdU检测抗体溶液，室温轻轻振荡孵育1h。然后用300μl 1×洗涤缓冲液洗涤细胞2次，与荧光偶联二抗孵育。用激光共聚焦扫描显微镜观察荧光图像，用ImageJ软件进行定量分析。
13.葡萄糖摄取测定
在葡萄糖摄取测定中，将100μl细胞(2×103细胞/孔)接种于96孔板中约8-12小时。然后用PBS洗涤细胞两次，并在无血清培养基中饥饿过夜。用PBS洗涤细胞3次，然后用含2％BSA的100μl KRPH缓冲液进行40分钟的葡萄糖饥饿。加入10mL 10mM 2-DG，混合，孵育20分钟。葡萄糖摄取比色试剂盒检测葡萄糖摄取。
14.锚着依赖性和非依赖性细胞增殖分析
对于锚定非依赖性细胞增殖试验，将约400个细胞接种到6孔培养板的每孔中，并在37℃孵育14天，之后在PBS中洗涤两次细胞，并在室温下用0.5％结晶紫染色15分钟。采用佳能G9数码相机拍照，统计并分析各条件下细胞群落形成数。
在锚定非依赖性细胞增殖实验中，将上述稳定敲除的细胞经胰蛋白酶消化、计数后接种于DMEM中底层0.6％低温琼脂和顶层0.4％琼脂的6孔板中。细胞培养4周后，固定并用氯化碘硝基四氮唑染色。对直径大于100μm的克隆进行计数和分析。
15.组蛋白提取
每组取3个10cm培养皿的神经母细胞瘤细胞提取组蛋白。细胞融合度为80％时，瞬时转染siRNA(即前面的siACSS1、siACSS2、siACSS3)或用ACSS2抑制剂(ACSS2inhibitorSelleckchem,美国,货号S8588)处理。用PBS洗涤细胞，用Triton萃取缓冲液(TEB:含0.5％Triton X 100、2mM Phenylmethanesulfonylfluoride、0.02％NaN3的PBS)裂解细胞，在温和搅拌的情况下冰上裂解10分钟。以2000rpm离心10分钟后，取出上清液并弃用。然后，用PBS洗涤3次，并在100μl 0.2N HCl中重悬。Western blot检测细胞培养上清液。
16.小鼠异种移植瘤形成
计数神经母细胞瘤细胞(3x106)并立体定向注射到8周龄雄性裸鼠的右半大脑。使用卡尺在指定时间监测肿瘤生长情况，体积计算公式为V＝L×W2×0.5，其中L为最长径，W为最短径。21天后处死小鼠，解剖肿瘤并拍照。每天持续观察，直到小鼠安乐死。
17.统计分析
采用ImageJ软件对免疫荧光图像进行定量分析。数据以平均值±标准差表示。两组间比较采用t检验。多组间比较采用单因素方差分析。当方差不齐时，采用Student-Newman-Keuls法或Dunnett's T3法进行两两比较。采用GraphPad Prism和SPSS软件进行统计分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
二、结果
1.ACSS2表达升高与MYCN表达和不良临床预后相关。
代谢重新编程是癌症的标志之一。乙酰辅酶A是肿瘤细胞需要应对增加的代谢需求和表观遗传调控施加的不受控制的增殖状态的代谢物。在哺乳动物细胞中，乙酰辅酶A在线粒体、细胞质和细胞核内产生。如图1A，线粒体乙酰辅酶a主要通过几种途径产生:丙酮酸通过丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)产生，脂肪酸-过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPAR)氧化，谷氨酰胺通过谷氨酸脱氢酶(GDH)和谷氨酰胺酶(GLS)产生，醋酸通过线粒体酰基辅酶A合成酶短链家族成员1和3(ACSS1/3)产生。在细胞质和细胞核中，乙酰辅酶a通过ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)从柠檬酸盐中生成，通过酰基辅酶A合成酶短链家族成员2(ACSS2)从乙酸中生成。为了识别神经母细胞瘤中的差异重编程代谢途径，并建立乙酰辅酶A和MYCN表达水平及临床结果之间的相关性，我们比较了GEO数据库中649例具有高或低MYCN表达水平的NB患者的基因表达谱[GSE45547(n＝649with survival of476)]，发现ACSS2表达水平低的肿瘤患者比ACSS2表达水平高的肿瘤患者有更长的总生存期，这与MYCN一致。MYCN水平与ACSS2表达水平呈正相关，但和ACSS1/3的表达水平不呈正相关(图1B-C)。同时，通过比较MYCN多拷贝和MYCN单拷贝数的神经母细胞瘤的基因表达谱，我们发现ACSS2的表达与MYCN扩增相关(图1D和图4A)。这些结果表明，ACSS2通过捕获乙酸盐作为碳源在胞质和胞核中介导乙酰辅酶A的生物合成可能是MYCN表达和神经母细胞瘤恶性进展的关键。
为了进一步研究ACSS2和MYCN表达之间的关系，我们对74例神经母细胞瘤样本和14例周围神经组织进行了ACSS2和MYCN蛋白表达的免疫组织化学染色(IHC)。染色图像的统计分析表明，ACSS2和MYCN在神经母细胞瘤中均显著上调，并且在统计学上正相关性(图1E-1F)。更重要的是，ACSS2和MYCN表达水平与神经母细胞瘤病理分期相关(图4B)，证实ACSS2表达与MYCN表达呈正相关。此外，我们进行了RNA测序(RNA-seq)来检测ACSS2缺陷的BE(2)-C细胞(MYCN多拷贝突变的神经母细胞瘤细胞)的转录组改变。差异基因表达分析鉴定出591个差异表达基因，其中485个下调基因，106个上调基因(图1G)。差异表达基因(DEGs)的分子功能富集分析显示，与ACSS2介导的表观遗传调控密切相关的转录因子结合、转录顺式调控区结合、转录调控区核酸结合、顺式调控区序列特异性DNA结合呈高聚类(图1G)。我们观察到与MYCN多拷贝突变神经母细胞瘤相关的转录因子在ACSS2缺陷细胞中降低，包括MYCN表达(图1I)。此外，我们检测了在ACSS2缺陷的MYCN扩增的人神经母细胞瘤细胞系BE(2)-C和IMR32中的MYCN表达。结果表明，敲低ACSS2显著降低了MYCN在转录和翻译水平(图1J-1K)。这些数据表明ACSS2表达和MYCN扩增在NB中是正相关的。
2.ACSS2介导的乙酸盐代谢促进MYCN多拷贝突变神经母细胞瘤发生发展。
为了确定ACSS2介导的乙酸盐代谢对MYCN多拷贝神经母细胞瘤形成的贡献，我们首先用乙酸盐，柠檬酸盐，棕榈酸，丙酮酸和谷氨酰胺处理BE(2)-C和IMR32细胞，观察到与柠檬酸盐，棕榈酸，丙酮酸和谷氨酰胺处理相比，用乙酸盐处理显著诱导细胞生长(图2A)。与此同时，细胞增殖率和克隆生长能力也有所提高(图2B和图5)，这表明醋酸盐代谢对神经母细胞瘤生长的关键贡献。此外，为了发现哪些酰基辅酶A合成酶参与了醋酸介导的神经母细胞瘤细胞生长，我们将针对ACSS1/2/3的小干扰RNA(siRNA)转染到BE(2)-C和IMR32细胞中，并证实了ACSS1/2/3的表达被有效敲低(图6A和图1J-1K)。我们观察到，与对照相比，ACSS2表达下调降低了细胞增殖率。然而，ACSS1和ACSS3敲低并不影响MYCN多拷贝突变神经母细胞瘤细胞生长(图2C)。这些发现说明了ACSS2介导的乙酸盐代谢对神经母细胞瘤细胞增殖的功能依赖性。
鉴于ACSS2高表达与不良临床结局相关，我们进一步研究了ACSS2敲除对BE(2)-C和IMR32细胞体外和体内致瘤性的影响。首先，我们通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术建立了ACSS2敲除稳定的BE(2)-C和IMR32细胞株(图2D，左)。由于MYCN在BE(2)-C和IMR32细胞中多拷贝，我们必须使用短发夹RNA(shRNA)来产生稳定的MYCN敲低BE(2)-C和IMR32细胞系(图2D，右)。我们发现，基因敲除ACSS2或化学分子抑制ACSS2抑制细胞增殖和克隆形成能力，这与这两种神经母细胞瘤细胞中MYCN敲低一致(图2E和图6B-6D)。我们通过将150万个NB细胞植入免疫缺陷裸鼠体内来评估体内致瘤性。BE(2)-C和IMR32细胞接种后6周可检出肿瘤，而ACSS2敲除组、ACSS2抑制剂组和MYCN敲除组的所有小鼠只有较小的肿瘤或未检出肿瘤(图2F和2G)。免疫组化分析Ki-67和cleaved caspase-3的表达强度，结果表明，在神经母细胞瘤细胞中ACSS2缺陷或抑制会阻碍细胞增殖并诱导细胞凋亡(图2H-2I和图6E-6F)。总之，这些发现揭示了ACSS2在促进MYCN多拷贝突变神经母细胞瘤发生中的致癌作用，并支持了ACSS2介导的乙酸盐代谢参与促进神经母细胞瘤细胞的增殖和肿瘤生长的假设。
3.ACSS2通过CBP(组蛋白乙酰化酶的亚型)调控的组蛋白乙酰化来调控MYCN的转录。
众所周知，ACSS2是哺乳动物细胞将乙酸盐转化为乙酰辅酶A的关键酶，并通过产生乙酰辅酶A作为组蛋白乙酰化的必要底物来发挥表观遗传调节剂的作用。我们假设ACSS2可能通过组蛋白乙酰化在转录水平调控MYCN的表达。为了验证我们的假设，我们首先在MYCN多拷贝神经母细胞瘤细胞中评估了ACSS2敲低或抑制对乙酰辅酶A水平和组蛋白乙酰化的影响。如图3A所示，我们观察到ACSS2缺陷的神经母细胞瘤细胞中乙酰辅酶A水平显著降低。免疫荧光和western blot检测组蛋白3和组蛋白4的乙酰化水平，包括泛组蛋白3/4、H3K9、H3K27、H4K5和H4K12的乙酰化水平。我们证明，在MYCN多拷贝神经母细胞瘤细胞中，ACSS2表达的缺失显著降低了组蛋白3和组蛋白4的乙酰化水平(图3B，图7和8A)，而ACSS1和ACSS3的表达缺失并没有降低组蛋白3和组蛋白4的乙酰化水平。为了进一步评估乙酸盐对组蛋白乙酰化的影响是否依赖于ACSS2的表达，我们用10mM乙酸钠处理MYCN多拷贝神经母细胞瘤细胞16小时。由于ACSS2缺乏，乙酸盐刺激的组蛋白3和组蛋白4乙酰化的作用被消除(图3C和图8B)。这提示ACSS2对组蛋白乙酰化的调控作用可能是通过乙酸盐和乙酰辅酶A依赖的方式实现的。
ACSS2是定位于细胞质和细胞核的主要酶，负责将乙酸盐转化为乙酰辅酶A，而乙酰辅酶A是蛋白质乙酰化的速率决定性底物。理论上，ACSS2介导的乙酰辅酶A的产生应该会增加位于细胞质和细胞核的蛋白质的整体乙酰化。然而，我们的初步数据(图3B)显示，在神经母细胞瘤细胞中，ACSS2敲低只抑制了H3K9/K27和H4K5/K12的乙酰化。这表明ACSS2可能与特异性乙酰转移酶协同，实现组蛋白指定残基的乙酰化。既往研究表明，ACSS2通过招募CBP并激活CBP在细胞核内的HAT活性来调节组蛋白乙酰化。为明确ACSS2与CBP是否直接相互作用调控MYCN转录，我们将Flag-ACSS2和HA-CBP质粒DNA共转染293T细胞。免疫共沉淀(Co-IP)实验结果显示，ACSS2与CBP相互作用(图3D)。同样，使用内源性核蛋白提取物的Co-IP实验进一步证实了在MYCN多拷贝神经母细胞瘤细胞中ACSS2和CBP之间的相互作用(图3E)。然而，ACSS2不能与其他组蛋白乙酰转移酶，如PCAF和GCN5相互作用(图9A)。同时，通过原位近端连接实验(PLA)检测ACSS2和CBP在MYCN多拷贝神经母细胞瘤细胞中的生理相互作用。以ACSS2-/-BE(2)-c和IMR32细胞为阴性对照，验证PLA方法的特异性。PLA结果显示，在MYCN多拷贝神经母细胞瘤细胞中，内源性ACSS2确实可以直接与内源性CBP相互作用，而不是与EP300相互作用(图3F和图9B)。
为了进一步研究ACSS2-CBP复合体调控MYCN转录的潜在机制，我们使用CBP抗体进行ChIP-qPCR以确定CBP复合体在MYCN启动子区域的结合。结果表明，CBP结合在MYCN启动子的-1450～-1556上，在ACSS2缺陷的神经母细胞瘤细胞中，CBP结合显著降低(图3G)。先前的研究表明，CBP将辅激活因子NCOA1募集到染色质上以上调基因表达，而辅抑制因子NCOR1与CBP结合以下调基因表达。ACSS2的异常表达是否会影响CBP调控复合体的组成和激活尚需阐明。采用抗CBP抗体进行Co-IP检测。ACSS2缺陷增加了NCOR1和CBP的结合，抑制了NCOA1和CBP之间的相互作用(图3H)。这表明，ACSS2缺陷通过招募辅抑制因子来抑制CBP的寡聚化而抑制CBP的激活。由于CBP介导组蛋白和基因表达的乙酰化，我们进一步使用乙酰化的H3K9,H3K27,H4K5和H4K12抗体进行ChIP-qPCR检测。如图3I和图10所示，ChIP-qPCR结果显示乙酰化的H3K9、H3K27、H4K5和H4K27分别富集在MYCN的启动子上。然而，在ACSS2缺陷的神经母细胞瘤细胞中，乙酰化H3K9和H4K5的结合显著降低。相反，敲低ACSS2并不影响MYCN启动子区乙酰化H3K27和H4K12的结合。总之，这些结果表明ACSS2通过CBP介导的H3K9和H4K5乙酰化来调节MYCN的表达。

Claims (9)

1.ACSS2基因作为靶标在筛选/制备治疗神经母细胞瘤的药物中的应用，其特征在于：调控ACSS2基因，ACSS2表达的降低缓解或抑制神经母细胞瘤的发展。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：通过调控ACSS2基因，抑制ACSS2介导乙酸生成乙酰辅酶A，降低组蛋白乙酰化，进而减少MYCN的转录，达到缓解或抑制神经母细胞瘤发展的目的。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：ACSS2通过CBP调控的组蛋白乙酰化来调控MYCN的转录。
4.抑制ACSS2基因表达的试剂制备治疗神经母细胞瘤的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：抑制ACSS2基因表达的试剂抑制ACSS2表达，抑制ACSS2介导乙酸生成乙酰辅酶A，降低组蛋白乙酰化，进而减少MYCN的转录，达到缓解或抑制神经母细胞瘤发展的目的。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述抑制ACSS2基因表达的试剂为小分子或低分子量化合物、ACSS2蛋白特异性结合剂或者核酸分子，所述ACSS2蛋白特异性结合剂包括针对ACSS2的抗体、肽抗体、凝集素、结合剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为siRNA。
8.检测ACSS2表达的试剂在制备用于诊断神经母细胞瘤或者神经母细胞瘤预后的试剂盒中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：ACSS2的高表达预示患者患有神经母细胞瘤，或者预示神经母细胞瘤患者的预后不良。
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