CN115819579A - 全人源抗白介素17A单链抗体No.34及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种全人源抗IL‑17A单链抗体No.34及应用，该单链抗体包含完整的重链和轻链可变区序列，利用分子克隆及原核表达系统成功表达纯化抗IL‑17A单链抗体No.34。抗IL‑17A单链抗体No.34与IL‑17A重组蛋白具有较高的亲和力(KD为110nM)，能够特异性结合IL‑17A重组蛋白，具有阻断IL‑17A与其受体结合的作用，而且在银屑病小鼠体内展现出了显著的抗炎作用。本发明所提供的抗IL‑17A单链抗体No.34能够阻断IL‑17A信号转导通路，可用于炎症治疗药物的开发。

Description

全人源抗白介素17A单链抗体No.34及应用

技术领域

本发明属于基因与抗体工程，涉及全人源抗白介素17A单链抗体No.34及应用，所述单链抗体No.34是全人源抗白介素17A(interleukin 17A,IL-17A)单链抗体No.34，利用此单抗可进行原核表达、体外亲和力及抑制作用分析和银屑病小鼠模型体内抗炎作用分析，显示其在炎症药物开发中的应用前景。

背景技术

IL-17A细胞因子最初分离于大鼠T细胞杂交瘤，被认为是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白(ctotoxic T lymphocyte-associated proteins，CTLA)家族的一个亚型，称为CTLA-8。IL-17A分子量为1.7×10⁴道尔顿(Dalton,Da)，包含155个氨基酸，以二硫键连接的同型二聚体糖蛋白形式分泌并发挥作用。IL-17细胞因子家族中包含IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(又称为IL-25)和IL-17F。IL-17受体(interleukin 17receptor family,IL-17R)家族包含IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD和IL-17RE。IL-17RA为共有亚基，其他亚基作用时分别与IL-17RA组成异二聚体。

IL-17A结合IL-17RA/IL-17RC异二聚体，激活下游信号通路，通过多种调节机制促进炎症反应，参与肿瘤生长、迁移及侵袭和血管生成等。核因子-κB激活剂1(nuclearfactor-κB activator 1,Act1)，IL-17依赖信号通路所必需的接头蛋白，能够结合IL-17R的SEFIR结构域来介导下游信号传导。Act1作为桥梁蛋白募集TRAF相关因子TRAF6，以K63多聚泛素化的方式修饰TRAF6，从而作用于下游NF-κB信号通路，启动一系列细胞因子和生长因子的转录及表达。此外，TNFR6也能够促进有丝分裂原活化的蛋白激酶家族(motigen-activated protein kinase,MAPK)的激活，进一步活化激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)从而促进下游炎症有关细胞因子IL-6、TNF-α、G-CSF等的转录及分泌表达，从而引发炎症反应。IL-17A可通过调控mRNA的稳定性从而来放大自身对靶细胞的作用。Act1与TRAF相关因子2/5结合形成复合物后进一步与剪接子2(splicing factor,SF2)结合，阻止了下游通路中趋化因子CXCL1 mRNA的降解，从而增强对中性粒细胞及其他非造血细胞等的趋化作用，使多种免疫相关细胞至损伤及感染部位调节炎症反应。

IL-17A及IL-17A受体作为主要的治疗靶点，在自身免疫性疾病的临床治疗中发挥了关键作用。目前已上市及临床在研的针对IL-17A的靶点药物数量增加，2015年全球首个获得批准的Secukinumab被用来治疗中重度斑块状银屑病成人患者，为自身免疫性疾病的治疗提供了新武器。Secukinumab被FDA批准用于治疗中重度斑块型银屑病，2019年3月我国国家药品监督管理局正式批准“可善挺”(司库奇尤单抗注射液)用于银屑病治疗。另外，Ixekizumab与Brodalumab单克隆抗体，分别靶向IL-17A和IL-17RA。它们能够阻断IL-17RA与IL-17A细胞因子结合，抑制IL-17A介导的IL-6、IL-8、基质金属蛋白酶及环氧化酶-2的释放，有效作用于炎性疾病的患者。如今，自身免疫性疾病在世界范围内发病率不断上升，开发特异性强、副作用低、疗效好的靶向IL-17A药物是治疗自身免疫性疾病的重点。

近年来，噬菌体展示技术已经成为全人源抗体筛选的重要平台之一，噬菌体展示技术筛选周期短，可在短时间内实现对抗原的高通量筛选，极大地提高了筛选的效率。噬菌体展示技术是将编码多肽或抗体的外源基因插入到噬菌体特定基因中，使外源基因与噬菌体外壳蛋白的结构基因融合表达，形成融合蛋白表达于噬菌体表面。噬菌体抗体库筛选技术是抗体库中的噬菌体与靶蛋白孵育结合后，洗去未结合的噬菌体，并且将结合能力较强的噬菌体洗脱下来进一步扩增，经过3-5轮筛选后得到与靶蛋白结合能力较强的噬菌体，最终获得识别靶抗原的高亲和力噬菌体抗体。噬菌体筛选得到的抗体结构稳定，避免提前降解，靶向性良好，大大减少了毒副作用，在一定程度上克服了杂交瘤技术生产抗体的缺点，价格低廉。其中，单链抗体具有分子量较小，体内免疫原性较低，不容易引起炎症反应，穿透能力较强，在组织中分布指数较全长抗体分子量高，半衰期较短，在体内危害较小，并且亲和力较高，特异性强，易于制备等优点，在疾病临床诊断、治疗、预防等方面具有重要作用和广阔的应用前景。通过全人源噬菌体单链抗体库筛选一种能与IL-17A特异性结合的单链抗体scFv，这类识别IL-17A的单链抗体本身或者其可变区序列经过基因工程改造成其它的抗体形式后，可以特异性靶向炎症性疾病病人血清及组织中高表达的IL-17A细胞因子，以此达到抗炎作用。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种全人源抗白介素17A单链抗体No.34，此单链抗体是从全人源噬菌体单链抗体库中筛选出能够特异结合于IL-17A的单链抗体。所述全人源抗IL-17A单链抗体No.34的DNA序列如SEQ ID No.1所示：

atgcaggtccagcttgtgcagtctggagctgaggtgaagccgcctggggcctcagtgaaggtttcctgtaaggcttctggatacactttcactacccataaaatacagtgggtgcgccaggcccccggacaaaggcttgagtggatgggatggatcaacactgacaaaggtgacacaaaatattcacagaagtttcagggcagagtcaccattaccagtgacacatccgcgagcacagccttcatggatctgagcagcctgagatctgaagacacggctgtgtattactgtgcgagagatggagagggatatgcgcccttcggaatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggaggaggaggttcgggcggcggcggctccggtggtggtggatctgacatccggttgacccagtctccaccctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcaaaccattggcagtcatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctggaacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagtcacagtggactcaccttcggcggagggaccaaagtggatatcaaatga。

所述全人源抗IL-17A单链抗体No.34的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示：

MQVQLVQSGAEVKPPGASVKVSCKASGYTFTTHKIQWVRQAPGQRLEWMGWINTDKGDTKYSQKFQGRVTITSDTSASTAFMDLSSLRSEDTAVYYCARDGEGYAPFGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIRLTQSPPSLSASVGDRVTITCRASQTIGSHLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSHSGLTFGGGTKVDIK。

该全人源抗IL-17A单链抗体No.34含有完整的抗体重链可变区VH和轻链可变区VL，其重链可变区VH CDR1的氨基酸序列为：GYTFTTHK(SEQ ID No.3)，重链可变区VH CDR2的氨基酸序列为：INTDKGDT(SEQ ID No.4)，重链可变区VH CDR3的氨基酸序列为：ARDGEGYAPFGMDV(SEQ ID No.5)；其轻链可变区VL CDR1的氨基酸序列为：QTIGSH(SEQ IDNo.6)，轻链可变区VL CDR2的氨基酸序列为：AAS(SEQ ID No.7)，轻链可变区VL CDR3的氨基酸序列为：QQSHSGLT(SEQ ID No.8)。

本发明所述全人源抗IL-17A单链抗体No.34的筛选方法，是通过以下步骤实现：诱导表达的IL-17A重组蛋白作为抗原进行噬菌体筛选，噬菌体单链抗体库中的噬菌体与IL-17A重组蛋白孵育结合后，洗去未结合的噬菌体，并且将结合能力较强的噬菌体洗脱下来进一步扩增，经过3-5轮“吸附-洗脱-扩增”能够得到与靶蛋白结合能力较强的噬菌体单克隆，将最后一轮随机挑取的噬菌体单克隆进行DNA提取与测序。根据测序结果挑选完整重链与轻链的单链抗体序列。通过分子生物学技术，构建含有单链抗体基因的重组表达载体。重组表达载体转化至E.coil Rosetta菌株中，IPTG诱导表达单链抗体，镍柱纯化后得到单链抗体。

本发明的另一个目的是提供所述的抗IL-17A单链抗体No.34在制备治疗炎症性疾病药物中的应用。所述应用是指抗IL-17A单链抗体No.34本身及其轻链及重链可变区序列靶向IL-17A细胞因子，抑制IL-17A与其受体的结合，产生抗炎作用，从而达到靶向治疗炎症性疾病的目的。所述炎症性疾病如银屑病。

本发明的有益效果是：(1)本发明通过噬菌体展示技术筛选得到的单链抗体为全人源的抗体，能够降低免疫原性，稳定性较好；(2)本发明所用试剂简单易得，价格低廉，能够快速筛选到特异性结合IL-17A蛋白的单链抗体；(3)本发明得到的单链抗体结合能力强，亲和力高，能够抑制IL-17A与其受体的结合；(4)本发明得到的单链抗体在银屑病小鼠模型中具有抗炎作用，可以作为炎症性疾病治疗性药物进行开发。

附图说明

图1是重组蛋白IL-17A的表达(图1A)、纯化(图1B)及鉴定(图1C)的SDS-PAGE电泳图。

图2是噬菌体抗体库的富集筛选过程示意图。

图3是ELISA检测阳性噬菌体单克隆与IL-17A抗原的结合活性。

图4是抗IL-17A单链抗体No.34表达、纯化(图4A)及鉴定(图4B)的SDS-PAGE电泳图。

图5是抗IL-17A单链抗体No.34与IL-17A抗原的亲和力测定曲线。

图6是抗IL-17A单链抗体No.34的特异性分析。

图7是抗IL-17A单链抗体No.34对IL-17A与IL-17RA结合的抑制作用分析。

图8是抗IL-17A单链抗体No.34对银屑病小鼠模型的抗炎作用分析，对照组(图8A),抗IL-17A单链抗体No.34(图8B)。

图9是抗IL-17A单链抗体No.34对银屑病小鼠皮损组织中细胞因子IL-6的抑制作用分析。

具体实施方式

本发明结合以下实施例及附图作进一步说明。

实施例1：重组蛋白IL-17A的表达、纯化及鉴定

实验方法：(1)蛋白表达：将实验室构建成功的pET-30a(+)/IL-17A重组质粒转化至表达菌株E.coli Rosetta中，将菌液以1：100比例加入到200ml LB新鲜液体培养基中，加入200μl Kana溶液(50μg/ml)，37℃，220rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6(约2～3h)，取出80μl菌液于1.5ml离心管中，作为诱导前菌液4℃保存；向200ml菌液中加入200μl浓度为1M IPTG至终浓度为1mM，37℃，220rpm振荡培养6h，取出80μl菌液于1.5ml离心管中，作为诱导后菌液4℃保存，以判断目的蛋白是否表达成功；4℃，4000rpm，离心10min，弃掉上清，使用10ml PBS重悬沉淀；冰浴超声破碎30min,工作及间歇各3s,温度为4℃，工作强度为35％；4℃，12,000rpm，离心10min，分别收集上清及沉淀，各取80μl于1.5ml离心管中，作为超声上清及超声沉淀4℃保存；向收集菌液中加入20μl 5×蛋白上样缓冲液，煮沸10min，1000rmp，离心5min，蛋白电泳检测其可溶性。

(2)蛋白纯化：冰浴超声破碎后，0.1％Triton X-100重悬沉淀，使用移液枪轻轻吹打混匀，4℃，12,000rpm,，离心10min；重复此步骤三次；灭菌水洗涤2次，4℃，12,000rpm，离心10min；使用10ml 8M尿素重悬沉淀，放置于冰上直到沉淀完全溶解；向装有2ml Ni-NTA树脂的纯化柱中缓慢加入溶解的蛋白溶液，流速为6滴/min；蛋白溶液全部过柱后，加入6ml8M尿素溶液洗涤镍柱，此步骤可以洗去非特异性结合蛋白；依次加入6ml 20mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM及400mM咪唑洗脱镍柱，将蛋白从纯化柱中洗脱下来，分别收集洗脱液；洗脱结束后，使用10ml 8M尿素平衡镍柱，4℃保存镍柱；取80μl不同的洗脱液样品置于1.5ml离心管中；最后，使用PEG 20000进行浓缩蛋白后，再经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后进行SDS-PAGE凝胶电泳分析目的蛋白的纯化条带，-20℃保存。

实验结果：与诱导前对比，诱导后的样本中约16kDa处有条带，且分子量大小与目的蛋白预期大小相同，表明IL-17A重组蛋白诱导表达成功，经超声破碎后，结果显示目的蛋白主要存在于沉淀中，表明IL-17A蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在(图1A)。将包涵体蛋白变性及纯化后，电泳结果表明IL-17A重组蛋白主要被100、150、200、250和400mM的咪唑溶液洗脱富集(图1B)。将含有IL-17A重组蛋白的不同浓度咪唑溶液透析复性及浓缩后，IL-17A重组蛋白的含量约为85％，而且存在少量的IL-17A二聚体(图1C)。

实施例2：噬菌体抗体库的富集筛选

实验方法：以IL-17A重组蛋白为靶标，使用全人源噬菌体单链抗体库进行3～4轮亲和淘筛。将100μl Ni-NTA树脂加入至2ml离心管中，加入2ml Buffer缓冲液上下颠倒1min，室温静置5min，5000rpm离心3min，弃掉上清，重复此步骤；孵育IL-17A抗原：向离心管中加入500μg/100μl IL-17A重组蛋白，4℃孵育过夜；封闭：加入3％BSA至2ml，于37℃恒温培养箱中封闭1h；孵育噬菌体抗体库：加入100μl噬菌体抗体库(滴度为10¹²pfu/ml)，补足3％BSA至2ml。于37℃恒温培养箱中孵育2h，孵育1h后上下颠倒离心管混匀一次；洗涤：于室温下，静置离心管10min，弃掉上清后加TBST洗涤液洗涤5次(每轮依次递增5次，第二轮10次，第三轮15次)；加入洗涤液后，上下颠倒1min，静置5min，5000rpm离心3min；使用无菌双蒸水洗涤2次，上下颠倒1min，静置5min，5000rpm离心3min；弃掉上清后，加入400μl洗脱液，上下颠倒1min，静置5min；将上述洗脱液及树脂混合物转入10ml离心管中，向离心管中加入2.4ml甘氨酸-盐酸(pH 2.2)混匀，离心管平行放置10min；向离心管中加入200μl中和液Tris-HCl(pH 8.9)使混合物pH调整至中性(pH 7～7.4)；使用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，取出20μl于4℃保存，进行噬菌体滴度测定；将剩余的混合物加到5ml OD₆₀₀为0.6的TG1菌液中，37℃，静置30min；加入2×YT-A液体培养基至20ml，37℃，220rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6；加入辅助噬菌体M13K07至1×10¹⁰pfu/ml，于37℃恒温培养箱中静置30min，37℃，220rpm振荡培养30min；4℃，2200rpm离心15min，弃去上清；200ml 2×YT-AK液体培养基重悬沉淀，30℃，220rpm振荡培养16h；4℃，8000rpm离心10min收集上清，加入1/4～1/3(约60ml)PEG/NaCl溶液沉降噬菌体，冰上放置4h；4℃，12,000rpm，离心10min，弃上清，2ml PBS重悬噬菌体沉淀；4℃，12,000rpm，离心10min，0.22μm微孔滤膜过滤除菌；噬菌体滴度测定，4℃保存待用；第三轮噬菌体筛选结束后，取10μl噬菌体扩增产物，进行梯度稀释，侵染OD600为0.6的90μl TG1菌液，涂布于2×YT-A平板上；次日，在固体平板上挑取96个单克隆，分别接种于3ml 2×YT-A液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养过夜，提取质粒并标记；将质粒送由上海生工生物工程有限公司进行测序，分析插入目的基因的序列是否具有完整的轻链及重链。图2为步骤说明图。

实验结果：纯化后的IL-17A重组蛋白作为靶标与Ni-NTA树脂固相载体结合，孵育扩增后的全人源化噬菌体单链抗体库，进行3轮噬菌体筛选。计算每一轮筛选后噬菌体的输出量与加入量的比值，得到每一轮的富集率。每轮筛选及扩增后，噬菌体种类减少，亲和噬菌体增多，从而使得富集率呈数量级递增。由表1可知，经过3轮筛选后，第三轮噬菌体的富集率为161倍，证明噬菌体筛选有效富集。

表1、噬菌体抗体库的富集筛选结果

筛选轮数	洗脱次数	噬菌体加入量	噬菌体输出量	噬菌体产量	富集率
						1	5	1.00x10<sup>12</sup>	7.05x10<sup>6</sup>	7.05x10<sup>-6</sup>	1
2	10	5.25x10<sup>11</sup>	2.70x10<sup>8</sup>	5.14x10<sup>-4</sup>	73
						3	15	5.20x10<sup>11</sup>	5.94x10<sup>8</sup>	1.14x10<sup>-3</sup>	161

实施例3：ELISA检测阳性噬菌体单克隆与IL-17A抗原的结合活性

实验方法：分析测序序列结果，扩增轻重链序列完整的噬菌体克隆，扩增后测定噬菌体滴度，进行后续实验；IL-17A抗原包被：PBS稀释抗原至7.5μg/ml，100μl/孔加到酶标板中，4℃孵育过夜；洗涤：弃掉抗原溶液，PBST(ELISA漂洗液)洗涤3次；封闭：每孔加入300μl3％溶于PBST的脱脂奶粉，于37℃恒温培养箱封闭1h；洗涤；孵育一抗：使用PBS作为溶剂，按照比例稀释扩增后的噬菌体克隆至1×10¹¹pfu/ml，每孔加入200μl，同时以PBS作为对照组进行检测，37℃孵育2h；洗涤；孵育二抗：使用PBS作为溶剂，按照比例稀释HRP-M13抗体，每孔加入200μl，37℃孵育1h；洗涤；显色：配制TMB工作液，A液与B液按照1：1混匀后，每孔加入100μl，37℃孵育15～30min，溶液逐渐呈现蓝色；终止：加入50μl/孔2M H2SO4终止液，终止显色，溶液变为黄色；读数：终止后，用酶标仪在450nm处测定各孔的吸光值；分析：使用GraphPad Prism 7.0统计软件分析与IL-17A抗原高亲和力结合的噬菌体克隆。

实验结果：与对照组相比，6种阳性噬菌体均能够与IL-17A重组蛋白结合，具有较高的亲和力。ELISA分析表明，六种阳性噬菌体均具有与IL-17A重组蛋白结合的抗体活性，已初步鉴定阳性噬菌体与IL-17A重组蛋白的结合力(图3)。

实施例4：抗IL-17A单链抗体No.34的表达、纯化及鉴定

实验方法：(1)蛋白表达：将实验室构建成功的pET-30a(+)/anti-IL-17A scFvNo.34重组质粒转入到表达菌株E.coli Rosetta中，以1：100比例将2ml培养菌液加入到200ml LB新鲜液体培养基中，加入200μl Kana溶液(50μg/ml)，37℃，220rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6(约2～3h)；取出80μl菌液于1.5ml离心管中，作为诱导前菌液4℃保存；向200ml菌液中加入200μl浓度为1M IPTG至终浓度为1mM,37℃，220rpm振荡培养6h；取出80μl菌液于1.5ml离心管中，作为诱导后菌液4℃保存，以判断目的蛋白是否表达成功；4℃，4000rpm，离心10min，弃掉上清，使用10ml PBS重悬沉淀；冰浴超声破碎30min,工作及间歇各3s,温度为4℃，工作强度为35％；4℃，12,000rpm，离心10min，分别收集上清及沉淀，各取80μl于1.5ml离心管中，作为超声上清及超声沉淀4℃保存；向收集菌液中加入20μl 5×蛋白上样缓冲液，煮沸10min，1000rmp，离心5min，蛋白电泳检测其可溶性。

(2)蛋白纯化：冰浴超声破碎后，0.1％Triton X-100重悬沉淀，使用移液枪轻轻吹打混匀，4℃，12,000rpm,，离心10min；重复此步骤三次；灭菌水洗涤2次，4℃，12,000rpm，离心10min；使用10ml 8M尿素重悬沉淀，放置于冰上直到沉淀完全溶解；向装有2ml Ni-NTA树脂的纯化柱中缓慢加入溶解的蛋白溶液，流速为6滴/min；蛋白溶液全部过柱后，加入6ml8M尿素溶液洗涤镍柱，此步骤可以洗去非特异性结合蛋白；依次加入6ml 20mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM及400mM咪唑洗脱镍柱，将蛋白从纯化柱中洗脱下来，分别收集洗脱液；洗脱结束后，使用10ml 8M尿素平衡镍柱，4℃保存镍柱；取80μl不同的洗脱液样品置于1.5ml离心管中；最后，使用PEG 20000进行浓缩蛋白后，再经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后进行SDS-PAGE凝胶电泳分析目的蛋白的纯化条带，-20℃保存。

实验结果：与诱导前对比，诱导后的样本中约27kDa处有条带，且分子量大小与目的蛋白预期大小相同，表明抗IL-17A单链抗体诱导表达成功，经超声破碎后，结果显示目的蛋白主要存在于沉淀中，表明IL-17A单链抗体主要以不可溶的包涵体形式存在。将包涵体蛋白变性及纯化后，电泳结果表明抗IL-17A单链抗体主要被100、150、200、250和400mM的咪唑溶液洗脱富集(图4A)。将含有抗IL-17A单链抗体的不同浓度咪唑溶液透析复性后，SDS-PAGE凝胶电泳分析，抗IL-17A单链抗体No.34的表达量较高，约为总蛋白量的95％(图4B)。

实施例5：抗IL-17A单链抗体No.34的抗原亲和力鉴定

实验方法：将本实验室制备的IL-17A重组蛋白和挑选出的抗IL-17A单链抗体送至杭州双天生物技术有限公司，利用Fortebio系统(生物薄膜干涉技术)分析测定筛选得到的抗IL-17A单链抗体与IL-17A抗原之间的结合动力学。

实验结果：IL-17A抗原与单链抗体亲和力如图5所示，其中KD值(Kdis/Kon的比值)反映了抗原及单链抗体之间的亲和力。由图5所示抗IL-17A单链抗体No.34的结合能力均随着抗原浓度的升高而增强，KD值为110nM。

实施例6：抗IL-17A单链抗体No.34的特异性分析

实验方法：抗原包被：PBS稀释BSA或IL-17A至1μg/ml，100μl/孔加到酶标板中，4℃孵育过夜；洗涤：弃掉抗原溶液，PBST(ELISA漂洗液)洗涤3次(每次使用200μl漂洗液，震荡5min)，酶标板倒扣在吸水纸上，去掉残余液体；封闭：每孔加入300μl 3％溶于PBST的脱脂奶粉，37℃恒温培养箱封闭1h；洗涤；孵育单链抗体：PBS稀释抗IL-17A单链抗体至0.1μg/ml,100μl/孔加到酶标板中,37℃恒温培养箱孵育1h，同时PBS作为阴性对照组加入酶标板中；洗涤；孵育一抗：使用PBS作为溶剂，按照1：2000比例稀释抗His鼠单克隆抗体，每孔加入100μl，37℃孵育1h；洗涤；孵育二抗：使用PBS作为溶剂，按照1：3000比例稀释HRP标记的羊抗鼠抗体，每孔加入100μl，37℃孵育1h；洗涤；显色：配制TMB工作液，A液与B液按照1：1混匀后，每孔加入100μl，37℃孵育15～30min，溶液逐渐呈现蓝色；终止：加入50μl/孔2M硫酸终止液，终止显色，溶液变为黄色；检测及分析：终止后，用酶标仪在450nm处测定各孔的吸光值，使用GraphPad Prism7.0统计软件分析数据。

实验结果：ELISA在蛋白水平检测抗IL-17A单链抗体No.34对IL-17A重组蛋白的特异性，与对照组牛血清白蛋白(BSA)相比，0.1μg/ml抗IL-17A单链抗体No.34与BSA结合OD450无显著性差异，而与IL-17A的结合能力较高，由此推断抗IL-17A单链抗体No.34的特异性。

实施例7：抗IL-17A单链抗体No.34对IL-17A与IL-17RA结合的抑制作用分析

实验方法：胰酶消化IL-17RA阳性的A549细胞，1000rpm，离心5min收集细胞沉淀，3×10⁵个细胞/管分装于1.5ml离心管中，每组细胞设置2个重复；洗涤：2％FBS-PBS洗涤细胞，1000rpm，离心5min，此步骤重复三次；孵育蛋白：每组细胞加入10μg/ml IL-17A重组蛋白和不同浓度的抗IL-17A单链抗体的混合液，充分混匀后，冰上孵育2h。每组设置2个重复，其中一组只加IL-17A重组蛋白作为阳性对照组进行孵育；洗涤：2％FBS-PBS洗涤细胞，1000rpm，离心5min，此步骤重复三次；孵育二抗：加入PBS稀释的anti-mouse His单克隆抗体(1：400稀释比)，冰上孵育1h；洗涤：2％FBS-PBS洗涤细胞，1000rpm，离心5min，此步骤重复三次；孵育荧光抗体：加入PBS稀释的Alexa Flior 647标记的anti-mouse荧光二抗(1：500稀释比)，冰上避光孵育1h；上机检测：300μl PBS重悬细胞，300目细胞筛过滤细胞，ACEANovoCyteTM流式细胞仪上机检测。根据得到的平均荧光强度(MFI)，计算抗IL-17A单链抗体抑制IL-17A与A549细胞表面受体结合作用。

公式：

抑制率(％)＝(MFI_IL-17A-MFI_scFvs)/MFI_IL-17A*100％

其中，MFI_IL-17A：IL-17A组的MFI值；MFI_scFvs：不同浓度抗IL-17A单链抗体组的MFI值。

实验结果：在不加入单链抗体的条件下，IL-17A重组蛋白结合细胞的MFI值最高，但加入单链抗体后，MFI值下降，结合在细胞表面的IL-17A重组蛋白减少。其中，抗IL-17A单链抗体No.34(0.1μg/ml)组的抑制率达到62.4％(图7)，说明抗IL-17A单链抗体具有竞争性结合IL-17A的作用，可以抑制IL-17A与其受体IL-17RA的结合。

实施例8：抗IL-17A单链抗体No.34对银屑病小鼠模型的抗炎作用分析

实验方法：实验小鼠(BALB/c)编号后随机分组，分为PBS组和Anti-IL-17A scFvNo.34组，每组4只。使用电动剃毛刀给小鼠背部剃毛，露出约2cm×3cm的皮肤。给药前一天，不同组别的小鼠分别腹腔注射PBS和Anti-IL-17A scFv No.34(1mg/ml)各100μl，每隔一天腹腔注射PBS及抗IL-17A单链抗体。每只小鼠于第1天起每日于背部涂抹约为62.5mg的5％咪喹莫特(Imiquimod，IMQ)乳膏1次，连续涂抹7天，建立银屑病小鼠模型。于第七天处死全部小鼠，剪取背部部分皮损皮肤固定于4％多聚甲醛缓冲液中，标本脱水、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(HE)染色。显微镜下观察组织病理形态，皮损表皮增厚及炎性细胞浸润情况，并拍照，使用CaseViewer软件对HE染色的皮损组织进行分析。

实验结果：涂抹IMQ 2天后，小鼠背部皮肤开始出现红斑、鳞屑和皮肤增厚的现象。然后，严重程度随时间呈上升趋势，评分也相应提高。与PBS组相比，使用抗IL-17A scFvNo.34治疗后，小鼠皮损严重程度评分和病理改变降低。PBS组IMQ处理小鼠皮肤组织可见角质层微脓肿，中性粒细胞聚集；棘层可见少量细胞坏死核固缩，胞质嗜酸性增强；真皮层少量中性粒细胞浸润(图8A)。抗IL-17A scFv No.34治疗小鼠皮肤组织可见表皮增厚，未见明显炎性细胞浸润(图8B)。

实施例9：抗IL-17A单链抗体No.34对银屑病小鼠皮损组织中细胞因子IL-6的抑制作用分析

实验方法：于背部给药第七天处死小鼠，取0.1g皮损组织加入1ml PBS后匀浆，3000rpm离心20min，取上清液检测IL-6含量。具体操作步骤如下：抗原包被：取匀浆液100μl/孔加到酶标板中，不同组别匀浆各设三个复孔，放置于4℃冰箱中孵育过夜；洗涤：弃掉抗原溶液，PBST(ELISA漂洗液)洗涤3次(每次使用200μl漂洗液，震荡5min)，酶标板倒扣在吸水纸上，去掉残余液体；封闭：每孔加入300μl 3％溶于PBST的脱脂奶粉，37℃恒温培养箱封闭1h；洗涤：弃掉抗原溶液，PBST(ELISA漂洗液)洗涤3次(每次使用200μl漂洗液，震荡5min)，酶标板倒扣在吸水纸上，去掉残余液体；孵育一抗：使用3％脱脂奶粉稀释抗IL-6鼠单克隆抗体，稀释比例为1：1000，100μl/孔加入到酶标板中，37℃孵育1h；洗涤：弃掉抗原溶液，PBST(ELISA漂洗液)洗涤3次(每次使用200μl漂洗液，震荡5min)，酶标板倒扣在吸水纸上，去掉残余液体；孵育二抗：使用3％脱脂奶粉稀释HRP标记的羊抗鼠抗体，稀释比例为1：2000，100μl/孔加入到ELISA板中，37℃孵育1h；洗涤：弃掉抗原溶液，PBST(ELISA漂洗液)洗涤3次(每次使用200μl漂洗液，震荡5min)，酶标板倒扣在吸水纸上，去掉残余液体；显色：配制TMB工作液，A液与B液按照1：1混匀后，每孔加入100μl，37℃孵育15～30min，溶液逐渐呈现蓝色终止：加入50μl/孔2M H₂SO₄溶液终止显色；检测及分析：终止后，用酶标仪在450nm处测定各孔的吸光值，使用GraphPad Prism 7.0统计软件分析数据。

实验结果：用ELISA检测小鼠皮损组织中细胞因子IL-6的含量，结果显示：与PBS组相比，抗IL-17A单链抗体No.34组处理的小鼠皮损组织，细胞因子IL-6的含量显著降低，具有统计学意义(*P<0.05)。此结果表明，抗IL-17A单链抗体No.34组治疗后具有降低IL-17A所促进细胞因子IL-6分泌的作用，进一步验证了此单链抗体的抗炎效果。

对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种全人源抗IL-17A的单链抗体No.34，其特征在于，所述全人源抗IL-17A单链抗体No.34的DNA序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种全人源抗IL-17A的单链抗体No.34，其特征在于，所述全人源抗IL-17A单链抗体No.34的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求1或2所述的一种全人源抗IL-17A的单链抗体No.34，其特征在于，所述全人源抗IL-17A单链抗体No.34含有完整的抗体重链可变区VH和轻链可变区VL，其重链可变区VH CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，重链可变区VH CDR2的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示，重链可变区VH CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；其轻链可变区VL CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，轻链可变区VL CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，轻链可变区VL CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。

4.权利要求1所述的抗IL-17A单链抗体No.34在制备治疗炎症性疾病药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述炎症性疾病为银屑病。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用是通过抗IL-17A单链抗体No.34本身或其轻链或重链可变区序列靶向IL-17A细胞因子，抑制IL-17A与其受体的结合，达到抗炎作用。

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