CN104231080A

CN104231080A - 全人源抗人白介素17a单链抗体

Info

Publication number: CN104231080A
Application number: CN201410098197.7A
Authority: CN
Inventors: 胡卓伟; 孙巍; 林珩; 米粟; 解静
Original assignee: Beijing Weifeng Yimin Bio Technology Ltd; Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Beijing Weifeng Yimin Bio Technology Ltd; Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-17
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2034-03-17
Also published as: CN104231080B

Abstract

全人源抗人白介素17A单链抗体，本发明属基因工程抗体技术领域，具体涉及基因工程设计、筛选、表达与人白介素17A（IL-17A）有特异亲和力的全人源抗体片段。此基因工程抗体片段由一段柔性连接片段将抗体的重链区与轻链区首尾相连。本发明通过构建大容量天然噬菌体抗体库，通过生物淘洗获得对IL-17A具有特异吸附能力的抗体片段。该抗体片段构建成全长抗体，通过真核分泌表达亲和纯化后能够抑制IL-17A对人纤维肉瘤细胞HT1080释放白介素6（IL-6）的反应。本发明的抗体片段可用于检测及治疗类风湿性关节炎。

Description

全人源抗人白介素17A单链抗体

技术领域

本发明涉及一种构建天然噬菌体抗体库的方法以及由该抗体库获得的可与人白介素17A特异结合的单链抗体。属于医药技术领域。

背景技术

人白细胞介素17（human interleukin-17，hIL-17）于1993年从一种激活的T细胞杂交瘤中分离出来，最初称为细胞毒性T细胞抗原8（CTLA8）。目前已知IL-17即IL-17A主要由Th-17细胞分泌，且在IL-17家族中存在6个成员（IL-17A-F），他们分别由150～180个氨基酸构成，通常以二聚体的形式存在。它可以导致趋化性细胞因子如IL-8、单核细胞趋化因子-1（MCP-1）和GRO-α的增高，从而促使中性粒细胞和单核细胞的募集。此外，IL-17通过刺激IL-6和PGE2的产生，加强局部炎症反应；诱导细胞间黏附因子（ICAM）产生，促使T细胞反应。IL-17具有强大的促炎作用，其与多种疾病如类风湿性关节炎（rheumatoidarthritis，RA）,气道炎症，慢性炎性疾病以及肿瘤的生长相关。

类风湿性关节炎：一种以关节滑膜炎为特征，以慢性多发性关节炎为主要临床表现的一种自身免疫性疾病。研究表面，在病人关节的滑液中可以检测到活性的IL-17，IL-17刺激软骨细胞产生iNOS和NO及其它与分解代谢相关的酶，并与IL-1β，TNF-α一起刺激成骨细胞分泌如GM-CSF和IL-6等细胞因子，从而抑制软骨细胞增殖和蛋白多糖合成，调节破骨细胞，发生骨破坏。IL-17还可以诱导基质金属蛋白酶，直接在疾病进展中起到破坏性作用。因此，阻断IL-17/IL-17R通路可能是治疗RA的新途径。研究发现，利用抗鼠IL-17抗体治疗胶原诱导的关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型中，关节局部炎症，软骨破坏，骨质侵蚀明显减轻。

肺病：如慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary diseases)，是一种具有气流受限特征的疾病，气流受限不完全可逆、呈进行性发展，多与肺部对有害颗粒物或有害气体的异常炎症反应有关。其病程的恶化，与气道中中性粒细胞的数量增多有关。研究表明，在COPD急性加重期及稳定期IL-17水平显著升高,IL-17引起中性粒细胞增多，促进释放IL-6、IL-8,打破基质金属蛋白酶平衡，参与了COPD的发病,是引起肺内炎症细胞浸润及肺实质破坏的主要原因之一。

其他疾病如：多种慢性纤维化性疾病（Mi等，2011）；

急性移植物排斥（Antonysamy等，1999;Yoshida等,2006;Tang等，2001）；

银屑病（Teunissen等，1998）和银屑病关节炎；

全身性硬化症（Kurasawa等，2000）；

全身性红斑狼疮（Wong等，2000）；

自身免疫炎性肠炎和克罗恩病（Nielsen等，2003；Fujino等，2003；Yen等，2006）；

心血管疾病，包括动脉粥样硬化（Csiszar和Ungvari,2004），川崎病（Sohn等，2003），缺血性心脏病（Csiszar，2003）和中风；

癌症，包括淋巴瘤（Maggio等，2002）和肿瘤（Numassaki等，2005）；

病毒感染导致的疾病等。

综上所诉，此类疾病均出现IL-17异常表达，利用IL-17拮抗剂治疗此类疾病，具有重要价值。

上世纪90年代中期以来，抗体药物在新药中崭露头角。在治疗性应用中，全人抗体可以克服鼠源单克隆抗体在临床应用中的诸多缺点：如诱发人体产生抗鼠抗体（HAMA）反应，不能有效引起CDC及ADCC等。随着对人类抗体基因及结构的研究及分子生物学技术的进展，利用噬菌体抗体库制备人源抗体，已成为获得全人抗体的最主要手段之一。

噬菌体抗体库是利用基因重组技术将外源基因的基因型和表型统一在同一个噬菌体颗粒内。更重要的是，该类噬菌体抗体，不仅可以与特异的配体结合，而且保持感染能力。这样又将抗体的选择能力和噬菌体的扩增能力偶联起来，使得噬菌体展示技术成为一种极其有效抗体筛选系统。经典的筛选方法是将抗原纯化，然后与抗体库孵育，通过数次“吸附—洗涤—洗脱—扩增”的过程(即生物淘选)，使得特异克隆得以富集。可以迅速得到针对靶抗原的抗体，通过功能筛选最终获得中和性抗体。

针对IL-17A的抗体已见报道，例如，R&D公司已生产鼠抗人IL-17单克隆抗体MAB317。WO2006/054059(UCB细胞技术公司)描述了IL-17A中和性抗体分子，该分子最初从杂交瘤中分离并PEG化抗体片段。采用BIAcore测定该片段对IL-17的亲和力为133-365pM。

CN200580026569.4（诺瓦提斯公司）报道IL-17A的特异性抗体，并应用与治疗IL-17介导的相关疾病。

CN200680046605.8（伊莱利利公司）报道IL-17A的特异性抗体，并应用与治疗IL-17介导的相关疾病。

WO2006/013107(诺华制药股份有限公司)报道了IL-17A的特异性抗体，特别是称为AIN457，从杂交瘤分离人抗IL-17抗体与人IL-17A的亲和力为227pM.

CN200780023566.4(阿斯特拉捷利康股份公司)，报道利用噬菌体库分离获得抗IL-17单链抗体片段。

CN200780029886.0（UCB医药有限公司）报道IL-17A的特异性抗体，并应用与治疗IL-17介导的相关疾病。

CN200780003925.X（诺瓦提斯公司）报道了将IL-17A特异性抗体用于治疗实体或造血系统性肿瘤。

其本发明中的与人IL-17A相结合的片段，与上述片段序列完全不同，并抑制IL-17A相关生物学活性可用于治疗IL-17A相关疾病，其为全新的IL-17A的抗体分子，特别是人抗体分子。

发明内容

本发明的目的是提供具有潜在医学和药学价值的一组全人源抗人白介素17A抗体可变区序列。全人源抗人白介素17A抗体可变区核苷酸序列全长234个核苷酸，其由可变重链区和可变轻链区组成，下划线部分为可变区序列。

重链可变区：

QVQLQQSGPG LVKPSQTLSL TCAISGDSVS 30

SNSAAWNWIR QSPSRGLEWL GRTYYRSKWS 60

HDYAVSVKSR ITINPDTSKN QFSLQLNSVT 90

PEDTAVYYCA REGEYGDYGY WGQGTLVTVS 120

S

轻链可变区：

SSELTQDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY 30

YASWYQQKPG QAPVLVIYYD DDRPTGIPER60

FSGSNSGNTA TLTISRVEAG DEADYYCAAW 90

DDSLNGPVFG GGTKVTVLSG GST 113

本发明公开了一种能够和人成熟白介素17A结合的抗体，其特征在于，所述的抗体含有的如下的结合片段，

该片段的重链氨基酸序列为：SEQ ID NO:1；

该片段的轻链氨基酸序列为：SEQ ID NO:3。

所述的结合片段的核苷酸序列如下：

该片段的重链核苷酸序列为：SEQ ID NO:2；

该片段的轻链核苷酸序列为：SEQ ID NO:4。

本发明公开的一种能够和人成熟白介素17A结合的抗体，其特征在于，所述的抗体含有的如下的结合片段，包含一组CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中该组CDR的至少与下列序列的同源性具有30%：

HCDR1的氨基酸序列SEQ ID NO:5；

HCDR2的氨基酸序列SEQ ID NO:6；

HCDR3的氨基酸序列SEQ ID NO:7；

LCDR1的氨基酸序列SEQ ID NO:8；

LCDR2的氨基酸序列SEQ ID NO:9；

LCDR3的氨基酸序列SEQ ID NO:10。

本发明公开的一种能够和人成熟白介素17A结合的抗体，其特征在于，所述的抗体含有的如下的结合片段，所述结合片段中包含含有抗体VH结构域和VL结构域，

其中所述VH结构域包含HCDR1、HCDR2和HCDR3及重链框架区FR1、FR2、FR3和FR4；

其中所述VL结构域包含LCDR1、LCDR2和LCDR3及轻链框架区FR1、FR2、FR3和FR4。

所述的重链框架区FR根据抗体框架分类，可以属于人或其他物种的

VH1、VH2、VH3、VH4、VH5或VH6；

所述的轻链框架区FR根据抗体框架分类，可以属于人的或其他物种

的Vκ1、Vκ2、Vκ3或Vκ4或Vλ1、Vλ2、Vλ3或Vλ4。

所述的其他物种优选是鼠。

本发明公开的一种能够和人成熟白介素17A结合的抗体，其特征在于，所述的抗体含有的如下的结合片段，包含一组重链FR：HFR1、HFR2、HFR3，以及轻链FR：LFR1、LFR2和LFR3，其中该组FR的至少与下列序列的同源性具有30%：

HFR1的氨基酸序列SEQ ID NO:11；

HFR2的氨基酸序列SEQ ID NO:12；

HFR3的氨基酸序列SEQ ID NO:13；

LFR1的氨基酸序列SEQ ID NO:14；

LFR2的氨基酸序列SEQ ID NO:15；

LFR3的氨基酸序列SEQ ID NO:16。

本发明的抗体，其特征在于，含有上述结合片段的改型片段，及抗体基因片段，以及同源性在30%以上的免疫结合片段。

所述的改型片段选自Diabody、Triabody、Tetrabody、Fab、scFv-Fv、IgG。

所述的抗体基因片段如VH或VL。

本发明的抗体，为全人源抗体。

本发明公开了一种产生结合人IL-17A的结合片段的方法，该方法包括：提供编码VH结构域的起始核酸和编码VL结构域的起始核酸的序列库，该起始核酸具有可替换的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3编码序列；利用随机突变VH和VL结构域起始核酸序列，和/或将一个或多个核酸插入HCDR3起始序列库区域，进而产生亲和力更高的结合片段。

适应症：由于IL-17A信号通路参与许多自身免疫病（类风湿性关节炎）、慢性炎症疾病（慢性阻塞性肺炎）及肿瘤的发生及发展，激活IL-17A信号通路，促进相关细胞因子释放可以抑制以上疾病的进程，该全人源抗人白介IL-17A单链抗体具有亲和力高，全人源化，免疫原性低，其生物学功能在于阻断IL-17A信号通路和抑制相关细胞因子释放，因此其适应症在于治疗以上自身免疫病及慢性炎症疾病。

本发明的抗体优选在制备治疗IL-17A相关疾病中的应用。

优选的IL-17A相关疾病选自类风湿性关节炎。

本发明的结合成员偶联于可检测物质和治疗剂，包含权利要求的结合成员用于的诊断试剂盒。

术语及简称

附图说明

图1：噬菌粒载体pHLS示意图及多克隆酶切位点基因序列。

图2：大容量天然噬菌体抗体库抗体基因髓系分布。随机挑选抗体库克隆进行测序后统计，纵坐标为抗体基因出现的百分率，横坐标为各抗体亚家族基因，该图说明抗体库基因序列与人体天然分布比列接近。

图3：重链CDR3区氨基酸个数分布。随机挑选抗体库克隆进行测序后统计，纵坐标为抗体基因出现的百分率，横坐标为各抗体CDR3区氨基酸的个数，图中所示氨基酸个数呈6-25个分布，说明基因分布良好。

图4：亲和筛选每轮洗脱噬菌体滴度。以重组人IL-17A蛋白为抗原，对单链噬菌体抗体库进行了四轮亲和筛选，每一轮筛选后噬菌体抗体收获率呈增长趋势。纵坐标为每一轮筛选洗脱得到的噬菌体个数，横坐标为淘洗轮数。

图5：ELISA筛选与抗原特异结合的单链抗体。纵坐标为ELISA检测后OD450吸光值，横坐标为克隆号。以人IL-17A为抗原，A图为随机挑选的噬菌体抗体与抗原结合的ELISA实验结果；B为将结合阳性噬菌体的噬菌粒转入大肠杆菌HB2151，可溶性表达单链抗体后再与抗原结合的ELISA实验结果。

图6：Ni+亲和柱纯化电泳图。将结合阳性噬菌体的噬菌粒转入大肠杆菌HB2151，可溶性表达单链抗体进行Ni+柱亲和纯化。M,分子量Marker;a，未诱导全菌；b，诱导全菌；c，50nm咪唑洗脱液；d，100nm咪唑洗脱液；e，200nm咪唑洗脱液；f，500nm咪唑洗脱液。

图7：ELISA分析抗体结合抗原表位。A.将人IL-17A蛋白分成相互重叠的三段（S1、S2、S3）；B.纵坐标为ELISA检测后OD450吸光值，横坐标为克隆号。以三段蛋白为抗原，ELISA检测抗体结合区域，商业化鼠抗人IL-17A（eBioscience）作为阳性对照。鼠IL-17A蛋白作为抗原，检测抗体物种间的交叉反应。麦芽糖结合蛋白（MBP）作为阴性对照抗原。A13-scFv抗体与IL-17A的28—55位氨基酸有更多的结合。

图8：全长抗体的表达与纯化。抗体在人胚肾细胞293细胞中表达，表达的细胞上清经过抗体亲和纯化柱纯化，蛋白分别在非还原性SDS-PAGE及还原性SDS-PAGE电泳进行检测。与蛋白Marker相比较，蛋白组装成IgG与预期分子量一致，纯度为95.1%。

图9：单链抗体生物活性检测。重组蛋白IL-17A刺激人成纤维肉瘤细胞（HT1080）分泌IL-6，将纯化的浓度梯度抗体A13-scFv及A13M-scFv与IL-17A共孵育后，刺激HT1080细胞，12小时后收集细胞上清ELISA检测IL-6细胞因子水平计算抑制IL-17A生物活性的抑制曲线。纵坐标为IL-6最大反应值（%），横坐标为抗体浓度。

图10：抗体的亲和力成熟及亲和力检测。将A13-scFv抗体亲和力成熟，筛选亲和力高的突变株A13M-scFv。并将这两株抗体构建在抗体全长表达质粒中，通过真核表达获得抗体全长抗体蛋白A13-IgG及A13M-IgG。利用BIAcoreT100检测抗体亲和力，得到其相应的动力学曲线。纵坐标表示抗原抗体动力学反应值（RU），横坐标表示反应时间。A.A13-IgG全长抗体动力学曲线；B.成熟后的A13M-IgG全长抗体动力学曲线。

图11：A13M-IgG抗体中和人IL-17A改善风湿性关节炎关节。纵坐标表示检测的炎性因子浓度，横坐标为未处理组与抗体处理组。A.A13M-IgG降低类风湿关节炎病人滑膜分泌IL-17A水平；B.A13M-IgG降低类风湿关节炎病人滑膜分泌IL-6水平；C.A13M-IgG降低类风湿关节炎病人滑膜产生I型胶原C前肽水平；D.A13M-IgG降低类风湿关节炎病人骨块分泌IL-17A水平；E.A13M-IgG降低类风湿关节炎病人骨块分泌IL-6水平；F.A13M-IgG降低类风湿关节炎病人骨块产生I型胶原C前肽水平。

具体实施方式

以下通过SEQ ID NO：1多肽筛选，鉴定及应用优选实施例并结合附图具体说明本发明的各个方面和特征。本领域的技术人员应该理解，这些实施例只是用于说明目的，而不限制本发明的范围。本发明的保护范围只受权利要求书的限制。在不背离权利要求书范围的条件下。本领域的技术人员可以对本发明的各个方面进行各种修改和改进，这些修改和改进也属于本发明的保护范围。

另外，需要注意的是，除非特别指明，下面实施例中所用的各种材料和试剂都是本领域中常用的材料和试剂，可以通过常规的商业途径获得；所用方法均为本领域技术人员公知的常规方法或按照厂商所建议的条件。

制备例1大容量天然噬菌体抗体库的构建

1.1噬菌粒pHLS的制备

1）在噬菌粒pUC119载体（购自TAKARA公司）基础上，设计基因序列，如图1，利用全基因合成技术，构建成噬菌粒pHLS。

2）将质粒转入XL1-blue(invitrogen)感受态细胞中，挑选单个菌落，接入5mL2YT-A⁺培养液（16g蛋白胨，10g酵母粉，5g氯化钠，加水至1000mL，PH7.0，含有100μg/mL氨卞青霉素）中，次日转接如200mL2YT-A+培养液过夜。

3）用Qiagen质粒提取试剂盒，根据试剂盒说明书，提取质粒。最后在紫外分光光度计中检测DNA浓度，终浓度约为0.3μg/mL。

1.2淋巴细胞总RNA的提取

1)收集成年健康人外周血及新生儿脐血共65份，每mL血加入5单位肝素。

2)用等量PBS稀释外周血。

3)于15mL离心管中加入3mL淋巴细胞分离液，然后于每个试管中从管壁轻轻加入5mL稀释后的血液。

4)置低速台式离心机，4500rpm，离心20分钟。从上至下分别为血浆层,淋巴细胞层，分离液和红细胞层,用毛细吸管轻轻吸取淋巴细胞层,置于另一15mL离心管中。

5)用PBS作等量稀释,1000rpm离心10分钟。

6)小心弃上清，离心后将沉淀加入1mL Trizol试剂，用手反复摇匀至细胞碎块完全被裂解。

1.3Trizol法提取总RNA

1）将上述细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15～30℃下放置5分钟；

2）在上述EP管中，按照每1mL TRIZOL加0.2mL氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；

3）取上层水相置于新EP管中,按照每1mL TRIZOL加0.5mL异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟，12000g（2℃～8℃）离心10分钟；

4）弃上清，按照每1mL Trizol加1mL75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；

6）让沉淀的RNA在室温下自然干燥，用Rnase-free water溶解RNA沉淀。

1.4cDNA的合成

1）取纯化后的RNA约10μg，放入DEPC处理的EP管，采用cDNA合成试剂盒（Promga），加入4μL oligodT16，分为2管，置于70℃10min，然后置于冰浴1分钟。

2）制备下列混合液体：10×RT buffer8μL、25nM MgCl28μL、0.1MDTT8μL、RNaseOUT(40U/mL)4μL。

3）取14μL上述混合液，分别加入上述EP管中，混匀，室温放置5min。

4)每管加入200单位逆转录酶，42℃60min,然后70℃10min终止反应，置冰浴中。产物置于-20℃保存。

1.5PCR扩增scFv抗体基因

1）根据表1所示选择扩库引物，将下列混合物加入到0.5mL EP管中

2)PCR反应程序：94℃变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30循环；72℃补平10℃。

3）PCR结束后，从每管中取出5μL反应产物1%的琼脂糖电泳观察结果，VH基因约400bp，VL基因约380bp。

4）PCR反应产物纯化用Qiagen胶纯化试剂盒按照说明书纯化回收。

表1.用于扩增抗体基因的引物组

VH5’端引物
		VHU1	GTTATCCTCGAGCGGTACCCAGGTGCAGCTGCACGTC
VHU2	GTTATCCTCGAGCGGTACCCAGGTACAGCTGCACGTC
		VHU3	GTTATCCTCGAGCGGTACCCAGGTGCAGCTACACGTC
VHU4	GTTATCCTCGAGCGGTACCGAGGTGCAGCTGKTCGTC
		VHU5	GTTATCCTCGAGCGGTACCCAGGTCCAGCTKGTRCAG
VHU6	GTTATCCTCGAGCGGTACCCAGRTCACCTTGAACGTC
		VHU7	GTTATCCTCGAGCGGTACCCAGGTGCAGCTGGTGRAST
VHU8	GTTATCCTCGAGCGGTACCSAGGTCCAGCTGGAGTAC

VHU9	GTTATCCTCGAGCGGTACCCAGGTBCAGCTGGTARGCT
		VHU11	GTTATCCTCGAGCGGTACCCRGSTGCAGCTGCASTAGG
VHU12	GTTATCCTCGAGCGGTACCSARRTGCAGCTGCAGGTG
		VHU13	GTTATCCTCGAGCGGTACCGAGGTRCAWCTGGAGGTG
λ链5’端引物
		VLU1	aAGCGGCGCGCATGCCCAGTCTGTSBTGCAGACG
VLU2	aAGCGGCGCGCATGCCTCCTATGWGCTWCAGGAC
		VLU3	aAGCGGCGCGCATGCCTCCTATGAGCTYRCGAAG
VLU4	aAGCGGCGCGCATGCCCAGCCTGTGCACTCARTGYC
		VLU5	aAGCGGCGCGCATGCCCAGDCTGTGGACYCATGG
VLU6	aAGCGGCGCGCATGCCCAGCCWGKACTGCTGCAG
		VLU7	aAGCGGCGCGCATGCCTCCTCTGAASTGCTGCAG
VLU8	aAGCGGCGCGCATGCCCAGTCTGYYAYCTGTCAG
		VLU9	aAGCGGCGCGCATGCCAATTTTATGACTCAGCTGCC
VLU10	aAGCGGCGCGCATGCCCWGBYTGTGCTTCGACAG
		VLU11	aAGCGGCGCGCATGCCCAGGCAGGGCTTCGACAG
κ链5’端引物
		VKU1	aAGCGGCGCGCATGCCGACATCCRGDTCCGACAG
VKU2	aAGCGGCGCGCATGCCAACATCCAGACCCATGAG
		VKU3	aAGCGGCGCGCATGCCGTCATCTGGACCTGACAG
VKU4	aAGCGGCGCGCATGCCGCCATCCRGWCTGACCAG
		VKU5	aAGCGGCGCGCATGCCGATRTTGTGATGAACTCGTC
VKU6	aAGCGGCGCGCATGCCGATATTGTGMTSCAGAGACC
		VKU7	aAGCGGCGCGCATGCCGAAATAGTGATGCAGGACT
VKU8	aAGCGGCGCGCATGCCGACATCGTGATCCAGGAC
		VKU9	aAGCGGCGCGCATGCCGAAACGACACGCAACTCG
VKU10	aAGCGGCGCGCATGCCGAAATTGTRWTRCAGACG
		VH3’端引物
VHD2	gattggtttgccgctagcTGAGGAGACGGTGAGCCAG
		VHD3	gattggtttgccgctagcTGAAGAGACGGTCATGACTG
VHD4	gattggtttgccgctagcTGAGGAGACGGTCGTGACG
		λ链3’端引物
VLD1	tatggtcgaccctccggaTAGGACGGTSASCGTTTGC
		κ链3’端引物

VKD1	tatggtcgaccctccggaTTTGATWTCCACYGTTTGCC
		VKD3	tatggtcgaccctccggaTTTAATCTCCAGTCGTCGTC
重叠延伸引物
		VHU	TAATGTATACTATACGAAGTTATCCTCCGGTAGAGC
VLU	TTATTACTCGCAGCAAGCGGCGATCGCG
		VHD	ggcccagcagtgggtttgggattggtttgccgctag
VLD	tagtatacattatacgAAgttatggtcgaccctccgga

1.6混合VH和VL基因

1)将VH和VL基因各亚家族按照HVH1：38%、HVH2：34%、HVH3：32%、HVH4：26%混合，HVK1：32%、HVK2：17%、HVK3：51%、HVK4：<1%混合，HVλ1：37%、HVλ2：33%、HVλ3：23%、HVλ4：1.3%、HVλ5：2%、HVλ6：0.7%、HVλ7：3%比例混合。将HVK与HVλ以3：2比例混合。

2）分别混合后的VH、VL基因5μL，DL2000plus Marker3μL，用1.5%的TAE琼脂糖凝胶电泳观察结果，用凝胶扫描系统对电泳出现的条带进行分析。

1.7扩增Linker片段

1）利用带有Linker的引物再次扩增VH和VL基因。根据表1所列重叠延伸引物，将下列混合物加入到0.5mL EP管中。

2)PCR反应程序：94℃变性4min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s,30循环；72℃补平10min。

3）PCR结束后，从每管中取出5μL反应产物1%的琼脂糖电泳观察结果，VH基因约430bp，VL基因约400bp。

5）分别取纯化的VH、VL基因5μL，DL2000plus Marker3μL，用1.5%的TAE琼脂糖凝胶电泳观察结果，用凝胶扫描系统对电泳出现的条带进行分析。

6）取纯化后的VH、VL基因5μL，于195μL去离子水中。在紫外分光光度计260nm处读值，计算出VH和VL的浓度。

1.8scFv的连接

1）将VH和VL等摩尔数之比混合，将下列混合物加入到0.5mlEP管中：

2)PCR反应程序：94℃变性4min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s,25循环；72℃补平10min。

3)PCR反应结束后，每管再加入下列混合反应液：

4）混合后再次PCR，反应程序：94℃变性4min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s,30循环；72℃补平10min。

5)PCR结束后，取出5μL反应产物1.5%TAE琼脂糖凝胶电泳观察结果，连接成的scFv约750bp。

6)利用Qiagen凝胶纯化试剂盒纯化PCR产物。

7）取出5μL反应产物1.5%TAE琼脂糖凝胶电泳，对scFv进行定量。

1.9大肠杆菌XL2-blue MRF`电转感受态的制备

1）从37℃培养16-18小时的新鲜平板中挑取一个XL2-blue MRF`(invitrogen)单菌落，转到一个含有100mL LB或SOB培养基的1L烧瓶中，于37℃剧烈振摇培养约3小时（旋转摇床，300转/分钟）。为得到有效转化，活细胞数不应超过10⁸细胞/mL，可每隔20-30分钟测量OD600值来监测培养物的生长情况。

2）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、用冰预冷的50mL聚丙烯离心管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃。

3）低温高速冷冻离心机于4℃以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。倒出培养液，将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。加入1/2体积预冷的10%的甘油，4℃4000rpm离心20min。

4）重复该操作一次。弃上清，用总量为20mL的预冷的10%的甘油重悬细胞沉淀，置于50mL离心管中，4℃3500rpm离心15min。

5）弃上清，在离心管底留2-2.5ml10%的甘油，分装为0.2mL/管，速冻于-70℃备用。

6）用0.01μgPUC19质粒，1μL DNA加入40μL感受态菌，其转化效率应达到2ｘ10¹⁰pfu/μg，此电转感受态菌可用于抗体库的建立。

1.10噬菌粒pHLS载体与scFv的酶切

2）1%TAE电泳分离酶切产物，紫外切胶后，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收纯化酶切片段。

3）纯化后的酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计定量。

1.11scFv-pHLS载体的连接与抗体库初级库的构建

1）将上述纯化的scFv和pHLS载体进行连接反应，反应体系：

低温水浴锅，16℃连接过夜。补充醋酸钠，乙醇沉淀后，用100μL离子水溶解沉淀。

2）将1.9步骤中制备好的感受态100μL一只，分别加入上述连接产物中，置于冰浴。取0.2cm预冷电转杯20支，将上述混合物沿管壁轻轻加入，避免气泡产生，置电转杯于BioRed电转化仪中，在预置程序（电压2.5KV）下电击。立刻加入SB培养基（30g蛋白胨，20g酵母提取物，10gMOPS，定容至1000mL,PH7.3）。37℃复苏1小时。取出10μL菌液，梯度稀释涂2YTAG平板，测库容。

3）其余菌液，培养2小时后再补加70mL含氨卞和1%葡萄糖的SB，再培养不少于6小时以后，取40mL，补加250mL含氨卞和1%葡萄糖的SB，培养过夜用于提取质粒。另60mL加入2000mL含氨卞和1%葡萄糖的培养液，培养3小时后加入滴度约10¹²pfu的M13K07辅助病毒，培养过夜。

4）次日，未加辅助病毒培养物，取出部分加10%甘油，按每支1mL-70℃冻存40-50支，作为原始库的菌株。余下提取质粒，作为原始库质粒保存。

5）加补助病毒培养者离心回收上清，加4%PEG8000和3%NaCl，溶解后冰浴30分钟，10000rpm离心回收沉淀，以100mLPBS悬浮，再次同上PEG沉淀，将回收沉淀溶解于含1%BSA的PBS中，10000rpm离心去除残留的细菌，将噬菌体库上清分装保存。计算噬菌体感染菌落数并计算初级抗体库滴度（菌落数/mL×稀释倍数）。

6）在1.11.2步骤及1.11.5步骤中的2YTAG培养板中随机挑选15个分隔良好的菌落，加入2ml2YTAG，37℃过夜培养。

7）将菌落倒入1.5ml的EP管中，离心，用Qiagen质粒小提试剂盒提取质粒。1%TAE琼脂糖凝胶电泳定量。

8）提取质粒的AscⅠ/SpeⅠ酶切鉴定

37℃进行4小时酶切反应。反应产物用1%琼脂糖电泳观察结果，应出现两条带，其中一条带为750bp大小。

1.12抗体库重组库的构建

1）选单集落BS1365菌株，2ml含50μg/mL卡那霉素和1%葡萄糖的2YT中培养过夜，以1：30至1：50稀释到25ml含5μg/mLl卡那霉素和1%葡萄糖的的2YT中，37℃培养至OD600=0.5。

2）加入1.11.5步骤初级抗体库，使库中噬菌体颗粒与细菌的比例大于100/1。37℃静置1小时，补充足量氨卞，30℃培养过夜。

3）次日补充400ml含50μg/mL卡那霉素、100μg/mL氨卞和1%葡萄糖的的2YT，37℃培养3-4小时，加2mLM13K07辅助噬菌体，37℃培养培养过夜。

4）次日同1.11.5至1.11.8步骤，离心沉淀回收上清，得到重组库，测定滴度，重组率，分装-70℃保存。

1.13抗体库工作库的制备

1）从四环素盘中挑取单集落XL2-Blue MRF`，20ml含20μg/mL四环素2YT培养过夜。

2）加到1000mL SB培养液中，37℃培养至OD约为0.5，加入重组库，使MOI≤1，静置40分钟，震荡培养20分钟。

3)取上述抗体库溶液按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6进行对数稀释，将每个稀释度的液体取100μL加入具有Amp抗性的培养板，与37℃培养过夜，次日计算菌落数，按每mL抗体库所含的克隆数计算抗体库库容。

4）加入氨卞和2×10¹²辅助噬菌体，30℃培养过夜。次日同1.11.5至1.11.8步骤，离心收集上清，PEG沉淀，得到工作库，测定滴度，重组率，分装-70℃保存。结果：利用单链抗体基因重组pHLS噬菌粒，转染高转化感受态XL2-Blue MRF`细胞，在cre-Loxp重组系统中，获得大容量天然噬菌体抗体库，抗体髄系基因分布良好，如图2。抗体重链CDR3区氨基酸个数呈6—25个分布，提示抗体多样性良好。如图3。

制备例2全人源抗IL-17A单链抗体筛选

2.1辅助噬菌体的制备

1）挑取单个XL1-BLUE菌株接种入40mLSB（含10ug/mL四环素），37℃振荡培养过夜。

2）次日进行1：500稀释入10mL同样的SB培养基中，37℃振荡培养1h。

3）挑取单个M13K07噬菌体空斑，接种入上述10mL菌液中，37℃振荡培养2h。

4）加入到含有10μg/mL四环素，70μg/mL卡那霉素的SB培养基中，至500mL,37℃振荡培养过夜。

5）培养至OD600约为1时，4℃12000rpm离心15min。取上清，无菌分装入试管，每管50ml，4℃保存。

2.2噬菌体毒种的滴定

1）准备不含任何抗性的LB培养平板6个。

2）用普通LB培养基制0.7%琼脂，即为表层琼脂，冷却至42℃并在42℃保存。

3）将步骤2.2.1中的噬菌体溶液按10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10进行梯度稀释。

4）将每个稀释度的噬菌体取100ul与100ul OD600=1的XL1-BLUE菌液混合，37℃缓慢振荡反应20min。

5）将42℃保温的0.7%琼脂3ml加入各反应管，混匀立即倒入无抗生素平皿，晃动铺平，于37℃培养过夜。

6）次日计算空斑数。

2.3固相亲和筛选

1）以包被缓冲液（50mmol/L NaHCO₃，PH9.6）稀释重组人IL-17至10ug/mL。取3mL加入免疫管中，4℃包被过夜。

2）PBS洗抗原包被的试管3次。

3）用10%牛血清封闭液加满免疫管（5mL），室温封闭1小时。

4）倒掉封闭液，用PBS洗3次，简单的将PBS倒入免疫管再迅速倒出，以下洗涤操作相同。

5）将步骤1.13中的噬菌体抗体库（滴度约10¹³pfu）与封闭液混合。加入免疫管中，室温60分钟，旋转60分钟，再室温静止60分钟。

6）在进行第一轮筛选时，以含有0.1%Tween-20的PBS洗管5次，再以PBS洗涤5次。

7）先加入1mL新鲜XL1-Blue菌，37℃孵育15min，转入9mL的SB中（含有20ug/ml氨苄，20ug/ml四环素）。

8）蒸馏水洗两次，加入1mL洗脱液，中间不时吹打，10分钟后加入40uL中和液充分中和。

9）加入到10mL新鲜XL1-Blue菌中，37℃孵育15min，再加入9mL的SB中（含有20ug/mL氨苄，20ug/mL四环素）。

10）将两次回收的菌液混匀后去除适量铺2YTAG板测定输出。其余菌液37℃培养3h。后扩大体积到50mL，加入辅助噬菌体，静置1h，摇1h，补卡那50μg/mL，30℃培养过夜。

2.4进一步亲和筛选

1)将上一步噬菌体感染菌液离心回收上清，PEG沉淀，得到次级噬菌体抗体库。取上述抗体库溶液按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6进行对数稀释，将每个稀释度的液体取100uL加入具有Amp抗性的培养板，与37℃培养过夜，次日计算菌落数，按每ml抗体库所含的克隆数计算滴度。

2）取1mL噬菌体4℃保存，另1mL噬菌体用于下一轮亲和筛选。

3）重复2.3步骤，其中步骤2.3.6中，第二轮筛选，PBST洗10次，PBS洗10次。第三轮与第四轮筛选，PBST洗20次，PBS洗20次。

结果：以人IL-17A为抗原，对单链噬菌体抗体库进行了四轮亲和筛选，每一轮筛选后噬菌体抗体收获率呈增长趋势，提示抗IL-17A噬菌体抗体特异性富集。见图4。

制备例3筛选鉴定

3.1随机克隆的挑选

1）配制2YT培养基，还有100μg/mL氨苄青霉素及10μg/mL四环素，加入96孔深孔培养板中，每空约600uL。

2）在第三轮，第四轮筛选输出的培养板上，牙签随机挑选菌落，接入96孔深孔培养板。37℃振荡培养过夜。

3）次日，1：10转接入新的含有600uL培养基96孔深孔培养板中，37℃振荡培养3小时。加入辅助噬菌体，37℃孵育20分钟后，30℃振荡培养8小时。

4)3000rpm离心，10分钟。上清作为待测scFv噬菌体溶液。

3.2多克隆噬菌体ELISA

1）将人IL-17A重组蛋白及牛血清白蛋白（BSA）用PBS稀释至10μg/mL，每孔添加100uL，4℃包被96孔ELISA板过夜。

2）用含有0.1%Tween-20PBS洗三次。用200ul封闭液（10%牛血清PBS）包板，37℃包被2h。

3）倒掉包被液，每孔对应加入3.3.1噬菌体scFv溶液200uL，及50ul封闭液。37℃孵育1h.

4)用含有0.1%Tween-20PBS洗五次。每孔加入100uL用封闭液1：4000稀释后的抗M13单克隆抗体，室温孵育1h。

5）用含有0.1%Tween-20PBS洗六次。配制底物显色液（100mmol/L乙酸钠，PH6.0，每50mL缓冲液加入10ul30%过氧化氢，100μg/mL TMB），每孔加入100uL，室温孵育5min。每孔加入50ul0.1M稀硫酸，终止反应。

6）测定OD₆₅₀和OD₄₅₀，并以OD₄₅₀的值减去OD₆₅₀的值作为最后检测结果。

结果：以样品孔的OD450值绘制柱状图，筛选出吸光值≥OD_BSA值的10倍，见图5A，测序鉴定获得A13-scFv，A24-scFv，B39-scFv，B64-scFv，F44-scFv五株克隆，测序结果显示，其序列均不相同。

制备例4抗体的表达，纯化及表位分析

4.1抗体的可溶性表达

1）将步骤3.2筛选的到的克隆菌株，接入5mL含有100μg/mL氨苄青霉素及10ug/mL四环素LB培养基中，37℃振荡培养过夜。

2）次日，用Qiagen质粒小提试剂盒，提出质粒，最后制成0.1ug/uL浓度左右的质粒DNA。

3）以质粒10ng左右加入HB2151化转感受态细胞，冰上放置30分钟，42℃热击90秒后立刻放在冰上3分钟。加入无抗性SOB培养基800uL，37℃，220rpm振荡培养1小时。

4）取200ul上清涂具有氨苄抗性的培养板，37℃孵育过夜。

5）次日挑取，单克隆菌株于5mL含有100μg/mL氨苄青霉素，1%葡萄糖2YT培养基中。37℃振荡培养过夜。

6）次日以1：100转接入5mL含有100μg/mL氨苄青霉素2YT培养基中，37℃振荡培养至OD600约0.6，加入IPTG至终浓度约0.5mmol/L。30℃振荡培养过夜。

7）次日，12000rpm离心收集沉淀。超声破菌（以200W，超声3秒，间歇3秒，时长3分钟），12000rpm离心10分钟收集上清。

8）SDS-PAGE检测表达情况，扩大培养，将过夜培养菌以1：200转接入300ml2YT培养基中，培养至对数生长期OD600=0.6，加入终浓度为1mM IPTG30℃摇床培养过夜。

9）12000rpm离心10min收集菌体，收集的菌体按照每克3mL加入PBS重悬，加入终浓度为1mg/mL溶菌酶，1mmol/L的苯甲基磺酰氟化物4度裂解1小时，超声破菌（以200W，超声3秒，间歇3秒，时长3分钟），12000rpm离心10分钟收集上清。

10）上清0.22um膜过滤，上于Qiagen Ni+亲和柱柱床，分别用20nm、50nm、100nm、200nm、500nm咪唑洗脱。获得电泳纯的可溶性抗人IL-17单链抗体融合蛋白，见图6，获得单链抗体纯蛋白。

4.2可溶性scFv的ELISA鉴定

3）倒掉包被液，每孔对应加入4.4.1可溶scFv上清200ul，及50ul封闭液。37℃孵育1h.

4)用含有0.1%Tween-20PBS洗五次。每孔加入100uL用封闭液1：4000稀释后的抗V5标签辣根过氧化物酶标记抗体，室温孵育1h。

5）用含有0.1%Tween-20PBS洗六次。配制底物显色液，每孔加入100ul，室温孵育5min。每孔加入50uL0.1M稀硫酸，终止反应。

6）测定OD₄₅₀，并以OD₄₅₀值与阴性对照比较，作为最后检测结果。

结果：以样品孔的OD₄₅₀值绘制柱状图，见图5B，A13-scFv、A24-scFv、F44-scFv与抗原特异性结合。

4.3表位分析

1）根据IL-17A蛋白序列（NP_002181.1），成熟的IL-17A起始于第24位甘氨酸，对应核酸序列（NM_002190.2），PCR扩增出的基因片段S1、S2、S3相互重叠，如图7A。

2）将扩增的三段基因的两段分别加入限制性酶切位点BamHⅠ，NheⅠ及保护碱基。PCR扩增三段基因序列，条件如下：

反应程序：94℃变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s,30循环；72℃补平10min。

3）将PCR产物电泳纯化后，切胶Qiagen试剂盒回收，定量。与pMAL质粒一同酶切，条件如下：

37℃孵育3h后终止反应，1%TAE电泳分离酶切片段。

4）将三段酶切纯化基因片段分别连入pMAL质粒中，转入大肠杆菌JM109。酶切鉴定后，挑单克隆重组菌株于5mL LB（Amp）试管中，培养过夜。

5）次日以1：200转接入5mL LB（Amp）试管中，培养至OD600=0.6，加入IPTG至终浓度约0.5mmol/L。30℃振荡培养过夜。

6）次日，12000rpm离心收集沉淀。超声破菌（以200W，超声3秒，间歇3秒，时长3分钟），12000rpm离心10分钟收集上清。

7）将菌体上清用PBS稀释包被ELISA板，每孔添加100uL，4℃包被过夜。

8）用含有0.1%Tween-20PBS洗三次。用200ul封闭液（10%牛血清PBS）包板，37℃包被2h。

9）倒掉包被液，每孔对应加入4.4.1可溶scFv上清200uL，及50uL封闭液。商品小鼠抗IL-17A单克隆抗体作为阳性对照，37℃孵育1h。

10)用含有0.1%Tween-20PBS洗五次。每孔加入100ul用封闭液1：4000稀释后的抗V5标签辣根过氧化物酶标记抗体，室温孵育1h。

11）用含有0.1%Tween-20PBS洗六次。配制底物显色液，每孔加入100uL，室温孵育5min。每孔加入50ul0.1M稀硫酸，终止反应。

12）测定OD₄₅₀，并以OD₄₅₀值与阴性对照比较，作为最后检测结果。

结果：以样品孔的OD₄₅₀值绘制柱状图，见图7B。A13-scFv抗体与IL-17A的28-55位氨基酸有更多的相互作用。

4.4全长IgG的表达与纯化

1）将A13-scFv抗体单链抗体酶切连入抗体表达载体pTT5中。

2）293EBNA细胞传代用1L的摇瓶，工作体积200ml，在摇床中37℃，5%CO2

下培养,密度到3×10⁶cells/ml时传代。摇床转速：125rpm。细胞计数：血细胞计数仪，细胞活率：台盼蓝染色法。

3）重组质粒提纯后加入150mM的NaCl溶液中混匀，然后加入转染试剂混匀，使得转染试剂和DNA的复合物为最终转染体积的5%，室温下孵育10min，然后加入要转染的细胞中。

4）转染后的细胞在摇瓶中放摇床上培养，根据不同培养体积选择不同大小的摇瓶或反应器。培养过程加料使得细胞高表达。然后培养6天后，收集上清液去纯化。

5）培养物离心，取上清，并通过0.22μm滤膜过滤。上清加入5ml protein Asepharose FF柱，pH7.4的PBS平衡，未结合组分用PBS缓冲液洗净，目标抗体蛋白用pH3.0缓冲液洗脱并立即中和。

结果：纯化后全长抗体分别在还原性及非还原性SDS-PAGE电泳检测，结果如图8，获得纯度约为95%的全长抗体蛋白为A13-IgG。

制备例5抗体的亲和力成熟

5.1酵母电转化感受态的制备

1)从新鲜的YPD平板中，挑EBY100菌单克隆于5mL YPD培养基中。30℃过夜培养。

2）将过夜培养物接入至50ml YPD培养基中，初始浓度为OD600=0.1，30℃培养至OD600=1.3-1.5，该过程大约需要6小时。

3）当细胞培养至OD600=1.3-1.5，加入500ul Tris-DTT buffer至培养基中。30℃在摇床中摇15min。

4）4℃,2500g离心3min培养物，用25mL冰冷的1M山梨醇柔和重悬清洗细胞沉淀。离心，用1mL冰冷的1M山梨醇柔和重悬清洗细胞沉淀，离心。5）用冰冷的E buffer重悬细胞沉淀至终体积为300uL，放置冰上待用。

5.2利用易错PCR制备随机突变库

1）构建随机突变库采用Stratagene生产的II random mutagenesis试剂盒。设计突变引物：A13FOR：TGAGTCAGCTCAGAGGAGGCAT；A13REV：GTTAGGGATAGGCTTACCTTCGAAG。配置如下PCR体系：

94℃变性3min；94℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸90s,35循环；72℃补平10min。

2）琼脂糖凝胶电泳分离纯化突变PCR产物，PCR进一步富集该产物以如下体系:

以如下循环扩增DNA片段

94℃变性3min；94℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸90s,30循环；72℃补平10min。

3)将PCR产物电泳纯化后，切胶Qiagen试剂盒回收，定量。与pYD2质粒一同酶切，条件如下：

37℃孵育3h后终止反应，1%TAE电泳分离酶切片段。

5.3酵母-DNA连接产物的电转化

1）准备4个电转杯，以5ug片段与1ug载体连接，1ug载体对应一个电转杯。转四次合集库容可达1×10⁷。

2）取50uL电转感受态细胞与连接产物混合，并加入电转杯中，该过程始终保持低温，电转前，电转杯放置冰上。

3）电转条件：0.54kv，25uF(酵母程序)。电转后向电转杯中迅速加入预热的（30℃）YPD培养基1mL。

4）将这1mL电转化产物转至15mL离心管中，再用1mL洗电转杯。四次合并，30℃摇1h。

5）4℃,2500g离心5min去上清。用10mL SDCAA培养基重悬细胞沉淀。梯度稀释涂SDCAA平板，计算库容及转化效率。

5.4构建酵母单链突变抗体库

1）将转化菌1：100转接入含有链青霉素1000mLSDCAA培养基30℃摇48h。

2）培养物吸光值一般可达OD600=6-8，诱导前，细胞需要全新传代。为尽可能减少死细胞，以1×10¹⁰个细胞于新鲜的SDCAA培养基中。

3）取1×10¹⁰个细胞从传代细胞库中，4℃,用50mL离心管2500g离心5min去上清，加入SGCAA培养基，至细胞终密度为OD600=0.5-1，诱导表达scFvs20℃20小时。

5.5流式分选亲和力成熟片段

1）诱导十倍于库容的细胞于新鲜的SGCAA培养基中，诱导表达scFvs20℃20小时。取5×10⁷个细胞，15000rpm离心30s将细胞收集于EP管中，去上清，用1mL PBSF buffer（PBS溶液，加入0.1%BSA）清洗。

2）第一轮筛选加入100uM浓度生物素化抗原与细胞混合，第二轮加入10uM，第三轮加入1uM，第四轮加入0.1uM生物素化标记抗原。室温孵育1h。

3）14000g4℃离心30s沉淀细胞,用1mL冰冷的PBSF buffer清洗细胞。

4）200uL重悬细胞，选择Alexa Fluor488羊抗鸡IgG（1:100稀释）和链亲和素-藻红蛋白(PE)（1:100稀释），涡旋细胞以重悬。在冰上避光孵育的细胞10-20分钟。

5）14000g，4℃离心30s沉淀细胞并用1mLPBSF buffer清洗细胞。保持细胞沉淀在冰上。

6）设出一个适当的分类门在双阳性四分之一象限以分离scFv阳性表达细胞和抗原结合。在第一轮流式细胞分选中，习惯使用一个非常保守选择设置门大约在细胞群顶端的5％，以避免失去独特的克隆。随着细胞群被富集，可以设置更多的对角分类窗口，收集顶端0.1-1％。

7)收集分选的细胞于1mLSDCAA培养基.随后的几轮分选扩增筛选到的酵母。加SDCAA培养基到洗脱细胞悬液，终体积为5mL，加链青霉素（1:100稀释），30℃过夜培养。

结果：重复以上步骤富集双阳细胞。经过四轮流式分选获得高亲和力的抗体片段（即A13M-scFv）。所获得抗体片段通过测序获得该片段的重链氨基酸序列如：SEQID NO:1所示；该片段的轻链氨基酸序列如：SEQ ID NO:3所示；重链氨基酸序列如：SEQ ID NO:1对应的核苷酸序列（即重链核苷酸序列）为：SEQ ID NO:2；轻链氨基酸序列对应的核苷酸序列（即轻链核苷酸序列）为：SEQ ID NO:4。

制备例6全长抗体蛋白A13M-IgG的表达与纯化

1）将单链抗体A13M-scFv酶切连入抗体表达载体pTT5中。

2）293EBNA细胞传代用1L的摇瓶，工作体积200ml，在摇床中37℃，5%CO2下培养,密度到3×10⁶cells/ml时传代。摇床转速：125rpm。细胞计数：血细胞计数仪，细胞活率：台盼蓝染色法。

5）培养物离心，取上清，并通过0.22μm滤膜过滤。上清加入5ml protein A sepharoseFF柱，pH7.4的PBS平衡，未结合组分用PBS缓冲液洗净，目标抗体蛋白用pH3.0缓冲液洗脱并立即中和。

结果：纯化后全长抗体分别在还原性及非还原性SDS-PAGE电泳检测，获得纯度约为95%的全长抗体蛋白为A13M-IgG。

试验例1抗体体外中和实验

6.1抗体在HT1080细胞中抑制IL-17A诱导活性

1）胰酶消化人纤维肉瘤细胞系（HT1080），于96孔板中。细胞计数，使得每孔中约有5×10⁴个细胞，在含有10%胎牛血清MEM培养基中，培养过夜。

2）无菌PBS梯度稀释重组蛋白IL-17A，分别为：5pM、20pM、60pM、100pM、500pM、1nM、5nM及10nM八个梯度，每个梯度三个复孔，加入HT1080细胞中培养24小时，实验设置复空，空白作为对照。

3）无菌PBS梯度稀释纯化后重组抗体A13-scFv及A13M-scFv，分别为：0pM、3pM、10pM、50pM、0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM及100nM十个梯度,与1nM重组IL-17A蛋白共孵育1h。去除HT1080细胞培养上清，加入抗体抗原共孵育溶液，每个梯度三个复孔，过夜培养。

4）次日收集细胞上清，利用商业化IL-6细胞因子检测试剂盒（R&D System），按照试剂盒说明书步骤检测各孔细胞IL-6表达的量，利用GraphPad Software5.0软件绘制量效关系曲线，并在图中得出单链抗体IC₅₀值。

结果：通过绘制量效关系曲线，如图9。计算各单链抗体IC₅₀值，如表1。

表1：中和性抗体的IC₅₀值。

试验例2抗体亲和力的检测

7.1亲和力的检测

1）利用BIAcore T100（GE公司）表面等离子共振技术检测单抗的亲和力。以氨基偶联方式，目标偶联水平为1200RU，将抗体用pH5.0的10mM醋酸钠固定缓冲液稀释到10μg/mL，乙醇胺作为洗涤缓冲液。

2）再生缓冲液为pH2.5的甘氨酸，注入时间为30s，流速调为30μl/min。开始程序将抗体固定在CM5芯片上。

3）HBS-EP缓冲液洗2小时，以1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联剂，活化CMD的羧基。梯度稀释IL-17A蛋白，浓度从100μg/mL，稀释终浓度为：0nM，2nM，4nM，8nM，16nM，32nM，重复一个8nM作为对照。注入时间为2min，解离时间为5min，流速调为30μL/min。按仪器提示加入各试剂，运行程序。

4）程序结束，可见抗体与抗原相结合的动力学图形，根据模型计算单抗的平衡解离常数，如图10。

结果：检测数据如表2，分别获得野生型A13-IgG及突变型A13M-IgG单链抗体的亲和力。

表2：BIAcoreT100表面等离子共振技术检测抗体的亲和力。

试验例3抗体中和人IL-17A改善风湿性关节炎关节

8.1风湿性关节炎体外模型制备

1）收集风湿性关节炎患者膝盖或手腕滑膜切除术或关节置换术中获得滑膜或骨样本。

2）无菌条件下，样本被切成2立方毫米小块并分成数份置于2块24孔板中。

3）样本利用MEM(Gibco,Grand Island,NY,USA)完全培养基（含有2mML-Glutamin,100U/ml penicillin,50mg/ml gentamicin,20mM Hepes buffer and1%fetal calf serum.）每孔2mL，37℃，5%CO₂，95%湿度培养。

8.2治疗活性检测

1）按照8.1.1制备风湿性关节炎体外模型，分成抗体处理组及未处理对照组，每组6个复孔。

2）抗体处理组中使用A13M-IgG抗体处理滑膜或骨骼培养物，抗体终浓度为10nM，未处理组加等体积生理盐水，培养24h。

3)24h后收集各孔细胞培养上清，使用商业化细胞因子检测试剂盒（R&DSystem），按照试剂盒说明书进行操作，双夹心酶联免疫吸附法检测培养液中IL-17A、IL-6、I型胶原C前肽等含量。

4）利用GraphPad Software5.0软件柱状图，t检验统计分析各组差异，结果如图11。

结果显示：A13M-IgG与未处理组相比较，A13M-IgG可以中和人IL-17A，改善风湿性关节炎相关因子。

Claims

1.一种能够和人成熟白介素17A结合的抗体，其特征在于，所述的抗体含有的如下的结合片段，

该片段的重链氨基酸序列为：SEQ ID NO:1；

该片段的轻链氨基酸序列为：SEQ ID NO:3。

2.根据权利要求1的抗体，其特征在于，所述的结合片段的核苷酸序列如下：

该片段的重链核苷酸序列为：SEQ ID NO:2；

该片段的轻链核苷酸序列为：SEQ ID NO:4。

3.一种能够和人成熟白介素17A结合的抗体，其特征在于，所述的抗体含有的如下的结合片段，包含一组CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中该组CDR的至少与下列序列的同源性具有30%：

HCDR1的氨基酸序列SEQ ID NO:5；

HCDR2的氨基酸序列SEQ ID NO:6；

HCDR3的氨基酸序列SEQ ID NO:7；

LCDR1的氨基酸序列SEQ ID NO:8；

LCDR2的氨基酸序列SEQ ID NO:9；

LCDR3的氨基酸序列SEQ ID NO:10。

4.一种能够和人成熟白介素17A结合的抗体，其特征在于，所述的抗体含有的如下的结合片段，所述结合片段中包含含有抗体VH结构域和VL结构域，

5.根据权利要求4的抗体，其特征在于，

所述的重链框架区FR根据抗体框架分类，可以属于人或其他物种的VH1、VH2、VH3、VH4、VH5或VH6；

所述的轻链框架区FR根据抗体框架分类，可以属于人的或其他物种的Vκ1、Vκ2、Vκ3或Vκ4或Vλ1、Vλ2、Vλ3或Vλ4。

6.根据权利要求5的抗体，其特征在于，所述的其他物种选自鼠。

7.一种能够和人成熟白介素17A结合的抗体，其特征在于，所述的抗体含有的如下的结合片段，包含一组重链FR：HFR1、HFR2、HFR3，以及轻链FR：LFR1、LFR2和LFR3，其中该组FR的至少与下列序列的同源性具有30%：

HFR1的氨基酸序列SEQ ID NO:11；

HFR2的氨基酸序列SEQ ID NO:12；

HFR3的氨基酸序列SEQ ID NO:13；

LFR1的氨基酸序列SEQ ID NO:14；

LFR2的氨基酸序列SEQ ID NO:15；

LFR3的氨基酸序列SEQ ID NO:16。

8.根据权利要求1-7中任一项的抗体，其特征在于，含有上述结合片段的改型片段，及抗体基因片段，以及同源性在30%以上的免疫结合片段。

9.根据权利要求8的抗体，其特征在于，所述的改型片段选自Diabody、Triabody、Tetrabody、Fab、scFv-Fv、IgG。

10.根据权利要求8的抗体，其特征在于，所述的抗体基因片段如VH或VL。

11.根据权利要求1-10中任一项的抗体，其中所述的特征为全人源抗体。

12.一种产生结合人IL-17A的结合片段的方法，该方法包括：

提供编码VH结构域的起始核酸和编码VL结构域的起始核酸的序列库，该起始核酸具有可替换的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3编码序列；利用随机突变VH和VL结构域起始核酸序列，和/或将一个或多个核酸插入HCDR3起始序列库区域，进而产生亲和力更高的结合片段。

13.权利要求1-X的抗体在制备治疗IL-17A相关疾病中的应用。

14.根据权利要求X的应用，其特征在于，所述的IL-17A相关疾病选自类风湿性关节炎。

15.权利要求1-11中的结合片段，其中所述的结合成员偶联于可检测物质和治疗剂，包含权利要求的结合成员用于的诊断试剂盒。