JP2022515504A - グルタチオン（ｇｓｈ）代謝経路阻害剤を含むｓｗｉ／ｓｎｆ複合体欠損がんの治療方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、グルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤を含むＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がんを治療するための方法、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がんにおける治療のためのグルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤を含む医薬組成物、及びＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がんの治療に使用するためのグルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤を提供する。本発明はまた、グルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤に対して感受性のある患者を検出及び／又は選択するための方法を提供する。

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り ウェブサイトのアドレス： （１）ｈｔｔｐｓ：／ｗｗｗ．ｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｃａｎｃｅｒ－ｃｅｌｌ／ｆｕｌｌｔｅｘｔ／Ｓ１５３５－６１０８（１８）３０５８１－６ （２）ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｃｍｓ／１０．１０１６／ｊ．ｃｃｅｌｌ．２０１８．１２．００９／ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ／２４３２２３３１－９ｆ６７－４１７ｄ－８０３４－ａ９２ａ１３ｂ５ｃ９ｃ７／ｍｍｃ１．ｐｄｆ （３）ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ａｃｔｉｏｎ／ｓｈｏｗＰｄｆ？ｐｉｉ＝Ｓ１５３５－６１０８％２８１８％２９３０５８１－６ （４）ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｃａｎｃｅｒ－ｃｅｌｌ／ｐｄｆＥｘｔｅｎｄｅｄ／Ｓ１５３５－６１０８（１８）３０５８１－６ （５）ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｃｅｌｌ．２０１８．１２．００９ 掲載日：平成３１年１月２４日 ［刊行物等］ Ｔｈｅ ４ｔｈ Ａｓｉａ－Ｐａｃｉｆｉｃ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｌａｐａｒｏｔｏｍｉｃ ａｎｄ Ｌａｐａｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ （ＡＰＯＬＬＯ） Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ 開催日：令和１年５月１８日 ［刊行物等］ 第２３回日本がん分子標的治療学会学術集会 抄録集 頒布日：令和１年５月 ［刊行物等］ 第２３回日本がん分子標的治療学会学術集会 開催日：令和１年６月１３日 ［刊行物等］ Ｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｖ １７ｔｈ ＪＢＳ Ｂｉｏｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ 開催日：令和１年９月１４日 ［刊行物等］ 第７８回日本癌学会学術総会 開催日：令和１年９月２８日 ［刊行物等］ ウェブサイトのアドレス： （１）ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄｉｒｅｃｔ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ａｒｔｉｃｌｅ／ａｂｓ／ｐｉｉ／Ｓ０００６２９１Ｘ１９３２２０４１？ｖｉａ％３Ｄｉｈｕｂ （２）ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄｉｒｅｃｔ．ｃｏｍ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ－ａｎｄ－ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ－ｒｅｓｅａｒｃｈ－ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ／ｖｏｌ／５２２／ｉｓｓｕｅ／２ （３）ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｂｒｃ．２０１９．１１．０７８ 掲載日：令和１年１１月２２日

関連出願の相互参照

この出願は、２０１８年１２月２７日に出願された米国仮出願第６２／７８５，４５８号及び２０１９年９月１９日に出願された米国仮出願第６２／９０２，４８０号に対し、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張しており、それぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、グルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤を含むＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がんを治療するための方法、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がんにおける治療のためのグルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤を含む医薬組成物、及びＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がんの治療に使用するためのグルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤に関する。

ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体は、もともと酵母では、接合型スイッチング（ＳＷＩ）又はショ糖発酵（ＳＮＦ）に対する細胞応答に重要なタンパク質複合体として説明されていた。最近、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体は、いくつかのヒト疾患、特にがんに関連付けられている。ＳＷＩ／ＳＮＦクロマチンリモデリング複合体のサブユニットをコードする遺伝子の機能喪失型変異は、すべてのヒトのがんの約２０％に見出される。このような変異は、転写のためのクロマチンリモデリング、ＤＮＡ損傷修復、ＤＮＡ複製、及びクロマチン分離に障害をきたすため、転写ホメオスタシスを妨害することによって腫瘍形成を促進すると考えられている。ＳＷＩ／ＳＮＦクロマチンリモデリング複合体の成分をコードするＡＲＩＤ１Ａ遺伝子は、いくつかの難治性がんでは頻繁に変異が認められる。前記遺伝子は、卵巣明細胞がん（ＯＣＣＣ）の約４６％、胃がんの３３％、胆管がんの２７％及び膵臓がんの１５％で変異しており［非特許文献１～４を参照］、これらのがんについてはすべて効果的な分子標的療法を欠いている。さらに、ＡＲＩＤ１Ａの欠損は、様々ながんの予後不良と関連している［非特許文献５を参照］。したがって、これらの難治性のがんに対する有効な治療法を開発するために、ＡＲＩＤ１Ａの欠損によって引き起こされる脆弱性を特定することに多大な努力が注がれてきた［非特許文献６を参照］。

同様に、ＳＭＡＲＣＡ２（ＢＲＭ）、ＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１）、ＳＭＡＲＣＢ１、ＰＢＲＭ１などのＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の他の成分も、様々ながんで変異していることが知られている［非特許文献７を参照］。
酸化ストレスのホメオスタシスの調節は、細胞の生存にとって重要である。活性酸素種（ＲＯＳ）は酸化ストレスを引き起こす。細胞のＲＯＳレベルは、ＲＯＳの生成と排除のバランスによって決定され、抗酸化防御メカニズムによって制御される。高レベルのＲＯＳは、細胞損傷と細胞死を引き起こす。したがって、抗酸化防御システムを標的にすることは、抗がん治療戦略であり得る。グルタチオン（ＧＳＨ）は、グルタミン酸システインリガーゼ触媒サブユニット（ＧＣＬＣ）とグルタミン酸システインリガーゼ修飾サブユニット（ＧＣＬＭ）で構成されるＡＴＰ依存性酵素グルタミン酸システインリガーゼシンテターゼ（ＧＣＬ）、及びＧＳＨシンテターゼ（ＧＳＳ）によりシステイン、グルタメート及びグリシンから合成される豊富な抗酸化トリペプチド分子である［非特許文献８を参照］。ＧＣＬは、ＧＳＨ合成中にシステインとのグルタメートライゲーションの律速段階を触媒する。システインは、ＧＳＨ合成の律速前駆体基質である。細胞内システインレベルは、シスチン／グルタミン酸トランスポータＸＣＴをコードするＳＬＣ７Ａ１１によって制御される。

慣用的分子標的薬は、がん細胞の増殖を活性化する遺伝子変異を選択的に阻害することができるが、遺伝子変異が検出され得ない多くの患者は、分子標的薬の標的ではない。しかしながら、分子標的薬を遺伝子の機能喪失型変異に適用することはできない。したがって、遺伝子の機能喪失型変異には新しい治療法が必要とされている。

遺伝子のいくつかの機能喪失型変異により、がん細胞に創薬可能な脆弱性がもたらされる。「合成致死性」とは、２つの遺伝子間の相互依存関係によって定義され、すなわち、どちらかの遺伝子のみが失われるのではなく、２つの遺伝子が同時に失われることが細胞死につながることを意味する。したがって、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の変異を有する遺伝性乳がん及び卵巣がんに対するＰＡＲＰ１標的療法の成功に代表されるように、前述の有害な遺伝子変異を有するがん細胞は、合成致死標的の阻害に対して脆弱なものとなる［非特許文献９を参照］。

しかしながら、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がんの効率的な治療戦略は確立されていない。本発明の目標は、創薬可能な標的を特定することにより、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がんを治療するための有効な治療戦略を開発することである。

Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６３（２０１０）１５３２－１５４３ Ｓｃｉｅｎｃｅ３３０（２０１０）２２８－２３１ Ｎａｔｕｒｅ ５０５（２０１４）４９５－５０１ Ｃｅｌｌ１７３（２０１８）３０５－３２０ Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ６（２０１５）３９０８８－３９０９７ Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ７（２０１６）５６９３３－５６９４３ Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４１９（２０１８）２６６－２７９ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．２０１７，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ９５８４９３２ Ｌｏｒｄ ａｎｄ Ａｓｈｗｏｒｔｈ，２０１６

グルタチオン（ＧＳＨ）を構成するエレメントであるシステインを運ぶＳＣＬ７Ａ１１タンパク質の発現がＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がんでは抑制されるため、ＧＳＨのレベルも低下すること（「機能喪失によるメタボローム異常」と呼ばれる）が予想外にも発見された。この現象は、正常細胞では見られない。

さらに、ＧＳＨ自体又はＧＳＨ合成酵素が阻害されると、ＧＳＨのレベルが容易に低下し、次いでＲＯＳが過剰になり、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がん細胞のアポトーシスが誘導される。本発明者らは、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体遺伝子変異を有する様々ながんが、ＧＳＨ又はＧＳＨ合成酵素（「合成致死標的」）の阻害剤を使用して治療され得ることを発見した。この新しい治療法は「合成致死性治療法」と呼ばれている。具体的には、第１の実施形態において、本発明は、有効量のグルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤をそれを必要とする哺乳動物に投与することを含む、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がんを治療するための方法を提供する。

第２の実施形態において、本発明は、がんを有する患者におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体タンパク質欠損の存在を検出することを含む、グルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤に対して感受性のある患者を検出及び／又は選択するための方法を提供する。
第３の実施形態において、本発明は、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がんを治療するための有効量のグルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤を含む医薬組成物を提供する。

第４の実施形態において、本発明は、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がんの治療に使用するためのグルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤を提供する。
第５の実施形態において、本発明は、（ａ）グルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤、及び（ｂ）ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がんを治療するための使用説明書を含むキットを提供する。

図１－１は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞がＰＲＩＭＡ－１及びＡＰＲ－２４６に対し選択的に感受性があることを示す。図１－１のＡは、ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞の全細胞抽出物におけるＡＲＩＤ１Ａ及びβ－アクチンのイムノブロッティングを示す。図１－１のＢは、ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞の増殖を選択的に抑制する化合物のスクリーニングを示すスキームを示す。図１－１のＣは、３３４の化合物（それぞれ１０μＭ）で５日間処理した後の、ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞の細胞生存率のヒートマップを示す。赤い矢印は、ＰＲＩＭＡ－１で処理した試料による結果を示す。 図１－２は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞がＰＲＩＭＡ－１及びＡＰＲ－２４６に対し選択的に感受性があることを示す。図１－２のＤは、３．７μＭのＰＲＩＭＡ－１で５日間処理した後のＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞の細胞生存率を示している。図１－２のＥは、２．５μＭのＰＲＩＭＡ－１で１０日間処理した後のＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞のコロニー形成を示す。図１－２のＦは、３．７μＭのＡＰＲ－２４６で５日間処理した後のＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞の細胞生存率を示す。図１－２のＧは、２μＭのＡＰＲ－２４６で１０日間処理した後のＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞のコロニー形成を示す。 図１－３は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞がＰＲＩＭＡ－１及びＡＰＲ－２４６に対し選択的に感受性があることを示す。図１－３のＨは、示された細胞株の全細胞抽出物におけるＡＲＩＤ１Ａ及びβ－アクチンのイムノブロッティングを示す。 図１－４は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞がＰＲＩＭＡ－１及びＡＰＲ－２４６に対し選択的に感受性があることを示す。図１－４のＩは、１１μＭのＡＰＲ－２４６で３日間処理した後のがん細胞株の細胞生存率を示す。図１－４のＪは、１μＭのＡＰＲ－２４６で１４日間処理した後の卵巣がん細胞株のコロニー形成を示す。図１－４のＫは、ＡＲＩＤ１Ａ ｃＤＮＡの異所性発現を伴う又は伴わないＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇがん細胞の全細胞抽出物におけるＡＲＩＤ１Ａ及びβ－アクチンのイムノブロッティング（左）並びに１１μＭのＡＰＲ－２４６で３日間処理した後のこれらの細胞の細胞生存率を示す（右）。 図１－５は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞がＰＲＩＭＡ－１及びＡＰＲ－２４６に対し選択的に感受性があることを示す。図１－５のＬは、４０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した後、発現が変化したＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞の遺伝子数と、ＷｉｋｉＰａｔｈｗａｙｓデータベース分析による、ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞において発現が大幅に変化した６，４２９個の遺伝子の中で最も濃縮された上位５つの経路を示すベン図を示す。 図１－６は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞がＰＲＩＭＡ－１及びＡＰＲ－２４６に対し選択的に感受性があることを示す。図１－６のＭは、４０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した後のＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞における２つのアポトーシス関連経路の遺伝子発現プロファイルを示す。赤色矢印の頭は、ＮＯＸＡ遺伝子のプロファイルを示す。 図１－７は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞がＰＲＩＭＡ－１及びＡＰＲ－２４６に対し選択的に感受性があることを示す。図１－７のＮは、２０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した後のＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞におけるＮＯＸＡの相対的なｍＲＮＡレベルを示す。図１－７のＯは、４０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した後の、ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞の全細胞抽出物におけるＡＲＩＤ１Ａ、ＮＯＸＡ、及びβ－アクチンのイムノブロッティングを示す。図１－７のＰは、１０μＭのＡＰＲ－２４６で４８時間処理した後の、ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞における切断型カスパーゼ－３／７陽性アポトーシス細胞の検出を示す。図１－７のＱは、１５μＭのＡＰＲ－２４６で４８時間処理した後の、ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞におけるアネキシンＶ陽性アポトーシス細胞の検出を示す。図１－７のＲは、５０μＭのＡＰＲ－２４６で４８時間処理した後の卵巣がん細胞株におけるアネキシンＶ陽性アポトーシス細胞の検出を示す。（図１－２のＤ、Ｆ、図１－４のＩ、Ｋ、図１－７のＮ、Ｐ、Ｑ、及びＲ）のデータは、平均±ＳＤとして表される。図Ｓ１及び表Ｓ１も参照。表Ｓ１は、５日間３３４の化合物（１０μＭ）により処理した場合のＨＣＴ１１６ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯの細胞生存率を示している。図１－１～図１－７に関連する。 図２－１は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞がＧＳＨ阻害に対して脆弱であることを示す。図２－１のＡはＡＰＲ－２４６の候補標的の概略図を示す。図２－１のＢは、２４時間ＡＰＲ－２４６で処理した後のＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞における相対ＧＳＨレベルを示す。図２－１のＣは、２４時間ＡＰＲ－２４６で処理した後のＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞における相対ＴｒｘＲ活性を示す。図２－１のＤは、４８時間ＡＰＲ－２４６で処理した後のＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞における相対ＲＯＳレベルを示す。 図２－２は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞がＧＳＨ阻害に対して脆弱であることを示す。図２－２のＥは、４０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理したＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞のシグナル強度の、未処理細胞における対応するシグナル強度に対する比率のヒートマップを示す。図２－２のＦは、２５μＭ又は５０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した後の、ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞の全細胞抽出物におけるＪＮＫ、ホスホ－ＪＮＫ（ｐＪＮＫ）、及びβ－アクチンのイムノブロッティングを示す。赤色矢印の頭は、ＪＮＫのリン酸化型を示す。図２－２のＧは、５μＭのＡＰＲ－２４６で１６時間処理した後の、ＲＭＧ－Ｉ細胞、ＴＯＶ２１Ｇ細胞、及びＯＶＩＳＥ細胞における相対ＧＳＨレベルを示す。 図２－３は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞がＧＳＨ阻害に対して脆弱であることを示す。図２－３のＨは、５μＭのＡＰＲ－２４６で４８時間処理した後の、ＲＭＧ－Ｉ細胞、ＴＯＶ２１Ｇ細胞、及びＯＶＩＳＥ細胞における相対ＲＯＳレベルを示す。図２－３のＩは、３０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した後の、ＡＲＩＤ１Ａ ｃＤＮＡの異所性発現を伴う場合又は伴わない場合でのＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇがん細胞における相対ＧＳＨレベルを示す。図２－３のＪは、３０μＭのＡＰＲ－２４６で４８時間処理した後の、ＡＲＩＤ１Ａ ｃＤＮＡの異所性発現を伴う場合又は伴わない場合でのＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇがん細胞における相対ＲＯＳレベルを示す。 図２－４は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞がＧＳＨ阻害に対して脆弱であることを示す。図２－４のＫは、３０μＭのＡＰＲ－２４６で４８時間処理した後の、ＡＲＩＤ１Ａ ｃＤＮＡの異所性発現を伴う場合又は伴わない場合でのＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇがん細胞における細胞生存率を示す。図２－４のＬは、５ｍＭのＮＡＣ又は５ｍＭのＧＳＨ－ＭＥＥでの同時処理を行わない場合又は同時処理を行う場合における、４０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した後のＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞での相対ＧＳＨレベルを示す。図２－４のＭは、５ｍＭのＮＡＣ又は５ｍＭのＧＳＨ－ＭＥＥでの同時処理を行わない場合又は同時処理を行う場合における、４０μＭのＡＰＲ－２４６で４８時間処理した後のＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞での相対ＲＯＳレベルを示す。 図２－５のＮは、５ｍＭのＮＡＣ又は５ｍＭのＧＳＨ－ＭＥＥでの同時処理を行わない場合又は同時処理を行う場合における、４０μＭのＡＰＲ－２４６で４８時間処理した後のＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞での細胞生存率を示す。図２－５のＯは、５ｍＭのＮＡＣ又は５ｍＭのＧＳＨ－ＭＥＥでの同時処理を行わない場合又は同時処理を行う場合における、４０μＭのＡＰＲ－２４６で４８時間処理した後のＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞でのアポトーシスレベルを示す。（図２－１のＢ～図２－１のＤ、図２－２のＧ～図２－３のＨ及び図２－３のＩ～図２－５のＯ）のデータは、平均±ＳＤとして表されている。図Ｓ２－１～図Ｓ２－７も参照。 図３－１は、ＧＣＬＣがＡＲＩＤ１Ａ欠損がんの有望な合成致死標的であることを示す。図３－１のＡは、ＧＳＨ代謝経路に関与する分子とその生成物の阻害剤の概略図を示す。 図３－２は、ＧＣＬＣがＡＲＩＤ１Ａ欠損がんの有望な合成致死標的であることを示す。図３－２のＢは、ＧＳＨ経路遺伝子のノックダウン後、５日目でのＡＲＩＤ１Ａ発現ＲＭＧ－Ｉ細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞における細胞生存率のヒートマップを示す。図３－２のＣは、ＧＳＨ経路遺伝子のノックダウン後、３日目でのＡＲＩＤ１Ａ発現ＲＭＧ－Ｉ細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞における相対ＧＳＨレベルのヒートマップを示す。図３－２のＤは、ＧＳＨ経路遺伝子のノックダウン後、３日目でのＡＲＩＤ１Ａ発現ＲＭＧ－Ｉ細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞における相対ＲＯＳレベルのヒートマップを示す。 図３－３は、ＧＣＬＣがＡＲＩＤ１Ａ欠損がんの有望な合成致死標的であることを示す。図３－３のＥは、ＢＳＯ、スルファサラジン、化合物９６８、又は６－アミノニコチンアミドで３日間処理した後の、ＡＲＩＤ１Ａ発現ＲＭＧ－Ｉ細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞の細胞生存率を示す。 図３－４は、ＧＣＬＣがＡＲＩＤ１Ａ欠損がんの有望な合成致死標的であることを示す。図３－４のＦは、０．５μｇ／ｍＬのドキシサイクリンでの処理によるＧＣＬＣのｓｈＲＮＡを介したノックダウン後３日目でのＡＲＩＤ１Ａ発現２００８細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞における相対ＧＣＬＣ ｍＲＮＡレベルを示す。図３－４のＧは、０．５μｇ／ｍＬのドキシサイクリンでの処理によるＧＣＬＣのｓｈＲＮＡを介したノックダウン後３日目でのＡＲＩＤ１Ａ発現２００８細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞における細胞生存率を示す。図３－４のＨは、０．５μｇ／ｍＬのドキシサイクリンでの処理によるＧＣＬＣのｓｈＲＮＡを介したノックダウン後３日目でのＡＲＩＤ１Ａ発現２００８細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞における相対ＧＳＨレベルを示す。図３－４のＩは、０．５μｇ／ｍＬのドキシサイクリンでの処理によるＧＣＬＣのｓｈＲＮＡを介したノックダウン後３日目でのＡＲＩＤ１Ａ発現２００８細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞における相対ＲＯＳレベルを示す。 図３－５は、ＧＣＬＣがＡＲＩＤ１Ａ欠損がんの有望な合成致死標的であることを示す。図３－５のＪは、ＧＣＬＣ遺伝子のノックダウンから１４日後の２００８細胞及びＴＯＶ２１Ｇ細胞のコロニー形成を示す。図３－５のＫは、全細胞抽出物におけるＧＣＬＣ及びβ－アクチンについてのイムノブロッティングを示す。図３－５のＬは、親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＧＣＬＣのノックダウン後にＧＣＬＣを安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞における相対ＧＳＨレベル（３日間）を示す。図３－５のＭは、親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＧＣＬＣのノックダウン後にＧＣＬＣを安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞における相対ＲＯＳレベル（３日間）を示す。図３－５のＮは、親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＧＣＬＣのノックダウン後にＧＣＬＣを安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞における細胞生存率（７日間）を示す。 図３－６は、ＧＣＬＣがＡＲＩＤ１Ａ欠損がんの有望な合成致死標的であることを示す。図３－６のＯは、３３μＭのＢＳＯで３日間処理した後のがん細胞株の細胞生存率を示す。図３－６のＰは、１０μＭのＢＳＯで処理してから１４日後の２００８がん細胞、ＴＯＶ２１Ｇがん細胞、及びＯＶＩＳＥがん細胞のコロニー形成を示す。図３－６のＱは、２００μＭのＢＳＯで７２時間処理した後の２００８細胞、ＴＯＶ２１Ｇ細胞、及びＯＶＩＳＥ細胞におけるアネキシンＶ陽性アポトーシス細胞の検出を示す。 図３－７は、ＧＣＬＣがＡＲＩＤ１Ａ欠損がんの有望な合成致死標的であることを示す。図３－７のＲは、全細胞抽出物におけるＧＣＬＣ及びβ－アクチンについてのイムノブロッティングを示す。図３－７のＳは、親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及び１００μＭのＢＳＯで処理した後にＧＣＬＣを安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞における相対ＧＳＨレベル（１日間）を示す。図３－７のＴは、親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及び１００μＭのＢＳＯで処理した後にＧＣＬＣを安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞における相対ＲＯＳレベル（１日間）を示す。図３－７のＵは、親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及び１００μＭのＢＳＯで処理した後にＧＣＬＣを安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞における細胞生存率（２日間）を示す。（図３－３のＥ～図３－４のＩ、図３－５のＬ～図３－６のＯ、図３－６のＱ、及び図３－７のＳ～図３－７のＵ）のデータは、平均±ＳＤとして表されている。図Ｓ３－１～図Ｓ３－５及び図Ｓ４－１～図Ｓ４－６も参照。 図４－１は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞のＧＳＨ阻害に対する脆弱性が、ＳＬＣ７Ａ１１発現の低下によるＧＳＨ合成の低減によって引き起こされていることを示す。図４－１のＡは、ＡＲＩＤ１Ａ発現細胞との比較において、ＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞で有意にダウンレギュレートされた（倍率変化＜－１．５）遺伝子の数を示すベン図を示す。図４－１のＢは、ＡＲＩＤ１Ａ発現ＲＭＧ－Ｉ細胞とＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞におけるＳＬＣ７Ａ１１ ｍＲＮＡ（左）とタンパク質（右）の相対的な発現を示す。図４－１のＣは、親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＡＲＩＤ１Ａを安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞におけるＳＬＣ７Ａ１１ ｍＲＮＡ（左）及びタンパク質（右）の相対的発現を示す。 図４－２は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞のＧＳＨ阻害に対する脆弱性が、ＳＬＣ７Ａ１１発現の低下によるＧＳＨ合成の低減によって引き起こされていることを示す。図４－２のＤは、ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞におけるＳＬＣ７Ａ１１ｍＲＮＡ（左）とタンパク質（右）の相対的な発現を示す。図４－２のＥは、ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞におけるＳＬＣ７Ａ１１のＴＳＳ周辺でのＡＲＩＤ１Ａの局在性のＣｈＩＰ分析を示す。図４－２のＦは、ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞におけるＳＬＣ７Ａ１１のＴＳＳ周辺でのＢＲＧ１の局在性のＣｈＩＰ分析を示す。 図４－３は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞のＧＳＨ阻害に対する脆弱性が、ＳＬＣ７Ａ１１発現の低下によるＧＳＨ合成の低減によって引き起こされていることを示す。図４－３のＧは、ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞におけるＳＬＣ７Ａ１１のＴＳＳ周辺でのＲＮＡＰＩＩの局在性のＣｈＩＰ分析を示す。図４－３のＨは、ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞におけるＳＬＣ７Ａ１１のＴＳＳ周辺でのＮＲＦ２の局在性のＣｈＩＰ分析を示す。図４－３のＩは、ＡＲＩＤ１ＡによるＳＬＣ７Ａ１１発現の調節の根底にあるメカニズムの概略図を示す。 図４－４は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞のＧＳＨ阻害に対する脆弱性が、ＳＬＣ７Ａ１１発現の低下によるＧＳＨ合成の低減によって引き起こされていることを示す。図４－４のＪは、ＡＲＩＤ１Ａ発現細胞と比較して、ＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞でダウンレギュレートされた代謝物（倍率変化＜－２）を示すベン図を示す。図４－４のＫは、ＡＲＩＤ１Ａ発現ＲＭＧ－Ｉ細胞とＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞における基礎システインレベルを示す。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表されている。＊ｐ＜０．０５；両側ｔ検定。図４－４のＬは、ＡＲＩＤ１Ａ発現ＲＭＧ－Ｉ細胞とＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞における基礎ＧＳＨレベルを示す。 図４－５は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞のＧＳＨ阻害に対する脆弱性が、ＳＬＣ７Ａ１１発現の低下によるＧＳＨ合成の低減によって引き起こされていることを示す。図４－５のＭはＧＳＨ合成経路の概略図を示す。図４－５のＮは、親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＡＲＩＤ１Ａを安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞における基礎ＧＳＨレベルを示す。図４－５のＯは、ＳＬＣ７Ａ１１とβ－アクチンのイムノブロッティングを示す。図４－５のＰは、親ＴＯＶ２１Ｇ細胞とＳＬＣ７Ａ１１を安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞の基礎ＧＳＨレベルを示す。図４－５のＱは、親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及び２０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した後にＳＬＣ７Ａ１１を安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞における相対ＧＳＨレベルを示す。図４－５のＲは、親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及び２０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した後にＳＬＣ７Ａ１１を安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞における相対ＲＯＳレベルを示す。 図４－６は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞のＧＳＨ阻害に対する脆弱性が、ＳＬＣ７Ａ１１発現の低下によるＧＳＨ合成の低減によって引き起こされていることを示す。図４－６のＳは、親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及び２０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した後にＳＬＣ７Ａ１１を安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞における細胞生存率を示す。図４－６のＴは、１００μＭのＣＣ－ＤＭＥによる同時処理を行わなかった場合又は同時処理を行った場合における、３０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間及び４８時間それぞれ処理した後の、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞における相対ＧＳＨレベルを示す。図４－６のＵは、１００μＭのＣＣ－ＤＭＥによる同時処理を行わなかった場合又は同時処理を行った場合における、３０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間及び４８時間それぞれ処理した後の、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞における相対ＲＯＳレベルを示す。図４－６のＶは、１００μＭのＣＣ－ＤＭＥによる同時処理を行わなかった場合又は同時処理を行った場合における、３０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間及び４８時間それぞれ処理した後の、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞における細胞生存率を示す。 図４－７は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞のＧＳＨ阻害に対する脆弱性が、ＳＬＣ７Ａ１１発現の低下によるＧＳＨ合成の低減によって引き起こされていることを示す。図４－７のＷは、ＧＳＨ代謝の阻害に対するＡＲＩＤ１Ａ欠損がんの脆弱性を説明する概略モデルを示す。等号及び不等号は、ＧＳＨ活性とＲＯＳのバランスを示している。（図４－１のＢ～図４－３のＨ、図４－４のＬ、図４－５のＮ、及び図４－５のＰ～図４－６のＶ）のデータは、平均±ＳＤとして表されている。図Ｓ５－１～図Ｓ５－７も参照。 図５－１は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんに対するＧＳＨ標的療法の臨床的関連性を示す。図５－１のＡは、野生型ＡＲＩＤ１Ａを有する卵巣がん標本におけるＡＲＩＤ１Ａ及びＳＬＣ７Ａ１１の免疫組織化学的染色を示す。 図５－２のＢは、変異型ＡＲＩＤ１Ａを有する卵巣がん標本におけるＡＲＩＤ１Ａ及びＳＬＣ７Ａ１１の免疫組織化学的染色を示す。スケールバー、５０μｍ。 図５－３は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんに対するＧＳＨ標的療法の臨床的関連性を示す。図５－３のＣは、卵巣ＰＤＣの全細胞抽出物におけるＡＲＩＤ１Ａ及びβ－アクチンのイムノブロッティングを示す。図５－３のＤは、３３μＭのＡＰＲ－２４６で６日間処理した後の卵巣ＰＤＣの細胞生存率を示す。図５－３のＥは、卵巣ＰＤＣにおけるＳＬＣ７Ａ１１ ｍＲＮＡの相対的な発現を示す。 図５－４は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんに対するＧＳＨ標的療法の臨床的関連性を示す。図５－４のＦは、卵巣ＰＤＣにおけるタンパク質を示す。図５－４のＧは卵巣ＰＤＣにおける基礎ＧＳＨレベルを示す。図５－４のＨは、５０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した後の卵巣ＰＤＣにおける相対ＧＳＨレベルを示す。 図５－５は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんに対するＧＳＨ標的療法の臨床的関連性を示す。図５－５のＩは、５０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した後の卵巣ＰＤＣにおける相対ＲＯＳレベルを示す。図５－５のＪは、４０μＭのＡＰＲ－２４６で４８時間処理した後の、卵巣ＰＤＣにおけるアネキシンＶ陽性アポトーシス細胞の検出を示す。（図５－３のＤ～図５－３のＥ及び図５－４のＧ～図５－５のＪ）のデータは、平均±ＳＤとして表されている。図Ｓ６－１～図Ｓ６－６も参照。 図６－１は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんに対するＧＳＨ標的療法の抗腫瘍効果を示す。図６－１のＡは、５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＲ－２４６で処置されたマウス（ｎ＝６）における、ＡＲＩＤ１Ａ発現ＲＭＧ－Ｉ細胞に由来する異種移植片の腫瘍体積を示す。図６－１のＢは、５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＲ－２４６で処置されたマウス（ｎ＝６）における、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞に由来する異種移植片の腫瘍体積を示す。図６－１のＣは、５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＲ－２４６で処置されたマウス（ｎ＝６）における、ＡＲＩＤ１Ａ発現ＲＭＧ－Ｉ細胞に由来する異種移植片の相対腫瘍重量を示す。図６－１のＤは、５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＲ－２４６で処置されたマウス（ｎ＝６）における、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞に由来する異種移植片の相対腫瘍重量を示す。図６－１のＥは、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんに対するＧＳＨ標的療法の抗腫瘍効果を示す。図６－１－Ｅは、５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＲ－２４６で処置されたマウス（ｎ＝６）における、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞に由来する異種移植片での相対ＧＳＨ比を示す。 図６－２は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんに対するＧＳＨ標的療法の抗腫瘍効果を示す。図６－２のＦは、５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＲ－２４６で処置されたマウスにおける、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞に由来する異種移植片での８－ＯＨｄＧ、ＮＯＸＡ、切断型カスパーゼ－３、切断されたＰＡＲＰ及びＫｉ６７についての免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色を示す。スケールバー、５０μｍ。図６－２のＧは、５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＲ－２４６で処置されたマウス（ｎ＝６）における、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞に由来する異種移植片での８－ＯＨｄＧについてのＩＨＣ染色の組織学的スコア（Ｈスコア）を示す。図６－２のＨは、５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＲ－２４６で処置されたマウス（ｎ＝６）における、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞に由来する異種移植片の腫瘍でのＮＯＸＡについて陽性に染色された細胞のパーセンテージを示す。図６－２のＩは、５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＲ－２４６で処置されたマウス（ｎ＝６）における、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞に由来する異種移植片の腫瘍での切断型カスパーゼ－３について陽性に染色された細胞のパーセンテージを示す。 図６－３は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんに対するＧＳＨ標的療法の抗腫瘍効果を示す。図６－３のＪは、５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＲ－２４６で処置されたマウス（ｎ＝６）における、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞に由来する異種移植片の腫瘍での切断型ＰＡＲＰについて陽性に染色された細胞のパーセンテージを示す。図６－３のＫは、５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＲ－２４６で処置されたマウス（ｎ＝６）における、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞に由来する異種移植片の腫瘍でのＫｉ６７について陽性に染色された細胞のパーセンテージを示す。図６－３のＬは、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を用いずに、又はドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を用いて処置されたマウスにおける、ＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＮＴ細胞に由来する異種移植片の腫瘍体積を示す。図６－３のＭは、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を用いずに、又はドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を用いて処置されたマウスにおける、ＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＧＣＬＣ細胞に由来する異種移植片の腫瘍体積を示す。 図６－４は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんに対するＧＳＨ標的療法の抗腫瘍効果を示す。図６－４のＮは、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を用いずに、又はドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を用いて処置されたマウスにおける、ＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＮＴ細胞に由来する異種移植片の相対腫瘍重量を示す。図６－４のＯは、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を用いずに、又はドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を用いて処置されたマウスにおける、ＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＧＣＬＣ細胞に由来する異種移植片の相対腫瘍重量を示す。腫瘍形成後、マウスにＤｏｘ含有又は不含有の食餌を与えた（ｎ＝６）。図６－４のＰは、Ｄｏｘを用いずに、又はＤｏｘを用いて処置されたマウス（ｎ＝６）におけるＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＮＴ細胞及びＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＧＣＬＣ細胞に由来する異種移植片の腫瘍での相対的なＧＳＨレベルを示す。（図６－１のＡ～図６－１のＥ及び図６－２のＧ～図６－４のＰ）のデータは、平均±ＳＥＭとして表されている。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；両側ｔ検定。図Ｓ６－１～図Ｓ６－６も参照。 図７は、びまん性胃がん患者由来細胞（ＰＤＣ）系統におけるＡＲＩＤ１Ａタンパク質の発現と異種移植腫瘍の組織像を示す。図７のＡは、びまん性胃がんＰＤＣの全細胞抽出物におけるＡＲＩＤ１Ａ、ＳＬＣ７Ａ１１、及びβ－アクチンについてのイムノブロッティングを示す。図７のＢは、ＰＤＣに由来する異種移植腫瘍のヘマトキシリン及びエオシン染色を示す。ＮＳＣ－６４Ｃ腫瘍、ＮＳＣ－７０Ｃ腫瘍、及びＮＳＣ－７Ｃ腫瘍は、低分化組織像を示した。ＮＳＣ－６５Ｃ腫瘍は、低分化又は中分化の組織像を示した。スケールバー、５０μｍ。 図８は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損びまん性胃がんＰＤＣがＧＳＨ阻害剤に対し感受性があることを示す。図８のＡは、６日間の処理後の４つのＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＰＤＣ及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＰＤＣを含むＤＧＣ ＰＤＣにおけるＡＰＲ－２４６のＩＣ５０値を示す。データは平均±ＳＥＭとして表されている。（ｎ＝４）＊ｐ＜０．０５；両側ｔ検定。図８のＢは、ＡＰＲ－２４６で６日間処理された４つのＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＰＤＣ及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＰＤＣを含むＰＤＣにおける細胞生存率の相対曲線下面積（ＡＵＣ）値を示す。データは平均±ＳＥＭとして表されている。（ｎ＝４）＊ｐ＜０．０５；両側ｔ検定。図８のＣは、ＢＳＯで６日間処理された４つのＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＰＤＣ及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＰＤＣを含むＰＤＣの細胞生存率の相対ＡＵＣ値を示す。データは平均±ＳＥＭとして表されている。（ｎ＝４）＊ｐ＜０．０５；両側ｔ検定。 図９は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損胃がん細胞が、ＧＳＨの基礎レベルが低いため、ＧＳＨ阻害に対して脆弱であることを示す。図９のＡは、ＰＤＣ：ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＮＳＣ－４８ＣＡ細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＮＳＣ－６７Ｃ細胞におけるＳＬＣ７Ａ１１ ｍＲＮＡの相対的発現を示す。データは平均±ＳＤとして表されている。図９のＢは、ＰＤＣ：ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＮＳＣ－４８ＣＡ細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＮＳＣ－６７Ｃ細胞におけるＳＬＣ７Ａ１１ ｍＲＮＡの相対的発現を示す。データは平均±ＳＤとして表されている。図９のＣは、２４時間４０μＭのＡＰＲ－２４６で処理されたＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＮＳＣ－４８ＣＡ細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＮＳＣ－６７Ｃ細胞における、還元型ＧＳＨと酸化型ＧＳＨジスルフィド（ＧＳＳＧ）の比率を示すＧＳＨ／ＧＳＳＧの相対レベルを示す。データは平均±ＳＤとして表されている。図９のＤは、４０μＭのＡＰＲ－２４６で４８時間処理されたＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＮＳＣ－４８ＣＡ細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＮＳＣ－６７Ｃ細胞における相対的なＲＯＳレベルを示す。データは平均±ＳＤとして表されている。 図１０は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損胃がん細胞のＧＳＨ阻害に対する脆弱性が、ＳＬＣ７Ａ１１発現の低下によるＧＳＨ合成の低減によって引き起こされていることを示す。図１０のＡは、１００μＭのＣＣ－ＤＭＥ又は２．５ｍＭのＧＳＨ－ＭＥＥの同時処理を伴う場合又は伴わない場合における２０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理された後でのＡＲＩＤ１Ａ欠損ＮＳＣ－６７Ｃ細胞における相対ＧＳＨレベルを示す。図１０のＢは、１００μＭのＣＣ－ＤＭＥ又は２．５ｍＭのＧＳＨ－ＭＥＥの同時処理を伴う場合又は伴わない場合における２０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理された後でのＡＲＩＤ１Ａ欠損ＮＳＣ－６７Ｃ細胞における相対ＲＯＳレベルを示す。図１０のＣは、１００μＭのＣＣ－ＤＭＥ又は２．５ｍＭのＧＳＨ－ＭＥＥの同時処理を伴う場合又は伴わない場合における２０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理された後でのＡＲＩＤ１Ａ欠損ＮＳＣ－６７Ｃ細胞における細胞生存率を示す。 図１１は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損子宮がん細胞株がＧＳＨ阻害剤に対し感受性があることを示す。６日間の処理後の４つのＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ子宮がん細胞株及びＡＲＩＤ１Ａ欠損子宮がん細胞株を含む子宮がん細胞株におけるＡＰＲ－２４６についてのＩＣ５０値。 図１２は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損子宮がん細胞株がＧＳＨ阻害剤に対し感受性があることを示す。６日間の処理後の４つのＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ子宮がん細胞株及びＡＲＩＤ１Ａ欠損子宮がん細胞株を含む子宮がん細胞株におけるＢＳＯについてのＩＣ５０値。 図１３は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損胆管がん細胞株がＧＳＨ阻害剤に対し感受性があることを示す。６日間の処理後の４つのＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ子宮がん細胞株及びＡＲＩＤ１Ａ欠損胆管がん細胞株を含む胆管がん細胞株におけるＡＰＲ－２４６についてのＩＣ５０値。 図１４は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損胆管がん細胞株がＧＳＨ阻害剤に対し感受性があることを示す。６日間の処理後の４つのＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ子宮がん細胞株及びＡＲＩＤ１Ａ欠損胆管がん細胞株を含む胆管がん細胞株におけるＢＳＯについてのＩＣ５０値。 図１５は、様々ながん細胞株におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（ＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１）、ＳＭＡＲＣＡ２（ＢＲＭ）、ＳＭＡＲＣＢ１、ＰＢＲＭ１、ＡＲＩＤ１Ａ）タンパク質の発現を示す。様々ながん細胞株の全細胞抽出物におけるＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１）、ＳＭＡＲＣＡ２（ＢＲＭ）、ＳＭＡＲＣＢ１、ＰＢＲＭ１、ＡＲＩＤ１Ａ、及びβ－アクチンについてのイムノブロッティング。 図１６は、様々ながん細胞株におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（ＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１）、ＳＭＡＲＣＡ２（ＢＲＭ）、ＳＭＡＲＣＢ１、ＰＢＲＭ１、ＡＲＩＤ１Ａ）タンパク質の発現を示す様々ながん細胞株の全細胞抽出物におけるＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１）、ＳＭＡＲＣＡ２（ＢＲＭ）、ＳＭＡＲＣＢ１、ＰＢＲＭ１、ＡＲＩＤ１Ａ、及びβ－アクチンについてのイムノブロッティング。 図１７は、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（ＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１）、ＳＭＡＲＣＡ２（ＢＲＭ）、ＳＭＡＲＣＢ１、ＰＢＲＭ１）が欠損している様々ながん細胞株がＡＰＲ－２４６に対し感受性があることを示す。６日間処理した後のＳＷＩ／ＳＮＦ複合体ＷＴがん細胞株及びＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（ＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１）、ＳＭＡＲＣＡ２（ＢＲＭ）、ＳＭＡＲＣＢ１、ＰＢＲＭ１）欠損の様々ながん細胞株を含む様々ながん細胞株におけるＡＰＲ－２４６についてのＩＣ５０値。データは平均±ＳＥＭとして表されている。＊ｐ＜０．０５；両側ｔ検定。 図１８は、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（ＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１）、ＳＭＡＲＣＡ２（ＢＲＭ）、ＳＭＡＲＣＢ１、ＰＢＲＭ１）が欠損している様々ながん細胞株がＢＳＯに対し感受性があることを示す。４つのＳＷＩ／ＳＮＦ複合体ＷＴがん細胞株及びＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（ＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１）、ＳＭＡＲＣＡ２（ＢＲＭ）、ＳＭＡＲＣＢ１、ＰＢＲＭ１）欠損の様々ながん細胞株を含むがん細胞株をＢＳＯで６日間処理した場合の細胞生存率についての相対曲線下面積（ＡＵＣ）値。データは平均±ＳＥＭとして表されている。＊ｐ＜０．０５；両側ｔ検定。 図１９は、様々ながん細胞株：ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体ＷＴ細胞及びＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（ＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１）、ＳＭＡＲＣＡ２（ＢＲＭ）、ＳＭＡＲＣＢ１、ＰＢＲＭ１）欠損の様々ながん細胞株におけるＳＬＣ７Ａ１１ ｍＲＮＡの相対的な発現を示す。データは平均±ＳＤとして表されている。 図２０は、様々ながん細胞株の基礎ＧＳＨレベルを示す。ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体ＷＴ細胞及びＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（ＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１）、ＳＭＡＲＣＡ２（ＢＲＭ）、ＳＭＡＲＣＢ１、ＰＢＲＭ１）欠損の様々ながん細胞株におけるＳＬＣ７Ａ１１ ｍＲＮＡの相対的な発現を示す。データは平均±ＳＤとして表されている。 図２１は、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体ＷＴ細胞及びＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（ＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１）、ＳＭＡＲＣＡ２（ＢＲＭ）ＳＭＡＲＣＢ１、ＰＢＲＭ１）欠損の様々ながん細胞株を４０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した場合の、還元型ＧＳＨと酸化型ＧＳＨジスルフィド（ＧＳＳＧ）の比率を示すＧＳＨ／ＧＳＳＧの相対レベルを示す。データは平均±ＳＤとして表されている。 図２２は、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体ＷＴ細胞及びＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（ＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１）、ＳＭＡＲＣＡ２（ＢＲＭ）、ＳＭＡＲＣＢ１、ＰＢＲＭ１）欠損の様々ながん細胞株を４０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した場合の相対的なＲＯＳレベルを示す。データは平均±ＳＤとして表されている。 図Ｓ１－１は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞がＰＲＩＭＡ－１及びＡＰＲ－２４６に対し選択的に感受性があることを示している。図１－１～図１－７に関連する。図Ｓ１－１のＡは、２．５μＭのＰＲＩＭＡ－１で１０日間処理した後のＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞のコロニー形成を示す。図Ｓ１－１のＢは、２μＭのＡＰＲ－２４６で１０日間処理した後のＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯＨＣＴ１１６細胞のコロニー形成を示す。図Ｓ１－１のＣは、卵巣がん細胞を含む、ＡＰＲ－２４６に対するがん細胞株の細胞生存率を示す。図Ｓ１－１のＤは、子宮がん細胞を含む、ＡＰＲ－２４６に対するがん細胞株の細胞生存率を示す。 図Ｓ１－２は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞がＰＲＩＭＡ－１及びＡＰＲ－２４６に対し選択的に感受性があることを示している。図１－１～１－７に関連する。図Ｓ１－２のＥは、胆道がん細胞を含む、ＡＰＲ－２４６に対するがん細胞株の細胞生存率を示す。図Ｓ１－２のＦは、１μＭのＡＰＲ－２４６で１４日間処理した後の卵巣がん細胞株のコロニー形成を示す。図Ｓ１－２のＧは、１１μＭのＰＲＩＭＡ－１で３日間処理した後の卵巣がん細胞の細胞生存率を示す。 図Ｓ１－３は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞がＰＲＩＭＡ－１及びＡＰＲ－２４６に対し選択的に感受性があることを示している。図１－１～図１－７に関連する。図Ｓ１－３のＨは、２．５μＭのＡＰＲ－２４６で１４日間処理した後の卵巣がん細胞株のコロニー形成アッセイを示す。図Ｓ１－３のＩは、３．７μＭのＡＰＲ－２４６で３日間処理した後の親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＡＲＩＤ１Ａを安定して発現するＴＯＶ２１Ｇ細胞の細胞生存率を示す。図Ｓ１－３のＪは、３０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した後のＲＭＧ－Ｉ細胞、ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＯＶＩＳＥ細胞におけるＮＯＸＡの相対的なｍＲＮＡレベルを示す。図Ｓ１－３のＫは、３０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した後の２００８細胞及びＡ２７８０細胞におけるＮＯＸＡの相対的ｍＲＮＡレベルを示す。 図Ｓ１－４は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞がＰＲＩＭＡ－１及びＡＰＲ－２４６に対し選択的に感受性があることを示している。図１－１～図１－７に関連する。図Ｓ１－４のＬは、１０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した後のＲＭＧ－Ｉ細胞、ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＯＶＩＳＥ細胞における切断型カスパーゼ－３／７陽性アポトーシス細胞の検出を示す。図Ｓ１－４のＭは、２０μＭのＡＰＲ－２４６で１６時間処理した後の２００８細胞及びＡ２７８０細胞における切断型カスパーゼ－３／７陽性アポトーシス細胞の検出を示す。すべてのデータは平均±ＳＤとして表されている。 図Ｓ２－１は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞がＧＳＨ阻害に対して脆弱であることを示している。図２－１～図２－５に関連する。図Ｓ２－１のＡは、５０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した後のＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞における相対的なＴｒｘＲ活性を示す。図Ｓ２－１のＢは、ＡＰＲ－２４６で処理された卵巣（左；１６時間／５μＭ）、子宮（中央；２４時間／４０μＭ）及び胆道（右；４８時間／４０μＭ）のがん細胞における相対ＧＳＨレベルを示す。 図Ｓ２－２は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞がＧＳＨ阻害に対して脆弱であることを示している。図２－１～図２－５に関連する。図Ｓ２－２のＣは、ＡＰＲ－２４６で処理された卵巣（左；１６時間／５μＭ）、子宮（中央；２４時間／４０μＭ）及び胆道（右；４８時間／４０μＭ）のがん細胞における相対ＲＯＳレベルを示す。図Ｓ２－２のＤは、２０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間及び５ｍＭのＮＡＣ又は５ｍＭのＧＳＨ－ＭＥＥで同時処理した後のＡＲＩＤ１Ａ欠損のＴＯＶ２１Ｇ（左）がん細胞及びＯＶＩＳＥ（右）がん細胞における相対ＧＳＨレベルを示す。 図Ｓ２－３は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞がＧＳＨ阻害に対して脆弱であることを示している。図２－１～図２－５に関連する。図Ｓ２－３のＥは、２０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間及び５ｍＭのＮＡＣ又は５ｍＭのＧＳＨ－ＭＥＥで同時処理した後のＡＲＩＤ１Ａ欠損のＴＯＶ２１Ｇ（左）がん細胞及びＯＶＩＳＥ（右）がん細胞における相対ＲＯＳレベルを示す。図Ｓ２－３のＦは、２０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間及び５ｍＭのＮＡＣ又は５ｍＭのＧＳＨ－ＭＥＥで同時処理した後のＡＲＩＤ１Ａ欠損のＴＯＶ２１Ｇ（左）がん細胞及びＯＶＩＳＥ（右）がん細胞における細胞生存率を示す。 図Ｓ２－４は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞がＧＳＨ阻害に対して脆弱であることを示している。図２－１～図２－５に関連する。図Ｓ２－４のＧは、示された濃度のオーラノフィンで１０日間処理した後の、ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞のコロニー形成を示す。図Ｓ２－４のＨは、０．４μＭのＡＰＲ－２４６で３日間処理した後の卵巣がん細胞株の細胞生存率を示す。図Ｓ２－４のＩは、１μＭのオーラノフィンで２４時間処理した後の、ＡＲＩＤ１Ａ発現２００８細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞における切断型カスパーゼ－３／７陽性アポトーシス細胞の検出を示す。図Ｓ２－４のＪは、１μＭのオーラノフィンで２４時間処理した後の２００８細胞及びＴＯＶ２１Ｇ細胞における相対ＧＳＨレベルを示す。図Ｓ２－４のＫは、１μＭのオーラノフィンで２４時間処理した後の２００８細胞及びＴＯＶ２１Ｇ細胞における相対ＲＯＳレベルを示す。図Ｓ２－４のＬは、ｓｈＮＴ（非標的指向性ｓｈＲＮＡ）又はｓｈｐ５３（ｐ５３標的指向性ｓｈＲＮＡ）を発現するＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞におけるＡＲＩＤ１Ａ及びｐ５３タンパク質のレベルを示す。 図Ｓ２－５は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞がＧＳＨ阻害に対して脆弱であることを示している。図２－１～図２－５に関連する。図Ｓ２－５のＭは、１０日間図Ｓ２－４について示された濃度のＡＰＲ－２４６で処理した後の、ｓｈＮＴ又はｓｈｐ５３を発現するＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞のコロニー形成を示す。図Ｓ２－５のＮは、２２．５μＭのＡＰＲ－２４６で７２時間処理した後の、ｓｈＮＴ又はｓｈｐ５３を発現するＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞におけるアネキシンＶ陽性アポトーシス細胞の検出を示す。図Ｓ２－５のＯは、ＤＭＳＯ、５０μＭのＰＲＩＭＡ－１、５０μＭのＡＰＲ－２４６、及び１０μＭのＮｕｔｌｉｎ（ヌトリン）３ａで１６時間処理されたＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞の全細胞抽出物におけるＡＲＩＤ１Ａ、ｐ５３、ｐ２１、及びβ－アクチンのイムノブロッティングを示す。 図Ｓ２－６は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞がＧＳＨ阻害に対して脆弱であることを示している。図２－１～図２－５に関連する。図Ｓ２－６のＰは、５０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した後のｓｈＮＴ又はｓｈｐ５３を発現するＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞におけるＮＯＸＡの相対的なｍＲＮＡレベルを示す。図Ｓ２－６のＱは、３０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理し、５ｍＭのＮＡＣ又は１０μＭのＪＮＫ阻害剤ＳＰ６００１２５（ＪＮＫｉ）で同時処理した後の、ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞の全細胞抽出物におけるＪＮＫ、ホスホ－ＪＮＫ、ＮＯＸＡ、及びβ－アクチンについてのイムノブロッティングを示す。赤色矢印の頭は、ＪＮＫのリン酸化型を示す。図Ｓ２－６のＲは、５０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理し、１０μＭのＪＮＫ阻害剤ＳＰ６００１２５（ＪＮＫｉ）で同時処理した後の、ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞におけるＮＯＸＡの相対的なｍＲＮＡレベルを示す。図Ｓ２－６のＳは、３０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理し、１０μＭのＪＮＫ阻害剤ＳＰ６００１２５（ＪＮＫｉ）で同時処理した後の、ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞における相対ＧＳＨレベルを示す。 図Ｓ２－７は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞がＧＳＨ阻害に対して脆弱であることを示している。図２－１～図２－５に関連する。図Ｓ２－７のＴは、３０μＭのＡＰＲ－２４６で４８時間処理し、１０μＭのＪＮＫ阻害剤ＳＰ６００１２５（ＪＮＫｉ）で同時処理した後の、ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞における相対ＲＯＳレベルを示す。図Ｓ２－７のＵは、ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞へのトランスフェクションの４日後におけるＮＯＸＡの相対的なｍＲＮＡレベルを示す。図Ｓ２－７のＶは、ＮＯＸＡのノックダウンから４日後に、５０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した後の、ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞における相対ＧＳＨレベルを示す。図Ｓ２－７のＷは、ＮＯＸＡのノックダウンから４日後の５０μＭのＡＰＲ－２４６で４８時間処理した後の、ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞における相対ＲＯＳレベルを示す。（図Ｓ２－１のＡ～図Ｓ２－４のＫ、図Ｓ２－５のＭ～図Ｓ２－５のＮ、図Ｓ２－６のＰ、及び図Ｓ２－６のＲ～図Ｓ２－７のＷ）のデータは、平均±ＳＤとして表されている。 図Ｓ３－１は、ＧＣＬＣがＡＲＩＤ１Ａ欠損がんの有望な合成致死標的であることを示す。図３－１～図３－７に関連する。図Ｓ３－１のＡは、ＴＲＸＲファミリー遺伝子及びＳＯＤファミリー遺伝子のノックダウン後、５日目でのＡＲＩＤ１Ａ発現ＲＭＧ－Ｉがん細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇがん細胞における細胞生存率のヒートマップを示す。図Ｓ３－１のＢは、ＴＲＸＲファミリー遺伝子及びＳＯＤファミリー遺伝子のノックダウン後、３日目でのＡＲＩＤ１Ａ発現ＲＭＧ－Ｉがん細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇがん細胞における相対ＧＳＨレベルのヒートマップを示す。図Ｓ３－１のＣは、ＴＲＸＲファミリー遺伝子及びＳＯＤファミリー遺伝子のノックダウン後、３日目でのＡＲＩＤ１Ａ発現ＲＭＧ－Ｉがん細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇがん細胞における相対ＲＯＳレベルのヒートマップを示す。図Ｓ３－１のＤは、５日間の処理後のＢＳＯ、スルファサラジン、化合物９６８、及び６－アミノニコチンアミドに対するＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞の細胞生存率を示す。 図Ｓ３－２は、ＧＣＬＣがＡＲＩＤ１Ａ欠損がんの有望な合成致死標的であることを示す。図３－１～図３－７に関連する。図Ｓ３－２のＥは、卵巣がん細胞におけるトランスフェクションの４日後のＧＣＬＣの相対的なｍＲＮＡレベルを示す。図Ｓ３－２のＦは、卵巣がん細胞におけるトランスフェクションの４日後のＧＳＳの相対的なｍＲＮＡレベルを示す。図Ｓ３－２のＧは、卵巣がん細胞におけるトランスフェクションの４日後のＳＬＣ７Ａ１１Ａの相対的なｍＲＮＡレベルを示す。図Ｓ３－２のＨは、卵巣がん細胞におけるＧＣＬＣ、ＧＳＳ、及びＳＬＣ７Ａ１１のノックダウンから３日後の細胞生存率を示す。 図Ｓ３－３は、ＧＣＬＣがＡＲＩＤ１Ａ欠損がんの有望な合成致死標的であることを示す。図Ｓ３－３のＩは、図３－１～図３－７に関連する。図Ｓ３－３のＩは、卵巣がん細胞におけるＧＣＬＣ、ＧＳＳ、及びＳＬＣ７Ａ１１のノックダウンから３日後の相対ＧＳＨレベルを示す。図Ｓ３－３のＪは、図３－１～図３－７に関連する。図Ｓ３－３のＪは、卵巣がん細胞におけるＧＣＬＣ、ＧＳＳ、及びＳＬＣ７Ａ１１のノックダウンから３日後の相対ＲＯＳレベルを示す。図Ｓ３－３のＫは、親ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＡＲＩＤ１Ａを安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞におけるトランスフェクションから４日後のＧＣＬＣの相対的なｍＲＮＡレベルを示す。図Ｓ３－３のＬは、親ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＡＲＩＤ１Ａを安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞におけるトランスフェクションから４日後のＳＬＣ７Ａ１１Ａの相対的なｍＲＮＡレベルを示す。図Ｓ３－３のＭは、親ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＡＲＩＤ１Ａを安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞におけるＧＣＬＣ及びＳＬＣ７Ａ１１のノックダウンから３日後の相対ＧＳＨレベルを示す。 図Ｓ３－４は、ＧＣＬＣがＡＲＩＤ１Ａ欠損がんの有望な合成致死標的であることを示す。図３－１～図３－７に関連する。図Ｓ３－４のＮは、親ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＡＲＩＤ１Ａを安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞におけるＧＣＬＣ及びＳＬＣ７Ａ１１のノックダウンから３日後の相対ＲＯＳレベルを示す。図Ｓ３－４のＯは、親ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＡＲＩＤ１Ａを安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞におけるＧＣＬＣ及びＳＬＣ７Ａ１１のノックダウンから３日後の細胞生存率を示す。図Ｓ３－４のＰは、ＧＣＬＣのノックダウンから７日後、３日後及び５日後のＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞におけるＧＣＬＣの相対ｍＲＮＡレベルを示す。図Ｓ３－４のＱは、ＧＣＬＣのノックダウンから７日後、３日後及び５日後のＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞における細胞生存率を示す。図Ｓ３－４のＲは、ＧＣＬＣのノックダウンから７日後、３日後及び５日後のＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞における相対ＧＳＨレベルを示す。図Ｓ３－４のＳは、ＧＣＬＣのノックダウンから７日後、３日後及び５日後のＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞における相対ＲＯＳレベルを示す。 図Ｓ３－５は、ＧＣＬＣがＡＲＩＤ１Ａ欠損がんの有望な合成致死標的であることを示す。図３－１～図３－７に関連する。図Ｓ３－５のＴは、ＡＲＩＤ１Ａ発現２００８細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞におけるトランスフェクションの４日後のＧＣＬＣの相対的なｍＲＮＡレベルを示す。図Ｓ３－５のＵは、ＧＣＬＣのノックダウンから１４日後の２００８細胞及びＴＯＶ２１Ｇ細胞のコロニー形成を示す。図Ｓ３－５のＶは、親ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞及びＧＣＬＣを安定して発現しているＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞におけるＧＣＬＣのノックダウンから３日後の全細胞抽出物におけるＧＣＬＣ及びβ－アクチンのイムノブロッティングを示す。図Ｓ３－５のＷは、親ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞及びＧＣＬＣを安定して発現しているＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞におけるＧＣＬＣのノックダウンから３日後の相対ＧＳＨレベルを示す。図Ｓ３－５のＸは、親ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞及びＧＣＬＣを安定して発現しているＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞におけるＧＣＬＣのノックダウンから３日後の相対ＲＯＳレベルを示す。図Ｓ３－５のＹは、親ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞及びＧＣＬＣを安定して発現しているＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞におけるＧＣＬＣのノックダウンから３日後の細胞生存率を示す。（図Ｓ３－１のＤ～図Ｓ３－５のＵ及び図Ｓ３－５のＷ～図Ｓ３－５のＹ）のデータは、平均±ＳＤとして表されている。 図Ｓ４－１は、ＧＣＬＣがＡＲＩＤ１Ａ欠損がんの有望な合成致死標的であることを示す。図３－１～図３－７に関連する。図Ｓ４－１のＡはＢＳＯに対するがん細胞株の細胞生存率を示す。図Ｓ４－１のＢは、１０μＭのＢＳＯで処理してから１４日後のＡＲＩＤ１Ａ発現２００８細胞、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＯＶＩＳＥ細胞のコロニー形成を示す。図Ｓ４－１のＣは、３００μＭのＢＳＯで１０日間処理した後のＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞のコロニー形成アッセイにおける代表的な画像を示す。図Ｓ４－１のＤは、３００μＭのＢＳＯで１０日間処理した後のＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞のコロニー形成アッセイにおける生存率を示す。 図Ｓ４－２は、ＧＣＬＣがＡＲＩＤ１Ａ欠損がんの有望な合成致死標的であることを示す。図３－１～図３－７に関連する。図Ｓ４－２のＥは、５００μＭのＡＰＲ－２４６で７２時間処理した後のＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞におけるアネキシンＶ陽性アポトーシス細胞の相対的な割合を示す。図Ｓ４－２のＦは、２０μＭのＢＳＯで２４時間処理した後の、ＲＭＧ－Ｉ細胞、ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＯＶＩＳＥ細胞における相対ＧＳＨレベルを示す。図Ｓ４－２のＧは、２０μＭのＢＳＯで２４時間処理した後の、ＲＭＧ－Ｉ細胞、ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＯＶＩＳＥ細胞における相対ＲＯＳレベルを示す。図Ｓ４－２のＨは、２０μＭのＢＳＯで２４時間処理した後の、ＲＭＧ－Ｉ細胞、ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＯＶＩＳＥ細胞におけるＮＯＸＡの相対ｍＲＮＡレベルを示す。 図Ｓ４－３は、ＧＣＬＣがＡＲＩＤ１Ａ欠損がんの有望な合成致死標的であることを示す。図３－１～図３－７に関連する。図Ｓ４－３のＩは、３００μＭのＢＳＯで２４時間処理した後の、２００８細胞及びＡ２７８０細胞における相対ＧＳＨレベルを示す。図Ｓ４－３のＪは、３００μＭのＢＳＯで４８時間処理した後の、２００８細胞及びＡ２７８０細胞における相対ＲＯＳレベルを示す。図Ｓ４－３のＫは、１００μＭのＢＳＯで２４時間処理した後の、親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＡＲＩＤ１Ａを安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞における相対ＧＳＨレベルを示す。図Ｓ４－３のＬは、１００μＭのＢＳＯで４８時間処理した後の、親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＡＲＩＤ１Ａを安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞における相対ＲＯＳレベルを示す。図Ｓ４－３のＭは、１００μＭのＢＳＯで４８時間処理した後の、親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＡＲＩＤ１Ａを安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞における細胞生存率を示す。 図Ｓ４－４は、ＧＣＬＣがＡＲＩＤ１Ａ欠損がんの有望な合成致死標的であることを示す。図３－１～図３－７に関連する。図Ｓ４－４のＮは、５ｍＭのＮＡＣ又は５ｍＭのＧＳＨ－ＭＥＥの存在下又は非存在下で２４時間それぞれ１０μＭ及び２０μＭのＢＳＯで処理した後の、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ（上）がん細胞及びＯＶＩＳＥ（下）がん細胞における相対ＧＳＨレベルを示す。図Ｓ４－４のＯは、５ｍＭのＮＡＣ又は５ｍＭのＧＳＨ－ＭＥＥの存在下又は非存在下で２４時間それぞれ１０μＭ及び２０μＭのＢＳＯで処理した後の、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ（上）がん細胞及びＯＶＩＳＥ（下）がん細胞における相対ＲＯＳレベルを示す。 図Ｓ４－５は、ＧＣＬＣがＡＲＩＤ１Ａ欠損がんの有望な合成致死標的であることを示す。図３－１～図３－７に関連する。図Ｓ４－５のＰは、５ｍＭのＮＡＣ又は５ｍＭのＧＳＨ－ＭＥＥの存在下又は非存在下で２４時間それぞれ１０μＭ及び２０μＭのＢＳＯで処理した後の、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ（上）がん細胞及びＯＶＩＳＥ（下）がん細胞における細胞生存率を示す。図Ｓ４－５のＱは、２０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した後の親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＧＣＬＣを安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞の相対ＧＳＨレベルを示す。 図Ｓ４－６は、ＧＣＬＣがＡＲＩＤ１Ａ欠損がんの有望な合成致死標的であることを示す。図３－１～図３－７に関連する。図Ｓ４－６のＲは、２０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した後の親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＧＣＬＣを安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞の相対ＲＯＳレベルを示す。図Ｓ４－６のＳは、２０μＭのＡＰＲ－２４６で４８時間処理した後の親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＧＣＬＣを安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞の細胞生存率を示す。（図Ｓ４－１のＡ～Ｂ及び図Ｓ４－１のＤ～図４－６のＳ）のデータは、平均±ＳＤとして表されている。 図Ｓ５－１は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんのＧＳＨ阻害に対する脆弱性が、ＳＬＣ７Ａ１１発現の低下によるＧＳＨ合成の低減によって引き起こされていることを示す。図４－１～４－７に関連する。図Ｓ５－１のＡは、卵巣がん細胞におけるＳＬＣ７Ａ１１の相対的なｍＲＮＡ発現（左）及びタンパク質発現（右）を示す。図Ｓ５－１のＢは、子宮がん細胞におけるＳＬＣ７Ａ１１の相対的なｍＲＮＡ発現（左）及びタンパク質発現（右）を示す。図Ｓ５－１のＣは、胆道がん細胞におけるＳＬＣ７Ａ１１の相対的なｍＲＮＡ発現（左）及びタンパク質発現（右）を示す。 図Ｓ５－２は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんのＧＳＨ阻害に対する脆弱性が、ＳＬＣ７Ａ１１発現の低下によるＧＳＨ合成の低減によって引き起こされていることを示す。図４－１～４－７に関連する。図Ｓ５－２のＤは、ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ細胞、親ＨＣＴ１１６ ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞、及びＮＲＦ２を安定して発現しているＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞におけるＮＲＦ２の相対的なｍＲＮＡ発現（左）及びタンパク質発現（右）を示す。図Ｓ５－２のＥは、ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ細胞、親ＨＣＴ１１６ ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞、及びＮＲＦ２を安定して発現しているＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞におけるＳＬＣ７Ａ１１の相対的なｍＲＮＡ発現（左）及びタンパク質発現（右）を示す。図Ｓ５－２のＦは、３．７μＭのＡＰＲ－２４６で６日間処理した後の親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＮＲＦ２を安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞における細胞生存率を示す。 図Ｓ５－３は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんのＧＳＨ阻害に対する脆弱性が、ＳＬＣ７Ａ１１発現の低下によるＧＳＨ合成の低減によって引き起こされていることを示す。図４－１～４－７に関連する。図Ｓ５－３のＧは、２μＭのＡＰＲ－２４６で１０日間処理した後の、ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞のコロニー形成アッセイについての代表的な画像（左）及び生存率（右）を示す。図Ｓ５－３のＨは、２０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した後の親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＮＲＦ２を安定して発現するＴＯＶ２１Ｇ細胞における相対ＧＳＨレベルを示す。図Ｓ５－３のＩは、２０μＭのＡＰＲ－２４６で４８時間処理した後の親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＮＲＦ２を安定して発現するＴＯＶ２１Ｇ細胞における相対ＲＯＳレベルを示す。図Ｓ５－３のＪは、ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞（左）並びにＡＲＩＤ１Ａ発現２００８細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損Ａ２７８０細胞（右）における基礎システインレベルを示す。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表されている。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１；両側ｔ検定。 図Ｓ５－４は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんのＧＳＨ阻害に対する脆弱性が、ＳＬＣ７Ａ１１発現の低下によるＧＳＨ合成の低減によって引き起こされていることを示す。図４－１～４－７に関連する。図Ｓ５－４のＫは、ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯＨＣＴ１１６細胞における基礎ＧＳＨレベルを示す。図Ｓ５－４のＬは、卵巣がん細胞（左）、子宮がん細胞（中央）、及び胆道がん細胞（右）における基礎ＧＳＨレベルを示す。 図Ｓ５－５は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんのＧＳＨ阻害に対する脆弱性が、ＳＬＣ７Ａ１１発現の低下によるＧＳＨ合成の低減によって引き起こされていることを示す。図Ｓ５－５のＭは、ＡＲＩＤ１Ａ発現ＲＭＧ－Ｉがん細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇがん細胞における基礎ＲＯＳレベルを示す。図Ｓ５－５のＮは、ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞における基礎ＲＯＳレベルを示す。図Ｓ５－５のＯは、卵巣がん細胞（左）、子宮がん細胞（中央）、及び胆道がん細胞（右）における基礎ＲＯＳレベルを示す。 図Ｓ５－６は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんのＧＳＨ阻害に対する脆弱性が、ＳＬＣ７Ａ１１発現の低下によるＧＳＨ合成の低減によって引き起こされていることを示す。図４－１～４－７に関連する。図Ｓ５－６のＰは、親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＡＲＩＤ１Ａを安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞における基礎ＲＯＳレベルを示す。図Ｓ５－６のＱは、親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＳＬＣ７Ａ１１を安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞における基礎ＲＯＳレベルを示す。図Ｓ５－６のＲは、親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＧＣＬＣを安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞における基礎ＧＳＨレベルを示す。図Ｓ５－６のＳは、親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＧＣＬＣを安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞における基礎ＲＯＳレベルを示す。 図Ｓ５－７は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんのＧＳＨ阻害に対する脆弱性が、ＳＬＣ７Ａ１１発現の低下によるＧＳＨ合成の低減によって引き起こされていることを示す。図４－１～４－７に関連する。図Ｓ５－７のＴは、５０μＭのＢＳＯで２４時間処理した後の、親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＳＬＣ７Ａ１１を安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞における相対ＧＳＨレベルを示す。図Ｓ５－７のＵは、５０μＭのＢＳＯで２４時間処理した後の、親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＳＬＣ７Ａ１１を安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞における相対ＲＯＳレベルを示す。図Ｓ５－７のＶは、５０μＭのＢＳＯで４８時間処理した後の、親ＴＯＶ２１Ｇ細胞及びＳＬＣ７Ａ１１を安定して発現しているＴＯＶ２１Ｇ細胞における細胞生存率を示す。（図Ｓ５－１のＡ～図Ｓ５－３のＩ及び図Ｓ５－４のＫ～図Ｓ５－７のＶ）のデータは、平均±ＳＤとして表されている。 図Ｓ６－１は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんに対するＧＳＨ標的療法の臨床的関連性を示す。図５－１～図５－５及び図６－１～図６－４に関連する。図Ｓ６－１のＡは、ＡＲＩＤ１Ａ遺伝子の状態を示し、免疫組織化学的分析に供された１１の卵巣がん標本のＡＲＩＤ１Ａ及びＳＬＣ７Ａ１１に対して陽性に染色された細胞のパーセンテージが示されている。図Ｓ６－１のＢは、ＡＲＩＤ１Ａタンパク質の発現を保持する変異体ＡＲＩＤ１Ａを有する外科的に切除された卵巣腫瘍におけるＡＲＩＤ１Ａ及びＳＬＣ７Ａ１１についての免疫組織化学的染色を示す。スケールバー、５０μｍ。 図Ｓ６－２は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんに対するＧＳＨ標的療法の臨床的関連性を示す。図５－１～図５－５及び図６－１～図６－４に関連する。図Ｓ６－２のＣは、１００μＭのＢＳＯで６日間処理した後の卵巣ＰＤＣの細胞生存率を示す。図Ｓ６－２のＤは卵巣ＰＤＣにおける基礎ＲＯＳレベルを示す。図Ｓ６－２のＥは、５０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した後の、卵巣ＰＤＣにおける切断型カスパーゼ－３／７陽性アポトーシス細胞の検出を示す。 図Ｓ６－３は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんに対するＧＳＨ標的療法の臨床的関連性を示す。図５－１～図５－５及び図６－１～図６－４に関連する。図Ｓ６－３のＦは、５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＲ－２４６で処置したマウスの体重を示す（ｎ＝６）。図Ｓ６－３のＧは、２５ｍｇ／ｋｇのＰＲＩＭＡ－１で処置されたマウス（ｎ＝５）におけるＡＲＩＤ１Ａ欠損ＯＶＩＳＥ ＯＣＣＣがん細胞に由来する異種移植片の腫瘍体積を示す。図Ｓ６－３のＨは、２５ｍｇ／ｋｇのＰＲＩＭＡ－１で処置されたマウス（ｎ＝５）の体重を示す。図Ｓ６－３のＩは、７５０ｍｇ／ｋｇのＢＳＯで１日１回１４日間処置されたマウス（ｎ＝６）におけるＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ ＯＣＣＣがん細胞に由来する異種移植片の腫瘍体積を示す。図Ｓ６－３のＪは、７５０ｍｇ／ｋｇのＢＳＯで１日１回１４日間処置されたマウス（ｎ＝６）のＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ ＯＣＣＣがん細胞に由来する異種移植片の相対腫瘍重量を示す。図Ｓ６－３のＫは、７５０ｍｇ／ｋｇのＢＳＯで１日１回１４日間処置されたマウス（ｎ＝６）の体重を示す。 図Ｓ６－４は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんに対するＧＳＨ標的療法の臨床的関連性を示す。図５－１～図５－５及び図６－１～図６－４に関連する。図Ｓ６－４のＬは、Ｄｏｘで処置されたマウスにおけるＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＮＴ（左）及びＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＧＣＬＣ（右）の異種移植片のＧＣＬＣ及びβ－アクチンについてのイムノブロッティングを示す。図Ｓ６－４のＭは、Ｄｏｘで処置されたマウスにおけるＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＮＴ（左）及びＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＧＣＬＣ（右）の異種移植片のＧＣＬＣタンパク質レベルを示す。腫瘍形成後、マウスにＤｏｘ含有又は不含有の食餌を与えた（ｎ＝６）。図Ｓ６－４のＮは、Ｄｏｘで処置されたマウスにおけるＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＮＴ異種移植片の腫瘍体積を示す。 図Ｓ６－５は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんに対するＧＳＨ標的療法の臨床的関連性を示す。図５－１～図５－５及び図６－１～図６－４に関連する。図Ｓ６－５のＯは、Ｄｏｘで処置されたマウスにおけるＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＧＣＬＣ異種移植片の腫瘍体積を示す。これらの細胞の接種後、マウスにはＤｏｘ含有又は不含有の食餌を与えた（ｎ＝６）。図Ｓ６－５のＰは、Ｄｏｘを用いずに、又はＤｏｘを用いて処置されたマウス（ｎ＝６）におけるＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＮＴ異種移植片の相対腫瘍重量を示す。図Ｓ６－５のＱは、Ｄｏｘを用いずに、又は用いて処置されたマウス（ｎ＝６）におけるＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＧＣＬＣ異種移植片の相対腫瘍重量を示す。図Ｓ６－５のＲは、Ｄｏｘで処置されたマウス（ｎ＝６）におけるＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＮＴ異種移植片及びＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＧＣＬＣ異種移植片の相対的なＧＳＨレベルを示す。 図Ｓ６－６は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんに対するＧＳＨ標的療法の臨床的関連性を示す。図５－１～図５－５及び図６－１～図６－４に関連する。図Ｓ６－６－Ｓは、Ｄｏｘで処置されたマウスのＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＧＣＬＣ異種移植片における酸化ストレスマーカー８－ＯＨｄＧ、アポトーシスマーカーＮＯＸＡ、切断型カスパーゼ－３及び切断型ＰＡＲＰ、及び細胞増殖マーカーＫｉ６７についての免疫組織化学的染色を示す。スケールバー、５０μｍ。（図Ｓ６－２のＣ～図Ｓ６－２のＥ）のデータは、平均±ＳＤとして表されている。（図Ｓ６－３のＦ～図Ｓ６－３のＫ及び図Ｓ６－４のＭ～図Ｓ６－５のＲ）のデータは、平均±ＳＥＭとして表されている。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１；両側ｔ検定。 図Ｓ７は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損胃がん細胞が、ＧＳＨの基礎レベルが低いため、ＧＳＨ阻害に対して脆弱であることを示す。図Ｓ７のＡは、ＰＤＣ：ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＮＳＣ－６４Ｃ細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＮＳＣ－７Ｃ細胞におけるＳＬＣ７Ａ１１ ｍＲＮＡの相対的発現を示す。データは平均±ＳＤとして表されている。図Ｓ７のＢは、ＰＤＣ：ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＮＳＣ－６４Ｃ細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＮＳＣ－７Ｃ細胞におけるＳＬＣ７Ａ１１ ｍＲＮＡの相対的発現を示す。データは平均±ＳＤとして表されている。図Ｓ７のＣは、５０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理されたＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＮＳＣ－６４Ｃ細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＮＳＣ－７Ｃ細胞における、還元型ＧＳＨと酸化型ＧＳＨジスルフィド（ＧＳＳＧ）の比率を示す、ＧＳＨ／ＧＳＳＧの相対レベルを示す。データは平均±ＳＤとして表されている。図Ｓ７のＤは、５０μＭのＡＰＲ－２４６で４８時間処理されたＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＮＳＣ－６４Ｃ細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＮＳＣ－７Ｃ細胞における相対ＲＯＳレベルを示す。データは平均±ＳＤとして表されている。 図Ｓ８は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損びまん性胃がんＰＤＣがエラスチンに対し感受性があることを示す。図Ｓ８のＡは、６日間の処置後の４つのＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＰＤＣ及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＰＤＣを含むＤＧＣ ＰＤＣにおけるエラスチンについてのＩＣ５０値を示す。データは平均±ＳＥＭとして表されている。（ｎ＝４）＊ｐ＜０．０５；両側スチューデントのｔ検定。図Ｓ８のＢは、１．２５μＭのエラスチンで２４時間処理されたＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＮＳＣ－４８ＣＡ細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損ＮＳＣ－６７Ｃ細胞における、還元型ＧＳＨと酸化型ＧＳＨジスルフィド（ＧＳＳＧ）の比率を示す、ＧＳＨ／ＧＳＳＧの相対レベルを示す。データは平均±ＳＤとして表されている。

定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合は、定義を含む本文書が優先されることになる。本明細書に記載されているものと同様又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、及び例は、例示にすぎず、限定することを意図するものではない。

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、及びそれらの変形である用語は、追加の行為又は構造の可能性を排除しない、制限のない移行句、用語、又は単語であるものとする。単数形の冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈で明確に指示されていない限り、複数形の場合も含まれる。
本開示はまた、明示的に記載されているかどうかにかかわらず、本明細書に提示される実施形態又は要素「を含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」他の実施形態も考慮に入れる。

数量に関連して使用される「約」という用語は、記載された値を含み、文脈によって決定される意味を有する（例えば、少なくとも特定の数量の測定に関連する誤差の程度を含む）。「約」という用語はまた、２つの終点の絶対値によって定義される範囲を開示しているものと見なすべきである。「約」という用語は、示された数のプラスマイナス１０％を指す場合がある。

検討
本発明は、有効量のグルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤をそれを必要とする哺乳動物に投与することを含む、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がんを治療するための方法に関する。
「グルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤」には、ＧＳＨ自体又はＧＳＨ合成酵素を阻害するための物質が含まれる。例えば、グルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤には、グルタミン酸－システインリガーゼシンテターゼ（ＧＣＬ）阻害剤、グルタミン酸－システインリガーゼ触媒サブユニット（ＧＣＬＣ）阻害剤、グルタミン酸－システインリガーゼ修飾因子（ＧＣＬＭ）阻害剤、ＧＳＨシンテターゼ（ＧＳＳ）阻害剤、ＳＬＣ７Ａ１１阻害剤、又はそれらの組合せが含まれる。

それらの中で、グルタミン酸－システインリガーゼ触媒サブユニット（ＧＣＬＣ）、すなわち、ＧＳＨ生合成経路における律速酵素を阻害するＧＣＬＣ阻害剤が特に好ましい。ＧＣＬＣ阻害剤の代表的な例は、ブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）（ＣＡＳ番号：８３７３０－５３－４）である。
その中では、ＧＣＬ阻害剤も好ましい。

ＳＬＣ７Ａ１１阻害剤は、例えば、スルファサラジン（Ｐｆｉｚｅｒ）である。
グルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤はまた、抗体、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子化合物、それらの組合せなどであり得る。
本明細書で使用される場合、「低分子化合物」は、酵素基質又は生物学的プロセスの調節因子としての役割を果たし得る低分子量有機化合物を意味する。一般に、低分子化合物のサイズは、約５キロダルトン（ｋＤ）未満である。いくつかの実施形態では、本発明によれば、低分子化合物は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、多糖、糖タンパク質、プロテオグリカンなどではない。いくつかの実施形態において、小分子は、治療薬、アジュバント、又は薬物であり得る。

グルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤は、ＧＳＨ自体を阻害し、その結果、細胞内のＧＳＨレベルを低下させる「ＧＳＨ低減化合物」であり得る。ＧＳＨ低減化合物は、例えば、ＡＰＲ－０１７（抗Ｐ２Ｙ１３受容体抗体又はＰＲＩＭＡ－１としても知られている；Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ．）又はＡＰＲ－２４６（ＰＲＩＭＡ－１ＭＥＴとしても知られている；Ａｐｒｅａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）（ＣＡＳ番号：５２９１－３２－７）である。

本明細書で使用される場合、「ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体」の成分には、例えば、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＬ６Ａ（ＢＡＦ５３Ａ）、ＡＣＴＬ６Ｂ（ＢＡＦ５３Ｂ）、ＡＲＩＤ１Ａ（ＢＡＦ２５０Ａ）、ＡＲＩＤ１Ｂ（ＢＡＦ２５０Ｂ）、ＡＲＩＤ２（ＢＡＦ２００）、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＣＬ１１Ｂ、ＢＣＬ７Ａ、ＢＣＬ７Ｂ、ＢＣＬ７Ｃ、ＢＩＣＲＡ（ＧＬＴＳＣＲ１）、ＢＲＤ７、ＢＲＤ９、ＤＰＦ１（ＢＡＦ４５Ｂ）、ＤＰＦ２（ＢＡＦ４５Ｄ）、ＤＰＦ３（ＢＡＦ４５Ｃ）、ＰＢＲＭ１（ＢＡＦ１８０）、ＰＨＦ１０（ＢＡＦ４５Ａ）、ＳＭＡＲＣＡ２（ＢＲＭ）、ＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１、ＢＡＦ１９０）、ＳＭＡＲＣＢ１（ＢＡＦ４７、ｈＳＮＦ５、ＩＮＩ１）、ＳＭＡＲＣＣ１（ＢＡＦ１５５）、ＳＭＡＲＣＣ２（ＢＡＦ１７０）、ＳＭＡＲＣＤ１（ＢＡＦ６０Ａ）、ＳＭＡＲＣＤ２（ＢＡＦ６０Ｂ）、ＳＭＡＲＣＤ３（ＢＡＦ６０Ｃ）、ＳＭＡＲＣＥ１（ＢＡＦ５７）、ＳＳ１８又はそれらの組合せが含まれる。それらの中で、ＡＲＩＤ１Ａ、ＳＭＡＲＣＡ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＰＢＲＭ１又はそれらの組合せが好ましい。特に、ＡＲＩＤ１Ａの方が好ましい。

本明細書で使用される場合、場合によっては、「（複数の場合もある）ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体」は、各成分（複数の場合もある）又はそれらの組合せを意味することもある。
本明細書で使用される場合、「ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（複数の場合もある）欠損」は、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（複数の場合もある）遺伝子（複数の場合もある）欠損又はＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（複数の場合もある）遺伝子突然変異によって引き起こされるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（複数の場合もある）タンパク質（複数の場合もある）欠損を意味する。本明細書において、「ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（複数の場合もある）欠損」は、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（複数の場合もある）に属する各遺伝子又はＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（複数の場合もある）に属する遺伝子の組合せが変異することによって引き起こされ得る。「ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がん」とは、複数の場合もあるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の欠損を有するがんを意味する。

本明細書で使用される場合、「ＡＲＩＤ１Ａ欠損」は、ＡＲＩＤ１Ａ遺伝子変異によって引き起こされるＡＲＩＤ１Ａ遺伝子欠損又はＡＲＩＤ１Ａタンパク質欠損を意味する。「ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん」とは、ＡＲＩＤ１Ａ欠損を有するがんを意味する。ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんの例としては、卵巣がん、子宮がん、胃がん、膀胱がん、胆管がん、肝がん、食道がん、肺がん、結腸がん、膵臓がん、乳がん、神経芽細胞腫、神経膠腫、皮膚がん、Ｂ細胞リンパ腫、腎がんなどがある。

本明細書で使用される場合、「ＳＭＡＲＣＡ２（ＢＲＭ）欠損」は、ＳＭＡＲＣＡ２（ＢＲＭ）遺伝子変異によって引き起こされるＳＭＡＲＣＡ２（ＢＲＭ）遺伝子欠損又はＳＭＡＲＣＡ２（ＢＲＭ）タンパク質欠損を意味する。「ＳＭＡＲＣＡ２（ＢＲＭ）欠損がん」とは、ＳＭＡＲＣＡ２（ＢＲＭ）欠損を有するがんを意味する。ＳＭＡＲＣＡ２（ＢＲＭ）欠損がんの例には、腺嚢胞がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、食道がん、胃がん、神経膠腫、頭頸部がん、肺がん、髄芽細胞腫、黒色腫、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、ＳＭＡＲＣＡ４欠損胸部肉腫、子宮がん、肉腫などが含まれる。

本明細書で使用される場合、「ＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１）欠損」は、ＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１）遺伝子変異によって引き起こされるＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１）遺伝子欠損又はＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１）タンパク質欠損を意味する。「ＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１）欠損がん」とは、ＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１）欠損を有するがんを意味する。ＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１）欠損がんの例には、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、Ｂ細胞リンパ腫、食道がん、胃がん、神経膠腫、頭頸部がん、肝がん、肺がん、黒色腫、膵臓がん、前立腺がん、腎がん、ラブドイド腫瘍、卵巣がん、ＳＭＡＲＣＡ４欠損胸部肉腫、子宮がんなどが含まれる。

本明細書で使用される場合、「ＳＭＡＲＣＢ１欠損」は、ＳＭＡＲＣＢ１遺伝子変異によって引き起こされるＳＭＡＲＣＢ１遺伝子欠損又はＳＭＡＲＣＢ１タンパク質欠損を意味する。「ＳＭＡＲＣＢ１欠損がん」とは、ＳＭＡＲＣＢ１欠損を有するがんを意味する。ＳＭＡＲＣＢ１欠損がんの例には、類上皮肉腫、家族性シュワノマトーシス、胃がん、腎がん、ラブドイド腫瘍、副鼻腔がん、滑膜肉腫、未分化脊索腫、子宮がんなどが含まれる。

本明細書で使用される場合、「ＰＢＲＭ１欠損」は、ＰＢＲＭ１遺伝子変異によって引き起こされるＰＢＲＭ１遺伝子欠損又はＰＢＲＭ１タンパク質欠損を意味する。「ＰＢＲＭ１欠損がん」とは、ＰＢＲＭ１欠損を有するがんを意味する。ＰＢＲＭ１欠損がんの例には、膀胱がん、胆管がん、結腸がん、Ｂ細胞リンパ腫、食道がん、胃がん、頭頸部がん、肺がん、黒色腫、中皮腫、膵臓がん、腎がん、子宮がんなどが含まれる。

本明細書で使用される場合、卵巣がんには、例えば、卵巣明細胞がん又は卵巣類内膜がんが含まれる。
日本では卵巣明細胞がんに罹患している患者が多く、ＡＲＩＤ１Ａ欠損卵巣がんは高い割合で、すなわち卵巣がん患者の２名のうちの１名に見られる。

本明細書で使用される場合、子宮がんは、例えば、子宮体子宮内膜がんである。
本明細書で使用される場合、「治療」（「治療する」又は「治療している」）という用語は、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（複数の場合もある）欠損がんの部分的若しくは完全な緩和、改善、回復、阻害、発症の遅延、重症度の軽減並びに／又は１つ以上の症状、特徴、及び／若しくは原因の頻度、発生率、若しくは重症度の低減をもたらすグルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤の何らかの投与を指す。前述の治療は、関連する疾患、障害及び／若しくは状態の兆候を示さない対象に対するものであり得（例えば、予防的であり得る）、かつ／又は疾患、障害及び／若しくは状態の初期兆候のみを示す対象に対するものであり得る。あるいは又はさらに、前述の治療は、関連する疾患、障害及び／又は状態の１つ以上の確立された兆候を示す対象のものであり得る（例えば、治療的であり得る）。

本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、所望の治療結果を達成するために必要な投与量及び期間で有効な量を指す。組成物の有効量は、当業者によって決定され得、個体の病状、年齢、性別、及び体重、並びに組成物が個体において所望の応答を誘発する能力などの要因に応じて変化し得る。有効量はまた、阻害剤の治療的に有益な効果がその毒性又は有害な作用よりも重要である場合の量である。

グルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤の有効量は、投与方法に応じて、局所的又は全身的な所望の薬物レベルを達成するために適切に調整され得る。具体的には、有効量は、好ましくは１日あたり１度に約０．５ｎｇ～約２０００ｍｇ、又は１日あたり１度に約１ｎｇ～約１０００ｍｇであり、患者に１日１回～数回投与され得る。

本明細書で使用される場合、「哺乳動物」という用語は、ヒト又はヒト以外の動物を指す。いくつかの実施形態において、非ヒト動物は、例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、ブタなどを含む。
本明細書で使用される場合、「投与する」（また、投与、投与すること）という用語は、本阻害剤又はそれを含む組成物を対象（哺乳動物）に投与することを指す。開示された阻害剤又は組成物が投与される経路及びその形態により、使用される担体のタイプが決定されることになる。阻害剤又は組成物は、例えば、全身投与（例えば、経口、直腸、鼻、舌下、頬側、インプラント、又は非経口）又は局所投与（例えば、皮膚、肺、鼻、耳、眼、リポソーム送達システム、又はイオントフォレーシス）に適した様々な形態であり得る。

本発明による阻害剤又は医薬組成物は、それ自体が知られており、当業者に馴染みのあるプロセスによって調製することができる。医薬組成物として、有効成分は、それ自体で、又は好ましくは適切な医薬助剤及び／又は補形薬と組み合わせて、例えば錠剤、コーティング錠、カプセル、カプレット、坐剤、パッチ、乳濁液、懸濁液、ゲル又は溶液の形で使用される。当業者は、その専門知識があるが故に、所望の医薬製剤、調製物又は組成物に適した助剤、賦形剤、補形薬、希釈剤、担体又はアジュバントに精通している。溶媒に加えて、ゲル形成剤、軟膏基剤及び他の補形薬、例えば、抗酸化剤、分散剤、乳化剤、防腐剤、可溶化剤、着色料、錯化剤又は透過促進剤を使用することができる。

本発明はまた、がんを有する患者におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（複数の場合もある）欠損の存在を検出することを含む、ＧＳＨ代謝経路阻害剤に対して感受性のある患者を検出及び／又は選択するための方法に関する。
本明細書で使用される場合、「ＧＳＨ代謝経路阻害剤に感受性のある患者」とは、ＧＳＨ代謝経路阻害剤に感受性のあるがんを有する患者を意味する。

本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、組織試料（脳、毛髪、頬スワブ、血液、唾液、精液、筋肉、任意の内臓、又はがん細胞、前がん性細胞、腫瘍細胞）、細胞試料、体液試料（尿、血液、腹水、胸膜液、脊髄液）などを含む。
具体的には、いくつかの実施形態において、本発明による、ＧＳＨ代謝経路阻害剤に対して感受性のある患者を検出及び／又は選択するための方法は、（ｉ）がんを有する患者に由来する試料を提供すること、（ｉｉ）試料におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（複数の場合もある）のレベルを測定すること、（ｉｉｉ）測定されたレベルと所定の値を比較することを含み、そして（ｉｖ）測定されたレベルが所定の値を下回っている場合、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（複数の場合もある）は欠損しており、その患者はＧＳＨ代謝経路阻害剤に対し感受性がある可能性が高いと判断され、測定されたレベルが所定の値を超えている場合、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（複数の場合もある）は欠損しておらず、その患者はＧＳＨ代謝経路阻害剤に対し感受性がある可能性は低いと判断される。

いくつかの実施形態において、本発明による、ＧＳＨ代謝経路阻害剤に対して感受性のある患者を検出及び／又は選択するための方法は、（ｉ）がんを有する患者に由来する試料を提供すること、（ｉｉ）試料におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（複数の場合もある）遺伝子発現のレベルを測定すること、（ｉｉｉ）測定されたレベルと所定の値を比較することを含み、そして（ｉｖ）測定されたレベルが所定の値を下回っている場合、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（複数の場合もある）遺伝子は欠損しており、その患者はＧＳＨ代謝経路阻害剤に対し感受性がある可能性が高いと判断され、測定されたレベルが所定の値を超えている場合、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（複数の場合もある）遺伝子は欠損しておらず、その患者はＧＳＨ代謝経路阻害剤に対し感受性がある可能性は低いと判断される。

所定の値は、罹患していない個体からの正常組織試料におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（複数の場合もある）遺伝子又はタンパク質のレベルであり得る。
試料中のＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（複数の場合もある）欠損の存在は、例えば、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｐａｎｅｌ Ｔｅｓｔ（ＯｎｃｏＧｕｉｄｅ（登録商標）ＮＣＣ Ｏｎｃｏｐａｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍ）によって決定される。
本発明はまた、キットに関する。キットには、キットの使用により哺乳動物（特にヒト）の病状の治療が実現することになるという情報、指示、又はその両方が含まれ得る。情報及び指示は、言葉、図、又はその両方の形態などであり得る。追加的又は代替的に、キットは、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト）の病状を治療又は予防するという利点を伴って、阻害剤、組成物、又はその両方、及び阻害剤又は組成物の適用方法に関する情報、指示、又はその両方を含み得る。

この試験では、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（複数の場合もある）欠損に応じたＡＰＲ－２４６などのＧＳＨ代謝経路阻害剤に対する選択的感受性がいくつかのがん細胞株で観察された。例えば、ＡＲＩＤ１Ａ欠損に関しては、人工遺伝子ノックアウトを伴うか又は伴わないＨＣＴ１１６結腸がん細胞、広く使用されている卵巣、子宮、胃、及び胆道のがん細胞株、並びに新しく確立された卵巣患者由来細胞（ＰＤＣ）。本明細書での結果に基づいて、ＡＲＩＤ１Ａタンパク質発現を保持しているＡＲＩＤ１Ａ変異腫瘍ではなく、ＡＲＩＤ１Ａタンパク質発現を伴わないＡＲＩＤ１Ａ変異腫瘍は、ＧＳＨ阻害剤又はＧＳＨ代謝経路阻害剤の標的療法によく反応することが実証された。したがって、ＡＲＩＤ１Ａタンパク質の免疫組織化学的評価は、ＧＳＨ阻害剤又はＧＳＨ代謝経路阻害剤の標的療法に適した患者を検出及び／又は選択するための有用な診断ツールとなる。

以下の実施例は、当業者に、特許請求の範囲で主張された方法がどのように作成及び評価されるかについての完全な開示及び説明を提供するために記載され、本発明の純粋な例示を意図したもので、本発明者らが発明として見なすものの範囲を限定することを意図している訳ではない。
実施例１：ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞はＰＲＩＭＡ－１及びＡＰＲ－２４６に対する選択的感受性を示す
ＡＲＩＤ１Ａ欠損によって引き起こされる細胞の脆弱性を調査するために、標的が解明されている３３４の阻害剤に対する親ＡＲＩＤ１Ａ野生型（ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ）及びＡＲＩＤ１Ａノックアウト（ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ）ＨＣＴ１１６結腸がん細胞の感受性の違いを調べた。薬物感受性スクリーニングにより、ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞の増殖を再現可能に抑制するが、ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ細胞の増殖を抑制しないユニークなヒットとして（図１－２－Ｄ）、複数のポリペプチドにおけるチオールに共有結合するＰＲＩＭＡ－１（ＡＰＲ－０１７）（図１－１－Ａ～図１－１－Ｃ、表Ｓ１）を特定した（Ｂｙｋｏｖら、Ｎａｔ Ｍｅｄ ８、２８２－２８８、２０１６を参照）。ＰＲＩＭＡ－１に対するＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞の選択的感受性を、コロニー形成アッセイで細胞の生存を測定することによって検証した（図１－２－Ｅ、図Ｓ１－１－Ａ）。ＰＲＩＭＡ－１の構造類似体であるＡＰＲ－２４６（ＰＲＩＭＡ－１Ｍｅｔ）は、血液がん及び前立腺がんの臨床試験で試験されている（Ｌｅｈｍａｎｎら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３０、３６３３－３６３９、２０１２を参照）。ＡＰＲ－２４６は、ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞の生存率を著しく低下させたが、ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ細胞については低下させなかった（図１－２－Ｆ～図１－２－Ｇ、図Ｓ１－１－Ｂ）。次に、ＡＰＲ－２４６及びＰＲＩＭＡ－１に対する様々なＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞の感受性を試験した。この分析では、４つのＡＲＩＤ１Ａ発現細胞株と６つのＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞株のパネルを使用した（図１－３－Ｈ）。ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞は、ＡＲＩＤ１Ａ発現がん細胞よりもＡＰＲ－２４６に対して感受性が高かった（図１－４－Ｉ、図Ｓ１－１－Ｃ～図Ｓ１－２－Ｅ）。ＡＰＲ－２４６に対するＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞の選択的感受性を、コロニー形成アッセイで細胞生存率を測定することによって検証した（図１－４－Ｊ、図Ｓ１－２－Ｆ）。ＰＲＩＭＡ－１処置でも同様の結果が得られた（図Ｓ１－２－Ｇ～図Ｓ１－３－Ｈ）。ＴＯＶ２１Ｇ ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞におけるＡＰＲ－２４６及びＰＲＩＭＡ－１の優先的致死性が、ＡＲＩＤ１Ａ ｃＤＮＡの安定した発現によってレスキューされたことから（図１－４－Ｋ、図Ｓ１－３－Ｉ）、細胞の状況に関係なく、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がこれらの薬物に対する感受性に関与していることを確認した。

ＡＰＲ－２４６に対するＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞の感受性を調べるために、ゲノム全体の発現プロファイリングを実施した。ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ細胞ではなく、ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞において発現レベルがＡＰＲ－２４６処理時に２倍超となる増加や２分の１未満となる減少を示す６，４２９遺伝子の経路分析を実施して、ＡＲＰ－２４６に対するＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞の感受性に関与する経路を特定した（図１－５－Ｌ）。アポトーシスに関連する経路は、これらの遺伝子間で有意に（ｐ＜０．００１）増加していた（図１－５－Ｌ）。特に、ＮＯＸＡを含むいくつかの重要なアポトーシス促進遺伝子は、ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞では著しくアップレギュレートされたが、ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ細胞ではアップレギュレートされなかった（図１－６－Ｍ）。定量的ＲＴ－ＰＣＲ分析により、ＡＰＲ－２４６で処理されたＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞でＮＯＸＡのｍＲＮＡ発現が増加することが確認された（図１－７－Ｎ、図Ｓ１－３－Ｊ～図Ｓ１－３－Ｋ）。それに応じて、ＮＯＸＡのタンパク質発現は、ＡＰＲ－２４６で処理されたＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞で特異的に増加した（図１－７－Ｏ）。さらに、ＡＰＲ－２４６処理は、ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞において、カスパーゼ活性化及びアネキシンＶの出現によって評価されるように、アポトーシスを誘導した（図１－７－Ｐ～図１－７－Ｒ、図Ｓ１－４－Ｌ～図Ｓ１－４－Ｍ）。

実施例２：ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞はＧＳＨ阻害に対して脆弱である
ＡＰＲ－２４６はマイケルアクセプターメチレンキヌクリジノン（ＭＱ）に変換され、チオールと反応して抗酸化代謝物ＧＳＨ及び抗酸化調節剤チオレドキシンレダクターゼ（ＴｒｘＲ）の活性を阻害する（Ｐｅｎｇら、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ ４、ｅ８８１、２０１３；Ｔｅｓｓｏｕｌｉｎら、Ｂｌｏｏｄ １２４、１６２６－１６３６、２０１４を参照）。ＭＱの共有結合により、ＧＳＨのレベルは低下し、ＴｒｘＲ活性は阻害され、それによってＲＯＳ生成と抗酸化の間の細胞内バランスがＲＯＳレベルの増加に向かってシフトした（図２－１－Ａ）。したがって、次に、ＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞に対するＡＰＲ－２４６の致死効果がＧＳＨ及びＴｒｘＲの阻害によるものかどうかを調べた。ＡＰＲ－２４６処理により、ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ細胞ではなく、ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞においてＧＳＨレベル［還元型ＧＳＨとその酸化型ＧＳＨジスルフィド（ＧＳＳＧ）の比率として表される］が用量依存的に減少した（図２－１－Ｂ）。一方、同じ濃度のＡＰＲ－２４６がＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ細胞又はＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞においてＴｒｘＲ活性（ＴｒｘＲ１、ＴｒｘＲ２及びＴｒｘＲ３を含む）に影響を与えることはなかったが、高濃度のＡＰＲ－２４６はＴｒｘＲ活性を抑制した（図２－１－Ｃ、図Ｓ２－１－Ａ）。特に、細胞内Ｈ２Ｏ２によって示されるように、細胞内ＲＯＳレベルは、ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ細胞よりもＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞においてより増加した（図２－１－Ｄ）。ＡＰＲ－２４６処理時のＲＯＳレベルの増加は、ＡＰＲ－２４６がＧＳＨなどの抗酸化剤に結合してその機能を抑制するという以前の発見と一致している（Ｂｙｋｏｖら、Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ ６、２１、２０１６を参照）。特に、ＲＯＳレベルはＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ細胞よりもＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞ではるかに増加しており、ＡＰＲ－２４６処理によって誘発される酸化ストレスのレベルがＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ細胞よりもＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞で高かったこと、すなわち、ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞におけるＧＳＨレベルが低下したため、ＲＯＳ生成と抗酸化のバランスがより酸化された状態にシフトしたことを示している。実際、酸化ストレスによって活性化されることが知られているｐ３８ＭＡＰＫ及びＥＧＦＲシグナル伝達経路の活性化（Ｍａｔｓｕｚａｗａ及びＩｃｈｉｊｏ、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７８０、１３２５－１３３６、２００８；Ｗｅｎｇら、Ｊ Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ３７、６１、２０１８を参照）は、ＡＲＰ－２４６で処理されたＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞における方がより明白であった（図１－５－Ｌ）。さらに、抗体アレイ分析は、シクロオキシゲナーゼ－２（ＣＯＸ－２）、リン酸化ＪＮＫ、及びリン酸化ＨＳＰ２７のレベルが、すべて酸化ストレスによって誘導されるものであり、ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ細胞よりもＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞の方で高いことを示した（図２－２－Ｅ）。ＡＰＲ－２４６に応答したＪＮＫのリン酸化は、ＲＯＳスカベンジャーであるＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）での同時処理によって抑制された（図２－２－Ｆ）。これらの結果は、ＡＰＲ－２４６がＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞において高い酸化ストレスの状態を誘発したことを示している。

ＡＰＲ－２４６処理後のＧＳＨレベルの低下とＲＯＳレベルの上昇は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損のヒト卵巣がん細胞及び他のがん細胞でのみ明らかであった（図２－２－Ｇ～図２－３－Ｈ、図Ｓ２－１－Ｂ～図Ｓ２－２－Ｃ）。ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞へのＡＲＩＤ１Ａ ｃＤＮＡの安定した導入により、ＡＰＲ－２４６によって誘発されるＧＳＨの減少、ＲＯＳの増加、及び細胞増殖の阻害がレスキューされたことから（図２－４－Ｉ～図２－４－Ｋ）、ＡＰＲ－２４６に対する感受性がＡＲＩＤ１Ａ機能に依存していることが示された。さらに、ＡＰＲ－２４６で処理されたＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞におけるＧＳＨの減少とＲＯＳの増加は、ＲＯＳスカベンジャーであるＮＡＣ又はＧＳＨ補償剤グルタチオンモノエチルエステル（ＧＳＨ－ＭＥＥ）での同時処理によって完全に抑制された（図２－４－Ｌ～図２－４－Ｍ）。一貫して、ＡＰＲ－２４６で処理されたＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞における細胞生存率の低下とアポトーシスの誘導は、ＮＡＣ又はＧＳＨ－ＭＥＥでの同時処理によって完全に消失した（図２－５ーＮ～図２－５－Ｏ）。同様の結果が、２つの異なるＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞株で得られた（図Ｓ２－２－Ｄ～図Ｓ２－３－Ｆ）。これらの結果は、ＡＰＲ－２４６によるＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞でのＧＳＨの阻害により、ＲＯＳ生成とＧＳＨによる抗酸化のバランスが崩れてＲＯＳレベルが高くなり、その結果アポトーシス細胞死がもたらされることを示している。

ＡＰＲ－２４６及びＰＲＩＭＡ－１に由来するＭＱも、ＴｒｘＲのシステイン残基に共有結合する（Ｂｙｋｏｖら、Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ ６、２１、２０１６を参照）。実際、ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞は、ＡＲＩＤ１Ａ発現細胞よりも、ＴｒｘＲ阻害剤であるオーラノフィンに対して感受性が高かった（図Ｓ２－４－Ｇ～図２－４－Ｉ）。オーラノフィンによるＧＳＨレベルの低下とＲＯＳレベルの上昇は、ＡＰＲ－２４６の場合と同様に、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞でより顕著であった（図Ｓ２－４－Ｊ～図Ｓ２－４－Ｋ）。これらの結果は、ＡＰＲ－２４６に対するＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞の感受性が、図２－１－Ｂ～図２－１－Ｃに示すように、主にＧＳＨ阻害に起因するものであるが、部分的にＴｒｘＲの阻害に起因する可能性もあることを示している。ＭＱはまた、変異体ｐ５３に結合して活性化し、アポトーシスの誘導に至る（Ｂｙｋｏｖら、Ｎａｔ Ｍｅｄ ８、２８２－２８８、２００２；Ｌａｍｂｅｒｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １５、３７６－３８８、２００９を参照）。ＨＣＴ１１６細胞は野生型ＴＰ５３を発現する。したがって、ｐ５３がＡＰＲ－２４６に対するＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞の感受性の根底にある標的である可能性は低い。実際、内因性野生型ｐ５３の枯渇が、ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞におけるＡＰＲ－２４６誘導アポトーシスに多大な影響を与えることはなかった（図Ｓ２－４－Ｌ～図Ｓ２－５－Ｎ）。さらに、野生型ｐ５３を安定化するＭＤＭ２阻害剤であるヌトリン３ａによる処理により、ｐ５３レベルは増加し、ｐ５３標的ｐ２１がアップレギュレートされたが、アポトーシスを誘導する濃度のＰＲＩＭＡ－１及びＡＰＲ－２４６による処理では、ｐ５３又はｐ２１の発現に著しい影響は無かった（図Ｓ２－５－Ｏ）。これらの発見は、ＡＰＲ－２４６に対するＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞の感受性がｐ５３に依存していないことを示している。ＮＯＸＡはｐ５３の転写標的であるが、ただし、ＡＰＲ－２４６によって誘導されたＮＯＸＡの発現は、ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞におけるｐ５３枯渇によって抑制されなかった（図Ｓ２－６－Ｐ）。ＮＯＸＡの誘導はまた、ＪＮＫシグナル伝達経路の活性化によっても引き起こされる（Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ Ｃａｒｃｉｎｏｇ ４７、４３６－４４５、２００８を参照）。実際、ＡＰＲ－２４６によって誘導されたＮＯＸＡ発現は、ＪＮＫ阻害剤（図Ｓ２－６－Ｑ～図Ｓ２－６－Ｒ）又はＲＯＳスカベンジャーであるＮＡＣ（図２－２－Ｆ）による同時処理によっても抑制された。したがって、酸化ストレスによって活性化されたＪＮＫシグナル伝達は、ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞においてＮＯＸＡのアップレギュレーションを誘発した。しかしながら、ＡＰＲ－２４６で処理されたＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞におけるＧＳＨレベルの低下とＲＯＳレベルの上昇は、ＪＮＫ阻害剤での同時処理又はＮＯＸＡの枯渇によって抑制されなかった（図Ｓ２－６－Ｓ～図Ｓ２－７－Ｗ）。したがって、ＪＮＫシグナル伝達経路の活性化とその結果としてのＮＯＸＡ発現の増加は、致死性を引き起こすメディエータではなく、酸化ストレスの二次的影響であると思われる。

実施例３：ＧＣＬＣは、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんにおける有望な合成致死標的である
ＧＳＨは、システイン、グルタメート、及びグリシンから、複数の代謝因子の作用を介して合成される（図３－１－Ａ）。ＧＳＨ代謝経路におけるＡＲＩＤ１Ａ欠損がんに対する治療標的を特定するために、ＧＳＨ代謝経路遺伝子をＡＲＩＤ１Ａとの合成致死パートナーシップについてスクリーニングした。後続分析により、ＧＣＬＣ、ＧＳＳ、及びＳＬＣ７Ａ１１のノックダウンは、ＧＳＨレベルの低下とＲＯＳレベルの上昇に関連して、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞の増殖を大幅かつ特異的に抑制することが明らかになった（図３－２－Ｂ～図３－２－Ｄ）。一方、不要な役割を果たしていると考えられている、ＧＬＳとＧＬＳ２、ＳＬＣ１Ａ４とＳＬＣ１Ａ５、及びＩＤＨ１とＩＤＨ２などの機能的なパラログ遺伝子産物を同時にノックダウンしても、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞の増殖には影響しなかった（図３－２－Ｂ）。さらに、ＴｒｘＲ及びスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）ファミリーに属する抗ＲＯＳ遺伝子産物のノックダウンは、複数のファミリーの遺伝子産物が同時にノックダウンされた場合でも、細胞増殖、ＧＳＨレベル、又はＲＯＳレベルに著しい影響を与えることはなかった（図Ｓ３－１－Ａ～図Ｓ３－１－Ｃ）。次に、ＧＳＨ代謝因子の既知阻害剤を、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんに対する選択性についてスクリーニングした。ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ卵巣がん細胞は、ＡＲＩＤ１Ａ発現ＲＭＧ－Ｉ卵巣がん細胞よりもＧＣＬＣ阻害剤ブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）及びＳＬＣ７Ａ１１阻害剤スルファサラジンに対し高い感受性を示したが、ＧＬＳ阻害剤化合物９６８又はＧ６ＰＤ阻害剤６－アミノニコチンアミド（６－ＡＮ）に対しては感受性を示さず（図３－３－Ｅ）、ノックダウン実験と一致していた。ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ細胞を使用して同様の結果を得た（図Ｓ３－１－Ｄ）。ＧＣＬＣ、ＧＳＳ、又はＳＬＣ７Ａ１１のノックダウンにより、ＧＳＨレベルの低下とＲＯＳレベルの上昇に関連して、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＯＶＩＳＥ卵巣がん細胞の増殖が阻害された（図Ｓ３－２－Ｅ～図Ｓ３－３－Ｊ）。ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ細胞におけるＧＣＬＣ及びＳＬＣ７Ａ１１のノックダウンによって引き起こされるＧＳＨレベルの低下、ＲＯＳレベルの上昇、及び細胞増殖の阻害が、ＡＲＩＤ１Ａ ｃＤＮＡの安定した発現によってレスキューされたことから（図Ｓ３－３－Ｋ～図Ｓ３－４－Ｏ）、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がこれらの遺伝子の枯渇に対する感受性に関与していることが確認された。

上記で列挙された３つのＧＳＨ合成経路酵素の中で、本発明者らは、ＧＣＬＣがＧＳＨ合成の律速酵素（すなわち、恐らくは創薬可能な標的）であり、その一時的なノックダウンによりＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞の増殖が著しく阻害されたため、ＧＣＬＣに焦点を絞った（図Ｓ３－２－Ｈ）。実際、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）による処理によって誘導されたＧＣＬＣの安定したｓｈＲＮＡ介在ノックダウンは、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞の増殖を選択的に阻害した（図３－４－Ｆ～図３－４－Ｇ）。ＧＳＨレベル及びＲＯＳレベルは、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞においてそれぞれ著しく減少及び増加したが、ＡＲＩＤ１Ａ発現細胞ではかかる減少及び増加は起こらなかった（図３－４－Ｈ～図３－４－Ｉ）。ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ細胞を使用して同様の結果を得た（図Ｓ３－４－Ｐ～図Ｓ３－４－Ｓ）。ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞におけるＧＣＬＣ枯渇の致死性は、コロニー形成アッセイで細胞生存率を測定することによって検証された（図３－５－Ｊ、図Ｓ３－５－Ｔ～図Ｓ３－５－Ｕ）。ＧＣＬＣの異所性発現により、ＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞株及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞におけるＧＣＬＣのノックダウン時のＧＳＨレベルの低下は抑止された（図３－５－Ｋ～図３－５－Ｌ、図Ｓ３－５－Ｖ～図Ｓ３－５－Ｗ）。さらに、異所性ＧＣＬＣ発現により、ＧＣＬＣノックダウン時にＲＯＳ産生とそれに続く細胞死が抑制された（図３－５－Ｍ～図３－５－Ｎ、図Ｓ３－５－Ｘ～図Ｓ３－５－Ｙ）。まとめると、これらのデータは、ＧＣＬＣがＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞における合成致死標的であることを示している。

ＧＣＬＣが創薬可能な標的であるかどうかを判断するために、本発明者らは、４つのＡＲＩＤ１Ａ発現がん細胞株と６つのＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞株のＧＣＬＣ阻害剤ＢＳＯに対する感受性を調べた。ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞株は、ＢＳＯに対して選択的感受性を示した（図３－６－Ｏ、図Ｓ４－１－Ａ）。コロニー形成アッセイは、ＢＳＯが、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞株及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞において生存を選択的に減少させ、アポトーシスを増加させることを示した（図３－６－Ｐ～図３－６－Ｑ、図Ｓ４－１－Ｂ～図Ｓ４－２－Ｅ）。ＢＳＯ処理によりＧＳＨレベルは低下したが、これはＲＯＳレベルとＮＯＸＡ発現の増加に関連しており、この効果はＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞においてより顕著であった（図Ｓ４－２－Ｆ～図Ｓ４－２－Ｊ）。ＡＲＩＤ１Ａの安定した発現により、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞におけるＢＳＯによって誘導されるＧＳＨの減少、ＲＯＳの増加、及び細胞増殖の阻害が抑止されたことから（図Ｓ４－３－Ｋ～図Ｓ４－３－Ｍ）、ＢＳＯに対し観察された応答はＡＲＩＤ１Ａに依存することが示されている。ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞におけるＢＳＯによって誘導されるＧＳＨの減少は、ＧＳＨ補償剤ＧＳＨ－ＭＥＥにより弱められたが、ＲＯＳスカベンジャーであるＮＡＣにより弱められることはなかった（図Ｓ４－４－Ｎ）。ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞におけるＡＰＲ－２４６によって誘導されるＧＳＨの低下は、ＧＳＨ－ＭＥＥとＮＡＣの両方によって抑制され（図２－４－Ｌ、図Ｓ２－２－Ｄ）、ＮＡＣが付加物を形成することによりＲＯＳとＡＰＲ－２４６活性を阻害するという事実と一致している（Ｌａｍｂｅｒｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １５、３７６－３８８、２００９を参照）。ＧＳＨ－ＭＥＥ及びＮＡＣの両方により、ＢＳＯによって誘導されるＲＯＳの増加と細胞増殖の阻害が抑止された（図Ｓ４－４－Ｏ～図Ｓ４－５－Ｐ）。これらの結果は、ＢＳＯ処理によってＧＳＨ産生が減少した場合でも、ＮＡＣとＧＳＨ－ＭＥＥは、それぞれ過剰なＲＯＳを除去し、ＧＳＨを補うことにより、細胞の生存率を回復させることを示している。ＧＣＬＣの異所性発現により、ＧＳＨの減少、ＲＯＳの増加、及び細胞増殖の阻害を含む、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞におけるＢＳＯ及びＡＰＲ－２４６のすべての影響が抑制された（図３－７－Ｒ～図３－７－Ｕ、図Ｓ４－５－Ｑ～図Ｓ４－６－Ｓ）。これらの結果は、ＧＣＬＣがＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞における創薬可能な標的であることを強く示唆している。

実施例４：ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞のＧＳＨ阻害に対する脆弱性は、ＳＬＣ７Ａ１１発現の低下によるＧＳＨ合成の低減によって引き起こされる
ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞は、ＡＲＩＤ１Ａ発現細胞と比べるとＧＳＨ阻害に対する感受性があった。したがって、本発明者らは、ＡＲＩＤ１Ａが、ＧＳＨ合成経路の構成要素をコードする遺伝子の転写を調節すると仮定した。これを調べるために、ＡＲＩＤ１Ａ発現がん細胞とＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞のパネルのゲノム全体の発現解析を実施した。合計で、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞において発現レベルが一貫して３分の２を下回る３４３個の遺伝子が同定された（図４－１－Ａ）。特に、この遺伝子セットには、ＧＳＨ代謝経路遺伝子ＳＬＣ７Ａ１１が１つだけ含まれていた。ＳＬＣ７Ａ１１ ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現は、ＡＲＩＤ１Ａ発現がん細胞の場合よりＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞の方が低かった（図４－１－Ｂ、図Ｓ５－１－Ａ～図Ｓ５－１－Ｃ）。ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞におけるＡＲＩＤ１Ａの安定した発現により、ＳＬＣ７Ａ１１ ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現が回復した（図４－１－Ｃ）。さらに、ＡＲＩＤ１Ａのノックアウトにより、ＳＬＣ７Ａ１１の発現が減少した（図４－２－Ｄ）。ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞におけるＳＬＣ７Ａ１１の誘導低下の根底にあるメカニズムを決定するために、ＳＬＣ７Ａ１１の転写アップレギュレーションにおけるＡＲＩＤ１Ａの関与を調査した。クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイにより、ＡＲＩＤ１ＡがＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ細胞におけるＳＬＣ７Ａ１１の転写開始部位（ＴＳＳ）に局在することが明らかになった（図４－２－Ｅ）。同様に、ＡＲＩＤ１Ａを含むＳＷＩ／ＳＮＦクロマチンリモデリング複合体（ＢＡＦ複合体）の触媒サブユニットであるＢＲＧ１は、ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ細胞におけるＳＬＣ７Ａ１１のＴＳＳに局在している（図４－２－Ｆ）。ＴＳＳでのＡＲＩＤ１ＡとＢＲＧ１の局在は、ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞では低下していた（図４－２－Ｅ～図４－２－Ｆ）。ＴＳＳでのＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰＩＩ）の局在も、ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞では著しく低下していた（図４－３－Ｇ）。ＴＳＳでのＳＬＣ７Ａ１１発現を調節する転写因子であるＮＲＦ２の局在（Ｇｏｒｒｉｎｉら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １２、９３１－９４７、２０１３を参照）も、ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞では著しく低下していたが（図４－３－Ｈ）、ＮＲＦ２自体の発現はＡＲＩＤ１Ａのノックアウトによる影響を受けなかった（図Ｓ５－２－Ｄ）。ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞におけるＮＲＦ２の異所性発現により、ＳＬＣ７Ａ１１ ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現が回復し（図Ｓ５－２－Ｄ～図Ｓ５－２－Ｅ）、ＡＰＲ－２４６によって誘導される増殖と生存の低下が回復し、ＡＰＲ－２４６によって誘導されるＧＳＨの減少とＲＯＳの増加が抑止された（図Ｓ５－２－Ｆ～図Ｓ５－３－Ｉ）。これらの結果は、ＡＲＩＤ１Ａが、ＢＡＦ複合体によるクロマチンリモデリングを通じてＳＬＣ７Ａ１１のＮＲＦ２介在による転写発現を促進するが、不可欠ではないことを強く示唆している。言い換えれば、ＡＲＩＤ１Ａの欠損により、ＳＬＣ７Ａ１１の発現は弱められる（図４－３－Ｉ）。

ＳＬＣ７Ａ１１は、シスチン／グルタミン酸トランスポータＸＣＴのサブユニットをコードする。シスチンはＸＣＴトランスポータを介して細胞に取り込まれ、次いで２分子のシステインに代謝されるが、これはＧＳＨ合成に不可欠である。ＡＲＩＤ１Ａ欠損によって引き起こされるＳＬＣ７Ａ１１のダウンレギュレーションの影響を調べるために、本発明者らは、４７５の代謝物を検出できるガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣＭＳ）を使用して、ＡＲＩＤ１Ａ発現細胞及びＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞の３つのペアでレベルが低下した代謝物をスクリーニングにかけた（システイン、グルタメート、及びグリシンは含むが、ＧＳＨは含まない）（図４－４－Ｊ）。システインは、ＡＲＩＤ１Ａ発現細胞よりもＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞で２分の１を下回る代謝産物として特定されたことから（図４－４－Ｊ～図４－４－Ｋ、図Ｓ５－３－Ｊ）、ＳＬＣ７Ａ１１のダウンレギュレーションが細胞へのシスチンの取り込み低下による細胞内システインレベルの低下を引き起こすことを示唆していた。ＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞におけるシステインレベルの低下と一致して、基礎ＧＳＨレベルは、ＡＲＩＤ１Ａ発現細胞よりもＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞の方が低かった（図４－４－Ｌ～図４－５－Ｍ、図Ｓ５－４－Ｋ～図Ｓ５－４－Ｌ）。ＧＳＨレベルの上昇を反映して、ＲＯＳレベルは、ＡＲＩＤ１Ａ発現細胞よりもＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞の方が高かった（図Ｓ５－５－Ｍ～図Ｓ５－５－Ｏ）。図４－１－Ｃに示すように、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞におけるＡＲＩＤ１Ａの安定した発現により、ＳＬＣ７Ａ１１の発現は増加しており、これはＧＳＨレベルの増加とＲＯＳレベルの減少に関連していた（図４－５ーＮ、図Ｓ５－６－Ｐ）。これらの結果は、ＡＲＩＤ１ＡがＳＬＣ７Ａ１１の発現を通じてＧＳＨとＲＯＳの基礎レベルのバランスに影響を与えることを示している。一貫して、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞におけるＳＬＣ７Ａ１１の強制発現により、基礎ＧＳＨレベルが増加し、これは基礎ＲＯＳレベルの減少と関連するものであった（図４－５－Ｏ～図４－５－Ｐ、図Ｓ５－６－Ｑ）。同様の結果が、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞におけるＧＣＬＣの安定した発現によって得られた（図Ｓ５－６－Ｒ～図Ｓ５－６－Ｓ）。ＳＬＣ７Ａ１１の過剰発現により、ＡＰＲ－２４６及びＢＳＯによって誘導されるＧＳＨレベルの低減とＲＯＳレベルの上昇が抑止され、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞の生存率が回復した（図４－５－Ｑ～図４－６－Ｓ、図Ｓ５－７－Ｔ～図Ｓ５－７－Ｖ）。

ＡＰＲ－２４６で処理されたＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞におけるＧＳＨの減少、ＲＯＳの増加、及び生存率の低下は、シスチンの細胞透過性バージョンであるシスチン補償剤シスチンジメチルエステル（ＣＣ－ＤＭＥ）での同時処理によって完全に抑制された（Ｓｔｅｉｎｈｅｒｚら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７９、４４４６－４４５０、１９８２を参照）（図４－６－Ｔ～図４－６－Ｖ）。これらのデータは、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞におけるＳＬＣ７Ａ１１発現の低下によるシステイン不足が、ＧＳＨ代謝経路の阻害に対する脆弱性の原因であることを示している。まとめると、これらの結果から、次のメカニズムが提案される（図４－３－Ｉ、図４－７－Ｗ）。ＡＲＩＤ１Ａは、ＳＬＣ７Ａ１１のＴＳＳへのＳＷＩ／ＳＮＦクロマチンリモデリング複合体の動員を促進し、結果として起こるリモデリングにより、ＮＲＦ２及びＲＮＡＰＩＩによるＳＬＣ７Ａ１１の転写が開始される。ＳＬＣ７Ａ１１によるシスチン取込みの強化により、ＧＣＬＣを介してＧＳＨ合成がアップレギュレートされ、ＧＳＨとＲＯＳの間におけるホメオスタシスのバランスが維持され、細胞はＧＳＨ阻害に対し耐性となる。しかしながら、ＡＲＩＤ１Ａが存在しない場合、ＳＬＣ７Ａ１１のＴＳＳへのＳＷＩ／ＳＮＦクロマチンリモデリング複合体の動員の低下により、この部位へのＮＲＦ２及びＲＮＡＰＩＩの動員が弱められ、その結果ＳＬＣ７Ａ１１の転写が低減される。結果として生じるシスチン取込みの減少により、ＧＳＨ合成は低下する。さらに、シスチンからシステインを生成するためのＧＳＨのフィードバック機能の障害は、システインの細胞内レベルをさらに低下させ、最終的には抗酸化システムの恒常性の乱れによるＧＳＨの不足につながることになる。基礎ＧＳＨレベルの低下により、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞はＧＳＨ代謝経路の阻害に対して脆弱になる。

実施例５：ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんに対するＧＳＨ標的療法の臨床的関連性
この仮説の臨床的関連性にさらに取り組むために、１１名の卵巣がん患者から外科的に得られた腫瘍標本の免疫組織化学的染色によってＡＲＩＤ１Ａ及びＳＬＣ７Ａ１１の発現を調べた（図Ｓ６－１－Ａ）。調べた４つのＡＲＩＤ１Ａ野生型標本はすべて、ＡＲＩＤ１ＡとＳＬＣ７Ａ１１の両方の高発現を示し（図５－１－Ａ）、ＡＲＩＤ１Ａ発現を欠く４つのＡＲＩＤ１Ａ変異標本はすべて低レベルのＳＬＣ７Ａ１１発現を示した（図５－２－Ｂ）。ＡＲＩＤ１Ａの発現を保持している残りの３つのＡＲＩＤ１Ａ変異標本はまた、ＳＬＣ７Ａ１１の発現も保持していた（図Ｓ６－１－Ａ、図Ｓ６－１－Ｂ）。まとめると、ＡＲＩＤ１Ａ遺伝子変異によるＡＲＩＤ１Ａ発現の減少／欠如は、臨床的に得られた腫瘍標本におけるＳＬＣ７Ａ１１発現の減少と相関していた。

患者由来のがん細胞（ＰＤＣ）は、がん治療の概念実証を取得するためのツールとして役立つことが多い。したがって、他の４名の卵巣がん患者からのＰＤＣ（３症例はＡＲＩＤ１Ａを欠いていたが、残りの症例はＡＲＩＤ１Ａの発現を保持していた）を培養した（図５－３－Ｃ）。がん細胞株を使用して得られた結果と一致して、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＰＤＣは、ＡＲＩＤ１Ａ陽性ＰＤＣよりもＡＰＲ－２４６及びＢＳＯに対して感受性が高かった（図５－３－Ｄ、図Ｓ６－２－Ｃ）。さらに、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＰＤＣにおけるＳＬＣ７Ａ１１ ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現は低く、これは上記の腫瘍標本での観察と一致している（図５－３－Ｅ～図５－４－Ｆ）。基礎ＧＳＨレベルはＡＲＩＤ１Ａ欠損ＰＤＣの方がＡＲＩＤ１Ａ発現ＰＤＣよりも低かったが（図５－４－Ｇ）、基礎ＲＯＳレベルは高かった（図Ｓ６－２－Ｄ）。ＡＰＲ－２４６処理により、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＰＤＣにおけるＧＳＨレベルは低下し、ＲＯＳとアポトーシスのレベルは上昇した（図５－４－Ｈ～図５－５－Ｊ、図Ｓ６－２－Ｅ）。

次に、ＡＰＲ－２４６を、インビボでＯＣＣＣ腫瘍異種移植片の増殖を抑制する能力について試験した。腫瘍形成後、マウスをＡＰＲ－２４６又は賦形剤で処置した。ＡＰＲ－２４６処置により、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＴＯＶ２１Ｇ ＯＣＣＣ異種移植片の増殖は大幅に抑制されたが、ＡＲＩＤ１Ａ発現ＲＭＧ－Ｉ ＯＣＣＣ異種移植片の増殖は抑制されなかった（図６－１－Ａ～図６－１－Ｂ）。一貫して、腫瘍重量は、ＴＯＶ２１Ｇ異種移植片でのみＡＰＲ－２４６によって減少した（図６－１－Ｃ～図６－１－Ｄ）。ＡＰＲ－２４６によるマウスの処置により、体重の著しい減少は起こらなかったことから、ＡＰＲ－２４６の副作用は最小限であることが示され（図Ｓ６－３－Ｆ）、第Ｉ相臨床試験の結果と一致していた（Ｌｅｈｍａｎｎら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３０、３６３３－３６３９、２０１２）。特に、ＴＯＶ２１Ｇ異種移植細胞のＧＳＨレベルは、ＡＰＲ－２４６での処理後に減少した（図６－１－Ｅ）。さらに、ＡＰＲ－２４６により酸化ストレスマーカーである８－ヒドロキシ－２’－デオキシグアノシン（８－ＯＨｄＧ）のレベルが著しく増加したことから、ＡＰＲ－２４６はインビボでＴＯＶ２１Ｇ異種移植片のＲＯＳレベルを増加させることが示された（図６－２－Ｆ～図６－２－Ｇ）。さらに、ＡＰＲ－２４６処置により、アポトーシスマーカーのＮＯＸＡ、切断型ＰＡＲＰ、及び切断型カスパーゼ－３の発現が著しく増加し、細胞増殖マーカーＫｉ６７の発現が減少したことから、アポトーシスがインビボでのＡＰＲ－２４６処置によっても誘導されることが示された（図６－２－Ｆ、図６－２－Ｈ～図６－２－Ｇ）。一貫して、ＡＰＲ－２４６類似体ＰＲＩＭＡ－１処置により、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＯＶＩＳＥ ＯＣＣＣ細胞における異種移植片の増殖も大幅に抑制されたが、これも大幅な体重減少を引き起こすことはなかった（図Ｓ６－３－Ｇ～図Ｓ６－３－Ｈ）。さらに、ＧＣＬＣ阻害剤ＢＳＯによる処置により、異種移植片の増殖は著しく抑制され、体重を減らすことなく腫瘍重量が減少した（図Ｓ６－３－Ｉ～図Ｓ６－３－Ｋ）。様々なメカニズムを介してＧＳＨ機能を阻害する薬剤を使用して得られた現在の結果は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＯＣＣＣでＧＣＬＣを標的とすることの有用性を立証している。

ＧＣＬＣを治療標的としてさらに検証するために、ＧＣＬＣ枯渇の影響をＡＲＩＤ１Ａ欠損ＯＣＣＣ腫瘍異種移植モデルで評価した。非標的指向性（ｓｈＮＴ）又はＧＣＬＣ標的指向性（ｓｈＧＣＬＣ）のｓｈＲＮＡを担持するＴＯＶ２１ＧＯＣＣＣ細胞をマウスに注入した。ＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＧＣＬＣ細胞におけるＧＣＬＣ発現は、Ｄｏｘによって条件付きで減少した（図３－４－Ｆ）。腫瘍形成後にＧＣＬＣ枯渇を誘発するためにマウスにＤｏｘを与えた場合、ＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＧＣＬＣ異種移植片の増殖は大幅に抑制され、その結果腫瘍重量が減少したが、ＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＮＴ異種移植片の増殖は影響を受けなかった（図６－３－Ｌ～図６－４－Ｏ）。ＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＮＴ異種移植片においてではなく、ＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＧＣＬＣ異種移植片において、ＧＣＬＣのノックダウンが、Ｄｏｘで処置されたマウスからの腫瘍で確認された（図Ｓ６－４－Ｌ～図Ｓ６－４－Ｍ）。ＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＧＣＬＣ異種移植細胞のＧＳＨレベルは、Ｄｏｘによる処置後にインビボで減少した（図６－４－Ｐ）。同様の結果は、細胞の接種直後（腫瘍形成前）にマウスにＤｏｘを与えた場合にも得られた（図Ｓ６－４－Ｎ～図Ｓ６－５－Ｒ）。ＴＯＶ２１Ｇ異種移植片のＡＰＲ－２４６処置の場合と同様に、ＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＧＣＬＣ異種移植片におけるＧＣＬＣのＤｏｘを介したノックダウンにより、酸化ストレスマーカー８－ＯＨｄＧのレベルは大幅に増加し、アポトーシスマーカーＮＯＸＡ、切断型カスパーゼ－３、及び切断型ＰＡＲＰのレベルは増加し、細胞増殖マーカー（ｍａｋｅｒ）であるＫｉ６７のレベルは低下した。これらの結果は、ＲＯＳレベルとアポトーシスがインビボでのＧＣＬＣの阻害によって高められたことを示している（図Ｓ６－６－Ｓ）。まとめると、本発明者らは、ＧＣＬＣがＡＲＩＤ１Ａ欠損ＯＣＣＣにおける治療標的であると結論付けている。

実施例６：びまん性胃がん患者の腹水から確立されたＡＲＩＤ１Ａ欠損患者由来細胞及びＡＲＩＤ１Ａ発現患者由来細胞の選択
びまん性胃がんの６５名の患者の腹水から得られた１００を超える患者由来細胞（ＰＤＣ）から、本発明者らは、浮遊細胞よりも薬剤感受性試験で付着細胞増殖と低い分散を示している１３の細胞型（ＮＳＣ－４Ｘ１ａ、－７Ｃ、－１４Ｃ、－２０Ｃ、－２２Ｃ、－３４Ｃ、－４８ＣＡ、－５８Ｃ、－６４Ｃ、－６５Ｃ、－６７Ｃ、－６８Ｃ、及び－７０Ｃ）を選択した。ＡＲＩＤ１Ａタンパク質の発現をイムノブロット分析によって調査した。全エクソームデータに基づいてさらに分析するために、８つのＰＤＣを選択した。これらの８つのＰＤＣのうち、４つ（ＮＳＣ－７Ｃ、－５８Ｃ、－６５Ｃ、及び－６７Ｃ）はＡＲＩＤ１Ａタンパク質の発現を欠いており（ＡＲＩＤ１Ａ欠損：ＡＲＩＤ１Ａ－）、４つ（ＮＳＣ－４８Ｃ、－６４Ｃ、－６８Ｃ、及び－７０Ｃ）はＡＲＩＤ１Ａタンパク質発現を保持していた（ＡＲＩＤ１Ａ発現：ＡＲＩＤ１Ａ＋）（図７Ａ）。ＳＬＣ７Ａ１１の発現はＡＲＩＤ１Ａ欠損ＰＤＣでの方がＡＲＩＤ１Ａ発現ＰＤＣの場合よりも低く（図７Ａ）、卵巣がんで観察されたパターンと一致していた（Ｈ．Ｏｇｉｗａｒａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３５（２０１９）１７７－１９０ ｅ１７８を参照、文書の内容は米国仮出願第６２／７８５，４５８号と同じである）。ＡＲＩＤ１Ａタンパク質レベルと一致して、４つのＡＲＩＤ１Ａ欠損ＰＤＣのうちの３つ（ＮＳＣ－７Ｃ、－５８Ｃ、及び－６７Ｃ）は、ＡＲＩＤ１Ａ遺伝子に均一なフレームシフト変異を有し、残りのＰＤＣ（ＮＳＣ－６５Ｃ）は均一な終止コドン変異（Ｒ１４６１Ｘ）を有していた。４つのＡＲＩＤ１Ａ発現ＰＤＣには変異がなかった。確立されたＰＤＣに由来する異種移植腫瘍は、びまん性胃がんの組織学的特性を保持していた（図７Ｂ）。確立されたＰＤＣに由来する異種移植腫瘍は、びまん性胃がんの組織学的特性を保持していた。代表的な組織学的データを図７Ｂに示す。

実施例７：ＡＲＩＤ１Ａ欠損胃がん細胞はＧＳＨ阻害剤に対する感受性がある
次に、本発明者らは、ＡＲＩＤ１Ａ欠損胃がん細胞のＧＳＨ阻害剤に対する感受性を調べた。ＧＳＨ阻害剤ＡＰＲ－２４６のＩＣ５０値は、ＡＲＩＤ１Ａ発現ＰＤＣよりもＡＲＩＤ１Ａ欠損ＰＤＣの方が著しく低かった（図８Ａ、図８Ｂ）。ＧＳＨ合成酵素ＧＣＬＣの阻害剤であるＢＳＯによる処理により、ＡＲＩＤ１Ａ発現ＰＤＣよりも効率的にＡＲＩＤ１Ａ欠損ＰＤＣが感作された（図８Ｃ）。これらの結果は、ＡＰＲ－２４６又はＢＳＯに対する感受性が胃がんのＡＲＩＤ１Ａ欠損と関連していることを示しており、これは卵巣がんで得られた結果と一致している（Ｈ．Ｏｇｉｗａｒａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３５（２０１９）１７７－１９０ ｅ１７８を参照）。まとめると、これらのデータは、ＧＳＨ阻害がＡＲＩＤ１Ａ欠損を伴うびまん性胃がんの治療のための有望な戦略であり得ることを示している。

実施例８：ＡＲＩＤ１Ａ欠損胃がん細胞は、ＧＳＨの基礎レベルが低いため、ＧＳＨ阻害に対して脆弱である
次に、本発明者らは、ＡＲＩＤ１Ａ欠損胃がんにおけるＳＬＣ７Ａ１１タンパク質の低発現がＳＬＣ７Ａ１１転写の低下と関連しているかどうかを調査した。ＳＬＣ７Ａ１１ ｍＲＮＡレベルは、ＡＲＩＤ１Ａ発現ＰＤＣよりもＡＲＩＤ１Ａ欠損ＰＤＣの方が低かった（図９Ａ、図Ｓ７Ａ）。ＳＬＣ７Ａ１１は細胞内システインを供給することによりＧＳＨ合成に必要とされるため、本発明者らは、ＳＬＣ７Ａ１１のダウンレギュレーションがＧＳＨ合成の低下につながるかどうかを調べた。ＧＳＨの基礎レベルは、ＡＲＩＤ１Ａ発現ＰＤＣよりもＡＲＩＤ１Ａ欠損ＰＤＣの方がかなり低かった（図９Ｂ、図Ｓ７Ｂ）。これらの結果は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損によりＳＬＣ７Ａ１１の発現がダウンレギュレートされ、びまん性胃がん細胞におけるＧＳＨの基礎レベルが低下することを示しており、卵巣がんでの所見と一致している（Ｈ．Ｏｇｉｗａｒａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３５（２０１９）１７７－１９０ ｅ１７８）。

ＡＰＲ－２４６は、チオール基と反応することによりＧＳＨ活性を阻害する（Ｂ．Ｔｅｓｓｏｕｌｉｎら、Ｂｌｏｏｄ １２４（２０１４）１６２６－１６３６参照）。したがって、次に本発明者らは、ＡＰＲ－２４６がＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞のＧＳＨを優先的に阻害するかどうかを調べた。ＡＰＲ－２４６処理により、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＰＤＣではＧＳＨレベルが著しく低下し、ＡＲＩＤ１Ａ発現ＰＤＣでは低下しなかった（図９Ｃ、図Ｓ７Ｃ）。ＧＳＨの抗酸化活性と一致して、ＲＯＳレベルは、ＡＲＩＤ１Ａ発現ＰＤＣよりもＡＲＩＤ１Ａ欠損ＰＤＣの方で著しく増加した（図９Ｄ、図Ｓ７Ｄ）。これらの結果は、ＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞においてＧＳＨ阻害剤により誘発される酸化ストレスの過度の増加によって細胞生存率が低下したことを示している。

実施例９：ＡＲＩＤ１Ａ欠損胃がん細胞のＧＳＨ阻害に対する脆弱性は、ＳＬＣ７Ａ１１発現の低減によるＧＳＨ合成の低下によって引き起こされる
次に、本発明者らは、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞の脆弱性がシステイン不足とその結果としてのＧＳＨ不足に関連しているかどうかを調べた。ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞においてＡＰＲ－２４６により誘導されるＧＳＨの減少、ＲＯＳの増加、及び細胞死は、それぞれシスチン及びＧＳＨの細胞透過性バージョンである、シスチン補償剤シスチンジメチルエステル（ＣＣ－ＤＭＥ）又はＧＳＨ補償剤グルタチオンモノエチルエステル（ＧＳＨ－ＭＥＥ）での同時処理により著しく抑制されたことから、これらの細胞透過性代謝物が、ＳＬＣ７Ａ１１発現の減少によるシスチン取込みの低下を補うことができることを示唆していた（図１０Ａ～図１０Ｃ）。ＧＳＨは、システイン、グルタメート、及びグリシンから合成される。ＳＬＣ７Ａ１１は、システインを細胞内に輸送することにより、ＧＳＨ合成に寄与する。したがって、次に本発明者らは、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＰＤＣにおいて、ＳＬＣ７Ａ１１阻害剤であるエラスチンに対する感受性を調べた（Ｂ．Ｄａｈｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７９（２０１９）３８７７－３８９０参照）。エラスチンのＩＣ５０値は、ＡＲＩＤ１Ａ発現ＰＤＣよりもＡＲＩＤ１Ａ欠損ＰＤＣの方が著しく低かった（図Ｓ８Ａ）。エラスチン処理により、ＡＲＩＤ１Ａ欠損ＰＤＣではＧＳＨレベルが著しく低下したが、ＡＲＩＤ１Ａ発現ＰＤＣでは低下しなかった（図Ｓ８Ｂ）。これらのデータは、ＡＲＩＤ１Ａ欠損がん細胞におけるＳＬＣ７Ａ１１発現の低下に続発するシステイン不足とその結果としてのＧＳＨ不足が、ＧＳＨ阻害に対する感受性の原因であることを示している。

実施例１０：ＡＲＩＤ１Ａ欠損子宮がん細胞はＧＳＨ阻害剤に対する感受性がある
本発明者らは、ＡＲＩＤ１Ａ欠損子宮がん細胞のＧＳＨ阻害剤に対する感受性を調べた。ＧＳＨ阻害剤ＡＰＲ－２４６のＩＣ５０値は、２つのＡＲＩＤ１Ａ発現細胞株よりも３つのＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞株の方で著しく低かった（図１１）。ＧＳＨ合成酵素ＧＣＬＣの阻害剤であるＢＳＯによる処理により、ＡＲＩＤ１Ａ発現細胞株よりも効率的にＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞株が感作された（図１２）。これらの結果は、ＡＰＲ－２４６又はＢＳＯに対する感受性が子宮（ｕｒｅｒｉｎｅ）がんでのＡＲＩＤ１Ａ欠損と関連していることを示しており、これは卵巣がんで得られた結果と一致している（Ｈ．Ｏｇｉｗａｒａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３５（２０１９）１７７－１９０ ｅ１７８参照）。まとめると、これらのデータは、ＧＳＨ阻害がＡＲＩＤ１Ａ欠損を伴う子宮がんの治療のための有望な戦略であり得ることを示している。

実施例１１：ＡＲＩＤ１Ａ欠損胆管がん細胞はＧＳＨ阻害剤に対する感受性がある
本発明者らは、ＡＲＩＤ１Ａ欠損胆管がん細胞のＧＳＨ阻害剤に対する感受性を調べた。ＧＳＨ阻害剤ＡＰＲ－２４６のＩＣ５０値は、２つのＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞株の方が、２つのＡＲＩＤ１Ａ発現細胞株よりも著しく低かった（図１３）。ＧＳＨ合成酵素ＧＣＬＣの阻害剤であるＢＳＯでの処理により、ＡＲＩＤ１Ａ発現細胞株よりも効率的にＡＲＩＤ１Ａ欠損細胞株が感作された（図１４）。これらの結果は、ＡＰＲ－２４６又はＢＳＯに対する感受性が胆管がんにおけるＡＲＩＤ１Ａ欠損と関連していることを示しており、これは卵巣がんで得られた結果と一致している（Ｈ．Ｏｇｉｗａｒａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３５（２０１９）１７７－１９０ ｅ１７８参照）。まとめると、これらのデータは、ＧＳＨ阻害がＡＲＩＤ１Ａ欠損を伴う胆管がんの治療のための有望な戦略であり得ることを示している。

実施例１２：様々なＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がん細胞株はＧＳＨ阻害剤に対する感受性がある
本発明者らは、様々なＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（ＳＭＡＲＣＡ２（ＢＲＭ）、ＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１、ＢＡＦ１９０）、ＳＭＡＲＣＢ１（ＢＡＦ４７、ｈＳＮＦ５、ＩＮＩ１）、ＰＢＲＭ１）欠損がん細胞のＧＳＨ阻害剤に対する感受性を調べた。ＧＳＨ阻害剤ＡＰＲ－２４６のＩＣ５０値は、これらのＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損細胞株の方が、野生型細胞株の場合よりも著しく低かった（図１５、図１６、図１７）。ＧＳＨ合成酵素ＧＣＬＣの阻害剤であるＢＳＯによる処理により、これらのＳＷＩ／ＳＮＦ複合体発現細胞株よりも、これらのＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損細胞株の方がより効率的に感作された（図１５、図１６、図１８）。これらの結果は、ＡＰＲ－２４６又はＢＳＯに対する感受性が、様々ながんにおけるこれらのＳＷＩ／ＳＮＦ複合体（すなわち、ＳＭＡＲＣＡ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＰＢＲＭ１）の欠損に関連していることを示している。まとめると、これらのデータは、ＧＳＨ阻害が、これらのＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損を伴う様々ながんの治療のための有望な戦略であり得ることを示している。

実施例１３：ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がん細胞のＧＳＨ阻害に対する脆弱性は、ＳＬＣ７Ａ１１発現の低下によるＧＳＨ合成の低減によって引き起こされる
ＡＲＩＤ１Ａ（すなわち、ＳＭＡＲＣＡ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＰＢＲＭ１）を除くＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損のがん細胞は、これらのＳＷＩ／ＳＮＦ複合体発現細胞と比較して、ＧＳＨ阻害に対し同様に感受性があった。これを調査すると、ＳＬＣ７Ａ１１ ｍＲＮＡの発現は、これらのＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がん細胞での方が、様々なＳＷＩ／ＳＮＦ複合体発現がん細胞の場合よりも低かった（図１９）。

実施例４と同様に、基礎ＧＳＨレベルは、これらのＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損細胞の方が、これらのＳＷＩ／ＳＮＦ複合体発現細胞の場合よりも低かった（図２０）。ＡＰＲ－２４６処理により、これらのＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がん細胞ではＧＳＨレベルが低下し、ＲＯＳレベルが上昇した（図２１、図２２）。基礎ＧＳＨレベルの低下により、これらのＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がん細胞はＧＳＨ代謝経路の阻害に対して脆弱になる。

実施例１～１３に関する実験方法
実験モデルと対象
（１）卵巣がんＰＤＣの確立（実施例５）
腫瘍試料と腹水を、国立がんセンター病院又は要町病院（東京、日本）で手術又は無細胞及び濃縮腹水再注入療法を受けた４名の卵巣がん患者から入手し、インビトロで培養した。このプロトコルは、国立がんセンター（東京、日本）の施設内審査委員会によって承認され、インフォームドコンセントが患者から得られた。ＣＣＣ０２１９及びＣＣＣ１２１６のＰＤＣを確立するために、患者の腹水（２４ｍｌ）を、２ｍＭのＥＤＴＡを含む２倍量のＰＢＳで希釈し、１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて積層し、２２００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。相間単核層を新しいコニカルチューブに移し、２ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳで２回洗浄した。上皮細胞に対し、モノクローナルヒト上皮抗原－１２５抗体（ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＥｐＣＡＭ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にコンジュゲートさせたマイクロビーズで磁気標識を行った。上皮抗原１２５陽性細胞を磁気選択により収集し、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ／Ｆ－１２で培養した。ＮＯＶＣ－１Ｃ ＰＤＣ及びＮＯＶＣ－４Ｃ ＰＤＣを確立するために、全無菌細胞を１５００ｒｐｍにて５分間、室温で遠心分離してペレット化し、次いで溶血緩衝液（０．７５％ＮＨ４Ｃｌ及び１７ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ７．６５）で１０分間インキュベートした。遠心分離後、ペレットをＰＢＳで洗浄し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０中で１週間培養した。その後、培養培地を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭと置き換えてリンパ球を除去し、細胞をさらに１週間培養した。付着細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０で数週間培養し、複数のコロニーが現れるまで週に１回培地を交換した。必要に応じて、培養細胞を０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡで短時間繰り返し処理して、線維芽細胞又は中皮細胞などの他の細胞型を除去した。コロニーが密集したときに培養物を継代した。ＡＲＩＤ１Ａの発現状態をイムノブロット分析により確認した。

（２）マウス異種移植モデル（実施例５）
すべてのマウス実験は、国立がんセンター（ＮＣＣ）の動物倫理委員会によって承認された。細胞をカウントし、氷上で１００μｌの培養培地と１００μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の１：１混合液に再懸濁した。その後、細胞（ＲＭＧ－Ｉ：２×１０^６細胞／マウス、ＴＯＶ２１Ｇ：ＡＲＰ－２４６処置用２×１０^５細胞／マウス及びＢＳＯ処置用１×１０^６細胞／マウス、ＯＶＩＳＥ：２×１０^６細胞／マウス、ＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＮＴ：２×１０^５細胞／マウス、及びＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＧＣＬＣ：２×１０^５細胞／マウス）を、６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウス（ＣＬＥＡ及びＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）の脇腹に皮下注射した。皮下モデルでは、腫瘍が触知可能になると（移植後約３～１４日）、マウスを無作為に２つの群に分けた。薬物処置群では、マウスにＰＢＳ又は化合物［ＡＰＲ－２４６（５０ｍｇ／ｋｇ）、ＰＲＩＭＡ－１（２５ｍｇ／ｋｇ）、又はＢＳＯ（７５０ｍｇ／ｋｇ）］のいずれかを１日１回１２～１４日間腹腔内注射した。ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）処置試験では、ＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＮＴ細胞及びＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＧＣＬＣ細胞を、６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスの脇腹に注射した。腫瘍が触知可能になると（移植後１３日）、マウスを無作為に２つの群に分け、Ｄｏｘ（６２５ｐｐｍ）を含む食餌又は対照食餌を与えた。他の実験では、ＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＮＴ細胞及びＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＧＣＬＣ細胞をＤｏｘ（０．５μｇ／ｍｌ）で４日間処理した後、６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスの脇腹に注射した。次に、マウスにＤｏｘ（６２５ｐｐｍ）を含む食餌又は対照食餌を与えた。腫瘍の成長を、キャリパーを使用して数日ごとに測定した。移植された腫瘍の体積を、式Ｖ＝Ｌ×Ｗ２／２［式中、Ｖは体積（ｍｍ^３）であり、Ｌは最大直径（ｍｍ）であり、Ｗは最小直径（ｍｍ）である］を使用して計算した。実験の終わりに、標準的なプロトコルに従ってマウスを屠殺した。

（３）細胞株（実施例１～実施例１３）
細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２μｍｏｌ／ｌのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｗａｋｏ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｗａｋｏ）中、３７℃で５％ＣＯ_２を含む加湿インキュベータ内で維持した。ＴＯＶ２１Ｇ細胞、ＨＥＣ１Ａ細胞、Ｈ２２２８細胞、Ｈ２１２２細胞、Ｈ１８１９細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ５２２細胞、及びＨ１７０３細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手された。ＲＭＧ－Ｉ細胞、ＯＶＩＳＥ細胞、ＨＥＣ－２６５細胞、ＨＥＣ－１５１細胞、ＫＫＵ－１００細胞、ＫＫＵ－０５５細胞、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞、ＪＨＵＥＭ－２細胞、ＨｕＣＣＡ－１細胞、ＫＰ－４細胞、ＪＭＵ－ＲＴＫ－２細胞、Ｇ４０１細胞、Ｇ４０２細胞及びＫＭＲＣ－１細胞は、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（医薬基盤研、ＪＣＲＢ）細胞バンクから入手された。ＪＨＵＥＭ－２細胞、ＳＳＰ２５細胞、ＰＣ９細胞、及びＨＳ－ＥＳ－１細胞は、理研細胞バンク（ＲＣＢ）から入手された。２００８細胞及びＡ２７８０細胞は、Ｓ．Ｂ．Ｈｏｗｅｌｌ博士及びＥ．Ｒｅｅｄ博士によって提供された。ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ（Ｑ４５６Ｘ／Ｑ４５６Ｘ）及び親ＨＣＴ１１６細胞は、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙから購入された。ＨＣＣ－４４細胞は、Ｇａｚｄａｒ、Ａ．Ｆから寄贈された。ＲＣＣ－ＭＦ細胞は、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｓｅｒｖｉｃｅから入手された。細胞株は、配列決定により複数のがん関連遺伝子の変化を検証することによって認証された。細胞を、受領後３ヶ月未満の継代後、機能性実験に使用した。すべての細胞株は、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（Ｌｏｎｚａ）により試験したところマイコプラズマについて陰性であった。

（４）ｓｈＲＮＡ及びｃＤＮＡを発現するレンチウイルス及びウイルス感染細胞の生成（実施例３）
ｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスベクターｐＧＩＰＺ（ｓｈＮＴ、ＯＨＳ４３４６；ｓｈｐ５３、ＲＨＳ４４３０－２００２８９９４６）（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びｐＴＲＩＰＺ（ｓｈＮＴ、ＯＨＳ５８３２；ｓｈＧＣＬＣ＃３、ＲＨＳ４９４６＿２００７７７１８２）、ｃＤＮＡ発現レンチウイルスベクター（ｐＬＯＣ－ＧＣＬＣ、ＯＨＳ５８９７＿２０２６１６６１６；ｐＬＯＣ－ＳＬＣ７Ａ１１、ＯＨＳ５８９８＿２１９５８２５５８；ｐＬＯＣ－ＮＲＦ２、ＯＨＳ５９００－２０２６２４５５８）（すべてＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）、（ｐＬｅｎｔｉ－ｐｕｒｏ－ＡＲＩＤ１Ａ、＃３９４７８）（Ａｄｄｇｅｎｅ）、及びパッケージングプラスミド（ｐｓＰＡＸ２：＃１２２６０及びｐＭＤ２．Ｇ：＃１２２５９）（Ａｄｄｇｅｎｅ）を、ｓｈＲＮＡ又はｃＤＮＡの構成的発現に使用した。ウイルスを生成するために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、２９３ＬＴＶ細胞に対しレンチウイルスプラスミドとパッケージングプラスミドでトランスフェクションを行った。翌日、培地を新鮮な増殖培地と置き換え、レンチウイルスを含む上清を回収し、遠心分離によって濃縮した。ウイルス構築物に感染した細胞を確立するために、細胞に対しレンチウイルスベクターで形質導入を行い、次いで２μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）又は２０μｇ／ｍｌのブラストサイジン（Ｗａｋｏ）を含む増殖培地で７～１４日間インキュベートした。

（５）びまん性胃がん細胞株の確立（実施例６）
腫瘍試料と腹水を、国立がんセンター病院又は要町病院（東京、日本）で手術又は無細胞及び濃縮腹水再注入療法を受けたびまん性胃がん患者から入手し、インビトロで培養した。研究プロトコルは、国立がんセンター（東京、日本）の施設内審査委員会によって承認され、書面によるインフォームドコンセントが患者から得られた。無菌細胞全体を、１５００ｒｐｍで５分間、室温で遠心分離してペレット化し、溶血緩衝液（０．７５％ＮＨ_４Ｃｌ及び１７ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．６５）中で１０分間インキュベートした。遠心分離後、ペレットをＰＢＳで洗浄し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０で１週間培養した後、培養培地を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭと置き換えてリンパ球を除去した。細胞をさらに１週間培養した。付着細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中で数週間培養し、複数のコロニーが出現するまで毎週培地を交換した。必要時、培養細胞を０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡで短時間繰り返し処理して、線維芽細胞又は中皮細胞などの他の細胞型を除去した。コロニーが密集したときに培養物を継代した。

方法
（１）薬物ライブラリスクリーニング（実施例１）
ＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ ＨＣＴ１１６がん細胞及びＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ ＨＣＴ１１６がん細胞をスクリーニングアッセイに使用した。細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間インキュベートした後、０．１、１、又は１０μＭの濃度の薬物で処理した［ＳＣＡＤＳ阻害剤キット、３３４の化合物を含む（表Ｓ１）］。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、５日後に細胞生存率を評価した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉ－ｌａｂｅｌプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して発光を測定した。発光の読み取り値を使用して、溶媒（ＤＭＳＯ）で処理した細胞の生存率との比較で細胞の生存率を決定した。ＡＲＩＤ１Ａ－ＫＯ細胞の生存率が４０％未満である場合にＡＲＩＤ１Ａ－ＷＴ細胞の生存率が８０％を超えていると、候補化合物として検討された。

（２）細胞生存率アッセイ（実施例１～実施例５、実施例１０～実施例１２）
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞のＡＴＰレベルを測定することにより、細胞の生存率を調べた。ｓｉＲＮＡを介したノックダウン後の細胞生存率を測定するために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを使用して細胞株に対しｓｉＲＮＡ（２５ｎＭ）によるトランスフェクションを行った。４８時間後、細胞をトリプシン処理し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを使用してｓｉＲＮＡ（２５ｎＭ）によるトランスフェクションを繰り返した。さらに４８時間後に細胞をトリプシン処理し、カウントし、９６ウェルプレートに指定された密度で再播種した。薬物処理後の細胞生存率を測定するために、細胞をトリプシン処理し、カウントし、９６ウェルプレートに特定された密度で再播種し、指定された濃度の薬物に曝露した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙを使用して細胞生存率を測定した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉ－ｌａｂｅｌプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して発光を測定した。

（３）コロニー形成アッセイ（実施例１、実施例３）
がん細胞の生存に対する薬物処置の効果を、コロニー形成アッセイで評価した。細胞をトリプシン処理し、カウントし、１２ウェルプレートに特定された密度で再播種し、指定された濃度の薬物に１０～１４日間曝露し、０．０１％（重量／体積）クリスタルバイオレットを含む５０％（体積／体積）メタノール中で１０分間固定した。ＬＡＳ－３０００ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）で画像を撮影し、Ｍｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅソフトウェアを使用してコロニーをカウントした。

（４）アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色アッセイ（実施例１、実施例３）
アネキシンＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩアポトーシス検出キット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、アポトーシス細胞を検出した。簡単に述べると、細胞ペレットを１×結合緩衝液に懸濁し、次いでアネキシンＶ－ＦＩＴＣ及びＰＩと共に暗所で１０分間インキュベートした。Ｇｕａｖａフローサイトメータ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で蛍光を分析した。ＧｕａｖａＳｏｆｔソフトウェア（ｖ．２．７）を使用してデータを分析した。処理された試料中のアネキシンＶ陽性割合の相対比を、未処理試料に対して正規化した。

（５）細胞株におけるＧＳＨ、ＲＯＳ及び切断型カスパーゼ－３／７の検出（実施例１～実施例５、実施例１３）
ＧＳＨ、ＲＯＳ、及びアポトーシスは、それぞれＧＳＨ／ＧＳＳＧ－Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び／又はＧＳＨ－Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＲＯＳ－Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、並びにＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ３／７アッセイを使用して検出された。薬物処理後のＧＳＨ、ＲＯＳ、及びアポトーシスのレベルを測定するために、細胞をトリプシン処理し、カウントし、９６ウェルプレートに特定された密度で再播種し、指定された濃度の薬物に曝露した。１６～４８時間後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉ－ｌａｂｅｌプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して発光を測定した。ｓｉＲＮＡを介したノックダウン後のＧＳＨ及びＲＯＳのレベルを測定するために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを使用して細胞株に対しｓｉＲＮＡ（２５ｎＭ）によるトランスフェクションを行った。４８時間後、細胞をトリプシン処理し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを使用してｓｉＲＮＡ（２５ｎＭ）によるトランスフェクションを繰り返した。さらに４８時間後に細胞をトリプシン処理し、カウントし、９６ウェルプレートに指定された密度で再播種した。７２～１２０時間後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉ－ｌａｂｅｌプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して発光を測定した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細胞生存率も測定した。カスパーゼ－３／７、ＧＳＨ、及びＲＯＳのレベルを、細胞生存率に対して正規化した。ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比は、ＧＳＨ－ＧＳＳＧシグナルをＧＳＳＧ／２シグナルで割ったものとして計算された。処理された試料における相対シグナル比を、未処理試料に対して正規化した。

（６）腫瘍試料中のＧＳＨの検出（実施例５、実施例１３）
ＧＳＨ－Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＧＳＨを検出した。異種移植片に由来する腫瘍試料を秤量し、ＰＢＳで洗浄した。腫瘍試料を５０μｌのＰＢＳと混合し、ミニコードレスグラインダー（フナコシ）を使用してホモジナイズした。ＰＢＳ（９５０μｌ）をホモジナイズした腫瘍試料に加え、４℃で１０分間１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。腫瘍抽出物と２ＸＧＳＨ－Ｇｌｏ試薬（各２５μｌ）を白い９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）で混合し、室温で３０分間インキュベートした。ルシフェリン検出試薬（５０μｌ）を添加し、試料を室温で１５分間インキュベートした。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉ－ｌａｂｅｌプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して発光を測定した。腫瘍試料１ｍｇあたりのＧＳＨシグナル強度を計算した。相対的ＧＳＨ比を、未処理試料（ＡＰＲ－２４６又はＤｏｘを伴わない）に対して正規化した。

（７）ＴｒｘＲ活性の検出（実施例２）
ＴｒｘＲ１、ＴｒｘＲ２、及びＴｒｘＲ３を含むＴｒｘＲ活性を、チオレドキシンレダクターゼアッセイキット（Ａｂｃａｍ）を使用して測定した。細胞をトリプシン処理し、カウントし、１０ｃｍ皿に特定された密度で再播種し、指定された濃度のＡＰＲ－２４６に曝露した。２４時間後、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、プロテイナーゼ阻害剤を含む緩衝液で溶解した。遠心分離後、上清にＴｒｘＲ阻害剤を添加し、２５℃で２０分間インキュベートした。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉ－ｌａｂｅｌプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して吸光度を測定した。相対的ＴｒｘＲ比を、未処理試料に対して正規化した。

（８）抗体アレイによる細胞ストレスプロファイリング（実施例２）
抗体アレイ分析については、Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ Ａｒｒａｙ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。全細胞抽出のために、１×１０^７の細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄し、プロテイナーゼ阻害剤カクテルとホスファターゼ阻害剤カクテル（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）を補った溶解緩衝液６で溶解し、氷上で３０分間インキュベートし、４℃で１０分間、１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。全細胞溶解物（１ｍｌ）を０．５ｍｌのアレイ緩衝液４及び２０μｌの再構成された検出抗体カクテルと室温で１時間混合した。これらの試料を、アレイ緩衝液４でブロックされた膜に添加した。４℃で一晩インキュベートした後、膜を１×洗浄緩衝液で２回洗浄し、蒸留水ですすいだ後、乾燥させた。希釈したストレプトアビジン－ＨＲＰ（２ｍｌ）を添加し、膜を室温で３０分間インキュベートした後、１×洗浄緩衝液で洗浄した。Ｃｈｅｍｉ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｍｉｘを膜に均一に塗布し、１分間インキュベートした。化学発光シグナルを、ＬＡＳ－３０００ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を使用して測定した。Ｍｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅソフトウェアを使用してシグナル強度を測定した。４０μＭのＡＰＲ－２４６で２４時間処理した細胞のシグナル強度の比率を、未処理細胞の対応する強度と比較して計算した。

（９）マイクロアレイによるトランスクリプトームプロファイリング（実施例１、実施例４）
Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキットを使用して全ＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡの完全性を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度法（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって確認した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ Ｑｕｉｃｋ Ａｍｐ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、全ＲＮＡを逆転写した。Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、デュプリケイトのＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイ（ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ８×６０Ｋ Ｖｅｒ．１．０、Ｇ４８５１：４２４０５プローブ）上で、ｃＤＮＡを６５℃で１６時間ハイブリダイズさせた。Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｗａｓｈ Ｐａｃｋ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してアレイを洗浄した後、Ａｇｉｌｅｎｔスキャナーを使用してデータを抽出した。最初にＦｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、アレイを分析した。定量的シグナル及び定性的検出コールを、各試料と転写物に対して生じさせた。

その後、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ１２．６（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、データファイルを解析し、正規化し、及び比較した。ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎアレイ上の４２，５４５のプローブセットの未加工発現データを処理し、ｌｏｇ２変換した。各試料の発現データを、対照条件での発現レベルの中央値に対して正規化した。遺伝子を、倍率の変化に従ってグループ分けした。すべての未加工マイクロアレイデータファイルは、遺伝子発現オムニバス（ＧＥＯ：ＧＳＥ１２２９２５及びＧＳＥ１２２９２６）に預けられている。

（１０）ｍＲＮＡの定量（実施例１～実施例５、実施例１３）
ｍＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ＆ＲＴ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用してｃＤＮＡを合成した。ＳｕｐｅｒＰｒｅｐ／ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ Ｐｒｏｂｅ ｑＰＣＲ Ｓｅｔ（ＴＯＹＯＢＯ）及びＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ｃＤＮＡのアリコートを定量ＰＣＲにかけた。以下の遺伝子特異的プライマー／プローブセット：ＮＯＸＡ（ＰＭＡＩＰ１）（Ｈｓ００５６０４０２＿ｍ１）、ＮＲＦ２（ＮＦＥ２Ｌ２）（Ｈｓ００９７５９６１＿ｇ１）、ＧＣＬＣ（Ｈｓ００１５５２４９＿ｍ１）、ＧＳＳ（Ｈｓ００６０９２８６＿ｍ１）、及びＳＬＣ７Ａ１１（Ｈｓ００９２１９３８＿ｍ１）を使用した。ＡＢＩ ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にて、９５℃で１５秒間の変性、続いて６０℃で３０秒間のアニーリングと伸長（４０サイクル）の条件下でＰＣＲを行った。各試料について、標的遺伝子のｍＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのレベルに対して正規化した。次に、２－ΔΔＣｔ法を使用して、標的／ＧＡＰＤＨ比を、対照試料の比に対して正規化した。

（１１）イムノブロット分析（実施例１～５、実施例１２）
全細胞抽出のために、５×１０^５の細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄し、プロテイナーゼ阻害剤カクテルとホスファターゼ阻害剤カクテル（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）を添加したＮＥＴＮ４２０緩衝液［２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、４２０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％ＮＰ－４０、及び１ｍＭのＥＤＴＡ］中で溶解し、氷上で３０分間インキュベートし、４℃で１０分間、１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。全細胞溶解物の可溶性画分をＳＤＳ試料緩衝液と混合した。ＳＬＣ７Ａ１１を検出するための膜画分を含む細胞抽出では、細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄し、プロテイナーゼ阻害剤カクテルとホスファターゼ阻害剤カクテル（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）を添加したＭ－ＰＥＲ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅｇｅｎｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で溶解し、氷上で１０分間インキュベートし、４℃で１０分間、１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。可溶性画分をＳＤＳ試料緩衝液と混合した。異種移植片に由来する腫瘍試料を秤量し、ＰＢＳで洗浄した。腫瘍試料（１０ｍｇ）を、プロテイナーゼ阻害剤カクテルとホスファターゼ阻害剤カクテル（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）を添加した５０μｌのＮＥＴＮ４２０緩衝液と混合し、ミニコードレスグラインダー（フナコシ）を使用してホモジナイズした。ホモジナイズした腫瘍試料を、追加の４５０μｌのＮＥＴＮ４２０緩衝液中で希釈し、氷上で３０分間インキュベートし、４℃で１０分間、１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。全細胞溶解物の可溶性画分をＳＤＳ試料緩衝液と混合した。タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、指示された抗体でイムノブロットした。ローディングコントロールとしてβ－アクチンを使用した。膜を４℃で一晩又は２５℃で１時間、ＰＶＤＦ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ（ＴＯＹＯＢＯ）でブロックし、次いで一次抗体を含むＣａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １（ＴＯＹＯＢＯ）でプローブした。０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳで洗浄した後、膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０、１％ＢＳＡ、及び西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウス又は抗ウサギ二次抗体を含むＴＢＳとインキュベートし、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ ＥＣＬ Ｐｒｏ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して視覚化した。化学発光シグナルを、ＬＡＳ－３０００ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を使用して測定した。Ｍｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅソフトウェアを使用してシグナル強度を測定した。ＧＣＬＣのタンパク質レベルを、β－アクチンのレベルに対して正規化した。次に、ＧＣＬＣ／β－アクチン比を、Ｄｏｘ処理なしの対照試料での比に対して正規化した。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として表す。イムノブロッティングには、以下の抗体：ＧＣＬＣ（Ａｂｃａｍ、ａｂ１９０６８５）、ＮＲＦ２（Ａｂｃａｍ、ａｂ６２３５２）、ｐ５３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＯＰ４３）、β－アクチン（ＣＳＴ、４７９０）、ＡＲＩＤ１Ａ（ＣＳＴ、１２３５４）、ＢＲＧ１（ＣＳＴ、４９３６０）、ＳＬＣ７Ａ１１（ＣＳＴ、１２６９１）、ＮＯＸＡ（ＣＳＴ、１４７６６）、ｐ２１（ＣＳＴ、２９４７）、ＪＮＫ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－７３４５）、及びｐｈｏｓｐｈｏ－ＪＮＫ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－６２５４）を使用した。

（１２）ＣｈＩＰアッセイ（実施例４）
播種の２４時間後に１×１０^６の細胞を採取し、１％ホルムアルデヒドで室温にて１０分間処理して、タンパク質をＤＮＡに架橋させた。グリシン（０．１２５Ｍ）を添加して、架橋プロセスを止めた。ＣｈＩＰ－ＩＴ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃキット（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）と、ＡＲＩＤ１Ａ（ＣＳＴ、１２３５４）、ＢＲＧ１（ＣＳＴ、４９３６０）、ＮＲＦ２（ＣＳＴ、１２７２１）、又はＲＮＡＰＩＩ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ、３９０９７）に対する抗体を使用して、ＣｈＩＰアッセイを実施した。精製されたＤＮＡに対し、ＳｕｐｅｒＰｒｅｐ／ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｓｅｔ（ＴＯＹＯＢＯ）と、以下のプライマー対：ＳＬＣ７Ａ１１－１１８２－１０９９－Ｆ（５’－ＴＣＡＧＡＡＧＣＴＴＡＴＴＴＡＡＴＧＧＴＧＣＧ－３’）及びＳＬＣ７Ａ１１－１１８２－１０９９－Ｒ（５’－ＧＴＧＧＴＴＴＴＧＧＡＴＴＣＡＧＴＧＡＧＡＡＧ－３’）；ＳＬＣ７Ａ１１－２９７－２４１－Ｆ（５’－ＣＡＧＣＴＴＴＴＧＴＴＧＣＴＣＡＣＴＡＣＧ－３’）及びＳＬＣ７Ａ１１－２９７－２４１－Ｒ（５’－ＴＣＧＧＡＡＣＡＧＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧ－３’）；ＳＬＣ７Ａ１１－１４＿７９－Ｆ（５’－ＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＴＴＧ－３’）及びＳＬＣ７Ａ１１－１４＿７９－Ｒ（５’－ＧＣＡＴＣＧＴＧＣＴＣＴＣＡＡＴＴＣＴＣ－３’）；ＳＬＣ７Ａ１１＿７１＿１９０－Ｆ（５’－ＧＣＡＣＧＡＴＧＣＡＴＡＣＡＣＡＧＧＴＧ－３’）及びＳＬＣ７Ａ１１＿７１＿１９０－Ｒ（５’－ＣＣＴＣＴＧＣＴＴＴＣＡＧＡＣＴＧＴＣＴ－３’）；及びＳＬＣ７Ａ１１＿９７２＿１０７０－Ｆ（５’－ＣＧＧＡＧＴＧＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＴＣ－３’）及びＳＬＣ７Ａ１１＿９７２＿１０７０－Ｒ（５’－ＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＧＣＡＣＡＴＧＡＡＣ－３’）を使用して、定量ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で１５秒間の変性、続いて６０℃で６０秒間のアニーリングと伸長（４５サイクル）であった。ＰＣＲを、ＡＢＩ ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で実行した。タンパク質の濃縮を、投入量のパーセンテージとして表した。

（１３）メタボローム分析（実施例４）
代謝物を、２×１０^６の細胞から抽出した。培養培地を除去し、細胞を、２回５％マンニトール溶液（８ｍｌ、次に４ｍｌ）で洗浄し、次いで８００μｌのメタノール及び内部対照として５μｇの２－イソプロピルリンゴ酸を含む１５０μｌのＭｉｌｌｉ－Ｑ水で処理した。代謝物抽出物を微量遠心管に移し、スピンドライヤー（ＴＡＩＴＥＣ）を使用して乾燥させた。固相での誘導体化を、下記要領で行った。固相カートリッジＰｒｅｓｈ－ＳＰＥ ＡＯＳは、ＡｉＳＴＩ ＳＣＩＥＮＣＥ（和歌山）から供給された。細胞抽出物を２００μｌのＭｉｌｌｉ－Ｑ水及び８００μｌのアセトニトリルと混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。１４，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離した後、上清を新しいチューブに移した。誘導体化条件は、５μｌの５％超のメトキシアミン溶液による３分間のメトキシム化と、２５μｌのＮ－メチル－Ｎ－トリメチルシリル－トリフルオロアセトアミドによる１０分間のトリメチルシリル化であった。誘導体化された被検物質を、１００μｌのｎ－ヘキサンで効果的に溶出させ、１．０μｌの誘導体化された溶液を、ガスクロマトグラフ／質量分析計ＧＣＭＳ－ＴＱ８０５０（島津製作所）に注入した。

メタボローム分析を、ＢＰＸ－５キャピラリーカラム（内径：３０ｍ×０．２５ｍｍ、膜厚：０．２５μｍ、ＳＥＧ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ）を備えたＧＣＭＳ－ＴＱ８０５０で実施した。パラメータ設定は以前に報告されている（Ｎｉｓｈｉｕｍｉら、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ８、１７１１５－１７１２６、２０１７参照）。ＧＣＭＳ－ＴＱ８０５０分析中、入口温度を２５０℃に維持し、ヘリウムを３９．０ｃｍ／秒の一定流量でキャリアガスとして使用した。インジェクタのスプリット比を１：１０に設定した。ＧＣカラム温度を、６０℃で２分間維持し、次いで、毎分１５℃の速度で６０℃から３３０℃に上昇させた後、３３０℃で３分間保つようにプログラム化した。ＧＣの合計実行時間は２３分であった。トランスファラインとイオン源の温度は、それぞれ２８０℃と２００℃であった。イオン化電圧は７０ｅＶであった。衝突誘起解離ガスとしてアルゴンガスを使用した。代謝物測定に使用されるＧＣ分析条件、ＭＲＭパラメータ、及び保持指数に関する関連ＭＲＭ法ファイル及びデータを含む、Ｓｍａｒｔ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（島津製作所）を使用して代謝物を検出した。ＧＣＭＳｓｏｌｕｔｉｏｎソフトウェア（島津製作所）の自動保持時間調整（ＡＡＲＴ）機能と標準アルカン系列混合物（Ｃ７～Ｃ３３）を使用して、保持時間を修正した。ピークは自動的に識別され、特定のプリカサイオンとプロダクトイオン、及び保持時間に基づいて手動で確認された。相対的なシステイン比を、ＡＲＩＤ１Ａ発現細胞に対して正規化した。

（１４）標的及び全エクソーム配列決定（実施例５）
培養がん細胞から抽出された１．０μｇのＤＮＡを使用して、標的配列決定を実施した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔキットＮＣＣ Ｏｎｃｏｐａｎｅｌ（９３１１９６）を使用して、標的ゲノムキャプチャを実行した。１５０ｂｐペアエンドリード（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、配列決定をＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑプラットフォームで実行した。基本的なアラインメントと配列品質管理を、Ｐｉｃａｒｄパイプライン及びＦｉｒｅｈｏｓｅパイプラインを使用して実施した。Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ Ｍｕｌｔｉ－Ｖｉｓｉｏｎソフトウェアパッケージを使用して、ＵＣＳＣヒトゲノム１９（ｈｇ１９）からの参照ヒトゲノムに対してリードを整列させた。ＰＣＲ中に重複したリードが生成された。したがって、同じゲノム位置に対し整列しているペアエンドリードは、ＳＡＭｔｏｏｌｓを使用して削除された。体細胞一塩基バリアントは、ベイズ分類器を適用して対立遺伝子頻度の低い体細胞変異を検出できるようにするＭｕＴｅｃｔプログラムによってコールされた。体細胞挿入／欠失変異（インデル）は、ＧＡＴＫ Ｓｏｍａｔｉｃ ＩｎｄｅｌＤｅｔｅｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ａｒｃｈｉｖｅ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ｃｇａ／ｉｎｄｅｌｏｃａｔｏｒ）を使用してコールされた。

（１５）免疫組織化学（実施例５）
１１名の患者が卵巣がんと診断され、日本国東京の国立がん研究センター中央病院（ＮＣＣＨ）又は日本国東京の慈恵会医科大学病院（ＪＵＨ）で手術を受けた。１１名の患者のいずれも術前治療を受けていなかった。この研究は、国立がんセンター（東京、日本国）と慈恵会医科大学の施設内審査委員会によって承認され、患者からインフォームドコンセントが得られた。卵巣腫瘍は、国際産婦人科連合（ＦＩＧＯ）のガイドラインに従って診断され、世界保健機関（ＷＨＯ）の分類システムに従って分類された。ＡＲＩＤ１Ａ変異は、前述のように、標的及び全エクソーム配列決定によって決定された（Ｋａｎｋｅら、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ９、６２２８－６２３７、２０１８参照）。

ホルマリン固定されたパラフィン包埋卵巣がん臨床標本及びＴＯＶ２１Ｇ異種移植片を脱パラフィンし、代表的な４μｍ厚の全切片をＩＨＣで分析した。ＴＯＶ２１Ｇ－ｓｈＧＣＬＣ異種移植片をＯＴＣ化合物（２５６０８－９３０；Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ）に包埋し、－８０℃で保存した。試料を冷凍庫から取り出し、切片化する前に－２０℃で約１５分間平衡状態にした。組織切片（厚さ６μｍ）を正に帯電したスライド上に置き、乾燥させ、３％ホルムアルデヒド中、室温で１５分間固定した後、－２０℃のメタノール中で５分間固定した。固定後、代表的な切片をＩＨＣで分析した。Ｋｉ－６７（ＭＩＢ－１）（ＧＡ６２６６１－２、１：１００希釈、Ｄａｋｏ）、切断型カスパーゼ－３（５Ａ１Ｅ）（９６６４、１：２００希釈、ＣＳＴ）、切断型ＰＡＲＰ（Ｄ６４Ｅ１０）（５６２５、１：１００希釈、ＣＳＴ）、ＮＯＸＡ（１１４Ｃ３０７）（ａｂ１３６５４、１：２０００希釈、Ａｂｃａｍ）、８－ヒドロキシ－２’－デオキシグアノシン（Ｎ４５．１）（ａｂ４８５０８、１：５００希釈、Ａｂｃａｍ）、ＡＲＩＤ１Ａ（ＨＰＡ００５４５６、１：２０００希釈、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び抗ＳＬＣ７Ａ１１（ｘＣＴ）（ａｂ１７５１８６、１：４００希釈、Ａｂｃａｍ）に対する抗体を使用して、組織切片を染色した。Ｄａｋｏ自動染色装置Ｌｉｎｋ４８（Ｄａｋｏ）を使用して、すべてのＩＨＣ染色を実施した。

さらに、腫瘍試料に組織学的スコア（Ｈスコア）を割り当てるために使用される半定量的アプローチによって、８－ＯＨｄＧの免疫組織化学的染色を評価した（Ｈｉｒｓｃｈら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２１、３７９８－３８０７、２００３参照）。最初に、固定フィールド内の各細胞の膜染色強度（０、１＋、２＋、又は３＋）を決定した。次の式：［１×（１＋の細胞の％）＋２×（２＋の細胞の％）＋３×（３＋の細胞の％）］を使用して、Ｈスコアを割り当てた。０～３００の範囲の最終スコアにより、所定の腫瘍試料における高強度の膜染色に対してより相対的重みが与えられる。各スライドにおける（細胞の総数の）ＮＯＸＡ－陽性細胞、切断型カスパーゼ－３－陽性細胞、切断型ＰＡＲＰ－陽性細胞及びＫｉ６７－陽性細胞のパーセンテージをカウントした。

（１６）全エクソーム配列決定（実施例６）
Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＸＴ（Ａｇｉｌｅｎｔ、カリフォルニア州パロアルト）を製造元のプロトコルに従って使用して、エクソームライブラリを生成した。配列決定する前に、Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｄ１０００（Ａｇｉｌｅｎｔ）を伴うＡｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ２２００、及びＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カリフォルニア州サンディエゴ）を伴うＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ｂＦｌｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、イリノイ州ロックフォード）を使用して、エクソームライブラリを分析した。ＴｒｕＳｅｑ ＳＢＳ Ｋｉｔ ｖ３－ＨＳ（２００サイクル）試薬（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を備えたＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００／２５００システムを使用して、すべてのライブラリを配列決定した。ＢＷＡ－ＭＥＭを使用して、配列データをＧｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ゲノムリファレンスコンソーシアム）ＧＲＣｈ３７アセンブリにマッピングした。ＧＡＴＫ４ Ｍｕｔｅｃｔ２を使用して、体細胞変異体のコールを行った。

（１７）細胞株由来の異種移植片の組織学的分析（実施例６）
６週齢の雌ＣＡｎＮ．Ｃｇ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌＣｒｌｊ（ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｊａｐａｎ）を、室温で１２時間の明暗サイクルにより飼育した。マウスは特定病原体除去条件下で維持され、無菌の餌、水、及びケージが提供された。約５×１０^６のがん細胞を１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水で懸濁し、２６．５ゲージの針を使用してマウスの皮下に注射した。すべての実験は、国際疼痛学会の倫理ガイドラインに従って実施され、国立がんセンターの動物実験倫理委員会によって承認された。ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した標本を、８μｍの切片に切断し、常用的ヘマトキシリン及びエオシン染色のために脱ロウ及び脱水した。

定量化及び統計的分析
（１）統計分析（実施例１～５）
統計分析は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用して実行された。図の凡例に示されているように、データは平均±ＳＤ又は平均±ＳＥＭとして表されている。試料サイズ（ｎ）は図の凡例に示され、生物学的複製を表す。統計的有意性は、両側スチューデントのｔ検定を使用して評価された。統計的有意差は、アスタリスクで次のように示されている：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１。

本発明の開示によれば、グルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤を投与することにより、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がんを治療することが可能である。

Claims (16)

1. 有効量のグルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤をそれを必要とする哺乳動物に投与することを含む、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がんを治療するための方法。
2. 前記ＧＳＨ代謝経路阻害剤が、グルタミン酸システインリガーゼシンテターゼ（ＧＣＬ）阻害剤、グルタミン酸システインリガーゼ触媒サブユニット（ＧＣＬＣ）阻害剤、グルタミン酸システインリガーゼ修飾因子（ＧＣＬＭ）阻害剤、ＧＳＨシンテターゼ（ＧＳＳ）阻害剤、ＳＬＣ７Ａ１１阻害剤、又はそれらの組合せである、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＧＳＨ代謝経路阻害剤が、抗体、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は低分子化合物である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体が、ＡＲＩＤ１Ａ、ＳＭＡＲＣＡ２（ＢＲＭ）、ＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１）、ＳＭＡＲＣＢ１、ＰＢＲＭ１、又はそれらの組合せである、請求項１に記載の方法。
5. 前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がんがＡＲＩＤ１Ａ欠損がんであり、前記ＡＲＩＤ１Ａ欠損がんが、卵巣がん、子宮がん、胃がん、膀胱がん、胆管がん、肝がん、食道がん、肺がん、結腸がん、膵臓がん、乳がん、神経芽細胞腫、神経膠腫、皮膚がん、Ｂ細胞リンパ腫又は腎がんである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がんがＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１）欠損がんであり、前記ＳＭＡＲＣＡ４（ＢＲＧ１）欠損がんが、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、Ｂ細胞リンパ腫、食道がん、胃がん、神経膠腫、頭頸部がん、肝がん、肺がん、黒色腫、膵臓がん、前立腺がん、腎がん、ラブドイド腫瘍、卵巣がん、ＳＭＡＲＣＡ４欠損胸部肉腫、又は子宮がんである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がんがＳＭＡＲＣＢ１欠損がんであり、前記ＳＭＡＲＣＢ１欠損がんが、類上皮肉腫、家族性シュワノマトーシス、胃がん、腎がん、ラブドイド腫瘍、副鼻腔がん、滑膜肉腫、未分化脊索腫又は子宮がんである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がんが、膀胱がん、胆管がん、結腸がん、Ｂ細胞リンパ腫、食道がん、胃がん、頭頸部がん、肺がん、黒色腫、中皮腫、膵臓がん、腎がん、又は子宮がんであるＰＢＲＭ１欠損がんである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記ＧＳＨ代謝経路阻害剤がＧＳＨ低減化合物である、請求項１に記載の方法。
10. 前記ＧＳＨ低減化合物がＡＰＲ－０１７又はＡＰＲ－２４６である、請求項９に記載の方法。
11. 前記ＧＣＬＣ阻害剤がブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）である、請求項２に記載の方法。
12. 前記ＳＬＣ７Ａ１１阻害剤がスルファサラジンである、請求項２に記載の方法。
13. グルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤に感受性のある患者を検出及び／又は選択するための方法であって、がんを有する患者におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損の存在を検出することを含む方法。
14. ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がんを治療するための有効量のグルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤を含む医薬組成物。
15. ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がんの治療に使用するためのグルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤。
16. （ａ）グルタチオン（ＧＳＨ）代謝経路阻害剤、及び（ｂ）ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体欠損がんを治療するための説明書を含むキット。

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