CN102942629A - 一种抗sftsv的人源抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗SFTSV的人源抗体，该抗体的核苷酸序列，其中轻链核苷酸序列见SEQ ID NO.5，重链核苷酸序列见SEQ ID NO.6，本发明公开了制备上述抗体的方法。本发明的抗体特异性识别SFTSV病毒颗粒。利用该抗体与对SFTSV的中和作用，将其制成特异性抗体药物，从而可在临床上用于预防和治疗由SFTSV感染引起的疾病。

Description

一种抗SFTSV的人源抗体

技术领域

本发明涉及一种抗体，具体而言涉及一种抗SFTSV的人源抗体。

背景技术

2010年中国中东部部分地区，包括安徽、江苏、湖北、河南、山东等省先后暴发多起由蜱虫叮咬而致人死亡的公共卫生事件，造成社会恐慌，严重影响当地群众健康安全和经济发展。经包括国家和相关省疾控中心多家单位的联合攻关，查明引起该传染病的病原为一新型的出血热病毒，在分类学上属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)，目前命名为发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(Severe Febrile and Thrombocytopenic Syndrome Virus，SFTSV)[Xuej ie Yu，Mifang Liang，Shouyin Zhang，et al.Fever with thrombocytopenia associated with anovel bunyavirus in China.N Engl Med 2011；364(16)：1523-1532]。随着全国监测力度的加强，目前在我国浙江也发现该病毒的存在。另外，中东阿联酋最近也有疑似该病例的报道；在美国密苏里州发现的一种被称为Heartland的病毒[McMullan，Laura K.，Folk，Scott M.，Kelly，Aubree J.et.al.A New PhlebovirusAssociated with S evere Febrile Illness in Missouri.New England Journal ofMedicine，2012，367(9)：834-841]，其与SFTSV基因组的同源性很高，说明SFTSV或许呈现世界性分布，或者能被生物媒介携带快速传播。

布尼亚病毒科现分为5个属，其中有4个属对人致病，分别为正布尼亚病毒属、汉坦病毒属、内罗病毒属和白蛉病毒属。该科成员大多由媒介生物，如蜱、螨、蚊、鼠等传播，引起地区或全球性流行。在我国主要有汉坦病毒(汉坦病毒属)和新疆出血热病毒(内罗病毒属)引起地方性流行，而新发现的SFTSV则为白蛉病毒属的新成员。SFTSV基因组由大(L)、中(M)、小(S)三个单股负链RNA片段组成，与布尼亚病毒科其他病毒相似，病毒基因组3′末端和5′末端序列互补，形成非共价闭环RNA。L片段编码由2084个氨基酸组成的RNA依赖的RNA聚合酶；M片段编码具有1073个氨基酸的膜蛋白前体，翻译后经宿主细胞内蛋白酶的修饰形成Gn和Gc两个糖蛋白；S片段属双义RNA，分别编码核衣壳蛋白NP和非结构蛋白NSs。

该病毒引起人感染的典型症状为，病人起病急，高热伴全身乏力、头痛、肌肉关节酸痛，其典型临床特征为白细胞和血小板明显降低，转氨酶升高，血清乳酸脱氢酶明显升高，凝血酶原时间延长，钠、钾、氯等电解质偏低。病例大都生活于丘陵地区，首发病例多为有野外工作经历的中老年人，病死率较高(可高达30％)，死亡原因主要是多脏器功能衰竭。该病例多为散发，亦可引起家庭聚集性暴发，人传人现象严重[Bao CJ，Guo XL，Qi X，et.al.A family cluster ofinfections by a newly recognized bunyavirus in eastem China，2007：further evidenceof person-to-person transmission.Clin Infect Dis.2011，53(12)：1208-1214；Yan Liu，Qun Li，Wanfu Hu，et.al.Person-to-Person Transmission of Severe Fever withThrombocytopenia Syndrome Virus.Vector-Borne and Zoonotic Diseases.February2012，12(2)：156-160；Zhongtao Gai，Mifang Liang，Ying Zhang，et.al.Person-to-Person Transmission of Severe Fever With Thrombocytopenia SyndromeBunyavirus ThroughBlood Contact.Clinical Infectious Diseases2012；54(2)：249-252]。

由于该病是一新发自然疫源性传染病，疫情不可能短期内消失；目前临床尚无有效治疗策略，无疫苗供应；该病临床始发症状与普通流感无异，且病人多集中在农村地区，交通不便，卫生医疗水平薄弱，等到确诊，病情大多发展到病毒血症、多脏器衰竭，此时临床只能采取对症治疗手段。而作为化学治疗的补充，由抗体介导的预防和治疗病毒感染的措施已显现良好的效果，其应用前景得到专家的认同。事实上，国内首个用于治疗汉坦病毒感染的抗体药物已完成III期临床试验，准备上市。抗体作为人体内一种最重要的抗病毒免疫介质，抗体分子可以通过阻断病毒颗粒与其受体的结合、激活巨噬细胞、NK细胞等杀伤细胞、激活补体等多种机制来杀伤、清除病毒颗粒及受感染细胞。抗体制剂不仅可以中和病人体内大量的病毒，降低荷载，转归病情，对病人的密切接触者，如陪护、医护人员进行紧急被动免疫，防止二代、三代感染者的出现。

研究表明，临床上使用病毒特异性的康复人血浆，可有效中和病毒，防止病毒在体内各器官扩散，避免发生致死性的多脏器衰竭，对病人病程的转归也起了重要作用。但多抗血浆不仅来源有限，同时其临床应用也受到诸如难以质控、供受体血型不匹配、潜在的传染性因子等条件的限制。鼠源单抗制备简单，治疗机理明确，但是其异源性阻碍了在人体内的应用。而人源单克隆抗体可有效克服上述问题。

本研究采用噬菌体展示抗体文库技术，以纯化的SFTSV病毒为靶标，筛选人源抗体单链抗体片段(single chain variable fragment，scFv)，获得一株具有广谱中和活性的人源单克隆抗体分子，MAb4-5。应用分子生物学手段对该抗体片段进行全分子化基因构建，真核表达了MAb4-5IgGl。进一步的研究表明，该抗体分子结合的抗原决定簇位于病毒颗粒外膜Gn糖蛋白N末端的一个结构域，该决定簇呈线性排列。另外，对MAb4-5中和机制的研究结果表明，该抗体通过阻碍病毒糖蛋白与其易感细胞膜上受体的结合而发挥作用。

发明内容

本发明采用噬菌体展示抗体文库技术，以纯化的发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(Severe Febrile and Thrombocytopenic Syndrome Virus，SFTSV)为靶标，筛选人源抗体单链抗体片段(single chain variable fragment，scFv)，获得一株具有广谱中和活性的人源单克隆抗体分子，MAb4-5，并应用分子生物学手段对该抗体片段进行全分子化基因构建，真核表达了MAb4-5 IgGl。进一步的研究表明，该抗体分子结合的抗原决定簇位于病毒颗粒外膜GTn糖蛋白N末端的一个结构域，该决定簇呈线性排列。另外，对MAb 4-5中和机制的研究结果表明，该抗体通过阻碍病毒糖蛋白与其易感细胞膜上受体的结合而发挥作用。

本发明公开了一种抗SFTSV的人源单链抗体MAb4-5，所述单链抗体包括轻链和重链，其氨基酸可变区序列分别如序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示，其编码基因分别如序列表中SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。

本发明所述的单链抗体的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，分别如序列表中SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7所示。所述单链抗体的重链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10所示。

本发明还公开了上述单链抗体MAb4-5及其全分子抗体MAb4-5IgG的制备方法，主要包括如下：

1.抗SFTSV scFv人源抗体文库构建和筛选

首先，获取5名SFTSV感染康复者的外周血(经专利申请者所在单位伦理委员会、及相关献血者书面同意)，分离外周淋巴细胞，抽提总RNA，使用oligo(dT)引物反转合成cDNA，PCR分别扩增抗体的重、轻链可变区基因V_H和V_L，连接成scFv后克隆入载体pComb3Xss，电转化大肠杆菌XLl-Blue。

以纯化的SFTSV颗粒包板进行亲和筛库，经过3轮的筛选(吸附-洗脱-扩增)，将第3轮洗脱的重组噬菌体感染大肠杆菌XL1-Blue后铺板，随机挑取90个单菌落，制备重组噬菌体，用ELISA筛选SFTSV特异性噬菌体克隆，共获得14个阳性克隆，经测序、去除重复序列，共获得6个特异性抗体克隆，分别是：4-5、A5、A9、A11、B2和D6。

2.中和实验

对于上述的6个scFv片段在大肠杆菌中进行了表达、纯化，并用纯化的scFv片段做中和实验。

将浓度为100μg/nL的scFv片段50μL与等体积的SFTSV毒株JS-2010-003(含有100TCID50)混合，37℃作用1h后，该混合物加入到培养有Vero细胞单层的96孔板中，于37℃、5％CO₂的培养箱中培养6d，每天观察细胞病变(Cytopathic effect，CPE)。对于能抑制大于90％CPE的单抗被认为具有中和活性。结果发现6个抗体中只有4-5具有中和活性。

3.MAb4-5抗体克隆全分子化构建和真核表达

将MAb4-5抗体的重、轻链可变区基因分别克隆入载体pAc-K-CH3中，应用杆状病毒表达系统表达全分子抗体(MAb4-5IgG1)并纯化。

4.MAb4-5IgG1中和活性的测定

利用分离自不同地区、不同时间的SFTSV株与MAb4-5IgG1做交叉保护实验，测定该抗体分子的广谱中和能力。结果表明，MAb4-5从scFv片段转化成全分子IgG1其亲和力大约提高了20倍，具有较高的中和活性；同时MAb4-5IgG1对2010-2012年度分离自不同疫区的病毒株均表现出较强的中和能力，显示出MAb4-5 IgG1具有较广的中和谱。

5.单克隆抗体MAb 4-5轻、重链可变区基因序列和氨基酸序列的确定

用www.expasy.org在线软件将编码抗SFTSV抗体MAb 4-5的轻、重链可变区核苷酸序列翻译为其编码的氨基酸序列。MAb 4-5的轻、重链可变区氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。根据Kabat数据库确定轻链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示。重链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。

本发明采用噬菌体展示抗体文库技术，成功地筛选出一株对SFTSV具有中和能力的人源抗体片段，MAb4-5。并阐明了该抗体分子所结合的抗原决定簇和其对病毒中和作用的机制。全分子化的MAb4-5 IgG1表现出了对SFTSV广谱性的中和能力，利用该抗体与对SFTSV的中和作用，将其制成特异性抗体药物，从而可在临床上用于预防和治疗由SFTSV感染引起的疾病，具有很强的临床应用和经济价值。

附图说明

图1分离得到的6株scFv抗体对JS-2010-003病毒株中和活性的测定结果，PC为康复期病人血清，NC为阴性对照；

图2纯化后的MAb4-5IgG1 SDS-PAGE图；

图3MAb4-5、MAb4-5 IgG1的中和滴度测定结果，阴性对照为抗肠道病毒71的人抗体IgG1；

图45μg/mL MAb4-5IgG1对不同SFTSV病毒株的中和活性测定结果；

图5Western blot检测MAb4-5IgG1与JS-2010-003病毒株的Gn糖蛋白的结合；

图6免疫荧光检测MAb4-5IgG1与JS-2010-003病毒株感染Vero细胞的结合，

图A显示MAb4-5IgG1能结合JS-2010-003感染的Vero细胞，图B为阴性对照

图7免疫电镜检测MAb 4-5 IgG1与JS-2010-003的结合，图A显示MAb 4-5IgG1能与JS-2010-003，图B为阴性对照；

图8Western blot检测MAb4-5IgG1与Gn糖蛋白膜外结构域结合；

图9Western blot检测MAb 4-5对Gn1与Vero细胞膜上的受体结合的阻断，对照为无中和活性的抗体MAb A5。

具体实施方式

通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明本发明，并不意味着限定本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例一JS-2010-003病毒颗粒的纯化

1.材料

病毒株JS-2010-003：为专利申请者于2010年从江苏一SFTSV感染病人血清中分离获得。

2.方法和结果

将病毒接种Vero细胞后，于37℃、5％ CO₂培养箱中培养10d，无菌吸取病毒培养上清液；使用1∶4000稀释的β-丙内酯(β-propiolactone)于4℃灭活24h，5000rpm离心30min去除细胞碎片；30000rpm，4℃超速离心2h；用少量磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)重悬病毒颗粒，用分子筛层析柱Sepharose 4FF进一步纯化病毒。通过上述步骤收集到了纯度较高的JS-2010-003病毒颗粒。所有的病毒操作均在生物安全2级(BSL-2)实验室中进行。

实施例二噬菌体展示scFv人源抗体文库的构建和筛选

1.材料

引物：

V_H基因扩增引物：

上游引物：HSCVH1-F，见序列表中SEQ IDNO：11；HSCVH2-F，见序列表中SEQ IDNO：12；HSCVH35-F，见序列表中SEQ IDNO：13；HSCVH3a-F见序列表中SEQ ID NO：14，HSCVH4-F见序列表中SEQ ID NO：15；HSCVH4a-F，见序列表中SEQ ID NO：16；

下游引物：HSCG1234-B，见序列表中SEQ ID NO：17；

V_κ基因扩增引物：

上游引物：HSCK1-F，见序列表中SEQ ID NO：18；HSCK24-F，见序列表中SEQ ID NO：19；HSCK3-F见序列表中SEQ ID NO：20；HSCK5-F，见序列表中SEQ ID NO：21；

下游引物：HSCJK14o-B，见序列表中SEQ ID NO：22；HSCJK2o-B，见序列表中SEQ ID NO：23；HSCJK3o-B，见序列表中SEQ ID NO：24；HSCJK5o-B，见序列表中SEQ ID NO：25；

V_λ基因扩增引物：

上游引物：HSCLamla，见序列表中SEQ ID NO：26；HSCLamlb，见序列表中SEQ ID NO：27；HSCLam2，见序列表中SEQ ID NO：28；HSCLam3，见序列表中SEQ ID NO：29；HSCLam4，见序列表中SEQ ID NO：30；HSCLam6，见序列表中SEQ ID NO：31；HSCLam78，见序列表中SEQ ID NO：32；HSCLam9，见序列表中SEQ ID NO：33；HSCLam10，见序列表中SEQ ID NO：34；

下游引物：HSCJLam1236，见序列表中SEQ ID NO：35；HSCJLam4，见序列表中SEQ ID NO：36；HSCJLam57，见序列表中SEQ ID NO：37；

scFv基因扩增引物：

上游引物：RSC-F，见序列表中SEQ ID NO：38；

下游引物：RSC-B，见序列表中SEQ ID NO：39；

2.方法和结果

2.1抗SFTSV特异性噬菌体抗体构建

(1)外周血淋巴细胞的分离。取5名SFTSV感染康复者的外周血，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，4℃，5000rpm离心10min，并用生理盐水或PBS洗涤两次。将收集到的淋巴细胞混合后进行总RNA提取。

(2)总RNA的提取。参照总RNA提取试剂盒说明书抽提淋巴细胞中的总RNA。并用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。

(3)逆转录cDNA。取含1g总RNA的溶液，加入Oligo(dT)₁₈5μL，双蒸水9μL，70℃水浴10min；取出后迅速置于冰上5min后，再置于室温10min；依次加入依次加入10×缓冲液5μL，MgCl₂ 0.5μL，2.5mmol/L dNTP2μL，Inhibitor2μL，M-MLV4μL，混匀后42℃水浴60min；产物为cDNA第一链，-20℃冻存备用。

(4)PCR扩增V_H、V_κ、V_λ基因。以上述制备的cDNA为模板，利用前述V_H、V_κ和V_λ基因引物，分别扩增V_H、V_κ和V_λ基因片段。扩增体系如下所示：cDNA 0.5μg，上游引物60pmol，下游引物60pmol，10×PCR缓冲液10μL，dNTP8μL，MgCl₂6μL，Ex Taq0.5μL，加水至100μL。PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 15s，50℃ 30s，72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min。1％琼脂糖凝胶电泳观察所扩增片段的大小。切下目的条带，使用DNA片段纯化剂盒回收。

(5)scFv基因的扩增

等摩尔比混合V_H和V_κ，V_H和V_λ基因片段，利用overlap-PCR扩增scFv基因，扩增体系如下：V_H l pmol，V_k(V_λ)1pmol，RSC-F60pmol，RSC-B60pmol，10×PCR缓冲液10μL，dNTP8μL，MgCl₂6μL，Ex Taq0.5μL，加水至100μL。PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 15s，56℃ 30s，72℃ 1min，25个循环；72℃10min。1％琼脂糖凝胶电泳观察所扩增片段的大小。切下目的条带，使用DNA片段纯化剂盒回收。

(6)scFv基因酶切及与载体连接。

将上述制备的scFv回收产物及载体质粒pComb3XSS用紫外分光光度计测核酸浓度后进行酶切。取scFv基因或载体pComb3XSS10μg，加入SfiI酶40u，10×缓冲液M40μL，加水到200μL，50℃酶切20h。1％琼脂糖凝胶电泳切下目的条带，进行胶回收，方法同前。取酶切后的scFv0.7μg，酶切后的载体pComb3XSS1.4μg，T4连接酶40u，5×连接缓冲液40μL，16℃连接过夜。

(6)连接产物的转化。将连接产物置于65℃水浴10min，灭活T4DNA连接酶。经乙醇沉淀后加入ddH₂O溶解连接产物。用0.2cm电转杯，25μF，2.5kV，200Q的电转条件转化感受态大肠杆菌XL1-Blue。迅速将转化产物加入5mL SOC培养基中，300rpm，37℃振摇培养1h，用预热的SB培养基(含20μg/mL Amp和10μg/mL四环素)10倍梯度稀释将菌液涂布于LB琼脂平板上，37℃培养过夜。次日计数细菌克隆数计算库容。

将电转化后的菌液加入辅助噬菌体VCSM13超感染，加入SB培养基(含20μg/mL Amp和10μg/mL四环素)37℃振摇培养1.5h，加卡那霉素到终浓度70μg/mL，37℃振摇培养过夜。离心沉淀菌体，收集上清，加入PEG8000/NaC1冰上沉淀噬菌体1h，15000rpm，4℃离心15min，弃上清，干燥后用2mL含1％BSA的PBS重悬。15000rpm，4℃离心5min，将上清用0.22μm过滤，即得到噬菌体展示scFv抗体库。

2.2抗SFTSV特异性噬菌体抗体富集筛选

(1)用纯化的SFTSV颗粒包被ELISA板1μf/孔L，洗涤加封闭液，洗涤，加噬菌体抗体库，洗去未结合的噬菌体，感染增殖，加辅助噬菌体VCSM13超感染；重复以上筛选步骤，共进行三轮“吸附-洗脱-扩增”富集筛选；

(2)将最后一轮筛选并增殖得到的噬菌体稀释后铺于培养板上，培养过夜，随机挑取90个单菌落于细胞培养板中，振摇培养过夜；从第一块板各孔中分别转移5μL菌液至第二块板，振摇培养；加辅助噬菌体VCSM13超感染，振摇培养；离心，培养基重悬沉淀，振摇培养过夜，离心取出上清进行ELISA检测(SFTSV颗粒包被ELISA板浓度为1μg/孔)，当P/N值(Positive/Negative)大于2.1时，该菌株为阳性单克隆噬菌体株；共得到14株阳性克隆。阳性克隆经核酸序列分析后，发现有6株不同序列scFv，分别是4-5、A5、A9、A11、B2和D6。

实施例三scFv抗体中和活性筛选

1.材料

用于实验的SFTSV毒株如下表所示。

^aSFTS病人来自于安徽或山东，病人收治和病毒分离在江苏省内医疗机构。

2.方法与结果

(1)scFv抗体片段的原核表达及纯化。将实施例二中得到的阳性噬菌体克隆质粒转化入E.coli TOP10F’感受态细胞，铺Amp平板，挑取单克隆，37℃振摇培养过夜；将过夜菌液1∶100转接新鲜的SB培养基，37℃振摇培养至OD600约为1.0；加入终浓度为1mmol/L的IPTG，250rpm，37℃振摇培养16h；12000rpm，4℃离心20min，弃上清，沉淀用结合缓冲液(含有20mmol/L PBS，8mol/L脲，20mmol/L咪唑)500mL重悬；将上述重新悬浮的溶液，超声裂解后(40％power，30min)，加1％Triton-100乳化30min，再次22000rpm、4℃离心30min后收集上清上His Trap柱；上样结束后用B结合缓冲液洗涤杂蛋白至A280值接近于0；用洗脱缓冲液(含有20mmmol/L PBS，8mmol/L脲，500mmmol/L咪唑)洗脱目的蛋白，收集洗脱峰；将洗脱目的蛋白稀释10倍后，用含有尿素的透析液进行透析复性，复性的尿素浓度梯度依次为4、2、1、0.5、0.25、0.125mmol/L(pH7.5)；透析完成后超滤管3000rpm浓缩蛋白，测定浓度后进行SDS-PAGE分析。

(2)中和实验。将浓度为100μg/mL的scFv片段50μL与等体积的SFTSV毒株JS-2010-003(含有100TCID50)混合，37℃作用1h，该混合物加入到96孔板中的Vero细胞单层中，于37℃、5％CO₂的培养箱中培养6天，每天观察细胞病变(Cytopathic effect，CPE)。对于能抑制大于90％CPE的单抗被认为具有中和活性。结果发现6个抗体中只有4-5具有中和活性，如图1。

实施例四4-5抗体克隆全分子化构建和真核表达

1.材料

引物：4-5IgGlVHfor，见序列表中SEQ ID NO：40；4-5IgGlVHreverse，见序列表中SEQ ID NO：41；4-5IgGlVkfor，见序列表中SEQ ID NO：42；4-5IgGlVkreverse，见序列表中SEQ ID NO：43；

2.方法结果

(1)杆状病毒重组质粒pAc-K-CH3-4-5IgG1的构建

PCR扩增4-5的VH、Vκ基因以4-5单链抗体质粒为模板，利用前述设计的2对引物，分别扩增VH、Vκ基因，每个扩增体系均包含以下内容：4-5scfv质粒0.1μg，上游引物60pmol，下游引物，60pmol，10×PCR缓冲液10μL，dNTP8μL，MgCl₂ 6μL，Ex Taq 0.5μL，加水至100μL。反应条件为：94℃ 5min；94℃ 15sec，56℃ 30sec，72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min。胶回收试剂盒回收目的条带。将上述PCR产物，分别用XhoI/NheI(V_H)、SacI/HindIII(V_k)进行酶切，同时真核杆状病毒表达载体质粒pAc-K-CH3先进行XhoI/NheI酶切，待V_H片段插入后，再进行SacI/HindIII酶切，插入V_k片段。酶切休系为：DNA 10μg，XhoI/NheI或SacI/HindIII各10u，10×酶切缓冲液10μL，加水至100μL。37℃酶切20h。1％琼脂糖凝胶电泳切下目的条带，进行胶回收。连接体系为：V_H或V_K3μL，载体3μL，T4DNA连接酶1μL5×连接缓冲液2μL，加水至10μL。16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α，通过PCR鉴定阳性克隆(如上述)，对于V_H和V_k都有插入的克隆，用Qiagen公司的质粒抽提试剂盒制备大约10μg纯化的重组质粒。

(2)MAb4-5IgG1全抗体分子在昆虫细胞中的表达。

采用pharmingen公司的BaculoGold共转染试剂盒，将重组质粒pAc-K-CH3-4-5IgGl转染SF9昆虫细胞。27℃培养4-5天后，观察感染情况；5天后收集感染上清，得到重组病毒。噬斑纯化及重组病毒扩增将SF9细胞传至24孔板后，用重组病毒感染。27℃培养4-5天后收获上清。2000rpm离心10min，去除细胞碎片。将收获的蛋白表达上清液用0.45μL的微孔滤膜后上样至GE Healthcare的protein A亲和层析柱；PBS洗至基线。洗脱液(0.1mol/L的Gly-HCl，pH2.7)洗脱，用1mol/L的Tris中和至pH7.0；对纯化的样品行SDS-PAGE检测，观察纯度。结果如图2所示。

(3)MAb4-5IgG1全抗体分子抗体中和活性测定

分别将不同浓度为的MAb4-5或MAb4-5IgG1 50μL与等体积的各SFTSV毒株(含有100TCID50)混合，37℃作用1h，将混合物加入到96孔板中的Vero细胞单层中，于37℃、5％  CO2的培养箱中培养6天，每天观察细胞病变(Cytopathic effect，CPE)。对于能抑制大于90％CPE的单抗被认为具有中和活性。结果如图3所示，MAb4-5从scFv片段转化成全分子IgG1其亲和力大约提高了20倍，具有较高的中和活性。

实施例五MAb4-5IgGl的中和活性谱验证

利用来自不同地区、时间的SFTSV分离株与MAb4-5IgGl做交叉保护实验，以测定该抗体分子的中和广谱性。具体实验步骤如下：

分别将浓度为100μg/mL的MAb4-5IgGl 50μL与等体积的各SFTSV毒株(含有100TCID50)混合，37℃作用1h，该混合物加入到96孔板中的Vero细胞单层中，于37℃、5％ CO₂的培养箱中培养6天，每天观察细胞病变(Cytopathiceffect，CPE)。对于能抑制大于90％CPE的单抗被认为具有中和活性。结果如图4所示，MAb4-5IgGl几乎可以中和来自不同疫区的、2010-2012年度的分离株，显示出MAb4-5IgGl较强的中和谱。

实施例五MAb4-5IgGl与JS-2010-003病毒颗粒的结合验证

免疫转印实验用纯化的JS-2010-003病毒颗粒1μg，与SDS-PAGE上样缓冲液混合，煮沸5min，12000rpm离心10min，以10％ SDS-PAGE进行电泳，转NC膜，以MAb4-5IgGl为一抗，anti-His HRP为二抗进行检测。结果如图5所示，该抗体能与分子量为65kDa的Gn糖蛋白结合。说明该抗体结合的表位为一线性表位。

免疫荧光实验用JS-2010-003感染Vero细胞后，接种于8-孔的Millicell EZ载玻片(为millipore公司产品)，于37℃、5％ CO₂的培养箱中培养36小时。经冷丙酮固定后，用MAb4-5 IgGl杂交，二抗为FITC-抗人IgG。玻片置于荧光显微镜下观察。结果如下，如图6所示，MAb4-5IgGl能与病毒感染的细胞特异性结合，而对照抗体(抗EV-71人源抗体)则不能结合。

免疫电镜实验将感染JS-2010-003的Vero细胞上清液，吸附到铜网上，然后滴加MAb4-5IgGl，于室温孵育30分钟，然后再滴加10nm金颗粒-抗人IgG，铜网经2％的磷钨酸负染后，用Hitachi 7650A投射电镜镜检。结果如下(图7)，与对照抗体人IgGl比较，MAb4-5 IgGl可特性结合到病毒外膜的糖蛋白上。

实施例六MAb4-5IgGl结合抗原表位的筛选

经网上服务器TMHMM Serverv.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)的预测，Gn蛋白有2个膜外区结构域，分别为Gnl(20-452aa)和Gn2(496-562aa)，而Gc有1个膜外结构域(1-473aa)，PCR分别扩增上述编码各个结构域的基因，克隆入真核表达载体pXJ40-HA，转染293细胞，进行瞬时表达。表达产物行免疫转印，用MAb4-5IgGl杂交。结果显示，上述3个结构域中，只有Gnl(20-452aa)能与MAb4-5IgGl结合(图8)，说明该抗体的结合靶点位于Gn糖蛋白的N末端。

实施例七MAb4-5中和作用机制

将重组的Gnl-HA融合蛋白与过量的MAb4-5scFv混合，4℃孵育过夜，该混合物再与Vero细胞共同孵育，于室温下作用2小时，经充分洗涤后，细胞与SDS-PAGE上样缓冲液混合，煮沸5min，12000rpm离心10min，以10％SDS-PAGE进行电泳，转NC膜进行Westem Blot检测。本次使用的抗体为HRP标记的抗HA标签的抗体。结果如下(图9)，MAb4-5scFv可有效地阻止Gnl与Vero细胞膜上的受体结合，而无中和活性抗体MAb A5scFv则不能阻止，说明MAb4-5是通过干扰病毒与其受体的结合而发挥中和作用的。

Claims (7)

1.一种抗SFTSV的人源单克隆抗体或其片段，包括轻链CDR1-3和重链CDR1-3，

其特征在于，所述轻链CDR1-3的氨基酸序列为：

CDR1：如序列表中SEQ ID NO：5所示；

CDR2：如序列表中SEQ ID NO：6所示；

CDR3：如序列表中SEQ ID NO：7所示；

所述重链CDR1-3的氨基酸序列为：

CDR1：如序列表中SEQ ID NO：8所示；

CDR2：如序列表中SEQ ID NO：9所示；

CDR3：如序列表中SEQ ID NO：10所示。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

3.如权利要求1-2任意一项所述的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述轻链可变区的核甘酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述重链可变区的核甘酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

4.权利要求1-3任意一项所述的单克隆抗体或其片段在制备检测SFTSV病毒的试剂、药剂或试剂盒中的应用。

5.如权利要求4所述的试剂、药剂或试剂盒，其特征在于，所述抗体或其片段带有生物标记或化学标记，所述生物标记或化学标记为荧光标记、放射性标记或酶标记。

6.权利要求1-3任意一项所述的单克隆抗体或其片段在制备治疗和/或预防SFTSV感染药物中的应用。

7.权利要求1-3任意一项所述的单克隆抗体或其片段在制备检测SFTSV的抗原或抗体的工具中的应用。

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