CN118178655A - Rna解旋酶dhx33抑制剂在制备用于治疗骨肉瘤的药物中的应用 - Google Patents

Rna解旋酶dhx33抑制剂在制备用于治疗骨肉瘤的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗或者辅助治疗骨肉瘤的药物中的应用。本发明确立了DHX33蛋白在骨肉瘤发生发展中的重要作用，提供的DHX33抑制剂具有抑制DHX33解旋酶活力的作用，进而诱导癌细胞铁死亡。该DHX33抑制剂可以在体外和体内显著地抑制骨肉瘤细胞的生长，从而达到治疗骨肉瘤的目的，并因此具有重要的医药开发价值。

Description

RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗骨肉瘤的药物中的 应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地说，涉及RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗骨肉瘤的药物中的应用。
背景技术
骨肉瘤来源于间叶组织的原发性恶性骨肿瘤，是一种最常见的骨癌类型，发病率在原发性骨肿瘤中占第二位，通常发生在10至30岁的青少年或年轻人中，占儿童和青少年所有癌症病例的2％，男性居多。其好发部位为长骨干骺端，股骨远端和胫骨近端最多见。骨肉瘤恶性程度高，早期极易发生肺转移，经血液转移至肺，少数转移至脑、内脏、肾及经淋巴管至淋巴结，截肢后3～5年存活率仅为5～20％，预后较差。
骨肉瘤的致病机制尚未明确，部分与基因突变有关。最新研究发现，近70％的骨肉瘤患者可能出现肿瘤抑癌基因视网膜母细胞瘤基因Rb的突变，进而导致细胞的恶性增生。目前，骨肉瘤的治疗主要依赖手术。有条件的病例可作局部或广泛切除而保留肢体。由于骨肉瘤的恶性程度很高，对于已有内脏转移的骨癌晚期患者，或局部瘤体巨大、疼痛严重的情况，为了减少痛苦，通常只能作姑息性截肢。这种情况下，即使进行截肢术或关节离断术，并不能将癌细胞完全清除，会给骨肉瘤晚期患者带来巨大的身心痛苦。此时如果配合放射、化疗可减轻一些手术症状，稍微提高疗效，但都不能真正抑制癌细胞的再度转移和复发。在很大程度上增加了患者的经济负担、心理负担和身心痛苦。
化疗的兴起，使骨肉瘤5年生存率有了大幅度提高。骨肉瘤化疗中现在多采用以大剂量的氨甲蝶呤为主的化疗方案。经典化疗方案常有MTX、阿霉素、顺铂、IFO这四个药物联用。然而在药物使用中，MTX需要四氢叶酸的解毒，顺铂使用中需要水化保护肾功能，阿霉素要注意心脏毒性，在很大程度上增加了药物的副作用风险。根据调查，约30％的局限性骨肉瘤和80％的转移性骨肉瘤会复发，手术和化疗对复发性骨肉瘤的治疗意义有限。靶向药物治疗骨肉瘤肺转移是当前临床治疗的重要进展之一，展现了惊人的疗效，如果在早期使用靶向药物能够有效控制骨肉瘤的发展，抑制癌细胞生长，或实现转移灶完全切除，将会带来长远生存效益。目前大部分针对骨肉瘤的靶向药为多种络氨酸激酶的受体，比如靶向血管生长因子受体(VEGFR)，血小板衍生生长因子受体的药物安罗替尼、阿帕替尼、帕唑帕尼等。对部分骨肉瘤肺部发生转移的患者，采用阿帕替尼治疗效果显著；此外帕唑帕尼也针对部分患者有较好的效果。其他靶向药，比如安罗替尼、乐伐替尼、卡博替尼等针对一类患者会有较好的治疗效果。多种信号通路的靶向抑制剂，包括mTOR、SRC激酶家族的抑制剂，正在进行临床评估。目前整体针对复发难治性骨肉瘤缺乏有效药物，因此期待开发治疗骨肉瘤的新型靶向药物。
发明内容
有鉴于此，本发明目的是，提供RNA解旋酶DHX33抑制剂及其在制备用于治疗或者辅助治疗骨肉瘤的药物或组合物中的应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供了用于治疗或辅助治疗骨肉瘤的RNA解旋酶DHX33抑制剂。在本发明中，RNA解旋酶DHX33抑制剂(即DHX33蛋白抑制剂)为式Ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐或者前药中的至少一种：
本发明首次公开了DHX33蛋白质可以作为新靶点进行骨肉瘤的治疗，因此在第二方面，本发明提供了RNA解旋酶DHX33作为新型骨肉瘤治疗靶点的应用。还提供了RNA解旋酶DHX33作为一种新型的骨肉瘤病理组织诊断及检测标志物的应用。
第三方面，本发明提供了用于治疗或者辅助治疗骨肉瘤的靶向药物，其中所述药物的靶点是RNA解旋酶DHX33，该靶向药物可以抑制DHX33解旋酶的活力，进而影响由DHX33蛋白所调控的骨肉瘤癌细胞铁死亡过程。该靶向药物的有效成分为上式所示化合物或者其药学上可接受的盐或者前药中的至少一种。
在第四方面，本发明提供了上述RNA解旋酶DHX33抑制剂在抑制骨肉瘤细胞中脂肪酸代谢去饱和酶SCD1、FADS1或FADS2中的应用。
在第五方面，本发明提供了RNA解旋酶DHX33抑制剂作为由DHX33(DHX33基因)调控的骨肉瘤细胞铁死亡诱导剂的应用，即DHX33抑制剂可以快速诱导骨肉瘤癌细胞的铁死亡。铁死亡(ferroptosis)是铁离子依赖性的细胞死亡，是不同于细胞凋亡、细胞自噬的新型细胞死亡方式。脂肪酸代谢与细胞的铁死亡密切关联。脂肪酸代谢主要包括脂肪酸从头合成、脂肪酸氧化、脂肪酸的去饱和及加长而生成不同饱和程度和不同碳链长度的脂肪酸，其中，脂肪酸的去饱和酶主要包括：SCD1、FADS1、FADS2，而SCD1是其中的限速步骤酶。研究表明，脂肪酸代谢在癌症细胞中出现异常，很多癌症细胞有这几个脂肪酸去饱和酶的过表达。抑制SCD可以导致细胞质膜的脂类过氧化物生成，并进一步诱导细胞进入铁死亡。这一过程伴随铁离子的蓄积，是铁离子依赖的。
DHX33基因在NCBI上的参考序列编号为：NM_020162.4。
在第六方面，本发明提供了上述RNA解旋酶DHX33抑制剂在治疗或者辅助治疗骨肉瘤中的应用。
在第七方面，本发明提供了上述RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗或者辅助治疗骨肉瘤的药物或药物组合物中的应用。
在第八方面，本发明提供了上述RNA解旋酶DHX33抑制剂作为骨肉瘤治疗中的癌细胞铁死亡诱导剂的应用，其中，癌细胞铁死亡是DHX33解旋酶依赖型。本发明还提供了RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于诱导骨肉瘤癌细胞铁死亡的药物中的应用。
在本发明的实施方案中，RNA解旋酶DHX33抑制剂的摄入频率或剂量可以由医师根据个体的身体状况、年龄、性别、体重等因素来确定。在具体实施方案中，摄入频率范围可以是一天一次到三次。在本发明的实施方案中，RNA解旋酶DHX33抑制剂的摄入剂量需要保证药物的有效暴露量达到每天4000-7500ng·h/mL。在具体实施方案中，在小鼠中，RNA解旋酶DHX33抑制剂的口服剂量可以为25mg-300mg/kg一次，静脉注射剂量可以为每次2.5mg-25mg/kg。在具体实施方案中，在小鼠中，RNA解旋酶DHX33抑制剂的口服摄入剂量可以为每次例如35mg-290m/kg，45mg-280mg/kg，55mg-270mg/kg，65mg-260mg/kg，75mg-250mg/kg，85mg-240mg/kg，95mg-230mg/kg，105mg-220mg/kg，115mg-210mg/kg，125mg-200mg/kg，135mg-190mg/kg，145mg-180mg/kg，或155mg-170mg/kg。当通过静脉注射施用时，在小鼠中，RNA解旋酶DHX33抑制剂注射一次的剂量可以为例如3.0mg-24.5mg/kg、3.5mg-24mg/kg、4.0mg-23.5mg/kg、4.5mg-23mg/kg、5.0mg-22.5mg/kg、5.5mg-22mg/kg、6.0mg-21.5mg/kg、6.5mg-21mg/kg、7.0mg-20.5mg/kg、7.5mg-20mg/kg、8.0mg-19.5mg/kg、8.5mg-19mg/kg、9.0mg-18.5mg/kg、9.5mg-18mg/kg、10.0mg-17.5mg/kg、10.5mg-17.0mg/kg、11.0mg-16.5mg/kg、11.5mg-16mg/kg、12.0mg-15.5mg/kg、12.5mg-15.0mg/kg或13.0mg-14.5mg/kg。
本发明确立了DHX33蛋白在骨肉瘤发生发展中的重要作用，提供的DHX33抑制剂具有抑制DHX33解旋酶活力的作用，进而诱导癌细胞铁死亡。该DHX33抑制剂可以在体外和体内显著地抑制骨肉瘤细胞的生长，从而达到治疗骨肉瘤的目的，并因此具有重要的医药开发价值。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中代表性人类骨肉瘤癌组织相比于癌旁正常骨组织的DHX33蛋白表达量明显偏高。
图2为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂处理后的SJSA-1细胞半抑制浓度分析，化合物的半抑制浓度40nM。
图3为本发明较佳实施例中用紫杉醇处理SJSA-1细胞后的半抑制浓度分析，式Ⅰ所示化合物的半抑制浓度为1.5nM。
图4为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂处理后的U2OS细胞半抑制浓度分析，式Ⅰ所示化合物的半抑制浓度23nM。
图5为本发明较佳实施例中用紫杉醇处理U2OS细胞后的半抑制浓度分析，式Ⅰ所示化合物的半抑制浓度为16nM。
图6为本发明较佳实施例中用不同浓度的DHX33抑制剂处理的骨肉瘤细胞SJSA-1中脂质代谢去饱和酶基因的转录水平变化。
图7为本发明较佳实施例中沉默处理DHX33后骨肉瘤细胞SJSA-1中脂质代谢去饱和酶基因的转录水平变化。
图8为本发明较佳实施例中沉默处理DHX33后骨肉瘤细胞U2OS中脂质代谢去饱和酶基因的转录水平变化。
图9为本发明较佳实施例中SJSA-1细胞用DHX33抑制剂处理16h后的细胞活性氧(ROS)的定量分析图。
图10为本发明较佳实施例中U2OS细胞用DHX33抑制剂处理16h后的细胞活性氧(ROS)的定量分析图。
图11为本发明较佳实施例中SJSA-1细胞用DHX33抑制剂处理16h后的细胞亚铁离子(Fe2+)的定量分析图。
图12为本发明较佳实施例中U2OS细胞用DHX33抑制剂处理16h后的细胞亚铁离子(Fe2+)的定量分析图。
图13为本发明较佳实施例中SJSA-1细胞用DHX33基因沉默处理后的细胞活性氧(ROS)的定量分析。
图14为本发明较佳实施例中U2OS细胞用DHX33基因沉默处理后的细胞活性氧(ROS)的定量分析。
图15为SJSA-1细胞用DHX33基因沉默处理后的脂类过氧化物(LPO)的定量分析。
图16为本发明较佳实施例中U2OS细胞用DHX33基因沉默处理后的谷胱甘肽(GSH)定量分析图。
图17为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂处理后的U2OS细胞克隆生长分析结果.
图18为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂处理后的SJSA-1软琼脂实验-悬浮独立生长分析结果。
图19为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂处理SJSA-1与U2OS细胞后相关的蛋白表达结果。
图20为本发明实施例中DHX33抑制剂对人骨肉瘤SJSA-1小鼠荷瘤模型中癌症生长曲线(肿瘤体积)分析。
图21为本发明实施例中DHX33抑制剂对人骨肉瘤SJSA-1小鼠荷瘤模型中终点肿瘤重量的比较分析。
图22为DHX33抑制剂抑制人骨肉瘤SJSA-1小鼠荷瘤模型实验中各组小鼠的体重监测分析。
图23为DHX33抑制剂抑制人骨肉瘤SJSA-1小鼠荷瘤模型实验终点肿瘤大小的图片拍照。
图24为DHX33抑制剂抑制人骨肉瘤SJSA-1小鼠荷瘤生长后分析的小鼠肿瘤组织的免疫组织化学(HE染色剂Ki67染色)的代表性图片。
图25为DHX33抑制剂抑制人骨肉瘤SJSA-1小鼠荷瘤生长后分析的小鼠肿瘤组织的Ki67染色指数。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
1.细胞培养
人骨肉瘤细胞株SJSA-1、U2OS等购自武汉普诺赛生命科技有限公司。SJSA-1细胞用RPMI-1640培养基培养，其含有10％胎牛血清(FBS)、2mML-谷氨酰胺、非必须氨基酸和链霉素、青霉素。培养U2OS所用的完全培养基是添加了10％胎牛血清(FBS)、2mML-谷氨酰胺、非必须氨基酸和链霉素、青霉素的Meccoy’s 5A培养基。细胞培养条件为37℃的二氧化碳培养箱，湿度60-70％。
2.实时定量PCR
为了分析DHX33蛋白促进骨肉瘤细胞生长的分子机理，使用定量PCR(SYBRgreensupermix(Bio-Rad))分析骨肉瘤细胞中重要基因的表达变化。将待分析的细胞以合适的密度铺到6孔板，第二天将适当浓度的式Ⅰ所示化合物加入培养基，化合物处理细胞的时间为16h，然后收获细胞，提取RNA。之后对RNA样本进行定量PCR分析。待分析的目的基因为FADS1、FADS2和SCD。引物均由(https://sg.idtdna.com/site)在线“realtimePCRtool”设计，购自BGI(深圳)公司。
针对人体细胞中参与细胞铁死亡基因的引物序列如下文表1所示(所有引物都按5'-3'方向)：
表1.参与细胞铁死亡基因的引物序列
引物名称 序列
H3.3-Forward TGTGGCGCTCCGTGAAATTAG
H3.3-Reverse CTGCAAAGCACCGATAGCTG
SCD-Forward CCTGGTTTCACTTGGAGCTGTG
SCD-Reverse TGTGGTGAAGTTGATGTGCCAGC
FADS1-Forward CTGTCGGTCTTCAGCACCTCAA
FADS1-Reverse CTGGGTCTTTGCGGAAGCAGTT
FADS2-Forward TGCAACGTGGAGCAGTCCTTCT
FADS2-Reverse GGCACATAGAGACTTCACCAGC
3.细胞半抑制浓度IC50值测定
将骨肉瘤细胞株SJSA-1、U2OS细胞以1×104个细胞/100μL/孔铺到96孔板上，等待细胞贴壁完全，将式Ⅰ所示化合物以19nM、39nM、78nM、156nM、312nM、625nM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM的浓度添加到细胞培养基中，用多通道排枪混合均匀。待化合物和细胞的孵育时间达到72h后，用CCK-8试剂(上海翊圣生物科技有限公司)按照标准流程添加到96孔板的培养基中，孵育1h后，用酶标仪读板(OD450nm)，并绘制化合物在不同浓度下的抑制曲线(如图2-5所示)，计算化合物的细胞半抑制浓度(IC50)。图中曲线的纵坐标是细胞活度指数，横坐标是化合物浓度(μM)的LOG10值。
4.免疫组化分析
骨肉瘤组织切片均来自上海交通大学医学院附属第九人民医院张陈平教授团队，共有89张切片，进行免疫组化(IHC)染色处理。具体而言，将组织在组织透明脱蜡液(索莱宝生物技术有限公司)中脱石蜡并在一系列梯度浓度乙醇中再水合。加入Tris-EDTA浸泡，放入蒸锅中蒸40min呈现抗原。然后将组织浸泡在3％H2O2溶液中以灭活内源性过氧化物酶。在室温下用10％FBS封闭1h后，向组织加入DHX33抗体，4℃孵育过夜。次日用5％FBS-PBS洗涤组织芯片5次，滴入鼠兔二抗覆盖组织芯片，湿盒内孵育30min；用PBS缓冲液将二抗洗去；按1:50稀释DAB显色试剂,滴加到组织芯片中，染色5min后用纯水洗净；滴入苏木素染色液，染色2min，用PBS缓冲液清洗，将组织芯片擦干，滴加胶水后，使用盖玻片封片；通过显微镜观察到：DHX33蛋白在人类骨肉瘤组织中发生高表达(图1中染色的暗色区域)。
5.活性氧(ROS)检测
将癌细胞株SJSA-1、U2OS细胞以1×105个细胞2ml/孔铺到6孔板上，等待细胞完全贴壁，将式Ⅰ所示化合物以不同的浓度添加到培养基中，利用活性氧荧光法检测试剂盒(Elabscience公司)中提供的阳性(Positive)参考(铁死亡诱导剂作为阳性参考)。待化合物孵育时间达到16h后，用活性氧荧光法检测试剂盒进行活性氧检测，设置3个复孔，试剂DCFH-DA经过一系列的化学反应成为不能透过细胞膜的荧光物质DCF，用多功能酶标仪(PerkinElmer)绘制化合物在不同浓度下的活性氧含量的柱状图，通过OD值分析癌细胞的活性氧情况。DHX33抑制剂能够增加ROS含量，从而损害细胞甚至诱导细胞死亡。
6.细胞亚铁离子检测(Fe2+)
将细胞用胰蛋白酶消化后，低速离心(4℃，1200rpm)5min收集细胞，加入300-500μL的PBS(0.01M，pH7.4)，进行超声破碎，于4℃条件下高速离心，10000×g离心10min，取上清置于冰上待测，留取部分上清用于蛋白浓度测定。根据细胞亚铁比色法检测试剂盒(购自Elabscience公司)的流程进行亚铁离子检测，用酶标仪读板(OD590nm)，根据绘制的亚铁离子标准曲线计算细胞样本的亚铁离子含量。
7.脂质过氧化物(LPO)
将细胞用胰蛋白酶消化后，低速离心(4℃，1200rpm)5min收集细胞，加入300-500μL的PBS(0.01M，pH 7.4)，进行超声破碎，于4℃条件下高速离心，10000×g离心10min，取上清置于冰上待测，留取部分上清用于蛋白浓度测定。根据脂质过氧化物比色法检测试剂盒(购自Elabscience公司)说明书进行脂质过氧化物含量的检测，用酶标仪读板(OD590nm)，通过LPO的标准曲线测定LPO在细胞样本的含量，经过总蛋白校准后计算LPO含量。
8.还原性谷胱甘肽(GHS)
使用PBS缓冲液对细胞清洗一遍，用细胞刮刮下细胞后加入2～5ml的PBS缓冲液，收集于1.5ml的EP管中，4℃离心10min(1000xg)，按照1x106个细胞加入300～500μl磷酸缓冲液，用超声破碎仪(宁波新芝)使细胞充分破碎，4℃离心10min(1500×g)。取0.1ml上清液，加入0.1ml原性谷胱甘肽比色法检测试剂盒(Elabscience公司)中的试剂一，混匀，离心10min(4500×g)，取100μl上清液，加入试剂盒中的试剂二，酶标仪振板1min，静置5min，用酶标仪在450nm处测OD值，并分析结果。制备样本检测前，需要留取部分样本用于蛋白浓度测定，根据还原性谷胱甘肽比色法检测试剂盒(Elabscience公司)的使用流程进行还原性谷胱甘肽含量的检测，用酶标仪读板(OD405nm)，按蛋白浓度计算GSH含量。
9.软琼脂试验
将1.0×104个SJSA-1细胞与4.0mL含0.3％琼脂和10％FBS的RPMI-1640培养基混合，并加在基础琼脂上(4.0mL凝固的含0.6％琼脂和10％FBS的RPMI-1640培养基)；同样将1.0×104个U2OS细胞与4.0mL含0.3％琼脂和10％FBS的Meccoy’s 5A培养基混合，并加在基础琼脂上(4.0mL含0.6％琼脂和10％FBS的凝固Meccoy’s 5A培养基)。将平板在37℃下孵育14天，观察细胞三维克隆生长情况，并拍照记录统计细胞团。
10.细胞的克隆生长(Foci)
将2.0×103个细胞用10.0mL添加或者不添加RNA解旋酶DHX33抑制剂的完全培养基培养(100mm细胞培养皿)，在37℃的二氧化碳培养箱种培养，每周更新培养基。观察细胞克隆生长情况，2-3周后，待细胞克隆长到足够大小，使用吉姆萨染色(Geimsa staining)，拍照记录统计。
11.小鼠异种移植模型
所有小鼠实验均遵循广东省实验动物操作标准指南。SPF级别的Balb/cNude雌性小鼠购自浙江维多利华实验动物有限公司并接受标准的机构护理。待接种的细胞用胰蛋白酶消化并用PBS重悬至终浓度为每毫升1×108个细胞。对6周龄裸鼠(Balb/c)小鼠进行皮下注射，沿其侧翼注射1×107个细胞。待肿瘤生长到一定大小，小鼠经药物处理一段时间后，处死小鼠并解剖肿瘤进行拍照。
12.蛋白质印迹分析
用添加有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Thermo Fisher)的RIPA缓冲液裂解细胞。在冰上裂解5min后，通过超声处理进一步破坏细胞裂解物。然后将全细胞提取物进行SDS-PAGE凝胶电泳，每个样品的加载量为50μg蛋白质。然后将蛋白质转印到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。将蛋白膜在5％脱脂奶中封闭30min，用1×TBST稀释DHX33一抗，使之与膜在4℃孵育过夜。次日将膜用1×TBST缓冲液冲洗3次，使用兔二抗孵育2h。用ECL试剂盒(Thermo Fisher)显示印迹。使用的一抗如下：抗GAPDH，Absin(abs830030)；抗DHX33，上海优宁维生物科技股份有限公司(bethyl)；抗FADS2，ABclonal(A10270)。
13.慢病毒生产
为了研究DHX33在骨肉瘤中的作用，本发明使用慢病毒介导的shRNA以沉默DHX33信使RNA。本发明用质粒pLKO.1(BiovectorInc.)构建慢病毒载体，所述shRNA序列的基因通过限制酶切位点AgeI/EcoRI克隆到pLKO.1载体中。在sh-DHX33添加限制酶切位点AgeI/EcoRI，通过华大基因公司合成以下DNA序列：
sh-DHX33-前寡核苷酸：
5-CCGGGCTATCGCAAAGTGATCATTTCTCGAGAAATGATCAC TTTGCGATAGCTTTTTG-3’；
sh-DHX33-后寡核苷酸：
5’-AATTCAAAAAGCTATCGCAAAGTGATCATTTCTCGAGAAAT GATCACTTTGCGATAGC-3’。
然后，将上述序列的RNA序列克隆到pLKO.1载体的限制酶切位点AgeI/EcoR中。得到具有敲低DHX33蛋白表达水平作用的慢病毒，所述慢病毒中含有上述慢病毒质粒。对照组：作为对照的小RNA(shScrambled)序列为：5’-CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG-3’。
本发明还提供所述慢病毒的制备方法，包括以下步骤：用Lipofectamine 2000(Life Technologies)脂质体导入法在293T细胞中转染质粒混合物。具体操作方法是，采用直径为10cm的细胞培养皿做转染，待293T细胞生长到90％的融合度时，将下述质粒混合，包括pLKO.1-shRNA(即上述慢病毒质粒)、pCMV-VSV-G、pCMV-dR8.2 dvpr，质粒按照合适比例进行转染。其中，载体pLKO.1、pCMV-VSV-G、pCMV-dR8.2 dvpr购自Biovector Inc公司。经过16-18h更换成含有抗生素(盘尼西林和链霉素)的培养基，再过24h或48h，用无菌移液管收集细胞培养基，1000rpm离心2min，将病毒分装于5mL的无菌离心管中，存放于-80℃冰箱。
实施例1.DHX33蛋白在骨肉瘤组织中高效表达
在本实施例中，采用免疫组织化学分析DHX33蛋白在人骨肉瘤癌组织中的表达。
首先将石蜡包埋的组织芯片在60℃烘箱中孵育30min，然后迅速在组织透明脱蜡液中脱石蜡，并在一系列乙醇浓度(100％、95％、70％、50％和25％)逐渐降低的溶液中逐渐水合(每次轻轻摇动5min，每个浓度的乙醇溶液重复处理一次)，在蒸馏水中继续水合10min。然后在蒸汽器中用50mM的Tris盐酸缓冲液(pH 9.0)呈现抗原，蒸汽加热40min，随后冷却到室温。然后将组织在含3％H2O2的甲醇溶液中孵育以灭活内源性过氧化物酶。在室温下用10％FBS封闭1h后，将组织与一抗在4℃孵育过夜。次日用5％FBS-PBS洗涤组织芯片5次，滴入鼠兔二抗覆盖组织芯片，湿盒内孵育30min；用PBS缓冲液将二抗洗去；按1:50稀释DAB显色试剂，滴加到组织芯片中，染色5min后用纯水洗净；滴入苏木素染色液，染色2min，用PBS缓冲液清洗，将组织芯片擦干，滴加胶水后，使用盖玻片封片；通过显微镜观察到DHX33蛋白在人类骨肉瘤组织中发生高表达(图1中染色的暗色区域)。
下文的表2同时提供了针对89例骨肉瘤癌组织的数据，从这个统计数据可见，有大于30％的病理组织的DHX33蛋白高效表达。从病理切片的分析结果看，非肿瘤组织区域和正常组织中DHX33表达较低。
表2.89例骨肉瘤及癌旁组织的免疫组织数据，一抗：抗DHX33(Santa CruzBiotech.Inc)
评分原则：依据病理切片中DHX33蛋白染色强度和阳性表达占比评定阳性等级和得分。评分有两部分构成：DHX33蛋白表达强阳性为3分，蛋白表达中等为2分，DHX33蛋白表达弱阳性为1分；总体阳性比率占比大于50％为3分，阳性比率在25％-50％之间为2分，阳性比率小于25％为1分。总体评分为DHX33蛋白阳性得分与阳性比率得分之和。设定1-3分为阴性，4-6分为阳性。
实施例2.DHX33抑制剂可以有效抑制骨肉瘤细胞的生长增殖
为了分析DHX33蛋白对骨肉瘤细胞的抑制作用，我们用DHX33抑制剂来处理不同的人骨肉瘤细胞。我们分别对两种代表性骨肉瘤细胞株SJSA-1、U2OS开展抑制剂的细胞抑制性试验。如图2、图4所示，DHX33抑制剂对前述的两种不同的骨肉瘤细胞均具有纳摩尔级别的细胞抑制性，而且细胞的抑制曲线显示下降幅度均可以超过50％。图3及图5分别用了化疗药紫杉醇作为对照。除了细胞的半抑制浓度之外，我们也进行了细胞的克隆生长的测试分析，其具体方法如前所述，我们选择代表性骨肉瘤U2OS细胞开展实验。在采用20nM的浓度下，我们发现DHX33抑制剂均可以显著抑制骨肉瘤细胞U2OS的生长(图17)。除了细胞二维培养体系的分析之外，我们也在三维细胞培养体系中分析DHX33抑制剂对骨肉瘤细胞的抑制性，这个实验是在软琼脂体系中开展的，如前所述。悬浮独立生长是癌细胞的一个主要特征，在DHX33抑制剂(40nM)的处理下，我们发现骨肉瘤细胞SJSA-1几乎完全丧失了在软琼脂中进行悬浮独立生长的能力，不能形成聚集性增殖或者克隆(图18)。以上实验的结果表明，DHX33抑制剂对骨肉瘤细胞具有显著的抑制作用。
实施例3.DHX33抑制剂可以调控骨肉瘤细胞中的脂肪酸代谢酶——脂肪酸去饱和酶的表达
细胞生长离不开细胞膜的合成，尤其在癌细胞中，膜生成效率显著提高。研究表明，脂肪酸代谢对癌细胞的增殖至关重要。在多种癌细胞中，脂肪酸的合成异常活跃，尤其是细胞中脂肪酸的一些重要调控酶，例如脂肪酸去饱和酶，例如SCD1、FADS1、FADS2，都有高表达现象。为了分析DHX33抑制剂是否可以调控这些重要基因的表达，我们对DHX33抑制剂处理的细胞进行了实时定量PCR分析。对SJSA-1、细胞用DHX33抑制剂进行了不同浓度的处理，即0nM、40nM、80M，从细胞中提取总RNA后，用逆转录酶转换成其互补DNA分子，利用实时定量PCR技术，用这些DNA作为模板分析上述各种基因的转录本水平，引物的序列如前述。如图6所示，在DHX33受到抑制的SJSA-1细胞内，我们发现几个参与脂肪酸代谢的酶，特别是脂肪酸合成中的限速步骤酶SCD1和FADS，发生了基因表达的下调。我们也分析了DHX33基因缺失后的骨肉瘤细胞中上述基因的转录本表达水平的变化，如图7和图8所示，在两种骨肉瘤细胞中，DHX33的缺失可以下调脂肪酸代谢酶SCD和FADS的表达。
实施例4.DHX33抑制剂可以诱导骨肉瘤细胞的铁死亡
铁死亡，最早于2012年由Scott J Dixon提出，是一种铁依赖的区别于细胞凋亡、细胞坏死和细胞自噬的新的细胞程序性死亡模式，具有铁死亡特征的细胞死亡的报道可以追溯到上世纪50年代。铁死亡的敏感性与许多生物过程紧密相关，例如，与多不饱和脂肪酸代谢有密切关联。近期数据指向铁死亡中磷脂/脂质过氧化是主要的发生因素。所以多不饱和脂肪酸的代谢与癌细胞铁死亡的特殊敏感性密切关联。前期研究中也发现SCD1、FADS等基因的表达可以保护癌细胞免受铁死亡的影响。而我们已经发现DHX33促进骨肉瘤细胞中多种重要的脂肪酸去饱和酶的高表达，DHX33抑制剂处理后的癌细胞其FADS1、FADS2表达降低，所以这些基因的表达下调可能会诱导癌细胞的铁死亡。为了分析有关DHX33抑制剂是否引发骨肉瘤细胞的铁死亡相关通路，我们开展几个代表性的分析测试。
首先，在铁死亡途径中，标志性的物质是活性氧(ROS)的指标有显著的上升。我们用化合物处理SJSA-1和U2OS细胞，首先用不同剂量的化合物，处理骨肉瘤细胞16h，与阳性参照对比，我们发现按照同等数量的癌细胞计算，DHX33抑制剂可以显著诱导ROS的生成(图9和图10)。
铁死亡途径主要依赖于铁离子的积累，所以我们继续分析了DHX33抑制剂处理16h的亚铁例子的含量。在这个实验中，我们使用了亚铁离子的检测试剂盒(ELABSCIENCE)，如图11和图12所示，用化合物处理SJSA-1和U2OS细胞16h后，亚铁例子的水平有显著的提高，这个分析是在比较等量的总细胞蛋白量的水平上进行的。由此得出结论，DHX33抑制剂可以诱导铁离子的累计，进而导致细胞的铁死亡。
为了验证DHX33基因缺失可以引起类似的结果，我们继续在两种骨肉瘤细胞中做了DHX33基因的敲低，进而分析上述的几种铁死亡指标。首先在SJSA-1和U2OS细胞中，我们进行了DHX33基因的敲除，然后分析DHX33基因沉默后的细胞活性氧含量。如图13和图14所示，DHX33缺失后同样可以引起活性氧含量的升高。我们进一步分析了骨肉瘤细胞在敲除DHX33后，细胞中的脂类过氧化物LPO和还原性谷胱甘肽(GSH)的含量，结果如图15和图16所示，DHX33沉默后LPO含量增高，而GSH的水平有显著的降低。这些指标进一步验证了DHX33缺失或者被抑制后可以触发癌症细胞的铁死亡。
实施例5.DHX33调控人骨肉瘤细胞参与铁死亡途径的蛋白表达
我们在两种骨肉瘤细胞中，用DHX33蛋白的抑制剂处理后，收集总细胞裂解液，然后分析DHX33抑制剂处理后的细胞中参与铁死亡途径的几种蛋白表达情况。用免疫印迹技术分析DHX33蛋白在各个样品中的表达量，GAPDH作为内参。
结果如图19所示，发现在U2OS和SJSA细胞中，DHX33抑制剂可以下调参与铁死亡通路的几个基因的蛋白表达，对SCD1和FADS的影响更明显，而对SLC3A2、SLC7A11、GPX4的影响很小。这个结果说明DHX33主要通过影响细胞的脂类代谢进而影响细胞的的铁死亡过程。
实施例6.DHX33抑制剂在体内可以有效抑制骨肉瘤细胞的生长和增殖
1、动物信息
种属及品系：Balb/cNude小鼠。
性别及周龄：雌性，6周龄。
体重：18-22g，偏差约为体重均值的±20％。
接种动物数：6只。
动物来源：浙江维通利华实验动物技术有限公司。
2、动物饲养
居住条件：SPF环境，IVC小鼠笼，每笼3只。
温度：20-26℃。
湿度：40-70％。
光照：12h昼夜交替。
饲料：辐照大小鼠饲料，购自北京科澳协力饲料有限公司，自由进食。
饮用水：城市自来水，经过滤、高压灭菌后饮用。
垫料：玉米芯，购自北京科澳协力饲料有限公司，经高压灭菌后使用，每周更换一次。
适应性饲养：实验前给予小鼠不低于7天的适应性饲养期。
动物识别：每个鼠笼均挂有实验信息标示卡，其中包括小鼠信息、细胞接种信息、动物实验信息及实验人员信息等，小鼠用耳标法进行标记。
所有实验动物的操作和管理均严格遵守实验动物使用和管理指导原则。
3、溶媒处方及给药溶液储存条件
静脉注射用化合物样品的制备：用PEG300溶解式I所示化合物，然后加入Tween 80和ELP，混合为均一溶液后，再加入无菌生理盐水配成澄清的溶液，最终的化合物浓度为0.5mg/ml，各物质的比例为：8％PEG300、2％Tween 80、90％生理盐水。药物制剂澄清后，用于小鼠腹腔静脉注射，注射剂量为40mg/kg。按照每只小鼠的给药量小规模分装，避光放在-20度冰箱中。药物保存7天，对小鼠按一天BID、一天TID交替往复给药共7天。BID给药每次间隔5个小时、TID给药隔4个小时一次。使用当日，将分装的化合物放在室温融化。
4、实验设计
实验设计如表3所示：
表3.受试物对人骨肉瘤SJSA-1Balb/c裸鼠异种移植瘤生长抑制作用研究方案
注：IP物表示腹腔注射，BID表示一天两次，TID表示一天三次，Vehicle表示溶媒组。
5、实验方法
(1)模型建立
将SJSA-1细胞培养于含10％FBS的RPMI-1640培养基，维持在含5％CO2的37℃饱和湿度培养箱中。收集对数生长期细胞，调整细胞浓度至每毫升5×107个细胞。在无菌条件下，接种0.1mL细胞悬液至小鼠右侧背部皮下。
(2)分组及给药观察
在肿瘤平均体积达到250mm3时，将动物按肿瘤体积随机分组，使各组肿瘤体积差异小于均值的10％，分组当日记为第0天，并按照动物体重开始给药。给药期间，每周2次测定动物体重，每日观察记录动物临床症状。个别动物体重如果与第0天相比下降超过15％(BWL≥15％)，将做停药处理，直至动物体重恢复后(BWL<15％)，恢复给药。小鼠体重及肿瘤大小监测如表4所示：
表4.DHX33抑制剂给药组和对照组受试物的体重及肿瘤影响数据
实验终点：最后一次称量结束后，断颈处死动物，取瘤称重并拍照记录。
从图20可以看出，DHX33抑制剂处理后的小鼠肿瘤，与对照组相比，有明显的抑制现象。对照组和实验组小鼠在起始时间点(即开始分组，化合物处理之前)的肿瘤平均体积都是265m3左右，但在7天药物处理之后，肿瘤的增长指数对照组明显大于给药组小鼠。因为SJSA-1肿瘤生长非常快速，分组给药后7天，溶媒组已经达到实验终点。
获取肿瘤后，我们分析了给药组和溶媒组肿瘤重量的统计学差异。如图21所示，二组样本具有显著的统计学差异，P＝0.0225，可以看到两组肿瘤的重量有显著差异。与对照组相比，小鼠的行为和体重基本正常，虽然给药组小鼠有一定的体重降低(图22)。终点收获的各组小鼠的肿瘤图片如图23所示。进一步分析肿瘤增生指数，用细胞增生标志物Ki-67的免疫组织化学染色，同时对比了苏木精伊红染色的结果，代表性图片如图24所示。对Ki-67阳性的比率进行统计分析的数据如图25所示，药物处理后的骨肉瘤组织的增生指数明显降低，二组间差异明显。
以上实验数据表明，本发明中DHX33抑制剂对人骨肉瘤细胞具有显著的体内和体外抑制性，并且在使用的剂量范围内，没有看到对个体有明显毒副作用，可以作为治疗人骨肉瘤的一种新型的治疗手段。

Claims (7)

1.RNA解旋酶DHX33作为骨肉瘤治疗新型靶点的应用。
2.RNA解旋酶DHX33作为一种新型的骨肉瘤病理组织的诊断及检测标志物的应用。
3.用于治疗或辅助治疗骨肉瘤的DHX33抑制剂，其特征在于，所述抑制剂为下式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐：
4.RNA解旋酶DHX33抑制剂在抑制骨肉瘤细胞中脂肪酸代谢去饱和酶SCD1、FADS1或FADS2中的应用。
5.RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗或者辅助骨肉瘤的药物或者药物组合物中的应用，其特征在于所述抑制剂如权利要求3所述。
6.RNA解旋酶DHX33抑制剂作为骨肉瘤治疗中的癌细胞铁死亡诱导剂的应用，其中，所述癌细胞是DHX33解旋酶依赖型，所述RNA解旋酶DHX33抑制剂如权利要求3所述。
7.DHX33抑制剂在制备快速诱导骨肉瘤癌细胞铁死亡的药物中的应用，其中所述RNA解旋酶DHX33抑制剂如权利要求3所述。
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