CN115969980A

CN115969980A - Rna解旋酶dhx33抑制剂在制备用于治疗胃癌的药物中的应用

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Publication number: CN115969980A
Application number: CN202211720770.4A
Authority: CN
Inventors: 张严冬; 温馥瑜; 廖德清
Original assignee: Shenzhen Keye Health Co ltd
Current assignee: Shenzhen Keye Health Co ltd
Priority date: 2022-12-30
Filing date: 2022-12-30
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2042-12-30
Also published as: CN115969980B

Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗或者辅助治疗胃癌药物中的应用。本发明确立了DHX33蛋白在胃癌发展中的重要作用，提供的RNA解旋酶DHX33抑制剂具有抑制DHX33解旋酶活力的作用，进而导致由DHX33功能缺失所介导的脂质过氧化，该抑制剂可以快速诱导经由脂类代谢异常所导致的癌细胞铁死亡，对胃癌细胞具有显著的抑制性，因此具有重要的医药开发价值。

Description

RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗胃癌的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，涉及RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗胃癌的药物中的应用。

背景技术

胃癌源于上皮胃黏膜细胞恶性肿瘤，在全球范围内的发病率和死亡率极高。基于2020年数据显示，全年约有108万新增患者和76万死亡患者，在癌症发病率和死亡率中属于前列。中国新发患者和死亡患者在全球中将近一半的占比，是胃癌的高发地区。胃癌的发生是一个多因素的复杂过程，是一个由外在因素和内在因素共同作用的结果。外在因素中有饮食，生活环境等因素影响；内在因素主要有遗传、免疫等因素。在有家族遗传史中，后代患癌的几率会增大年龄越大，发生胃癌的几率亦会增高。在正常的人体中抑癌基因、癌基因和一些生长因子的共同调控维持人机体动态平衡，当原癌基因与抑癌基因失去平衡后，患癌的几率加大。胃癌患者在病变前体内发生一系列复杂的反应过程，从胃炎演变至异型增生最终发展成胃癌。胃癌可分为四个肿瘤分子亚型：EB病毒阳性胃癌(占比9％)、微卫星不稳定胃癌(占比22％)、基因组稳定胃癌占比20％)和染色体不稳定胃癌(占比50％)。胃癌基于分子亚型进行分类可以为后续的治疗中提供更加准确的判断和药物的使用。因为胃癌具有高度异质性，预后效果很差，导致了胃癌在治疗中难度的增加。EB病毒阳性胃癌是一种比较独特的亚型，预后效果较好，通常是伴有淋巴细胞浸润；微卫星不稳定胃癌与基因组稳定胃癌的表达与程序性细胞死亡配体-1(PD-L1)存在正相关性，巨噬细胞、B细胞表达较多，更适合与免疫治疗。染色体不稳定胃癌有基因或染色体的冗余或缺失，这类肿瘤有相当数量的基因组扩增，有癌相关基因的拷贝数增加，由于基因不断突变，因此这个亚型的胃癌对于免疫治疗不敏感。

目前胃癌的治疗方法多，化疗仍是当前最常用的治疗手段，其中有双药化疗常用药物包括氟尿嘧啶类、顺铂、卡培他滨等联合曲妥珠单抗，单药化疗常用紫杉醇、多西他赛、伊立替康等。靶向治疗药物常用阿帕替尼或纳武利尤单抗，曲妥珠单抗等。靶向治疗在胃癌治疗中不多见，针对Her2阳性的胃癌病人一般使用赫赛汀(Herceptin，注射用曲妥珠单抗)来进行针对性的治疗。目前针对胃癌的靶点主要包括EGFR、HER-2、VEGF、VEGFR、mTOc-MET、HGF等，但效果显著的靶向药物并不多，且需要根据患者的病理特征和分子分型来筛选靶向药物，进行个体化治疗。

尽管随着诊断技术和治疗手段不断普及完善，胃癌的发病率增长有一定的缓解但由于胃癌特异性差且胃癌具有高度异质性预后效果很差治疗效果不尽人意，因此大部分胃癌患者五年生存率较低特别是晚期胃癌患者，五年生存率不足5％，在胃癌治疗领域中仍然缺乏有效的靶点和抑制剂。

发明内容

本发明的目的是，提供RNA解旋酶DHX33抑制剂及其在制备用于治疗或者辅助治疗胃癌的药物或组合物中的应用。

为实现本发明的目的，在第一方面，本发明提供了用于治疗或辅助治疗胃癌的RNA解旋酶DHX33抑制剂。在本发明中，RNA解旋酶DHX33抑制剂(即DHX33蛋白抑制剂)选自化合物A、B、C或其药学上可接受的盐或者前药中的至少一种：

化合物C

本发明首次公开了DHX33蛋白质可以作为靶点进行胃癌的治疗，因此在第二方面，本发明提供了上述RNA解旋酶DHX33作为新型胃癌治疗靶点的应用。

在第三方面，本发明提供了RNA解旋酶DHX33作为一种新型的胃癌病理组织的诊断及检测标志物的应用。

在第四方面，本发明提供了一种用于治疗或者辅助治疗胃癌的靶向药物，其中所述药物的靶点是RNA解旋酶DHX33，该靶向药物可以抑制DHX33解旋酶的活力，进而影响由DHX33蛋白所调控的癌细胞铁死亡过程。该靶向药物的有效成分为化合物A、B、C或者其药学上可接受的盐或者前药中的至少一种。

在第五方面，本发明提供了RNA解旋酶抑制剂在抑制胃癌细胞中脂肪酸代谢去饱和酶SCD1、FADS1或FADS2中的应用。

在第六方面，本发明提供了上述RNA解旋酶DHX33抑制剂作为由DHX33(DHX33基因)调控的胃癌细胞铁死亡诱导剂的应用，即DHX33抑制剂可以快速诱导胃癌细胞的铁死亡。铁死亡(ferroptosis)是铁离子依赖性的细胞死亡，是不同于细胞凋亡、细胞自噬的新型细胞死亡方式。脂肪酸代谢与细胞的铁死亡密切关联。脂肪酸代谢主要包括脂肪酸从头合成、脂肪酸氧化、脂肪酸的去饱和及加长而生成不同饱和程度和不同碳链长度的脂肪酸，其中，脂肪酸的去饱和酶主要包括：SCD、FADS1、FADS2，而SCD是其中的限速步骤酶。研究表明，脂肪酸代谢在癌症细胞中出现异常，很多癌症细胞有这几个脂肪酸去饱和酶的过表达。抑制SCD可以导致细胞质膜的脂类过氧化物生成，并进一步诱导细胞进入铁死亡。这一过程伴随铁离子的蓄积，是铁离子依赖的。

DHX33基因在NCBI上的参考序列编号为：NM_020162.4。

在第七方面，本发明提供了上述RNA解旋酶DHX33抑制剂在治疗或者辅助治疗胃癌中的应用。

在第八方面，本发明提供了上述RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗或者辅助治疗胃癌的药物或药物组合物中的应用。

在本发明的实施方案中，胃癌为DHX33蛋白表达阳性的。在本发明的实施方案中，在本发明的实施方案中，胃癌可以为前期化疗或者靶向药耐药性肿瘤。

在第九方面，本发明提供了上述RNA解旋酶DHX33抑制剂作为胃癌治疗中的癌细胞铁死亡诱导剂的应用，其中，癌细胞铁死亡是DHX33解旋酶依赖型。

在本发明的实施方案中，RNA解旋酶DHX33抑制剂的摄入频率或剂量可以由医师根据个体的身体状况、年龄、性别、体重等因素来确定。

在具体实施方案中，摄入频率范围可以是一天一次到三次。在本发明的实施方案中，RNA解旋酶DHX33抑制剂的摄入剂量需要保证药物的有效暴露量达到每天4000-7500ng·h/mL。在具体实施方案中，在小鼠中，RNA解旋酶DHX33抑制剂的口服剂量可以为25mg-300mg/kg一次，静脉注射剂量可以为2.5mg-25mg/kg一次。在具体实施方案中，在小鼠中，RNA解旋酶DHX33抑制剂的口服摄入剂量可以为每次例如35mg-290mg/kg，45mg-280mg/kg，55mg-270mg/kg，65mg-260mg/kg，75mg-250mg/kg，85mg-240mg/kg，95mg-230mg/kg，105mg-220mg/kg，115mg-210mg/kg，125mg-200mg/kg，135mg-190mg/kg，145mg-180mg/kg，或155mg-170mg/kg。当通过静脉注射施用时，在小鼠中，RNA解旋酶DHX33抑制剂注射一次的剂量可以为例如3.0mg-24.5mg/kg、3.5mg-24mg/kg、4.0mg-23.5mg/kg、4.5mg-23mg/kg、5.0mg-22.5mg/kg、5.5mg-22mg/kg、6.0mg-21.5mg/kg、6.5mg-21mg/kg、7.0mg-20.5mg/kg、7.5mg-20mg/kg、8.0mg-19.5mg/kg、8.5mg-19mg/kg、9.0mg-18.5mg/kg、9.5mg-18mg/kg、10.0mg-17.5mg/kg、10.5mg-17.0mg/kg、11.0mg-16.5mg/kg、11.5mg-16mg/kg、12.0mg-15.5mg/kg、12.5mg-15.0mg/kg或13.0mg-14.5mg/kg。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明确立了DHX33蛋白在胃癌发生发展中的重要作用，提供的DHX33抑制剂具有抑制DHX33解旋酶活力的作用，进而诱导胃癌细胞铁死亡。该DHX33抑制剂可以在体外和体内显著地抑制胃癌细胞的生长，从而达到治疗胃癌的目的，并因此具有重要的医药开发价值。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中代表性人类胃癌组织相比于正常胃组织的DHX33蛋白表达量明显偏高。

图2为本发明较佳实施例中用DHX33基因沉默处理后与对照组比较的转移性胃癌细胞KATOIII的DHX33蛋白表达和生长曲线图。

图3为本发明较佳实施例中用DHX33基因沉默处理后与对照组比较的转移性胃癌细胞KATOIII的克隆生长(Foci)图。

图4为本发明较佳实施例中用DHX33基因沉默处理后与对照组比较的转移性胃癌细胞KATOIII的软琼脂生长-悬浮独立生长的结果。

图5为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂A-C处理后的HGC27细胞半抑制浓度分析，其中图5-1：化合物A的半抑制浓度5.1nM，图5-2：化合物B的半抑制浓度20.1nM，图5-3：化合物C的半抑制浓度112.5nM。

图6为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂A-C处理后的SGC7901细胞半抑制浓度分析，其中图6-1：化合物A的半抑制浓度9.6nM，图6-2：化合物B的半抑制浓度21.1nM，图6-3：化合物C的半抑制浓度272.2nM。

图7为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂B处理后的SGC7901细胞克隆生长分析结果。

图8为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂B处理后的SGC7901软琼脂实验-悬浮独立生长分析结果。

图9为本发明较佳实施例中HGC27细胞用DHX33抑制剂B处理24h、48h、72h后的流式细胞点状图和用AnnexinV染色的流式细胞凋亡比率分析结果。

图10为本发明较佳实施例中HGC27细胞用不同剂量的DHX33抑制剂B处理24h后的流式细胞点状图和用AnnexinV染色的流式细胞凋亡比率分析结果。

图11为本发明较佳实施例中HGC27细胞用不同剂量的DHX33抑制剂B处理72h后的流式细胞点状图和用AnnexinV染色的流式细胞总体死亡比率分析结果。

图12为本发明较佳实施例中SGC7901细胞用不同剂量的DHX33抑制剂B处理72h后的流式细胞点状图和用AnnexinV染色的流式细胞凋亡比率分析结果。

图13为本发明较佳实施例中在不同时间用DHX33抑制剂B处理的胃癌细胞HGC27中脂质代谢去饱和酶基因的转录水平变化。

图14为本发明较佳实施例中HGC27细胞用DHX33抑制剂B处理16h后的细胞活性氧ROS的定量分析图。

图15为本发明较佳实施例中HGC27细胞用DHX33抑制剂B处理8h后的细胞活性氧ROS的定量分析图。

图16为本发明较佳实施例中HGC27细胞用DHX33抑制剂B处理16h后的细胞脂类过氧化物(LPO)的定量分析图

图17为本发明较佳实施例中HGC27细胞用DHX33子抑制剂B处理16h后的细胞谷胱甘肽(GSH)的定量分析图

图18为本发明较佳实施例中HGC27细胞用DHX33抑制剂B处理8h后的细胞谷胱甘肽(GSH)的定量分析图。

图19为本发明实施例中DHX33抑制剂B口服后的小鼠药物代谢暴露量分析数据。

图20为本发明实施例中DHX33抑制剂B对人胃癌荷瘤模型的生长抑制性分析。

图21为本发明实施例中DHX33抑制剂B对小鼠处理后的体重监测分析。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

1.细胞培养

人胃癌细胞株HGC27、SGC7901等购自碧云天生物技术有限公司(上海)，人晚期胃癌细胞KATO III购买自上海细胞库。前两种癌细胞均用RPMI-1640培养基培养，该培养基含有10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、添加非必须氨基酸和链霉素、青霉素。KATOIII细胞用IMDM培养基培养，其含有10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、添加非必须氨基酸和链霉素、青霉素。所有细胞的培养条件为37℃的二氧化碳培养箱，湿度60-70％.

2.慢病毒生产

为了研究DHX33在胃癌中的作用，本发明使用慢病毒介导的shRNA以沉默DHX33信使RNA。本发明采用质粒pLKO.1(Biovector Inc.)用于构建慢病毒载体，所述shRNA序列的基因通过限制酶切位点AgeI/EcoRI克隆到pLKO.1载体中。在sh-DHX33添加限制酶切位点AgeI/EcoRI，通过华大基因公司合成以下DNA序列：

sh-DHX33-前寡核苷酸：5’-CCGGGCTATCGCAAAGTGATCATTT CTCGAGAAATGATCACTTTGCGATAGCTTTTTG-3’，

sh-DHX33-后寡核苷酸：5’-AATTCAAAAAGCTATCGCAAA GTGATCATTTCTCGAGAAATGATCACTTTGCGATAGC-3’。

然后，将上述序列的RNA序列克隆到pLKO.1载体的限制酶切位点AgeI/EcoR中。得到具有敲低DHX33蛋白表达水平作用的慢病毒，所述慢病毒中含有上述慢病毒质粒。对照组：作为对照的小RNA(shScrambled)序列为：5’-CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG-3’。

本发明还提供所述慢病毒的制备方法，包括以下步骤：

用Lipofectamine 2000(Life Technologies)脂质体导入法在293T细胞中转染质粒混合物：具体操作方法是采用直径为10cm的细胞培养皿做转染，待293T细胞生长到90％的融合度时，将下述质粒混合，包括pLKO.1-shRNA(即上述慢病毒质粒)、pCMV-VSV-G、pCMV-dR8.2 dvpr，质粒混合的比例为9:8:1，使总DNA量达到每个培养皿12μg。其中，载体pLKO.1、pCMV-VSV-G、pCMV-dR8.2 dvpr购自Biovector Inc公司。

经过16-18h更换成含有抗生素(盘尼西林和链霉素)的培养基，再过24h或48h，用无菌移液管收集细胞培养基，1000rpm离心2min，将病毒分装于5mL的无菌离心管中，存放于-80℃冰箱。

3.蛋白质印迹分析

用添加有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Thermo Fisher)的RIPA缓冲液裂解细胞。在冰上孵育10min后，通过超声处理进一步破坏细胞裂解物。然后将全细胞提取物进行SDS-PAGE凝胶，每个样品的加载量为50μg蛋白质。然后将蛋白质转印到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。将膜在5％脱脂奶中封闭，将其在1×TBST缓冲液中在室温下孵育1h。在5％FBS中稀释一抗(用1×TBST稀释)，使之与膜在4℃孵育过夜。然后将膜用1×TBST缓冲液冲洗多次，并在室温下与5％FBS(用1×TBST稀释)中的HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗一起孵育2h。用ECL试剂盒(Thermo Fisher)显示印迹。抗体如下：抗GAPDH，Absin(abs830030)；抗DHX33，SantaCruz生物技术公司(B4)。

4.细胞生长曲线分析

将细胞用胰蛋白酶消化并重悬浮于细胞培养基中以产生单细胞悬浮液，进行细胞计数，然后在6孔板上以每孔5万个细胞接种，从铺板开始每天计算细胞的数量。

5.实时定量PCR

为了分析DHX33蛋白促进胃癌细胞生长的分子机理，使用定量PCR(SYBR greensupermix(Bio-Rad))分析癌细胞中重要的基因的表达变化。将待分析的细胞以合适密度铺到6孔板，第二天将适当浓度的化合物加入培养基，化合物处理细胞的时间为0h、4h、6h或者8h，然后收获细胞，提取RNA。之后对RNA样本进行定量PCR分析。待分析的几个目的基因为：FADS1、FADS2和SCD。引物均由IDT(http：//sg.idtdna.com/site)在线“realtime PCRtool”设计，购自BGI(深圳)公司。

针对人体细胞中参与细胞铁死亡基因的引物序列如下(所有引物都从5'-3')：

引物名称	序列
		H3.3-Forward	TGTGGCGCTCCGTGAAATTAG
H3.3-Reverse	CTGCAAAGCACCGATAGCTG
		SCD-Forward	CCTGGTTTCACTTGGAGCTGTG
SCD-Reverse	TGTGGTGAAGTTGATGTGCCAGC
		FADS1-Forward	CTGTCGGTCTTCAGCACCTCAA
FADS1-Reverse	CTGGGTCTTTGCGGAAGCAGTT
		FADS2-Forward	TGCAACGTGGAGCAGTCCTTCT
FADS2-Reverse	GGCACATAGAGACTTCACCAGC

6.细胞半抑制浓度IC₅₀值测定

将癌细胞株以1×10⁴个细胞/100μL/孔铺到96孔板上，等待细胞贴壁完全，将化合物以19nM、39nM、78nM、156nM、312nM、625nM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM的浓度添加到细胞培养基中，用多通道排枪混合均匀。待化合物和细胞孵育时间达到72h后，用CCK-8试剂(上海翊圣生物科技有限公司)按照标准流程添加到96孔板的培养基中，孵育1h后，用酶标仪读板(OD_450nm)，将实验重复3次，并绘制化合物在不同浓度下的抑制曲线，计算化合物的细胞半抑制浓度(IC₅₀)。图中曲线的纵坐标是细胞活度指数，横坐标是化合物浓度(μM)的LOG10值。

7.免疫组化分析

组织芯片购自合森医学(芯片编号：20191023R02)，总共有75例组织，均为胃癌或者癌旁组织。使用前需先60℃烤片半小时。将芯片中的组织在脱蜡液中脱石蜡并在一系列乙醇浓度逐渐降低的溶液中再水合。在蒸锅中用Tris缓冲液(pH 9.0)呈现抗原。然后将组织在含有1％H₂O₂的甲醇溶液中孵育以灭活内源性过氧化物酶。在室温下用5％FBS-PBS封闭30min后，将组织与第一抗体在4℃孵育过夜。然后根据制造商的建议使用DAKO试剂盒(丹麦DAKO公司)按照说明书进行。使用的抗体如下：anti-DHX33(购自SantaCruz生物技术公司)。

8.脂质过氧化物(LPO)

根据

脂质过氧化物比色法检测试剂盒(Elabscience公司)的说明书进行脂质过氧化物含量的检测，用酶标仪读板(OD_590nm)，按蛋白浓度计算LPO含量。在测定中，先将细胞用PBS缓冲液清洗后加胰蛋白酶消化后用培养基重悬并收集于1.5ml的EP管中，细胞数量5×10⁶个，在4℃条件下，1000xg离心10min,去掉培养基后加入300～500μl的PBS缓冲液，用超声破碎仪(宁波新芝)进行充分的超声裂解，再次于4℃条件下，离心10min(1500xg)，留取部分上清用于蛋白浓度测定。取上清液200μl于1.5ml EP管中，加入试剂盒中按比例配制的显色工作液，混匀，再加入试剂盒中的试剂三，混匀后45℃水浴60min，然后离心10min(1100xg)，取上清液200μl于96孔板中，用酶标仪在586nm处测定其OD值，并按公式计算分析。

9.还原性谷胱甘肽

细胞用PBS缓冲液清洗一遍，用细胞刮刮下细胞后加入2～5ml的PBS缓冲液，收集于1.5ml的EP管中，4℃离心10min(1000xg)，按照1x10⁶个细胞加入300～500μl磷酸缓冲液，用超声破碎仪(宁波新芝)使细胞充分破碎，4℃，离心10min(1500xg)。取0.1ml上清液，加入

还原性谷胱甘肽比色法检测试剂盒(Elabscience公司)中的试剂一0.1ml，混匀，离心10min(4500xg),取100μl上清液，加入试剂盒中的试剂二，酶标仪振板1min，静置5min，用酶标仪在450nm处测OD值，并分析结果。制备样本检测前，需要留取部分样本用于蛋白浓度测定，根据

还原性谷胱甘肽比色法检测试剂盒(Elabscience公司)的使用流程进行还原性谷胱甘肽含量的检测，用酶标仪读板(OD405nm)，按蛋白浓度计算GSH含量。

10.活性氧检测(ROS)

将癌细胞细胞以1×10⁵个细胞/2ml/孔铺到6孔板上，等待细胞完全贴壁，将化合物以不同的浓度添加到培养基中，利用

活性氧荧光法检测试剂盒(Elabscience公司)中提供的阳性(Positive)参考(铁死亡诱导剂作为阳性参考)。待化合物处理一定时间后，用

活性氧荧光法检测试剂盒进行活性氧检测，设置3个复孔，试剂DCFH-DA经过一系列的化学反应成为不能透过细胞膜的荧光物质DCF，用多功能酶标仪(PerkinElmer)绘制化合物在不同浓度下的活性氧含量的柱状图，通过OD值分析癌细胞的活性氧情况。DHX33抑制剂能够增加ROS含量，从而损害细胞甚至诱导细胞死亡。

11.软琼脂试验

将1.0×10⁴个细胞与4.0mL含0.3％琼脂和10％FBS的DMEM培养基混合，并加在基础琼脂(4.0mL凝固的含0.6％琼脂和10％FBS的DMEM培养基)上。将平板在37℃孵育，每3天检查一次，每周加入2.0mL含0.3％琼脂和10％FBS的DMEM培养基。观察菌落生长情况，2-3周后计数。

12.细胞的克隆生长(Foci)

将2.0×10³个细胞用10.0mL添加或者不添加抑制剂的完全培养基中培养(100mm细胞培养皿)，在37℃的二氧化碳培养箱种培养，每周更新培养基。观察细胞克隆生长情况，2-3周后，待细胞克隆长到足够大小，采用吉姆萨染色(Geimsa staining)，拍照记录统计。

13.小鼠异种移植模型

所有小鼠实验均遵循广东省实验动物操作标准指南。SPF级别的Balb/cNude雌性小鼠购自北京维多利华实验动物有限公司并接受标准的机构护理。待接种的细胞用胰蛋白酶消化并用PBS重悬至终浓度为每毫升1×10⁸个细胞。对6周龄裸鼠(Balb/c)小鼠进行皮下注射，沿其侧翼注射1×10⁷个细胞。待肿瘤生长到一定大小，小鼠经药物处理一段时间后，处死小鼠并解剖肿瘤进行拍照。

14.细胞凋亡分析

根据制造商的方案用凋亡试剂盒(上海Yeasen公司)进行凋亡测定。将细胞用胰蛋白酶(索莱宝生物技术有限公司)消化并重悬浮于细胞培养基中以产生单细胞悬浮液，进行细胞计数。每个样本计数100万个细胞，沉淀细胞并用磷酸缓冲液洗涤两次，然后用试剂盒中的结合液重悬。然后重悬于含有AnnexinV的工作溶液中，避光孵育15min，然后用低速离心(1000rpm离心5min)，用磷酸缓冲液清洗一次。将细胞通过35μm过滤膜(BectonDickinson)过滤，然后进行流式细胞分选仪(FACS)分析。

15.本发明化合物A、B、C的合成

本发明化合物B的合成方法可参见中国专利申请第2021062902433420号，化合物A和化合物C的制备方法介绍如下。

化合物A(AB29588)的合成

(1)化合物2的合成

将化合物1(350mg,2.52mmol,1.00eq)溶解到乙醇(2.00mL)和水(0.40mL)中，在20℃下将溴化氰(0.26g,2.45mmol,180μL,1.10eq)慢慢加入到上述混合液中。将反应液在70℃下搅拌2h。LCMS显示出化合物1被消耗完，并检测到所需的化合物分子量。将反应液在真空下浓缩。通过薄层色谱(二氯甲烷：甲醇＝5：1，2.00mL氨水)进行纯化。得到化合物2(80.0mg,487μmol,产率19.3％)为褐色油。LCMS:Ms：M+H⁺＝165。

(2)化合物A(AB29558)的合成

将化合物2(69.3mg,266μmol,1.00eq)溶解到N,N-二甲基甲酰胺(2.00mL)中，加入化合物5(70.0mg)和N,N-二异丙基乙胺(137mg,1.07mmol,185μL,4.00eq)，将六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷(152mg,293μmol,1.10eq)加入到反应液中，将反应混合液在100℃下搅拌12h。LCMS显示原料消耗完，并检测到所需的化合物分子量。将反应液在真空下浓缩。通过高效液相色谱进行第一次纯化(column:Welch Xtimate C18150*25mm*5μm；流动相：[water(NH₃H₂O)-ACN]；B％:25％-55％,8min)。通过高效液相色谱进行第二次纯化(column:Welch Xtimate C18150*25mm*5μm；流动相：[water(HCl)-ACN]；B％:16％-46％,8min)。得到化合物AB29558(8.68mg,19.4μmol,产率：7.28％，纯度：99％，盐酸盐)为白色固体。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 11.68-11.92(m,1.00H),8.27(br s,1.00H),7.25(d,J＝1.13Hz,1.00H),6.96-7.06(m,1.00H),6.86(s,1.00H),3.89(s,3.00H),2.44(d,J＝1.00Hz,3.00H),2.31(s,3.00H),1.97(s,3.00H).LCMS:Ms：M+H⁺＝407。

化合物C(AB29564)的合成

化合物AB29564和AB29565的合成

在化合物1(100mg,246μmol,1.00eq)中加入二甲基亚砜(1.00mL)，将叔丁醇钾(60.9mg,542μmol,2.20eq)加入到反应液中，然后将三甲基氯乙酸氯甲酯(74.3mg,493μmol,71.4μL,2.00eq)加入到反应液中，反应液在30℃下搅拌反应5h。LCMS显示有5％左右的原料剩余，检测到目标产物主峰生成。反应液中加入水(10.0mL)，用乙酸乙酯萃取两次(20.0mL*2)，合并有机相用饱和食盐水反洗一次(10.0mL)，分出有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩。粗品通过高效液相色谱分离纯化(column:Welch Xtimate C18150*25mm*5μm；流动相：[water(NH3H2O)-ACN]；B％:55％-85％，8min)，得到的产物再经SFC分离(column:DAICELCHIRALCEL OD(250mm*30mm,10μm)；流动相：[0.1％NH₃H₂O MeOH]；B％:35％-35％,C7.5；60min)，得到化合物AB29564(5.36mg,9.62μmol,收率3.90％，纯度93.2％)为灰白色固体，并且得到化合物AB29565(5.39mg,9.81μmol，收率3.98％，纯度94.6％)为灰白色固体。

化合物AB29564：¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δppm 7.38(br d,J＝8.63Hz,1H),7.25(s,1H),7.12(s,1H),6.79-6.94(m,1H),6.52(s,1H),6.06-6.30(m,2H),3.82(s,3H),2.55(s,3H),2.49(br s,3H),2.07(s,3H),1.14(s,9H).LCMS:Ms:M+H⁺＝520。

16.化合物针对靶点的抑制性分析

使用一系列浓度的化合物(浓度范围设定为1nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM、250nM、500nM、1000nM)进行体外DHX33蛋白解旋酶活力测定。DHX33蛋白的提取、解旋酶活力分析的具体方法参见CN112661754A。使用上述方法进一步分析化合物对DHX33解旋酶活力的抑制性。

本发明的化合物对DHX33解旋酶活力的半抑制浓度如表1所示。从表1可以看出，本发明的化合物对DHX33蛋白解旋酶的活力具有显著的抑制作用。

表1：化合物A、化合物B和化合物C对DHX33蛋白解旋酶活力的抑制性分析

*代表半抑制浓度≥400nM；

**代表100nM≤半抑制浓度＜400nM；

***代表20nM≤半抑制浓度＜100nM；

****代表半抑制浓度＜20nM。

17.数据统计分析

数据表示为平均值+SD。使用斯氏t检验(Student’s test)确定统计学显著性，P值<0.05表示差异显著，用*标示；如果P值<0.01，用**标示；如果P值<0.001，用***标示。

实施例1.DHX33蛋白在多种胃癌组织中高效表达

免疫组织化学分析DHX33蛋白在人胃癌组织中的表达

将石蜡包埋的组织芯片首先在60℃烘箱中孵育30min，然后迅速在组织透明脱蜡液中脱石蜡，并在一系列乙醇浓度(100％、95％、70％、50％和25％)逐渐降低的溶液中逐渐水合(每次轻轻摇动5min，每个浓度的乙醇溶液重复处理一次)，最在蒸馏水中继续水合10min。然后在蒸汽器中用50mM的Tris盐酸缓冲液(pH 9.0)呈现抗原，蒸汽加热40min，随后冷却到室温。然后将组织在含1％H₂O₂的甲醇溶液中孵育以灭活内源性过氧化物酶。在室温下用10％FBS封闭1h后，将组织与一抗在4℃孵育过夜。然后根据制造商的建议使用DAKO试剂盒(丹麦DAKO公司)进行标准方案。使用的抗体来源如下：anti-DHX33，Santa Cruz(SantaCruz生物技术公司)。实验结果(图1中显示染色的暗色圆形区域)显示，DHX33蛋白在多种人类胃癌组织(尤其在细胞核中)发生高表达。下文的表2同时提供了针对75种癌组织的数据，从这个统计数据可见，有大于30％的病理组织的DHX33蛋白高效表达。从病理切片的分析结果看，非肿瘤的组织区域和正常组织中DHX33表达较低。

表2.75例胃癌及癌旁组织的免疫组织数据，抗体：anti-DHX33

实施例2.敲低DHX33引起人胃癌细胞生长的抑制

癌细胞系KATO从中科院细胞库获得。这种细胞分别用编码小发夹RNA的慢病毒侵染，72h后收集细胞并提取总蛋白。具体提取蛋白的方法是将细胞悬于细胞裂解液中(20mMTris-HCl，150mMNaCl，1mM EDTA，1％Triton-X-100，1％SDS，并补加蛋白酶和磷酸酶的抑制剂)。构建得到DHX33稳定敲低及稳定表达细胞系。用免疫印迹技术分析DHX33蛋白在各个样品中的表达量，用抗-GAPDH的抗体分析总蛋白上样量。

结果如图2所示，对照组DHX33稳定表达体系shSCR-KATO III能检测到DHX33蛋白；实验组DHX33稳定敲低体系shDHX33-KATO III几乎检测不到DHX33蛋白。

为了分析癌细胞敲低DHX33后的表型，KATO III癌细胞中敲低了DHX33后，将对照组和DHX33敲低组的细胞按同等细胞数铺在6孔板上，分别在每天计数每孔细胞数目，一共计数6天。

结果如图2所示，对照组shSCR的细胞生长旺盛，融合度高；而敲低DHX33的细胞shDHX33-KATO III表现非常明显的停滞生长现象。说明在人类胃癌细胞中敲低DHX33会严重抑制细胞生长。

癌细胞有一个特征，即可以在极低的密度条件下扩增，而正常细胞在密度很低的条件下出现生长停滞现象。上述DHX33敲低的细胞和对照组细胞分别以5000个细胞的密度铺在直径为10cm的细胞培养皿上面。2个星期后，发现对照组的细胞形成多个扩增生长的克隆，而DHX33敲低的细胞则没有发生同样的生长现象，如图3所示。

癌细胞具有在三维培养体系中悬浮生长的能力，为了检测DHX33敲低对癌细胞这一能力的影响，进一步将上述DHX33敲低的细胞和对照组细胞以同样的细胞数悬浮在软琼脂培养基中，2周后，对照组的细胞已经形成了数个扩大增殖的三维克隆，而DHX33敲低的细胞则很少形成克隆，如图4所示。对克隆的计数和统计分析如图4所示，对照组和实验组有显著差异。

实施例3.DHX33抑制剂可以有效抑制胃癌细胞的生长增殖

为了分析DHX33蛋白对胃癌细胞的抑制作用，我们选择了三种不同的DHX33抑制剂(即化合物A-C)来处理不同的人体胃癌细胞。这几种化合物的合成方法和针对DHX33解旋酶活力的抑制数据如前所述。我们分别选择二种不同的代表性胃癌细胞株HGC27、SGC7901开展化合物的细胞抑制性试验。如图5-6所示，DHX33抑制剂对前述的两种不同的胃癌细胞均具有纳摩尔级别的细胞抑制性，而且细胞的抑制曲线显示下降幅度均可以超过50％。三种化合物中，化合物A具有相对较高的细胞抑制性，即活性较高，化合物C的活性最低，但也可以达到100纳摩尔左右的半抑制浓度。我们主要选择化合物B开展后续的代表性分析，化合物B的活性排在化合物A和化合物C中间。除了细胞的半抑制浓度之外，我们也进行了细胞的克隆生长的测试分析，其具体方法如前所述，我们选择代表性胃癌细胞SGC7901细胞开展实验。在采用20nM的浓度下，我们发现DHX33抑制剂均可以显著抑制胃癌细胞SGC7901的生长(图7)。除了细胞二维培养体系的分析之外，我们也在三维细胞培养体系中分析DHX33抑制剂对胃癌细胞的抑制性，这个实验是在软琼脂体系中开展的，如前所述。悬浮独立生长是癌细胞的一个主要特征，在DHX33抑制剂B(20nM)的处理下，我们发现胃癌细胞SGC7901几乎完全丧失了在软琼脂中进行悬浮独立生长的能力，不能形成聚集性增殖或者克隆(图8)。以上实验的结果表明，DHX33抑制剂对胃癌细胞具有显著的抑制作用。

实施例4.DHX33抑制剂可以部分诱导胃癌细胞的凋亡

为了分析DHX33抑制剂对胃癌细胞抑制性的分子机理，首先我们用不同浓度的化合物处理胃癌细胞，分析细胞的凋亡指数。分别用25nM的抑制剂B处理HGC27细胞24h、48h或72h，收获细胞后，用凋亡染色试剂盒(上海Yeasen公司)分析细胞的凋亡比率。如图9所示，实验数据显示，抑制DHX33蛋白后，HGC27细胞发生了一定程度的细胞凋亡，但是只在长时间(48h)药物处理的条件下，可以看到有一定的凋亡(凋亡比率增加10％)，而在药物处理的早期时间点，如24h，凋亡并未出现。更长时间的处理，如72h，化合物B处理HGC27细胞可见增加了30％左右细胞死亡率。短时间内，比如24h药物处理，如果增加化合物剂量，对凋亡有微小的增加，增幅不大(图10)。如果在72h处理条件下，增加剂量，可以看到HGC27细胞的凋亡随着药物剂量的增加而呈现上升趋势，但即使在最高浓度100nM的条件下，依然有近一半的细胞未出现凋亡(图11)。在另外的一种胃癌细胞SGC7901细胞中看到了DHX33抑制剂的类似结果。用500nM的化合物B处理72h，依然有50％的细胞未出现凋亡(图12)。数据分别呈现了细胞的散点图、凋亡细胞集群比率(不同样品的细胞在图上标示了不同浓度或者处理时间)。凋亡比率用数字标示出来。

上述实验结果证明，DHX33抑制剂对胃癌细胞具有一定的诱导凋亡作用，而且一般不是在早期的药物处理条件下。

实施例5.DHX33抑制剂可以调控胃癌细胞中的脂肪酸代谢酶---脂肪酸去饱和酶的表达

细胞生长离不开细胞膜的合成，尤其在癌细胞中，膜生成效率显著提高。研究表明，脂肪酸代谢对癌细胞的增殖至关重要。在多种癌细胞中，脂肪酸的合成异常活跃，尤其是细胞中脂肪酸的一些重要调控酶，例如脂肪酸去饱和酶，例如SCD1、FADS1、FADS2，都有高表达现象。为了分析DHX33抑制剂是否可以调控这些重要基因的表达，我们对DHX33抑制剂处理的细胞进行了实时定量PCR分析。HGC27细胞用DHX33抑制剂(化合物B)处理了不同时间，即0h、4h、6h、8h，从细胞中提取总RNA后，用逆转录酶转换成其互补DNA分子，利用实时定量PCR技术，用这些DNA作为模板分析上述各种基因的转录本水平，引物的序列如前述。如图13所示，在DHX33受到抑制的T24细胞内，我们发现几个参与脂肪酸代谢的酶，特别是脂肪酸合成中的限速步骤酶SCD1和FADS1及FADS2，均发生了基因表达的下调。这一信号通路在现在技术中是没有报道过的。

实施例6.DHX33抑制剂可以诱导胃癌细胞的铁死亡

铁死亡，最早于2012年由Scott JDixon提出，是一种铁依赖的区别于细胞凋亡、细胞坏死和细胞自噬的新的细胞程序性死亡模式，具有铁死亡特征的细胞死亡的报道可以追溯到上世纪50年代。铁死亡的敏感性与许多生物过程紧密相关，例如，与多不饱和脂肪酸代谢有密切关联。近期数据指向铁死亡中磷脂/脂质过氧化是主要的发生因素。所以多不饱和脂肪酸的代谢与癌细胞铁死亡的特殊敏感性密切关联。前期研究中也发现SCD1、FADS等基因的表达可以保护癌细胞铁死亡的影响。而我们已经发现DHX33促进胃癌细胞中多种重要的脂肪酸去饱和酶的高表达，DHX33抑制剂处理后的癌细胞其SCD1、FADS1、FADS2表达降低，所以这些基因的表达下调可能会诱导癌细胞的铁死亡。为了分析有关DHX33抑制剂是否引发胃癌细胞的铁死亡相关通路，我们开展几个代表性的分析测试。首先，在铁死亡途径中，标志性的物质是活性氧(ROS)的指标有显著的上升。我们用化合物B处理HGC27细胞，首先用不同剂量的化合物B，处理HGC27细胞16h，与阳性参照对比，我们发现按照同等数量的癌细胞计算，DHX33抑制剂可以显著诱导ROS的生成(图14)。我们进一步缩短了药物处理的时间，即从16h降到8h处理，处理HGC27细胞8h，发现DHX33抑制剂同样可以导致ROS的上升(图15)。铁死亡途径的主要因素是脂类过氧化物的生成和积累导致的，所以我们继续分析了DHX33抑制剂处理16h的细胞质膜中的脂类过氧化物(LPO)的含量。在这个实验中，我们使用了LPO的检测试剂盒(ELABSCIENCE)，如图16所示，用化合物B处理HGC27细胞16h后，LPO的水平有显著的提高，这个分析是在比较等量的总细胞蛋白量的水平上进行的。我们进一步分析了药物处理16h的HGC27细胞中的还原性谷胱甘肽(GSH)的含量，结果如图17所示，GSH的水平有显著的降低。我们进一步在药物处理8h后的HGC27细胞中分析了GSH的含量，如图18所示，可以看到GSH的浓度有明显的降低。由此，我们得出结论，DHX33抑制剂可以诱导胃癌细胞的脂类过氧化物的生成，进而导致细胞的铁死亡。

实施例7.DHX33抑制剂的动物体内药代动力学分析

DHX33抑制剂虽然可以在体外明显抑制癌的细胞生长，但是其在体内的药效发挥会受到体内药代动力学的影响，选择化合物B进行药代动力学分析。针对化合物B，进行小鼠体内的药物代谢动力学分析。静脉注射用化合物样品的制备：用PEG400溶解化合物B，然后加入HS-15(BASF)，混合为均一溶液后，再加入无菌生理盐水配成澄清的溶液，最终的化合物B的浓度为0.5mg/ml，各物质的比例为：8％PEG400，2％HS-15,90％生理盐水。药物制剂澄清后，用于小鼠尾静脉注射，注射剂量为5mg/kg。灌胃化合物样品的制备：将化合物B溶解PEG400中，加入Phorsal 50PG(购自上海新睿生物科技有限公司)，使得最终辅料比率为20％PEG400+80％Phorsal 50PG，用于小鼠的灌胃，灌胃剂量为50ml/kg。小鼠来源：北京维通利华实验动物技术有限公司(中国北京)。

小鼠数量：共6只，3只用于静脉注射，3只用于口服灌胃。

血浆样品收集：

静脉注射：注射后0.083h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h和24h。

口服灌胃：口服后0.25h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h和24h。

血浆样品收集及操作步骤：小鼠给药后进行静脉取血，每个时间点取血0.2mL。将血液样品放置于冰上含有EDTA的小管中，直至离心。血液样品在取血后的1h内用离心机以6800g离心6min，然后迅速置于-80℃冰箱内，剩余的血液处理掉。

样品分析和数据处理：

分析结果通过质量检验后确定。大于66.7％的质量检验的样品的准确度应该保持在已知数据的80-120％范围内。

标准参数，包括曲线下面积(AUC(0-t)和AUC(0-∞))通过FDA认证的药代程序Phoenix WinNonlin 7.0(Pharsight,USA)进行分析。图19显示了DHX33抑制剂B在小鼠给药后的各种药物暴露量。从图19可见，化合物B在摄入小鼠体内后，具有一定的生物吸收度，口服的生物利用度平均为10％。

实施例8.DHX33抑制剂可以有效抑制胃癌的生长和增殖

1、动物信息

种属及品系：Balb/c Nude小鼠。

性别及周龄：雌性，6周龄。

体重：18--22g，偏差约为体重均值的±20％。

接种动物数：10只。

动物来源：浙江维通利华实验动物技术有限公司。

2、动物饲养

居住条件：SPF环境，IVC小鼠笼，每笼4只。

温度：20-26℃。

湿度：40-70％。

光照：12h昼夜交替。

饲料：辐照大小鼠饲料，购自北京科澳协力饲料有限公司，自由进食。

饮用水：城市自来水，经过滤、高压灭菌后饮用。

垫料：玉米芯，购自北京科澳协力饲料有限公司，经高压灭菌后使用，每周更换一次。

适应性饲养：实验前给予小鼠不低于7天的适应性饲养期。

动物识别：每个鼠笼均挂有实验信息标示卡，其中包括小鼠信息、细胞接种信息、动物实验信息及实验人员信息等，小鼠用耳标法进行标记。

所有实验动物的操作和管理均严格遵守实验动物使用和管理指导原则。

3、溶媒处方及给药溶液储存条件

(1)受试物(化合物B)

化合物配置：称取适量粉末状态药物，先用PEG400在常温下溶解，然后溶解在加入Phorsal 50PG，获得5mg/ml的溶液。

给药溶液保存条件：-20℃保存(一次配置7天的药物，14天的实验周期内一共配制2次药物。需要分装好，放置在-20℃冰箱)。

(2)细胞株

人胃癌细胞SGC7901购自碧云天(上海)生物技术公司。

(3)培养基

RPMI-1640培养基和胎牛血清(FBS)均购自GIBCO公司(Grand Island,NY,USA)，基质胶(Matrigel)购自BD公司(Franklin lake,NJ,USA)。

4、实验设计

实验设计如表3所示：

表3.受试物对人胃癌细胞SGC7901 Balb/c裸鼠异种移植瘤生长抑制作用研究方案

注：NA表示不适用，PO表示灌胃，BID表示一天两次灌胃，Vehicle表示溶媒组。

5、实验方法

(1)模型建立

SGC7901细胞培养于含10％FBS的RPMI-1640培养基，维持在含5％CO₂的37℃饱和湿度培养箱中。收集对数生长期细胞，调整细胞浓度至每毫升5×10⁷个细胞。在无菌条件下，接种0.1mL细胞悬液至小鼠右侧背部皮下，接种浓度为5×10⁶个细胞/0.1mL/小鼠。

(2)分组及给药观察

在肿瘤平均体积达到150mm³时，将动物按肿瘤体积随机分组，使各组肿瘤体积差异小于均值的10％，分组当日记为Day 0，并按照动物体重开始给药。给药期间，每周2次测定动物体重，每日观察记录动物临床症状。个别动物体重如果与Day 0相比下降超过15％(BWL≥15％)，将做停药处理，直至动物体重恢复后(BWL<15％)，恢复给药。

实验终点说明：

实验终点最后一次称量结束后，用CO₂安乐死处死剩余动物，取瘤称重并拍照记录。

从图20可见，DHX33抑制剂处理后的小鼠肿瘤，与对照组相比，有明显的抑制现象。对照组和实验组小鼠在起始时间点(即开始分组，化合物处理之前)的肿瘤平均体积都是150mm³左右，但在14天药物处理之后，肿瘤的增长指数对照组明显大于给药组小鼠。值得一提的是，本实验中所用化合物B的体内药物代谢数据不是在最佳条件下获得的。针对该化合物的机体摄入频率和剂量没有进行最佳组合分析，显示生物利用度偏低，但依然可以检测到化合物B在体内对肿瘤的抑制性。

用较高剂量(50mg/kg，一天两次)的DHX33抑制剂(化合物B)处理小鼠14天的过程中，也对各组小鼠的体重进行跟踪监测。检测结果显示(图21)，小鼠没有明显的体重减低现象。与对照组相比，小鼠的行为和体重正常。以上实验数据表明，本发明中DHX33抑制剂对人体的胃癌具有显著的体内和体外的抑制性，并且在使用的剂量范围内，没有看到对个体有明显毒副作用。DHX33抑制剂可以作为治疗人胃癌的一种新型的治疗手段。

Claims

1.RNA解旋酶DHX33作为新型胃癌治疗靶点的应用。

2.RNA解旋酶DHX33作为一种新型的胃癌病理组织的诊断及检测标志物的应用。

3.用于治疗或辅助治疗胃癌的DHX33抑制剂，其特征在于，所述抑制剂选自化合物A、B、C或其药学上可接受的盐或者前药中的至少一种，

4.RNA解旋酶抑制剂在抑制胃癌细胞中脂肪酸代谢去饱和酶SCD1、FADS1、FADS2中的应用，其中，所述抑制剂如权利要求3所述。

5.RNA解旋酶抑制剂作为诱导胃癌细胞铁死亡的诱导剂的应用，其中，所述抑制剂如权利要求3所述。

6.RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗或者辅助胃癌的药物或者药物组合物中的应用，其中，所述抑制剂如权利要求3所述。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述胃癌为DHX33蛋白表达阳性。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述胃癌可以为前期化疗或者靶向药耐药性肿瘤。

9.RNA解旋酶DHX33抑制剂作为胃癌治疗中的癌细胞铁死亡诱导剂的应用，其中，所述癌细胞是DHX33解旋酶依赖型，所述RNA解旋酶DHX33抑制剂如权利要求3所述。