CN115819606A - 一种具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体及其制备方法与应用,为修饰有鼠李糖衍生物的EGFR×HER2双特异性纳米抗体。制备步骤如下:1)化学合成含Rha基团的衍生物;2)构建EGFR×HER2双特异性纳米抗体表达菌株,发酵纯化获得EGFR×HER2双特异性纳米抗体;3)采用酶连手段对双特异性纳米进行Rha衍生物修饰,获得具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体。Fc免疫活性包括Fc介导的ADCC、ADCP和CDC作用及Fc介导的半衰期延长作用。本发明具备更低的脱靶风险和显著提升的抗肿瘤活性,可应用于EGFR和HER2双阳的鳞状细胞癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌等恶性肿瘤的治疗。
Description
技术领域
本发明属于抗体工程技术领域,具体涉及一种具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体及其制备方法和应用。
背景技术
EGFR和HER2是属于受体酪氨酸激酶ErbB家族的跨膜糖蛋白,它们的信号通路参与细胞增殖、迁移和分化等多种细胞进程。EGFR或HER2的过表达现象已在鳞状细胞癌、乳腺癌、肺癌和结直肠癌等多种恶性肿瘤中发现,且被证实与患者的不良预后相关。特别地,由于耐药性的出现、脱靶风险以及无法同时阻断EGFR和HER2信号激活,EGFR/HER2共同表达肿瘤患者对标准单特异性抗体(如针对EGFR或HER2的单克隆抗体)的临床反应降低。
因此,有必要开发针对EGFR和HER2抗原的双特异性抗体,以提高对EGFR/HER2共同表达肿瘤患者的治疗效果。
以纳米抗体为基础的“双特异性纳米抗体”是双特异性抗体家族的重要成员,其具备分子量小(~30kDa)、稳定性和水溶性好、组织渗透性强、易于进行生产和工程改造等特点。然而,双特异性纳米抗体缺乏传统抗体的Fc端,无法发挥传统抗体的Fc免疫活性,具体表现为:1)不能激活包括抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、抗体依赖细胞介导的细胞吞噬作用(ADCP)、补体依赖的细胞毒作用(CDC)在内的多种效应作用的能力;2)不能与新生儿Fc受体(FcRn)作用,半衰期极短。最终导致这些双特异性纳米抗体(特别是结合位点为同一细胞表面不同抗原或表位的双特异性纳米抗体)的抗肿瘤活性有限。目前,通过融合表达抗体Fc端可有效解决上述问题,但该策略往往会加重下游纯化步骤及成本,并引发潜在的免疫原性问题。
基于此,利用其他策略开发具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体,具有重要意义。
发明内容
发明目的:为了克服现有技术中存在的不足,本发明提供一种具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体,具体的为一类Rha修饰的EGFR×HER2双特异性纳米抗体,以克服双特异性纳米抗体无法发挥Fc免疫活性这一问题,此外使得该具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体的抗肿瘤活性明显优于相应的具有Fc免疫活性的EGFR单特异性纳米抗体、具有Fc免疫活性的HER2单特异性纳米抗体及两者的混合物。本发明的另一目的,是提供该具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体的制备方法及其应用。
技术方案:为了实现上述发明目的,本发明采用的技术方案为:
本发明的第一个目的是,提供一种具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体,该具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体为修饰有鼠李糖衍生物(本文中其他地方也称作Rha衍生物)的EGFR×HER2双特异性纳米抗体。
进一步的,所述EGFR×HER2双特异性纳米抗体,包含一种可识别肿瘤抗原EGFR胞外域的纳米抗体和一种可识别肿瘤抗原HER2胞外域的纳米抗体。
进一步的,所述EGFR×HER2双特异性纳米抗体为融合蛋白。
更进一步的,所述融合蛋白由可识别肿瘤抗原EGFR胞外域的纳米抗体和可识别肿瘤抗原HER2胞外域的纳米抗体通过柔性连接臂进行连接融合形成。
进一步的,所述Rha衍生物,包含可与双特异性纳米抗体反应的寡聚甘氨酸(Gm,m为1-5的正整数)。
进一步的,所述鼠李糖衍生物(Rha衍生物)的分子式为:
其中,n为1-12的正整数,m为1-5的正整数。
更进一步的,所述Rha衍生物的分子式包括但不限于:
进一步的,所述具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体的分子式为:
更进一步的,所述具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体选自以下(1)~(3)任一种:
(1)EGFR×HER2双特异性纳米抗体的氨基酸序列如Seq ID No.1所示,鼠李糖衍生物结构为:修饰位点为双特异抗体的C端,该具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体可表述为其中表示EGFR×HER2双特异性纳米抗体。
(2)EGFR×HER2双特异性纳米抗体的氨基酸序列如Seq ID No.1所示,鼠李糖衍生物结构为:修饰位点为双特异抗体的C端,该具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体可表述为:其中表示EGFR×HER2双特异性纳米抗体。
(3)EGFR×HER2双特异性纳米抗体的氨基酸序列如Seq ID No.1所示,鼠李糖衍生物结构为:修饰位点为双特异抗体的C端,该具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体可表述为:其中表示EGFR×HER2双特异性纳米抗体。
本发明的第二个目的是,提供一种具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体的制备方法,所述具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体由EGFR×HER2双特异性纳米抗体经鼠李糖衍生物修饰所得。
进一步的,所述鼠李糖衍生物通过酶连手段修饰到EGFR×HER2双特异性纳米抗体上。
进一步的,酶连手段的过程如下所示:
进一步的,采用Sortase A(SrtA)酶介导的连接反应技术对EGFR×HER2双特异性纳米抗体7D12-C7b进行Rha衍生物修饰的具体反应进程包括:在反应装置中,加入含Rha衍生物(5-100当量)的溶液、含EGFR×HER2(1当量)双特异性纳米抗体的溶液、含SrtA或SrtA突变体(0.01-0.5当量)的溶液、SrtA(或SrtA突变体)反应缓冲液(10×),并用超纯水将反应体系补足至反应缓冲液(10×)体积的10倍,混匀后,4-37℃、摇晃反应0.05-12h。
更进一步的,采用Sortase A(SrtA)酶介导的连接反应技术对EGFR×HER2双特异性纳米抗体7D12-C7b进行Rha衍生物修饰的具体反应进程包括:离心管中加入含50mmol/LRha衍生物的DMSO溶液10μL、含50μmol/L EGFR×HER2双特异性纳米抗体的溶液400μL、含50μmol/L增强型SrtA(eSrtA)的溶液100μL、含eSrtA反应缓冲液(10×)100μL,并用超纯水将反应体系补足至1mL,混匀后,将离心管置于摇床,16℃、200rpm反应2-4h。
进一步的,所述EGFR×HER2双特异性纳米抗体的制备方法包括:通过融合PCR技术获得EGFR×HER2双特异性纳米抗体的表达菌株,再经亲和层析纯化得到双特异性纳米抗体,所述纯化的方法具体包括:通过在蛋白质C末端添加组氨酸标签进行亲和层析。
进一步的,一种制备上述具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体方法,步骤如下:
1)化学合成Rha衍生物;
2)通过融合PCR技术获得EGFR×HER2双特异性纳米抗体的表达菌株;
3)采用亲和层析纯化得到EGFR×HER2双特异性纳米抗体;
4)通过温和的酶连手段或化学手段将Rha衍生物修饰到EGFR×HER2双特异性纳米抗体上;
5)脱盐除去多余的Rha衍生物,获得具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体。
进一步的,本发明表达用宿主优先原核宿主大肠杆菌。
进一步的,本发明优选的蛋白纯化方法为通过在蛋白质C末端添加组氨酸标签进行亲和层析。
本发明的第三个目的是,提供所述的改良型双特异性纳米抗体,或所述的方法,在抗体工程技术领域或肿瘤治疗领域的应用。包括构建其他具有Fc免疫活性的双特异性抗体,对EGFR/HER2双阳性的鳞状细胞癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌等恶性肿瘤进行治疗。
有益效果:与现有技术相比,本发明:
1)通过温和的手段成功赋予了EGFR×HER2双特异性纳米抗体Fc免疫活性,主要包括以下两个方面:a)可将抗鼠李糖抗体招募至靶细胞表面,从而介导ADCC、ADCP、CDC等免疫功能对靶细胞进行杀伤;b)具备更长的血浆半衰期。
2)由于利用的是机体自身的天然抗体,从而避免了潜在的毒性和免疫原性。
3)本发明具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体具备比具有Fc免疫活性的EGFR单特异性纳米抗体、具有Fc免疫活性的HER2单特异性纳米抗体、及这两种具有Fc免疫活性的单特异性纳米抗体的混合物更低的脱靶风险和更显著抗肿瘤活性。
附图说明
图1:Rha衍生物G3-PEG1-Rha的核磁表征。(A)1H谱;(B)13C谱。
图2:Rha衍生物G3-PEG3-Rha的核磁表征。(A)1H谱;(B)13C谱。
图3:Rha衍生物G3-PEG6-Rha的核磁表征。(A)1H谱;(B)13C谱。
图4:EGFR×HER2双特异性纳米抗体7D12-C7b的表征。(A)7D12-C7b的SDS-PAGE结果,其中泳道M为标准蛋白Marker,泳道1为纯化后的7D12-C7b;(B)7D12-C7b的蛋白质谱结果。
图5:酶连反应表征。EGFR×HER2双特异性纳米抗体7D12-C7b与Rha衍生物的酶连反应结果,其中泳道M标准蛋白Marker,泳道1为纯化后的7D12-C7b,泳道2、4、6分别为与磁珠结合的样品,泳道3、5、7分别为收集的酶连粗产物。
图6:具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体的蛋白质谱表征。具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体7D12-C7b-PEG1-Rha(R1)、7D12-C7b-PEG3-Rha(R2)和7D12-C7b-PEG6-Rha(R3)的蛋白质谱结果。
图7:流式细胞表征。EGFR×HER2双特异性纳米抗体7D12-C7b及具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体7D12-C7b-PEG1-Rha(R1)、7D12-C7b-PEG3-Rha(R2)和7D12-C7b-PEG6-Rha(R3)的特异性亲和能力及抗Rha抗体募集能力结果。
图8:EGFR×HER2双特异性纳米抗体7D12-C7b与具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体的体外抗肿瘤活性对比。(A)50nmol/L浓度下,7D12-C7b及7D12-C7b-PEG1-Rha(R1)、7D12-C7b-PEG3-Rha(R2)和7D12-C7b-PEG6-Rha(R3)的ADCC水平;(B)50nmol/L浓度下,7D12-C7b及其改良型7D12-C7b-PEG1-Rha(R1)、7D12-C7b-PEG3-Rha(R2)和7D12-C7b-PEG6-Rha(R3)的ADCP水平;(C)不同浓度下,7D12-C7b及7D12-C7b-PEG1-Rha(R1)、7D12-C7b-PEG3-Rha(R2)和7D12-C7b-PEG6-Rha(R3)的CDC水平。
图9:双特异性纳米抗体7D12-C7b与具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体7D12-C7b-PEG3-Rha(R2)的体内半衰期对比。在OVA-Rha预免疫的小鼠体内,7D12-C7b与7D12-C7b-PEG3-Rha(R2)的半衰期结果。
图10:具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体7D12-C7b-PEG3-Rha(R2)与具有Fc免疫活性EGFR单特异性纳米抗体(7D12-PEG3-Rha)、具有Fc免疫活性HER2单特异性纳米抗体(C7b-PEG3-Rha)的体外抗肿瘤活性对比。(A)50nmol/L浓度下,R2和7D12-PEG3-Rha、C7b-PEG3-Rha的ADCC水平;(B)50nmol/L浓度下,R2和7D12-PEG3-Rha、C7b-PEG3-Rha的ADCP水平;(C)不同浓度下,R2和7D12-PEG3-Rha、C7b-PEG3-Rha的CDC水平。
图11:抗体募集能力及脱靶风险评估。(A)两种具有Fc免疫活性的单特异性纳米抗体的混合物(7D12-PEG3-Rha+C7b-PEG3-Rha)的抗体募集能力结果;(B)具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体7D12-C7b-PEG3-Rha(R2)、两种具有Fc免疫活性的单特异性纳米抗体的混合物(7D12-PEG3-Rha∶C7b-PEG3-Rha=1∶2)的脱靶风险评估。
图12:具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体7D12-C7b-PEG3-Rha(R2)与两种具有Fc免疫活性的单特异性纳米抗体的混合物的体外抗肿瘤活性对比。不同浓度下,R2和两种具有Fc免疫活性的单特异性纳米抗体混合物(7D12-PEG3-Rha∶C7b-PEG3-Rha=1∶2)的CDC结果。
图13:体内抗肿瘤活性评估。PBS、EGFR×HER2双特异性纳米抗体7D12-C7b、具有Fc免疫活性EGFR单特异性纳米抗体7D12-PEG3-Rha、具有Fc免疫活性HER2单特异性纳米抗体C7b-PEG3-Rha、具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体7D12-C7b-PEG3-Rha(R2)对A431(EGFR+/HER2+)荷瘤小鼠的治疗结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明,应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明,凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。下面实施例未注明具体条件的实验方法,通常按照本领域的公知手段。下述实施例中所用的试验材料和细胞系,如无特殊说明,均为自常规试剂公司购买得到。
本发明旨在提出一种具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体及其制备方法与应用,该纳米抗体为修饰有鼠李糖衍生物的EGFR×HER2双特异性纳米抗体。
本发明具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体的制备步骤如下:
1)化学合成含Rha基团的衍生物;
2)构建EGFR×HER2双特异性纳米抗体表达菌株,并发酵纯化获得相应的EGFR×HER2双特异性纳米抗体;
3)采用酶连手段对双特异性纳米进行Rha衍生物修饰,获得具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体。
实施例1:含寡聚甘氨酸的Rha衍生物Gm-PEGn-Rha的制备
(1)Rha衍生物Gm-PEGn-Rha(m=3,n=1,3,6)的合成路径和条件如下所示:
以先前公开报道(J Med Chem,2022,65:323-332)的化合物1、2和3为出发底物,首先通过与化合物4进行常规的酰胺缩合反应分别获得化合物5、6和7。随后,利用TFA将化合物5、6和7中的Boc基团进行脱除,即可获得终产物G3-PEG1-Rha(8)、G3-PEG3-Rha(9)和G3-PEG6-Rha(10)。
经检测,三种终产物的核磁和质谱结果均与预期一致。
G3-PEG1-Rha(8),1H谱和13C谱如图1所示。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ5.30-5.14(m,2H),5.07-4.94(m,1H),4.72(d,J=2.1Hz,1H),3.92-3.72(m,2H),3.62-3.52(m,1H),3.45-3.27(m,2H),2.12-2.05(m,3H),2.01-1.95(m,3H),1.94-1.88(m,3H),1.19-1.15(m,3H).13C NMR(101MHz,Deuterium Oxide)δ171.74,171.35,167.86,163.03,162.67,114.85,99.65,72.05,70.24,70.10,68.60,65.63,42.47,42.30,40.44,38.98,16.60.HRMS:Calculated MW,378.1751;observed,379.1832[M+H].
G3-PEG3-Rha(9),1H谱和13C谱如图2所示。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.34-5.20(m,2H),5.37-5.21(m,2H),5.05(t,J=9.9Hz,1H),5.05(t,J=9.9Hz,1H),4.77(s,1H),4.77(s,1H),3.92(dd,J=9.7,6.3Hz,1H),3.92(dd,J=9.7,6.3Hz,1H),3.86-3.74(m,3H),3.83-3.72(m,3H),3.74-3.56(m,9H),3.72-3.60(m,9H),2.14(s,3H),2.14(s,3H),2.04(s,3H),2.04(s,3H),1.97(s,3H),1.97(s,3H),1.21(d,J=6.2Hz,3H),1.21(d,J=6.2Hz,3H).13C NMR(101MHz,Deuterium Oxide)δ171.73,171.29,167.85,99.99,72.07,70.27,70.12,69.65,69.52,69.45,68.80,68.62,66.45,46.72,42.43,42.37,40.47,38.98,16.65,8.25.HRMS:Calculated MW,466.2275;observed,467.2354[M+H].
G3-PEG6-Rha(10),1H谱和13C谱如图3所示。1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ4.73(d,J=1.7Hz,1H),4.01-3.94(m,6H),3.89(s,2H),3.82(d,J=3.3Hz,2H),3.77(s,2H),3.67(d,J=3.3Hz,16H),3.62(d,J=9.2Hz,4H),3.40(dd,J=9.4,4.0Hz,2H),1.26(d,J=6.2Hz,3H).13C NMR(101MHz,Deuterium Oxide)δ171.69,171.63,171.24,167.81,167.71,162.94,162.59,117.71,114.82,99.96,72.03,70.22,70.07,69.59,69.56,69.53,69.48,69.36,68.71,68.57,66.42,42.37,42.34,42.16,40.96,40.42,38.91,16.60.HRMS:Calculated MW,598.3061;observed,599.3145[M+H].
实施例2:EGFR×HER2双特异性纳米抗体7D12-C7b的制备
(1)双特异性纳米抗体7D12-C7b表达菌株的构建。
以含纳米抗体7D12(靶向EGFR,氨基酸序列如Seq ID No.2示)基因的质粒pET28a-7D12为模板,利用引物1(5’-3’:GGAATTCCATATGCAGGTGAAACTGGAAGAAAGTGGT)和引物2(5’-3’:GCTGCCGCCGCCGCCGCTACCACCACCACCGCTGCTAACGGTAACCTGGGT)扩增得到7D12基因片段;以含纳米抗体C7b(靶向HER2,氨基酸序列如Seq ID No.3所示)基因的质粒pET22b-C7b为模板,利用引物3(5’-3’:GGTGGTGGTGGTAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTTCAGCTGGTTCAGAG)和引物4(5’-3’:CCGCTCGAGACCACCGGTTTCCGGCAG)扩增得到C7b基因片段;取相同摩尔浓度的7D12和C7b基因片段混合,并利用引物1和引物4再次进行PCR扩增,扩增得到的片段通过胶回收试剂盒进行回收达到融合片段7D12-C7b;回收得到的7D12-C7b基因片段用限制性内切酶NdeI和Xho I双酶切且回收后,和用同样进行限制性内切酶双酶切处理的商业化载体pET22b进行连接,连接后的产物转化商业化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3),转化后的大肠杆菌涂布氨苄青霉素的平板进行筛选,选择阳性菌落进行测序验证,验证正确的克隆即为双特异性纳米抗体7D12-C7b(靶向EGFR×HER2,氨基酸序列如Seq ID No.1所示)表达菌株。
(2)蛋白表达与纯化
取20μL甘油菌至3mL氨苄抗性的LB培养基(蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,氯化钠10g/L),37℃,200rpm过夜培养,第二天按照4%的接种量转接TB发酵培养基(蛋白胨12g/L,酵母粉24g/L,甘油5g/L,KH2PO423.1g/L,K2HPO4125.4g/L),待菌浓达到OD600为0.6-1.2之后,加入终浓度为0.25mmol/L的诱导剂IPTG进行诱导,蛋白表达的条件为16℃,200rpm,表达时间为24h。
发酵完毕后,9000rpm离心5min收集菌体,弃置上清。菌体用破壁缓冲液(10mmol/LTris,500mmol/LNaCl,pH8.0)重悬后,用超声破碎仪进行破碎,破碎条件为:冰浴,运行2s,停3s,运行时长20min。破碎完毕后,9000rpm离心10min,重复三次,以彻底除去细胞碎片,得到澄清的破壁上清。破壁上清经与镍柱孵育完全后,用含20mmol/L咪唑的破壁缓冲液分别洗涤镍柱以去除杂蛋白。最终用含250mmol/L咪唑的破壁缓冲液将双特异性纳米抗体7D12-C7b洗下。纯化后的蛋白经脱盐后置于-20℃备用,即制备得到EGFR×HER2双特异性纳米抗体7D12-C7b,并经SDS-PAGE(图4A)和蛋白质谱(图4B)验证正确。
实施例3:具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体的制备
反应过程如下所示:
采用Sortase A(SrtA)酶介导的连接反应技术对EGFR×HER2双特异性纳米抗体7D12-C7b进行Rha衍生物修饰。
反应进程:在干净的1.5mL离心管中,加入含50mmol/LRha衍生物(8、9或10)的DMSO溶液10μL、含50μmol/L EGFR×HER2双特异性纳米抗体7D12-C7b的溶液400μL、含50μmol/L增强型SrtA(eSrtA)的溶液100μL、含eSrtA反应缓冲液(10×)100μL,并用超纯水将反应体系补足至1mL。混匀后,将离心管置于摇床,16℃、200rpm反应2-4h。
反应结束后,首先使用镍离子螯合磁珠和反应液在试管混匀仪上混合孵育10min,使磁珠完全吸附eSrtA,未反应的双特异性纳米抗体以及切割下来的His6标签。然后用磁力分离器使磁珠和反应液进行分离,取上清获得粗产物。将上述与磁珠结合的样品,以及粗产物进行SDS-PAGE表征,发现几乎没有7D12-C7b剩余(图5,泳道2、4和6),且粗产物在7D12-C7b相近位置仅含单一条带(图5,泳道3、5和7)。上述结果表明在本发明提供的条件下,7D12-C7b可被Rha衍生物高效修饰。最后,粗产物经G25脱盐柱去除多余的除Rha衍生物底物即可获得三种具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体7D12-C7b-PEG1-Rha(n=1)、7D12-C7b-PEG3-Rha(n=3)、7D12-C7b-PEG6-Rha(n=6),分别命名为R1、R2和R3,并经蛋白质谱(图6)验证正确。
实施例4:特异性亲和能力及抗体募集能力评估
流式细胞实验的实施方案为:
1)取生长状况良好的肿瘤细胞,重悬至4×105个/mL,移取100μL细胞悬液至预先装有100μL含50nmol/L样品(空白对照为100μL PBS)的无菌EP管,冰浴30min;2)用200μL含FITC耦合抗Rha抗体处理细胞;3)流式细胞仪Accuri C6进行检测。
抗Rha抗体的特异性亲和能力和抗体募集能力结果如图7所示,相对于空白对照和7D12-C7b,三种具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体R1-R3处理后的A431(EGFR+)、SKBR3(HER2+)和A431(EGFR+/HER2+)细胞有明显的荧光增长,表明修饰在双特异性纳米抗体上的Rha基团可被抗Rha抗体成功识别。而由于MCF7细胞为EGFR和HER2双阴性细胞,上述R1-R3无法与其结合,导致类似的现象未在MCF7细胞组中发现。上述结果表明双特异性纳米抗体7D12-C7b在被Rha修饰后,可特异性地将抗Rha抗体募集至EGFR/HER2阳性肿瘤细胞表面。
实施例5:体外抗肿瘤活性及体内半衰期评估
ADCC的实验方案为:1)取生长状况良好的肿瘤细胞,重悬至10万个/mL,移取100μL细胞悬液至96孔培养板中,过夜培养至细胞完全贴壁;2)弃置旧的培养基,加入100μL含1%抗Rha兔血清和50nmol/L样品的溶液,37℃处理0.5h;3)洗涤,加入200μL含20万个人外周血单核细胞的悬液,37℃处理6h;4)LDH试剂盒检测细胞毒性。
ADCP的实验方案为:1)取生长状况良好的肿瘤细胞,eFluor450染色后重悬至6万个/mL,移取500μL细胞悬液至24孔培养板中,过夜培养至细胞完全贴壁;2)弃置旧的培养基,加入500μL含1%抗Rha兔血清和50nmol/L样品的溶液,37℃处理1h;3)洗涤,加入500μL含15万个THP-1细胞(DiI预染)的悬液,37℃处理6h;4)流式细胞分析结果。
CDC的实验方案为:1)取生长状况良好的肿瘤细胞,重悬至5万个/mL,移取100μL细胞悬液至96孔培养板中,过夜培养至细胞完全贴壁;2)弃置旧的培养基,加入100μL含1%抗Rha兔血清和不同浓度(0.1to 1250nmol/L)样品的溶液,37℃处理0.5h;3)洗涤,加入100μL2%的乳兔补体,37℃处理6h;4)CCK8试剂盒检测细胞毒性。
半衰期的实验方案为:1)采用OVA-Rha疫苗对Balb/c小鼠(雌性,6-8周)进行免疫,免疫频率为一周一次,总共免疫三次;2)尾静脉注射样品;3)在不同时间点采取血样,并离心获得血清样品;4)酶联免疫吸附试验(ELISA)测定样品在小鼠体内的半衰期。
(1)与EGFR×HER2双特异性纳米抗体进行体外抗肿瘤活性及体内半衰期对比
如图8所示,在抗Rha抗体的存在下,三种具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体R1-R3均可介导显著ADCC(图8A)、ADCP(图8B)和CDC(图8C)杀伤,而相同条件下未改良的双特异性纳米抗体7D12-C7b则无法引起显著的细胞裂解,表明R1-R3具备激活Fc端介导的免疫效应功能的能力。这一现象可以解释为:具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体在将抗Rha抗体募集至靶细胞表面后,抗Rha抗体的Fc端可被免疫细胞表面的Fc受体、或补体家族中的C1q识别,从而激活相应的免疫杀伤作用。
选取7D12-C7b-PEG3-Rha(R2)作为代表进行半衰期评估,结果如图9所示。在OVA-Rha预免疫的小鼠中,R2的半衰期可达56.2h,较改良前延长了112倍。这一结果表明R1-R3具备显著延长自身半衰期的能力。这一现象可以解释为:具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体可与内源性抗Rha抗体形成免疫复合物,从而通过增加水合半径或参与FcRn介导的抗体循环改善自身的半衰期。
上述结果证实本发明所制备的改良型双特异性纳米抗体具备良好的Fc端生物学功能。
(2)与具有Fc免疫活性的单特异性纳米抗体进行体外抗肿瘤活性对比
为将具有Fc免疫活性的双特异性纳米抗体7D12-C7b-PEG3-Rha(R2)与相应的具有Fc免疫活性的单特异性纳米抗体进行体外抗肿瘤活性对比,首先制备了两种具有Fc免疫活性的单特异性纳米抗体7D12-PEG3-Rha和C7b-PEG3-Rha,其中,7D12-PEG3-Rha和C7b-PEG3-Rha的制备方法同R2,区别在于纳米抗体由7D12-C7b分别替换为7D12和C7b。两者的蛋白质谱表征结果分比为16092.8Da和16566.2Da,均与理论值相符。
如图10所示,在A431(EGFR+/HER2+)细胞中,R2介导的ADCC(图10A)、ADCP(图10B)以及CDC(图10C)水平均显著高于两种具有Fc免疫活性的单特异性纳米抗体7D12-PEG3-Rha和C7b-PEG3-Rha。例如,R2的CDC杀伤EC50值3.6nmol/L,较之7D12-PEG3-Rha和C7b-PEG3-Rha分别加强了2.4和5.1倍。最大杀伤比率为42%,较之7D12-PEG3-Rha和C7b-PEG3-Rha分别提高了14%和9%。
(3)与两种具有Fc免疫活性的单特异性纳米抗体的混合物进行体外抗肿瘤活性对比
为进一步证实具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体相对具有Fc免疫活性的单特异性纳米抗体的优越性,采用EGFR/HER2双阳性的A431(EGFR+/HER2+)细胞,对两种具有Fc免疫活性的单特异性纳米抗体的混合物进行体外抗肿瘤活性评估。
首先通过流式实验筛选出7D12-PEG3-Rha和C7b-PEG3-Rha的最佳混合比率。如图11A所示,在混合比例为1∶2时,混合物的抗体募集能力最佳。但依然仅为R2募集能力的60%,这一结果可以解释为:相对于两种具有Fc免疫活性的单特异性纳米抗体,R2具备更低的脱靶风险。为进一证实该推测,我们用不同浓度的混合物(7D12-PEG3-Rha∶C7b-PEG3-Rha=1∶2)和R2对A431(EGFR+/HER2+)进行处理,并用FITC耦合的抗Myc标签抗体进行染色。流式结果如图11B所示,经计算,R2的结合EC50值为2.7nmol/L,较7D12-PEG3-Rha和C7b-PEG3-Rha的混合物(结合EC50值为17.4nmol/L)加强了6.4倍。
CDC结果如图12所示,7D12-PEG3-Rha与C7b-PEG3-Rha混合物的最大杀伤比率虽然与R2相差无几,但在杀伤EC50值方面存在明显区别:混合物杀伤EC50值为8.8nmol/L,R2杀伤EC50值为3.6nmol/L。这一结果表明在相同的治疗效果下,R2的给药量/给药频率将更低。
上述结果证实与具有Fc免疫活性的单特异性纳米抗体的混合物相比,本发明所制备的具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体具有更低的脱靶风险和更高的抗肿瘤活性。即具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体>具有Fc免疫活性的EGFR单特异性纳米抗体+具有Fc免疫活性的HER2单特异性纳米抗体。
实施例6:小鼠体内治疗应用
将具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体应用到EGFR/HER2双阳性肿瘤的治疗中,并与EGFR×HER2双特异性纳米抗体、具有Fc免疫活性的EGFR单特异性纳米抗体、具有Fc免疫活性的HER2单特异性纳米抗体进行对比。
实施方案:在裸小鼠(Balb/c nude,雌性,4-6周龄)右侧近腋窝处皮下注射EGFR/HER2双阳性的鳞状细胞癌肿瘤细胞100万个;4天后,将小鼠均分为为5组,分别给予静脉注射50μL PBS/50μL抗Rha小鼠血清、50μL 7D12-C7b(50μmol/L)/50μL抗Rha小鼠血清、50μL7D12-PEG3-Rha(50μmol/L)/50μL抗Rha小鼠血清、50μL C7b-PEG3-Rha(50μmol/L)/50μL抗Rha小鼠血清、50μL R2(50μmol/L)/50μL抗Rha小鼠血清;治疗频率为每两天一次(第1、3、5、7、9天),期间每两天测量肿瘤体积一次。
如图13所示,与PBS组相比,7D12-C7b组小鼠的肿瘤生长并未得到有效抑制。而R2组、7D12-PEG3-Rha组和C7b-PEG3-Rha组小鼠的肿瘤生长均得到了有效抑制,且其中R2组小鼠的肿瘤生长抑制效果显著优于7D12-PEG3-Rha组和C7b-PEG3-Rha组。
上述结果证实了本发明所提供具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体应用于EGFR/HER2双阳性肿瘤体内治疗的潜力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体,其特征在于,为修饰有鼠李糖衍生物的EGFR×HER2双特异性纳米抗体。
2.根据权利要求1所述具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体,其特征在于,所述EGFR×HER2双特异性纳米抗体,包含一种可识别肿瘤抗原EGFR胞外域的纳米抗体和一种可识别肿瘤抗原HER2胞外域的纳米抗体。
3.根据权利要求1所述具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体,其特征在于,所述EGFR×HER2双特异性纳米抗体为融合蛋白。
4.根据权利要求3所述具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体,其特征在于,所述融合蛋白由可识别肿瘤抗原EGFR胞外域的纳米抗体和可识别肿瘤抗原HER2胞外域的纳米抗体通过柔性连接臂进行连接融合形成。
7.一种具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体的制备方法,其特征在于,具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体由EGFR×HER2双特异性纳米抗体经鼠李糖衍生物修饰所得。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述鼠李糖衍生物通过酶连手段修饰到EGFR×HER2双特异性纳米抗体上。
9.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述EGFR×HER2双特异性纳米抗体的制备方法包括:通过融合PCR技术获得EGFR×HER2双特异性纳米抗体的表达菌株,再经亲和层析纯化得到双特异性纳米抗体,所述纯化的方法具体包括:通过在蛋白质C末端添加组氨酸标签进行亲和层析。
10.根据权利要求1-6任一项所述具有Fc免疫活性的EGFR×HER2双特异性纳米抗体,或权利要求7-9任一项所述的方法,在抗体工程或肿瘤治疗领域的应用。
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