CN117599046A - Rna解旋酶dhx33抑制剂在制备用于治疗甲状腺癌的药物中的应用 - Google Patents
Rna解旋酶dhx33抑制剂在制备用于治疗甲状腺癌的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药领域，公开了RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗或者辅助治疗甲状腺癌药物中的应用。本发明确立了DHX33蛋白在甲状腺癌发展中的重要作用，提供的抑制剂具有抑制DHX33解旋酶活力的作用，进而导致由DHX33缺失所介导的脂质过氧化，并诱导甲状腺癌细胞中白介素24(IL‑24)表达，该抑制剂可以快速诱导癌细胞铁死亡，并通过上调IL‑24进而显著抑制甲状腺癌细胞增殖，因此具有重要的医药开发价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地说，涉及RNA解旋酶DHX33抑制剂及其在制备用于治疗甲状腺癌的药物中的应用。
背景技术
甲状腺癌是一种常见的内分泌系统性癌，也是发病率增长最快的癌症。
根据病理类型，可将甲状腺癌分为甲状腺乳头状癌(PTC)、滤泡样甲状腺癌(FTC)、低分化或未分化甲状腺癌及甲状腺髓样癌(MTC)，这与不同互斥基因的突变有关。不同病理类型的甲状腺癌其生理学特征、治疗方式以及预后均具有显著差异。
甲状腺乳头状癌(PTC)和滤泡样甲状腺癌(FTC)均属于分化型甲状腺癌(DTC)，存在血管内皮生长因子及其受体的高表达，以及BRAFV600E突变、RET重排、RAS点突变等基因改变。其中PTC是分化型甲状腺癌中最常见的组织类型，侵袭性低，占所有甲状腺癌的80％以上。由于其早期症状特异性较低，多表现为甲状腺区域无痛性肿块，声音嘶哑和吞咽困难等，因此诊断难度相对较高。但其生长缓慢、转移率低，主要通过甲状腺部分切除术和放射性碘治疗，或者针对靶点的多激酶抑制剂可延长中位无进展生存期，使部分患者的肿瘤缩小，均具有较好的疗效。
低分化甲状腺癌(PDTC)是甲状腺癌中较为罕见的一种疾病，发病率为所有甲状腺癌的2％～15％，临床病理特征主要表现为甲状腺外扩张，颈部淋巴结转移、有丝分裂率高、肿瘤坏死等。已有报道称BRAF、RAS、TERT等主要驱动基因的突变与PDTC的发生密切相关，且会随着肿瘤的发展而不断变化。由于疾病的罕见性和纳入标准的异质性，PDTC的治疗尚未标准化。目前手术是PDTC的首选治疗方法，可通过术前评估、适当的影像学检查和术中检查结果来确定手术范围。
甲状腺髓样癌(MTC)与甲状腺乳头状癌(PTC)一样生长较为缓慢，很少迅速长大，多数没有临床表现。MTC与PTC的区别主要基于起源细胞和组织结构，且MTC生存期小于PTC，晚期手术无法延长生存期。一般通过甲状腺全切除术和颈部淋巴结清扫治疗。
综上所述，针对不同病理特征以及恶性程度的甲状腺癌，手术均是首选的治疗方法，再辅以靶向治疗、化疗、放疗等。分子靶向治疗药物的选择与疾病特征(基因突变情况)、恶性程度、无法手术或放射性碘难治的患者有关。免疫治疗目前还处于临床阶段，而化疗仅适用于甲状腺癌Ⅳ期患者，但疗效相对较差。总之，研发更安全、有效的药物是提高甲状腺癌患者生存率及改善患者生活质量的关键。
发明内容
本发明的目的是，提供RNA解旋酶DHX33抑制剂及其在制备用于治疗或者辅助治疗甲状腺癌的药物或药物组合物中的应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供了用于治疗或辅助治疗甲状腺癌的RNA解旋酶DHX33抑制剂。在本发明中，RNA解旋酶DHX33抑制剂(即DHX33蛋白抑制剂)选自化合物A或药学上可接受的盐或者前药中的至少一种：
本发明首次公开了DHX33蛋白质可以作为靶点进行甲状腺癌的治疗，因此在第二方面，本发明提供了上述RNA解旋酶DHX33作为新型甲状腺癌治疗靶点的应用。
第三方面，本发明提供了RNA解旋酶DHX33抑制剂作为由DHX33(DHX33基因)调控的甲状腺癌细胞铁死亡诱导剂的应用，即DHX33抑制剂可以快速诱导甲状腺癌细胞的铁死亡(ferroptosis)。铁死亡是铁离子依赖性的细胞死亡，是不同于细胞凋亡、细胞自噬的新型细胞死亡方式。脂肪酸代谢与细胞的铁死亡密切关联。脂肪酸代谢主要包括脂肪酸从头合成、脂肪酸氧化、脂肪酸的去饱和及加长而生成不同饱和程度和不同碳链长度的脂肪酸，其中，脂肪酸去饱和酶主要包括：SCD、FADS1、FADS2，而SCD是其中的限速步骤酶。研究表明，脂肪酸代谢在癌症细胞中出现异常，很多癌症细胞有这几个脂肪酸去饱和酶的过表达。抑制SCD可以导致细胞质膜的脂类过氧化物生成，并进一步诱导细胞进入铁死亡。这一过程伴随铁离子的蓄积，是铁离子诱导发生的。
本发明提供了RNA解旋酶DHX33抑制剂作为由DHX33(DHX33基因)调控的甲状腺癌细胞白介素24(IL-24)诱导剂的应用，即DHX33抑制剂可上调甲状腺癌细胞中IL-24的表达而诱导细胞死亡。IL-24是一个既能抑制肿瘤细胞生长和血管生成并诱导凋亡，同时又能诱导免疫细胞表达细胞因子的新型抑癌基因。IL-24几乎对所有肿瘤细胞均具有抑制作用，可通过调节内质网应激和线粒体功能而促使肿瘤细胞凋亡、抑制血管形成进而抑制肿瘤细胞的生长，且对正常细胞不会产生有害影响。此外，IL-2可通过调节ABC转运蛋白超家族耐药相关蛋白影响药物代谢，干扰相关信号通路蛋白的表达而抑制耐药信号，调节肿瘤细胞DNA损伤修复等机制来实现其增强肿瘤细胞化疗敏感性和协同化疗药物抗肿瘤的特性。
DHX33基因在NCBI上的参考序列编号为：NM_020162.4。
第四方面，本发明提供了用于治疗或者辅助治疗甲状腺癌的靶向药物，其中所述药物的靶点是RNA解旋酶DHX33，该靶向药物可以抑制DHX33解旋酶的活力，进而影响由DHX33蛋白所调控的癌细胞铁死亡过程，并且由DHX33抑制剂诱导的IL-24对癌细胞的抑制。该靶向药物的有效成分为化合物A或其药学上可接受的盐或者前药。
在本发明的实施方案中，甲状腺癌由基因突变导致，所述突变包括但不限于BRAFV600E突变、RET重排、RAS突变。
在本发明的实施方案中，甲状腺癌包括但不限于前期化疗或者BRAFV600E、RET、BRAF、RAS、TERT靶向药耐药性肿瘤。
第五方面，本发明提供了上述RNA解旋酶DHX33抑制剂在治疗或者辅助治疗甲状腺癌中的应用。
第六方面，本发明提供了上述RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗或者辅助治疗甲状腺癌的药物或药物组合物中的应用。
第七方面，本发明提供了上述RNA解旋酶抑制剂在上调甲状腺癌细胞中白介素24(IL-24)表达水平的应用。
在本发明的实施方案中，RNA解旋酶DHX33抑制剂的摄入频率或剂量可以由医师根据个体的身体状况、年龄、性别、体重等因素来确定。在具体实施方案中，摄入频率范围可以是一天一次到三次。在本发明的实施方案中，RNA解旋酶DHX33抑制剂的摄入剂量需要保证药物的有效暴露量达到每天4000-7500ng·h/mL。在具体实施方案中，在小鼠中，RNA解旋酶DHX33抑制剂的口服剂量可以为25mg-300mg/kg一次，静脉注射剂量可以为每次2.5mg-25mg/kg。在具体实施方案中，在小鼠中，RNA解旋酶DHX33抑制剂的口服摄入剂量可以为每次例如35mg-290m/kg，45mg-280mg/kg，55mg-270mg/kg，65mg-260mg/kg，75mg-250mg/kg，85mg-240mg/kg，95mg-230mg/kg，105mg-220mg/kg，115mg-210mg/kg，125mg-200mg/kg，135mg-190mg/kg，145mg-180mg/kg，或155mg-170mg/kg。当通过静脉注射施用时，在小鼠中，RNA解旋酶DHX33抑制剂注射一次的剂量可以为例如3.0mg-24.5mg/kg、3.5mg-24mg/kg、4.0mg-23.5mg/kg、4.5mg-23mg/kg、5.0mg-22.5mg/kg、5.5mg-22mg/kg、6.0mg-21.5mg/kg、6.5mg-21mg/kg、7.0mg-20.5mg/kg、7.5mg-20mg/kg、8.0mg-19.5mg/kg、8.5mg-19mg/kg、9.0mg-18.5mg/kg、9.5mg-18mg/kg、10.0mg-17.5mg/kg、10.5mg-17.0mg/kg、11.0mg-16.5mg/kg、11.5mg-16mg/kg、12.0mg-15.5mg/kg、12.5mg-15.0mg/kg或13.0mg-14.5mg/kg。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明确立了RNA解旋酶DHX33在甲状腺癌发生发展中的重要作用，所提供的RNA解旋酶DHX33抑制剂具有抑制DHX33解旋酶活力的作用，进而诱导由DHX33所调控的细胞铁死亡，同时，该抑制剂可以通过上调白介素24(IL-24)的表达，进而阻止甲状腺癌细胞的增殖。本发明的RNA解旋酶DHX33抑制剂可以显著抑制甲状腺癌细胞的生长，从而达到治疗甲状腺癌的目的，并因此具有重要的医药开发价值。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中分析代表性的人类甲状腺癌组织相比于正常甲状腺组织的DHX33蛋白表达量明显偏高。
图2为本发明较佳实施例中分析代表性的人甲状腺癌细胞TPC-1和BCPAP相比于人皮肤成纤维细胞HSF(human skin fibroblast)的DHX33蛋白表达量明显偏高。
图3为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂化合物A处理后的HSF细胞半抑制浓度分析，半抑制浓度(IC50)大于10μM。
图4为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂化合物A处理后的TPC-1细胞半抑制浓度分析，半抑制浓度(IC50)为0.0456μM。
图5为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂化合物A处理后的BCPAP细胞半抑制浓度分析，半抑制浓度(IC50)为0.045μM。
图6为本发明较佳实施例中分析用DHX33抑制剂化合物A处理后的TPC-1和BCPAP细胞形态学变化。
图7为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂化合物A处理后的TPC-1细胞克隆生长的分析结果。
图8为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂化合物A处理后的TPC-1细胞软琼脂实验---悬浮独立生长的分析结果。
图9为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂化合物A处理后的BCPAP细胞克隆生长的分析结果
图10为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂化合物A处理后的BCPAP细胞软琼脂实验---悬浮独立生长的分析结果。
图11为本发明较佳实施例中用不同剂量的DHX33抑制剂化合物A处理甲状腺癌细胞TPC-1后分析的脂质代谢去饱和酶基因的转录水平变化。
图12为本发明较佳实施例中用不同剂量的DHX33抑制剂化合物A处理甲状腺癌细胞TPC-1后分析的白介素24(IL-24)基因的转录水平变化。
图13为本发明较佳实施例中分析DHX33敲除(shDHX33)后甲状腺癌细胞TPC-1中白介素24(IL-24)基因的转录水平变化。
图14本发明较佳实施例中分析TPC-1细胞用DHX33抑制剂化合物A处理24小时后细胞上清液中IL-24的含量。
图15为本发明较佳实施例中TPC-1细胞用DHX33抑制剂化合物A处理16小时或DHX33敲除(shDHX33)后的细胞活性氧(ROS)的定量分析图。
图16为本发明较佳实施例中BCPAP细胞用DHX33抑制剂化合物A处理16小时或DHX33敲除(shDHX33)后的细胞活性氧(ROS)的定量分析图
图17为本发明较佳实施例中TPC-1细胞用DHX33抑制剂化合物A处理16小时或DHX33敲除(shDHX33)后的细胞脂类过氧化物(LPO)的定量分析图。
图18为本发明较佳实施例中BCPAP细胞用DHX33抑制剂化合物A处理16小时后的细胞脂类过氧化物(LPO)的定量分析图。
图19为本发明较佳实施例中TPC-1细胞用DHX33抑制剂化合物A处理16小时或DHX33敲除(shDHX33)后的细胞亚铁离子的定量分析图。
图20为本发明较佳实施例中BCPAP细胞用DHX33抑制剂化合物A处理16小时后的细胞亚铁离子的定量分析图
图21为本发明较佳实施例中TPC-1细胞用DHX33抑制剂化合物A处理16小时后的细胞谷胱甘肽(GSH)的定量分析图。
图22为本发明较佳实施例中分析TPC-1和BCPAP细胞用DHX33抑制剂化合物A处理24小时后参与脂质代谢基因的表达水平。
图23为本发明较佳实施例中分析DHX33敲除(shDHX33)后甲状腺癌细胞TPC-1和BCPAP中脂质代谢基因的表达水平。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
1.细胞培养
人甲状腺癌细胞株TPC-1、BCPAP等购自普诺赛生物技术有限公司(武汉)。TPC-1、BCPAP细胞用RPMI-1640培养基培养，该培养基是含有10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、添加非必须氨基酸和链霉素、青霉素的完全培养基。培养条件为37℃的二氧化碳培养箱，湿度60-70％。人皮肤成纤维细胞HSF购自上海博尔森生物科技有限公司，培养基为Dulbecco'sModifiedEagle Medium(高糖)，添加10％胎牛血清(FBS)和2mM L-谷氨酰胺、非必须氨基酸、链霉素、青霉素。
2.实时定量PCR
为了分析DHX33蛋白促进甲状腺癌细胞生长的分子机理，使用定量PCR(SYBRgreen supermix(Bio-Rad))分析甲状腺癌细胞中重要基因的表达变化，并用H3.3值归一化之后通过Ct值计算转录物含量。将待分析的细胞以合适密度铺到6孔板，第二天将适当浓度的DHX33抑制剂加入到RPMI-1640培养基，抑制剂处理细胞的时间分别为0小时、4小时或者6小时，然后收获细胞提取RNA。之后对RNA样本进行定量PCR分析。待分析的几个目的基因为：FADS1、FADS2、SCD、SLC3A2、SLC7A11、GPX4、IL-24和IL-7。
引物均由IDT(http：//sg.idtdna.com/site)在线“realtime PCRtool”设计，购自BGI(深圳)公司。
针对人体细胞中参与细胞铁死亡基因的引物序列如下(所有引物都从5′-3′)：
| 引物名称 | 序列 |
| H3.3-Forward | TGTGGCGCTCCGTGAAATTAG |
| H3.3-Reverse | CTGCAAAGCACCGATAGCTG |
| SCD-Forward | CCTGGTTTCACTTGGAGCTGTG |
| SCD-Reverse | TGTGGTGAAGTTGATGTGCCAGC |
| FADS1-Forward | CTGTCGGTCTTCAGCACCTCAA |
| FADS1-Reverse | CTGGGTCTTTGCGGAAGCAGTT |
| FADS2-Forward | TGCAACGTGGAGCAGTCCTTCT |
| FADS2-Reverse | GGCACATAGAGACTTCACCAGC |
| GPX4-Forward | AGAGATCAAAGAGTTCGCCGC |
| GPX4-Reverse | TCTTCATCCACTTCCACAGCG |
| SLC3A2-Forward | CAACTACCGGGGTGAGAACT |
| SLC3A2--Reverse | TATGTCCCGAACCTGGAACC |
| SLC7A11-Forward | GCTGTGATATCCCTGGCATT |
| SLC7A11--Reverse | GGCGTCTTTAAAGTTCTGCG |
针对人体细胞中参与细胞白介素基因的引物序列如下(所有引物都从5′-3′)：
| IL-24-Forward | AGCCTGTGGACTTTAGCCAG |
| IL-24-Reverse | GGTAAAACCCAGGCAAGGGA |
| IL-7-Forward | TTGCCAAGGCGTTGAGAGAT |
| IL-7-Reverse | CCTGGATGAGGACCAGAGGA |
3.细胞半抑制浓度(IC50)测定
将甲状腺癌细胞株TPC-1、BCPAP细胞以1X104个细胞/100μL/孔铺到96孔板上，等待细胞贴壁完全，将DHX33抑制剂以19nM、39nM、78nM、156nM、312nM、625nM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM的浓度添加到细胞RPMI-1640培养基中，用多通道排枪混合均匀。待DHX33抑制剂和细胞孵育时间达到72h后，将CCK-8试剂(上海翊圣生物科技有限公司)按照标准流程添加到96孔板的RPMI-1640培养基中，孵育1h后，用酶标仪读板(OD450nm)，将实验重复3次，并绘制DHX33抑制剂在不同浓度下的抑制曲线(如图3-5所示)，计算DHX33抑制剂的细胞半抑制浓度(IC50)。
4.细胞形态学观察
将甲状腺癌细胞株TPC-1、BCPAP细胞以1X105个细胞/2mL/孔铺到6孔板上，等待细胞贴壁完全，将DHX33抑制剂以40nM的浓度添加到细胞RPMI-1640培养基中，左右轻晃混匀。分别在DHX33抑制剂和细胞孵育时间达到0、4、6、8、24h后，用荧光显微镜观察细胞形态变化。
5.免疫组化分析
甲状腺癌组织芯片购自武汉天德生物科技有限公司，芯片一共有102例，含97例癌症组织，和5例作为对照的正常组织。根据甲状腺癌组织芯片说明书中的免疫组化(IHC)染色进行处理。使用前需先60℃烤片半小时。将芯片中的组织在脱蜡液中脱石蜡并在一系列乙醇浓度逐渐降低的溶液中再水合。在蒸锅中用Tris缓冲液(pH 9.0)呈现抗原。然后将组织在含有1％H2O2的水醇溶液中孵育以灭活内源性过氧化物酶。在室温下用5％FBS-PBS封闭30min后，将组织与一抗在4℃孵育过夜。然后根据制造商的建议使用DAKO试剂盒(丹麦DAKO公司)按照说明书进行分析。使用的一抗如下：anti-DHX33(购自SantaCruz生物技术公司)。实验结果(图1中染色的暗色区域)显示DHX33蛋白在多种人类甲状腺癌组织(尤其细胞核)中高表达。
6.活性氧(ROS)检测
将人甲状腺癌细胞株TPC-1和BCPAP细胞以1×105个细胞/2ml/孔铺到6孔板上，等待细胞完全贴壁，将DHX33抑制剂以阳性(Positive,活性氧荧光法检测试剂盒(Elabscience公司)中铁死亡诱导剂)、阴性(Negative)、40nM、80nM的浓度添加到培养基中，振板1min混匀。待DHX33抑制剂和细胞孵育时间达到16h后，用活性氧荧光法检测试剂盒(Elabscience公司)进行活性氧检测，设置3个复孔，试剂DCFH-DA经过一系列的化学反应成为不能透过细胞膜的荧光物质DCF，用多功能酶标仪(PerkinElmer)绘制不同浓度DHX33抑制剂下活性氧含量的柱状图，通过OD590nm值分析人甲状腺癌细胞的活性氧情况。如图4所示，DHX33抑制剂能够增加ROS含量，从而损害人甲状腺癌细胞甚至诱导其死亡。
7.细胞亚铁离子检测
将细胞人甲状腺癌细胞TPC-1和BCPAP用胰蛋白酶消化后，制成细胞悬液细胞，进行细胞计数，根据细胞亚铁比色法检测试剂盒(Elabscience公司)的流程进行亚铁离子检测，用酶标仪读板(OD590nm)，计算细胞样本的亚铁离子含量。
8.脂质过氧化物(LPO)
根据脂质过氧化物比色法检测试剂盒(Elabscience公司)的说明书进行脂质过氧化物含量的检测，用酶标仪读板(OD590nm)，按蛋白浓度计算LPO含量。低速离心(4℃，1000rpm)10min收集细胞，加入300-500μL的PBS(0.01M，pH 7.4)，进行超声破碎，4℃1500×g离心10min，取上清置于冰上待测，留取部分上清用于蛋白浓度测定。根据检测试剂盒说明书加入相应试剂进行反应，用酶标仪读板(OD590nm)，按蛋白浓度分析细胞中LPO含量。
9.还原性谷胱甘肽(GSH)
制备样本检测前，需要留取部分样本用于蛋白浓度测定，根据还原性谷胱甘肽比色法检测试剂盒(Elabscience公司)的使用流程进行还原性谷胱甘肽含量的检测，用酶标仪读板(OD405nm)，按蛋白浓度计算GSH含量。
10.细胞的克隆生长(Foci)
将2.0×103个细胞用10.0mL添加或者不添加DHX33抑制剂的RPMI-1640培养基中培养(100mm细胞培养皿)，在37℃的二氧化碳培养箱中孵育，每周更新培养基。观察细胞克隆生长情况，2-3周后，待细胞克隆长到足够大小，采用吉姆萨染色(Geimsa staining)，拍照记录统计。
11.软琼脂试验
将1.0×104个细胞与4.0mL含0.3％琼脂和10％FBS的RPMI 1640培养基中混合，并加在基础琼脂(4.0mL凝固的含0.6％琼脂和10％FBS的RPMI 1640培养基)上。将平板在37℃孵育，每3天检查一次，每周加入2.0mL含0.3％琼脂和10％FBS的RPMI 1640培养基。观察菌落生长情况，2-3周后计数。
12.蛋白质印迹分析
用添加有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Thermo Fisher)的RIPA缓冲液裂解细胞。在冰上孵育5min后，通过超声处理进一步破坏细胞裂解物。然后将全细胞提取物进行SDS-PAGE凝胶，每个样品的加载量为40μg蛋白质。然后将蛋白质转印到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。将膜在5％脱脂奶中封闭，将其在1×TBST缓冲液中在室温下孵育1h。在5％FBS中稀释一抗(用1×TBST稀释)，使之与膜在4℃孵育过夜。然后将膜用1×TBST缓冲液冲洗多次，并在室温下与5％FBS(用1×TBST稀释)中的HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗一起孵育1h。用ECL试剂盒(Thermo Fisher)显示印迹。一抗如下：抗GAPDH，Absin(abs830030)；抗FADS1,ABclonal(A0178)；抗FADS2，ABclonal(A10270)；抗SCD，ABclonal(A16429)；抗DHX33，Bethy1(A300-800A)。
13.IL 24-Elisa检测
将人甲状腺癌细胞株TPC-1细胞铺到6孔板上，等待细胞完全贴壁，将DHX33抑制剂化合物A以0nM、40nM、80nM的浓度添加到细胞RPMI 1640培养基中，混匀。待化合物A和细胞孵育时间达到16h后，收集细胞上清液，根据Human IL-24ELISAKIT检测试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)进行IL-24含量检测，设置2个复孔，经过生物素抗体、酶一系列的化学反应，通过OD(450nm)分析癌细胞的IL-24情况，并绘制在不同化合物A浓度下的IL-24含量的柱状图。
14.数据统计分析
数据表示为平均值+SD。使用斯氏t检验(Student’s test)确定统计学显著性，P值<0.05表示差异显著，用*标示；如果P值<0.01，用**标示；如果P值<0.001，用***标示。
实施例1.DHX33蛋白在多种甲状腺癌组织中高表达
本实施例利用免疫组织化学分析DHX33蛋白在人甲状腺癌组织中的表达。
人甲状腺癌组织的石蜡组织切片微列阵购自武汉天德生物科技有限公司，一共包括97例癌症组织，和五例作为对照的正常组织。首先将石蜡包埋的组织芯片在60℃烘箱中孵育30min，然后迅速在二甲苯中脱石蜡，并在一系列乙醇浓度(100％、95％、70％、50％和25％)逐渐降低的溶液中逐渐水合(每次轻轻摇动5min，每个浓度的乙醇溶液重复处理一次)，最在蒸馏水中继续水合10min。然后在蒸汽器中用50mM的Tris盐酸缓冲液(pH 9.0)呈现抗原，蒸汽加热40min，随后冷却到室温。然后将组织在含1％H2O2的甲醇溶液中孵育以灭活内源性过氧化物酶。在室温下用10％FBS封闭1h后，将组织与一抗在4℃孵育过夜。然后根据制造商的建议使用DAKO试剂盒(丹麦DAKO公司)进行标准方案。使用的抗体来源如下：anti-DHX33，SantaCruz(购自SantaCruz生物技术公司)。实验结果(图1中显示染色的暗色圆形区域)显示，DHX33蛋白在多种人类甲状腺癌组织(尤其细胞核)中发生高表达。下文的表1同时提供了针对97种癌组织及5种正常组织的数据，从这个统计数据可见，有81例病理组织高表达DHX33蛋白，约占总病理样本数的79％。从病理切片的分析结果看，非肿瘤的组织区域和周边非增生的正常组织中，DHX33表达较低。
表1. 97种甲状腺癌组织及5种正常组织的DHX33蛋白表达分析
说明：表中“-”代表DHX33表达阴性；“+”代表DHX33表达弱阳性；“++”代表DHX33表达中等阳性；“+++”代表DHX33表达强阳性。
实施例2.DHX33蛋白在甲状腺癌细胞中高表达
本实施例利用WesternBlot分析DHX33蛋白在人甲状腺癌细胞中的表达。
为了分析DHX33蛋白在人甲状腺癌细胞中的表达情况，我们分别选择二种不同的代表性甲状腺癌细胞株TPC-1、BCPAP和人皮肤正常成纤维细胞HSF进行对比，具体方法如前所述。如图2所示，以人皮肤成纤维细胞HSF作为对照，DHX33蛋白在人甲状腺癌细胞TPC-1和BCPAP中表达含量明显偏高，正常细胞中的DHX33明显偏低。这一结果印证了图1分析的组织中DHX33蛋白表达的结果。说明DHX33在癌症组织中特异表达。
实施例3.DHX33抑制剂对甲状腺癌细胞有特异杀伤性，而正常细胞对该抑制剂不敏感
为了分析DHX33抑制剂对甲状腺癌细胞的抑制作用，我们使用DHX33抑制剂化合物A进行了半抑制浓度的检测。分别选择二种不同的代表性甲状腺癌细胞株TPC-1、BCPAP来开展化合物A的细胞抑制性试验，并用DHX33蛋白表达量低的正常细胞HSF作为对比。如图3、4、5所示，DHX33抑制剂对两种不同的甲状腺癌细胞均具有纳摩尔级别的细胞抑制性，而且细胞的抑制曲线显示下降幅度均可以超过50％。但在正常细胞HSF中，化合物A的半抑制浓度达到10uM以上，基本没有明显抑制。这说明DHX33抑制剂对癌症细胞具有特异杀伤性，而对DHX33含量低的正常细胞不具有显著抑制性。
实施例4.DHX33抑制剂有效抑制甲状腺癌细胞的克隆生长和悬浮独立性增殖
除了细胞的半抑制浓度之外，我们也分析了DHX33抑制剂化合物A分别处理不同时间0、4、6、8、24h后细胞形态的变化。如图6所示，在采用40nM的浓度下，我们发现DHX33抑制剂化合物A在处理TPC-1细胞4h时，TPC-1细胞形态发生了变化。而另一株细胞BCPAP在化合物A处理6h时其细胞形态也发生了变化(图6)。同时我们还进行了细胞的克隆生长的测试分析，其具体方法如前所述，我们选择这两种甲状腺癌细胞TPC-1和BCPAP来开展实验。在采用40nM的浓度下，我们发现DHX33抑制剂化合物A可以显著抑制这两种甲状腺癌细胞的生长(图7和9)。除了这些细胞二维培养体系的分析之外，我们也在三维细胞培养体系中分析DHX33抑制剂化合物A对甲状腺癌细胞的抑制性，这个实验是在软琼脂体系中开展的，如前所述。悬浮独立生长是癌细胞的一个主要特征，在DHX33抑制剂化合物A(40nM)的处理下，我们发现甲状腺癌细胞几乎完全丧失了在软琼脂中进行悬浮独立生长的能力，不能形成聚集性增殖或者克隆(图8和10)。以上实验的结果表明，DHX33抑制剂化合物A对甲状腺癌细胞具有显著的抑制作用。
实施例5.DHX33抑制剂可以调控甲状腺癌细胞中的脂肪酸代谢酶---脂肪酸去饱和酶的表达
细胞生长离不开细胞膜的合成，尤其在癌细胞中，膜生成效率显著提高。研究表明，脂肪酸代谢对癌细胞的增殖至关重要。在多种癌细胞中，脂肪酸的合成异常活跃，尤其是细胞中脂肪酸的一些重要调控酶，例如脂肪酸去饱和酶，例如SCD1、FADS1、FADS2，都有高表达的现象。为了分析DHX33抑制剂是否可以调控这些重要基因的表达，我们对DHX33抑制剂处理的细胞进行了实时定量PCR分析。将TPC-1细胞用不同剂量的DHX33抑制剂(化合物A)处理4h，从细胞中提取总RNA后，用逆转录酶转换成其互补DNA分子，我们利用实时定量PCR技术，用这些DNA分子作为模板分析上述脂肪酸去饱和酶基因的转录本水平，引物的序列如前述。如图11所示，发现在DHX33受到抑制的TPC-1细胞内，几个参与脂肪酸代谢的酶，特别是脂肪酸合成中的限速步骤酶SCD和FADS1及FADS2，均发生了基因表达的下调，随着化合物A剂量的增加，脂肪酸去饱和酶的转录出现了显著的下调。这一信号通路在现在技术中是没有报道过的。为了确定DHX33抑制剂化合物A的确可以抑制脂肪酸去饱和酶在蛋白质水平上的表达，我们选择了三个代表性的蛋白质即FADS1、FADS2和SCD来开展分析。利用蛋白质免疫分析(WesternBlot)分析了不同剂量化合物A处理TPC-1和BCPAP细胞24h以及通过敲除细胞内DHX33(shDHX33)后FADS1、FADS2和SCD1蛋白水平的变化，发现随着化合物A剂量的增加，三者均呈现剂量依赖性下调，尤其以FADS2和SCD1变化最为显著，在较低的化合物A处理下就能看到显著的下调(图22、23)。
实施例5.DHX33抑制剂可以诱导甲状腺癌细胞的铁死亡
铁死亡最早于2012年由Scott JDixon提出，是一种铁依赖的区别于细胞凋亡、细胞坏死和细胞自噬的新的细胞程序性死亡模式，具有铁死亡特征的细胞死亡的报道可以追溯到上世纪50年代。铁死亡的敏感性与许多生物过程紧密相关，例如，与多不饱和脂肪酸代谢有密切关联。近期数据指向铁死亡中磷脂/脂质过氧化是主要的发生因素。所以多不饱和脂肪酸的代谢与癌细胞铁死亡的特殊敏感性密切关联。前期研究中也发现SCD1、FADS等基因的表达可以保护癌细胞免受铁死亡的影响。而我们已经发现DHX33促进甲状腺癌细胞中多种重要的脂肪酸去饱和酶的高表达，DHX33抑制剂处理后，癌细胞的SCD1、FADS1、FADS2表达降低，所以这些基因表达的下调可能会诱导癌细胞的铁死亡。为了分析DHX33抑制剂是否引发甲状腺癌细胞的铁死亡相关通路，我们开展几个代表性的分析测试。首先，在铁死亡途径中，标志性的物质是活性氧(ROS)的指标有显著的上升。我们用不同剂量的DHX33抑制剂化合物A处理TPC-1细胞16h或敲除细胞内DHX33，与阳性或与SCR参照对比，我们发现按照同等数量的癌细胞计算，DHX33的抑制可以显著诱导ROS的生成(图15)。我们也用化合物A处理另外一株甲状腺癌细胞BCPAP(或敲除细胞内DHX33)，并分析了其活性氧含量。结果发现，化合物A处理BCPAP细胞仅16h或敲除细胞内DHX33，与阳性或与SCR参照对比，按照同等数量的癌细胞计算，DHX33的抑制可以显著诱导ROS的生成(图16)。铁死亡途径的主要因素是脂类过氧化物的生成和积累导致的，所以我们继续分析了DHX33抑制剂处理16h以及敲除细胞内DHX33之后细胞质膜中脂类过氧化物(LPO)的含量。在这个实验中，我们使用了LPO检测试剂盒(Elabscience公司)，如图17所示，用化合物A处理TPC-1细胞16h或敲除细胞内DHX33后，与对照组(SCR)比较，LPO水平有显著的提高，这个分析是在比较等量的总细胞蛋白量的水平下进行的。我们进一步分析了化合物A处理16h之后BCPAP细胞质膜中脂类过氧化物(LPO)的含量，结果如图18所示，LPO的水平有显著提高。我们进一步在化合物A处理16h后的TPC-1和BCPAP细胞中分析了亚铁离子含量，结果如图19、20所示，化合物A处理16h后，可以看到两种细胞中铁离子的蓄积和浓度增加。并且在敲除DHX33后，与对照组(SCR)相比，TPC-1细胞中也存在铁离子的蓄积。谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)能够利用谷胱甘肽(GSH)将过氧化的脂质还原为无毒性的脂醇，从而保护细胞免于铁死亡。我们最后分析了化合物A处理16h后TPC-1细胞中的谷胱甘肽含量，发现TPC-1细胞中GSH含量随化合物A浓度的增加而逐渐减少(如图21)。由此，我们得出结论，DHX33抑制剂化合物A可以诱导甲状腺癌细胞中脂类过氧化物的生成，进而导致细胞的铁死亡，这个过程有铁离子的积累和依赖。
实施例6.DHX33抑制剂可以调控甲状腺癌细胞的白介素24(IL-24)水平
有报道称白介素24(IL-24)蛋白以多种不同的方式攻击各种癌症，如肝癌、肺癌、胃癌等。在一项新的研究中，研究发现利用T细胞将编码IL-24的基因递送到实体瘤中，可以阻止多种癌症的肿瘤生长，并抑制癌症向其他组织的扩散。为了分析DHX33抑制剂是否可以调控白介素24(IL-24)基因的表达，我们对DHX33抑制剂处理的细胞进行了实时定量PCR分析。将TPC-1细胞用不同剂量的DHX33抑制剂化合物A处理4h，从细胞中提取总RNA后，用逆转录酶转换成其互补DNA分子，我们利用实时定量PCR技术，用这些DNA分子作为模板分析上述白介素基因(IL-24、IL7)的转录本水平，引物的序列如前述。如图12所示，在DHX33受到抑制的TPC-1细胞内，我们发现白介素24(IL-24)基因的表达发生了上调，随着化合物A剂量的增加，白介素24(IL-24)的转录出现了显著的上调，且在敲除DHX33后，与对照组(SCR)相比，TPC-1细胞内的IL-24水平也表达上调(图13)。此外，我们还通过Human IL-24ELISAKIT(上海江莱生物科技有限公司)检测试剂盒进行了IL-24含量分析。结果如图14所示，用化合物A处理TPC-1细胞24h后，TPC-1细胞上清液中IL-24含量随药物浓度的增加而显著上调。本实施例的结果表明，DHX33抑制剂化合物A可以上调甲状腺癌细胞内白介素24(IL-24)水平，进而抑制甲状腺腺细胞生长和血管生成并诱导凋亡。
Claims (8)
1.RNA解旋酶DHX33作为新型甲状腺癌治疗靶点的应用。
2.用于治疗或辅助治疗甲状腺癌的RNA解旋酶DHX33抑制剂，其特征在于，所述抑制剂选自化合物A或药学上可接受的盐或者前药中的至少一种，
3.RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗或者辅助治疗甲状腺癌的药物或者药物组合物中的应用，其特征在于所述甲状腺癌为DHX33蛋白表达阳性，所述抑制剂如权利要求2所述。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述甲状腺癌由包括但不限于BRAFV600E突变、RET重排、RAS突变的基因突变导致。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述甲状腺癌包括但不限于前期化疗或者BRAFV600E、RET、BRAF、RAS、TERT靶向药耐药性肿瘤。
6.RNA解旋酶DHX33抑制剂在上调甲状腺癌细胞中白介素24(IL-24)表达水平中的应用，其中所述抑制剂如权利要求2所述。
7.RNA解旋酶DHX33抑制剂作为甲状腺癌治疗中的癌细胞铁死亡诱导剂的应用，其中，所述癌细胞是DHX33解旋酶依赖型，所述RNA解旋酶DHX33抑制剂如权利要求2所述。
8.RNA解旋酶DHX33抑制剂在上调白介素24(IL-24)基因转录水平的应用，其特征在于所述抑制剂如权利要求2所述。
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