CN115819385A - 在生物催化剂存在下通过高法呢醇的生物转化形成的(-)-降龙涎香醚的固体形式 - Google Patents
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Abstract
通过生物转化过程形成的(‑)‑降龙涎香醚的固体形式。
Description
本申请是申请号为201780024917.7、申请日为2017年04月20日、发明名称为“在生物催化剂存在下通过高法呢醇的生物转化形成的(-)-降龙涎香醚的固体形式”的中国专利申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及(-)-降龙涎香醚(ambrox)的固体形式以及制备和纯化它们的方法。
发明背景
AMBROFIXTM是奇华顿(Givaudan)的(-)-降龙涎香醚的专利商品名,其具有式(I)
AMBROFIXTM是调香师成分调色板中重要的分子。它递送极为强力的、高度实质性的和高度稳定的适用于所有香味用品的琥珀香调。可从奇华顿获得的AMBROFIXTM是获得真正龙涎香香调的最适合材料。
目前,AMBROFIXTM与其他商业形式的(-)-降龙涎香醚一样由天然来源的原料通过合成化学生产。某些原料的可获得性和质量取决于气候条件以及社会经济因素。此外,由于原料可以从天然资源中提取,产量适中,因此它们的价格很可能不断增加,使得它们在工业规模上的应用不经济。因此,如果要继续以合理的成本获得AMBROFIXTM的商业化工业供应,则需要一种能够工业化的更具成本效益的生产和纯化方法。
工业上可扩展的形成(-)-降龙涎香醚生物的技术路线将具有吸引力,因为它可能比完全合成化学方法的复杂性更低、更环保且更有利于环境。
尝试生物转化以提供(-)-降龙涎香醚的潜在有用的底物是高法呢醇(homofarnesol)。在其开创性论文中,Neumann等人(Biol.Chem.Hoppe-Seyler,第367卷,第723-726页,(1986))讨论了在酶促催化下使用角鲨烯何帕烯(Hopene)环化酶(SHC)这样的酶将高法呢醇转化为(-)-降龙涎香醚的可行性。所用的高法呢醇是该分子的四种几何异构体的混合物。在四种异构体中,仅7E,3E几何异构体(使用常规命名法)可以被环化,且然后只有极低的所需(-)-降龙涎香醚收率。
JP2009-60799(Kao)公开了一种合成方法,其中SHC作用于高法呢醇底物以产生(-)-降龙涎香醚。底物是所有四种几何异构体(3Z,7Z;3E,7Z;3Z,7E;和3E,7E)的混合物。该对比文件仅公开了含有使用表达SHC基因的重组微生物制备的SHC的液体提取物从高法呢醇制备(-)-降龙涎香醚的方法。将高法呢醇混合物转化为(-)-降龙涎香醚及其9-表立体异构体,并且可以通过蒸馏或柱色谱法进行纯化。Kao没有描述其中使用产生SHC的基本上全或完整的微生物将高法呢醇转化为(-)-降龙涎香醚的方法,此外,其没有提供任何与通过这类可以产生嗅觉纯形式的(-)-降龙涎香醚的方法获得的复杂反应混合物的下游处理相关的技术教导。
据申请人所知,现有技术没有描述任何有活力的、工业上可扩展的方法,其涉及SHC催化的高法呢醇的生物转化,得到嗅觉纯的形式的(-)-降龙涎香醚。
此外,如果要在工业规模上实现高法呢醇的生物转化,则应当可以获得高纯度3E,7E-高法呢醇的成本有效来源。然而,虽然在文献中描述了合成高法呢醇的合成途径(参见例如US2013/0273619),但是根据申请人的知识,目前没有成本有效的、工业化规模的目前可利用的纯7E,3E-高法呢醇的来源。
仍然需要在有价值的香料成分(-)-降龙涎香醚中提供经济上可行且工业上可扩展的途径。
在共同悬而未决的专利申请PCT/EP2014/072891(公布为WO2015/059293)和PCT/EP2014/072882(公布为WO2015/059290)中,申请人描述了制备富含7E,3E几何异构体的7E,3E/Z-高法呢醇混合物的有效方法。7E,3E/Z-高法呢醇混合物由β-法呢烯制备,并且保留该原料中包含的异构体信息,使得7-位上的高法呢醇固定在E-构型中。然而,即使这种精制的化学成分仍然会产生3E/Z异构体混合物。纯7E,3E-高法呢醇仍然具有合成挑战性,并且可能仅通过经济上不利的异构体混合物纯化来实现。
尽管存在涉及从高法呢醇生物催化生产(-)-降龙涎香醚的研发,但是仍然需要提供从生物转化培养基中分离和纯化(-)-降龙涎香醚的有效方式,所述生物转化培养基包含颗粒材料和其他材料,例如细胞碎片,以及可能的副产物、未反应的底物和用于生物转化过程中的任何溶剂或其他试剂。
发明概述
在解决现有技术的缺陷时,申请人惊奇地发现(-)-降龙涎香醚的晶型可以在生物催化过程中形成。更具体地,申请人发现(-)-降龙涎香醚的晶体在生物转化培养基中形成。
(-)-降龙涎香醚在生物转化培养基中结晶的令人惊讶和出乎意料的方式以及形成的晶体的物理特性就从生物转化培养基中分离和纯化、基本上无色和展现真正的龙涎香香调的嗅觉纯形式(-)-降龙涎香醚方面而言是特别相关的。在生物催化剂是微生物生物催化剂的情况下,鉴于生物转化培养基中存在的微生物生物催化剂可能具有极其令人不愉快甚至令人反感异味特征的事实,(-)-降龙涎香醚以嗅觉纯的质量获得的发现尤其令人惊讶。(-)-降龙涎香醚晶体在生物转化培养基中形成在微生物催化剂外部的令人惊讶的发现使得能够特别有效地分离(-)-降龙涎香醚与恶臭气味介质。
因此,本发明在第一个方面提供式(I)的化合物的固体形式
其中所述固体形式的特征在于如下特征的至少一个:-
它展示出粉末X-射线衍射图案,该图案具有以下在约15.6、16.2、16.7、17.0、17.4、18.3+/-0.2°的衍射角2θ处的峰中的至少一个;
它包含通过激光粒度测定法测定的平均直径为10-400微米、更特别是40-400、且更特别是100-400的细长晶体;
它包含通过激光粒度测量法测定的沿其最长尺寸测量的长度为20至600微米、更特别是40至500且更特别是100至400、优选大于100、更特别是大于200且更特别是大于300微米的细长晶体;和
它基本上是无色的,如该术语在下文中定义的。
在一个更具体的实施方案中,式(I)的化合物的固体形式的特征在于粉末X-射线衍射图案,该图案展示出如下在约15.6、16.2、16.7、17.0、17.4和18.3+/-0.2°的衍射角2θ处的峰。
在更具体的实施方案中,式(I)的化合物的固体形式的特征在于基本上如在下面图1中所描绘的粉末X-射线衍射图案。
迄今为止,就申请人所知,在现有技术中,尚未描述或启示通过生物催化过程形成的(-)-降龙涎香醚的固体形式。
因此,本发明在其另一方面提供了式(I)的生物转化产物的固体形式。
在本发明的一个实施方案中,式(I)的生物转化产物的固体形式具有上文涉及的特征中的至少一种。
可以使用本领域公知的衍射仪设备以直接的方式收集上文涉及的粉末x-射线衍射数据。用于测量本文涉及的粉末X-射线衍射图案的方法和仪器在实施例中更详细地描述。
根据本领域众所周知的方法通过显微镜检查确定晶体的形状,并且在这里不需要进一步详述。
根据本发明获得的单个晶体的特征尺寸和形状展示在下面的图2中。
通过激光粒度测定法测定晶体的平均直径测量值。激光粒度测定法是本领域众所周知的技术。平均粒度可以在任何已知用于此目的的粒度分析仪上测定,例如CILAS 1180No.516仪器。可以根据ISO标准13320-1(2009修订版)使用Fraunhofer方法进行测量,其中水作为载液并且遮光指数(Obscuration Index)为24。
如上所述,(-)-降龙涎香醚在生物转化培养基中以晶型出现的事实以及晶体的物理特性即它们的尺寸和密度就(-)-降龙涎香醚的分离效率和最终其清晰度和嗅觉纯度方面而言是特别相关的。
更具体地,可以通过颗粒离析步骤有效地将晶体与包括颗粒材料(例如细胞碎片)的生物转化培养基以及任何副产物、杂质等分离,所述颗粒离析步骤是利用晶体的物理特性(例如尺寸、形状和/或密度)的分离步骤,更具体地是过滤或滗析步骤。
此外,不仅从颗粒和其他材料中而且还从多成分和高度着色的生物转化培养基中有效地分离晶体使得能够有效分离(-)-降龙涎香醚与杂质,包括可能形成的任何副产物,其可包括结构(构成)异构体和立体异构体,例如下文中称为化合物(II)、(III)和(IV)的那些立体或构成异构体,其与(-)-降龙涎香醚不同,不在生物转化培养基中结晶。因此,作为其中(-)-降龙涎香醚晶体的方式以及颗粒离析步骤的结果,能够使得申请人得到(-)-降龙涎香醚作为基本上无色和嗅觉纯的产物。
因此,本发明在其另一个方面提供了制备(-)-降龙涎香醚的固体形式的方法,该方法包括下列步骤:-
I)通过生物催化过程在生物转化培养基中形成结晶(-)-降龙涎香醚;和
II)将结晶(-)-降龙涎香醚与生物转化培养基分离。
可以按照本发明从其中分离结晶(-)-降龙涎香醚的生物转化培养基可以含有各种杂质,例如颗粒材料、副产物等。特别地,当使用微生物生物催化剂进行生物转化时,可以将结晶(-)-降龙涎香醚与含有细胞和细胞碎片的生物转化培养基分离。
在本发明的一个具体的实施方案中,分离步骤是颗粒离析步骤,其不仅允许从液相中分离结晶材料,而且允许从任意颗粒材料例如细胞或细胞碎片中分离晶体,这归因于晶体的物理特性,例如其尺寸、形状和/或密度。
在一个更具体的实施方案中,颗粒离析步骤是过滤步骤、滗析步骤或过滤与滗析的组合。
可替代地或者除了过滤和/或滗析之外,还可以使(-)-降龙涎香醚沉淀。优选地,在过滤和/或滗析和/或沉淀前使(-)-降龙涎香醚熔化。
在本发明的一个具体的实施方案中,在分离步骤ii)前,可以加热生物转化培养基以熔化(-)-降龙涎香醚晶体,然后逐步冷却以允许(-)-降龙涎香醚重结晶。为了该目的,可以将生物转化培养基加热至至少55℃的温度。加热可以在约15分钟至约2小时期限内逐步进行,然后以几度/小时、更具体地约5℃/小时的速率缓慢地冷却至约20℃或更低的温度,例如冷却至4℃。在这种冷却后,在8小时期间将生物转化培养基维持在4℃。
重结晶步骤能够使得更大和更均匀的晶体形成,这有助于进一步改善分离步骤的效率。
令人惊奇地发现,在重结晶之前向生物转化培养基中添加盐有助于晶体生长,这进一步增加了晶体的尺寸并且生成更均匀的晶体尺寸分布。具体的盐包括无机盐且特别是氯化钙、氯化钠、氯化镁、氯化钾和氯化锂。
晶体的增加的尺寸和改善的均匀度可以有利于随后的颗粒离析步骤,因为在生物转化期间形成的较小或破碎的晶体被消除。
可以通过过滤进行颗粒离析步骤,其中使用的过滤器的筛网尺寸足够大以允许生物转化培养基中包含的颗粒材料例如细胞和细胞碎片与滤液一起通过过滤器,同时筛网尺寸足够小以捕获全部或基本上全部(-)-降龙涎香醚晶体作为保留物。
可以用适合的过滤床过滤(-)-降龙涎香醚晶体,所述过滤床具有10-100微米或更大、优选大于约50微米、60微米、70微米、80微米、90微米或100微米的筛网尺寸。
关于进行过滤的方式,可以使用任意已知的过滤技术和设备。然而,优选提供工业上可扩展的技术。在这方面离心过滤是特别适合的。
过滤离心设备是本领域广泛已知的(参见,例如“Separation and PurificationTechniques in Biotechnology”,第1章,Frederick J.Dechow Noves;Publications ISBNNo.0-8155-1197-3。该设备可以是其任意变化形式,包括分离板离心机或圆筒型离心机。
能够使用连续筛式离心机进行过滤步骤,例如Siebtechnic H250设备。筛目尺寸可以是上文涉及的任意尺寸且特别是约100微米或更大。在过滤过程的效率方面,离心机可以以500-2500g、且更具体地约2000g、仍然更具体地2028g运转。可以优化进料入离心机的生物转化培养基的速率以便提供最有效过滤的可能性,并且可以包括300-800kg/小时、且更具体地约400kg/小时、仍然更具体地约430kg/小时的速率。
或者,颗粒离析步骤可以通过滗析步骤进行。
在滗析过程中,使生物转化培养基进料入适合的滗析设备,并且在其中经受重力加速。根据斯托克斯定律(Stoke’s Law),生物转化培养基中较小和较不致密的颗粒材料例如细胞或细胞碎片保持悬浮于包含生物转化过程的其他杂质的上清液中,而相对大和致密的(-)-降龙涎香醚晶体作为沉淀物沉降在为其提供的床上。分离可以通过静态方式进行,或者可以通过使生物转化培养基经受至多6000g、更具体地约500-1500g、且更具体地约1000g和仍然更具体地1170g的力来促进。
可以分离和弃去上清液,或可替代地对其进行进一步的滗析步骤以分离和回收保留在上清液中的任何结晶(-)-降龙涎香醚。
滗析设备是本领域一般公知的。适用于本发明的特定设备是Guinard Decanter,例如型号D1LC20HC。可以使生物转化培养基以任意期望的优化速率进料入所述设备,以提供有效的处理量,例如至多500kg/小时且更具体地约300-400kg/小时。
可以单独使用过滤和滗析作为颗粒离析过程中的步骤,或者可以使用过滤和滗析步骤的组合。可以洗涤从颗粒离析步骤的反应培养基中分离的(-)-降龙涎香醚晶体以除去任何残留的颗粒材料,例如细胞或细胞碎片,以及任何其他残留杂质,例如副产物、溶剂、未反应的底物等。
用于洗涤晶体的溶剂包括任意的溶剂,其中(-)-降龙涎香醚在进行洗涤步骤时的温度下不溶或极难溶。更具体地,认为(-)-降龙涎香醚不溶或极难溶于溶剂,其中(-)-降龙涎香醚的溶解度在5℃下为10wt%或更低。
使用水、与水溶混的溶剂或其混合物进行洗涤。适合的与水溶混的溶剂包括低级链烷醇,例如乙醇。
更具体地,用水洗涤晶体,例如3质量的水与1质量的晶体。可以进行多次洗涤。
洗涤后,滤液或视情况而定的上清液可以被弃去。
(-)-降龙涎香醚的回收可以通过从过滤器或滗析设备或带式过滤器(例如改型7、8、9和20)中机械除去、收集和干燥来实现。(-)-降龙涎香醚可以以这种形式用于香味用品,无需进一步纯化或精制(polishing)。
然而,更典型地,可以将(-)-降龙涎香醚溶于溶剂并且进行如下文更详细举出的进一步纯化步骤,然后用于香味用品。
得自分离步骤的(-)-降龙涎香醚可以溶于适合的溶剂。适合的溶剂包括甲苯或低级链烷醇,例如乙醇,例如96%乙醇。
(-)-降龙涎香醚溶液可以在过滤器上进行过滤步骤,所述过滤器具有的筛目尺寸适合于从(-)-降龙涎香醚除去和分离在颗粒离析步骤和随后的洗涤过程中可能尚未被除去的任何残留颗粒材料例如细胞或细胞碎片。适合的筛目尺寸可以从0.22-1微米开始并且至多为150微米。根据本发明,可以使用本领域已知适合于这类目的的任何过滤技术和设备。
乙醇可以用于溶解晶体。使用的乙醇量优选足以在约25℃下溶解(-)-降龙涎香醚,典型地为约1份晶体/4份乙醇,并且用0.22微米过滤器(例如KDS 15)在1巴压力和环境温度下过滤该溶液。此外,最终可以使用0.22微米过滤器过滤作为精细过滤步骤。
在该阶段过滤以除去任何残留的颗粒材料例如细胞或细胞碎片可以对(-)-降龙涎香醚具有除臭作用。这是因为如果保留在最终的(-)-降龙涎香醚产物中,则残留细胞或细胞碎片可能是极为令人不愉快的异味的原因。异味可以因(-)-降龙涎香醚的固定特性而特别地逗留不去,且由此其去除对于得到嗅觉纯(-)-降龙涎香醚的目的是特别重要的。
(-)-降龙涎香醚可以进行任选的漂白步骤以除去任何残留的着色物质,尽管晶体从生物转化培养基中有效分离,但是着色物质仍然可能存在。对于香料用品,即使轻微着色的(-)-降龙涎香醚作为原料也是不期望的,且由此特别重要的是净化(-)-降龙涎香醚至最大可能的程度,只要该产品对于香料用品且特别是精细香料用品或加香的化妆用品是有价值的即可。
为了该目的,可以使增溶的(-)-降龙涎香醚晶体溶液与漂白剂接触,例如活化的蒙脱石粘土和/或活性炭。适合的漂白剂包括TONSIL FF,更具体地为TONSIL 412FF和/或兽炭黑或诺瑞特(Norit)。
任选地,作为向(-)-降龙涎香醚溶液中添加漂白剂的可替代选择,可以浓缩溶液并且减压蒸馏固体残留物。
可以向(-)-降龙涎香醚回流溶液(80-85℃)中加入漂白剂。为了该目的,可以加入作为在适合的溶剂例如乙醇中的混悬液的漂白剂。漂白剂和溶液的接触可以为约30分钟的时间期限。此后,通过过滤,例如使用25微米过滤器除去漂白剂。
漂白剂在减少高度着色的反应混合物的颜色方面可能不一定有效,并且不一定达到香味用品所需或适合的程度。然而,由于从本文所述的生物转化培养基中有效分离和纯化(-)-降龙涎香醚,所以(-)-降龙涎香醚溶液已经基本上是无色的,并且对于该溶液得到期望的漂白作用是不那么困难的。作为结果,能够得到(-)-降龙涎香醚形式,尽管其是生物催化过程的产物,其具有所需的亮度和色泽,如果该产物用于香味用品,则所述亮度和色泽是期望的。
根据本发明的方法,通过除去溶剂可以固体形式提供除臭的和脱色的(-)-降龙涎香醚溶液。可以通过重结晶或通过蒸发来实现溶剂去除。可以得到回收的(-)-降龙涎香醚,其为重结晶形式或为固体残留物,根据其中溶剂除去方式的不同,可以对其进行粉碎。
可以通过蒸发除去溶剂,并且例如通过粉碎可回收残留固体,储存并用于香味用品。
或者,可以将残留固体溶于适合的重结晶溶剂。用于该目的的适合的溶剂是与水溶混的链烷醇,例如乙醇,或所述链烷醇与水的混合物。可以将重结晶溶剂加热至约75-80℃下15分钟,然后逐步冷却至约10-15℃。可以通过过滤回收得到的晶体,并且任选地真空干燥(例如0.5巴)。
作为本发明方法的结果,可以得到固体形式的(-)-降龙涎香醚,其为基本上无色的和嗅觉纯的。
因此,本发明在其另一方面中提供了基本上无色的(-)-降龙涎香醚的固体形式,该(-)-降龙涎香醚的固体形式具有90或更高的L*值;小于1且大于-1的a*值;和小于8的b*值,其中L*、a*和b*值表示CIELAB系统的色度坐标。
本发明(-)-降龙涎香醚的固体形式展示出高明亮度或高亮度和低黄色度。这对于香味用品且特别是对于精细香料或预期用于化妆品的香料是重要的,因为视觉美感和香味是高度有价值的,并且加香产品不应作为香味成分导入的结果被变色。
本发明的(-)-降龙涎香醚具有指示亮度为90或更高的L*值和指示为8或更低的蓝-黄色泽的b*值。L*值优选为92或更大,乃至93或更大。b*值优选为5或更低,乃至4或更低。
L*值是指定物质的亮度的值并且由0-100的值表示。100的L*值表示最亮状态(完全白色)且0的L*值表示最暗状态(完全黑色)。
b*值指定物质的蓝-黄色泽。b*值越大,则黄色度越高。b*值越小,则蓝色度越高。
L*值和b*值可以根据色差指示法由Lab色度坐标表示。L*值和b*值可以使用任意适合的商购分光光度计例如Minolta CM3500d测定。
在进行测定前,应将分光光度计通电至少1小时。为此提供的玻璃容器应该用待测量的固体产物填充一半,注意确保容器的底部完全被产物覆盖。此后,填充的容器应置于为此提供的样品平台内。应按下仪器上的样品键,并从显示面板上读取L*a*b*值。
在读取任何读数之前,应通过在仪器光学传感器的窗口上放置为此配备的黑色和白色物体来校准仪器的0和100%反射。
在本发明的一个实施方案中,(-)-降龙涎香醚的固体形式为上述表征的晶型。
在本发明的一个实施方案中,(-)-降龙涎香醚的固体形式是生物转化产物。
在本发明的一个实施方案中,(-)-降龙涎香醚的固体形式是根据如本文所述的生物转化过程形成的生物转化产物。
本发明的另一个方面提供了通过如本文所述的生物催化过程得到的(-)-降龙涎香醚的形式。
在一个更具体的实施方案中,所述生物催化过程是微生物生物催化过程。
本发明的另一个方面提供了本文定义的(-)-降龙涎香醚的形式在香料或香精用品中的用途。
本发明的原理、用途和实施方式可以参照附带详细描述和附图进一步示例和理解。然而,在更详细解释本发明的具体的实施方案之前,应当理解,本发明不将其原理限于下文描述的详细内容。
发明详述
根据本发明,(-)-降龙涎香醚的晶型通过生物转化过程得到。生物转化的精确性质(例如,所用生物催化剂的性质、底物,底物生物转化的反应条件等)并不关键,只要条件允许生物催化剂将底物转化以产生在生物转化培养基中结晶的形式的(-)-降龙涎香醚。
在本发明的一个实施方案中,由7E,3E/Z-高法呢醇混合物组成的底物进行生物转化过程,由此高法呢醇混合物在表达酶的重组微生物存在下被酶促环化,所述酶特别是能够将高法呢醇生物转化成(-)-降龙涎香醚的角鲨烯何帕烯环化酶(SHC)生物催化剂,从而得到反应混合物,从其中使用令人惊奇的有效下游加工可以分离基本上无色和嗅觉纯形式的(-)-降龙涎香醚。
本发明的一个方面提供了酶催化的高法呢醇的环化,得到包含(-)-降龙涎香醚的反应混合物,其中高法呢醇包含高法呢醇的7E,3E/Z-几何异构体混合物,并且其中该反应在重组微生物存在下进行,所述重组微生物是产生酶的重组微生物,更具体地为产生酶的基本上全或完整的重组微生物。
环化反应在能够将高法呢醇生物转化成(-)-降龙涎香醚的SHC生物催化剂存在下进行。
SHC生物催化剂是野生型或变体酶或是表达编码SHC酶的基因的微生物,优选重组大肠杆菌(E.coli)微生物。SHC生物催化剂可以以任意形式使用,例如、但不限于纯化的SHC酶、包含SHC酶的粗提取物或固定化SHC酶(例如在载体上),或者生物催化剂可以是具有产生的或正在产生的SHC酶的微生物,例如包含SHC酶的完整的重组全细胞和/或碎裂细胞或膜级分。
在本发明的一个具体的实施方案中,高法呢醇混合物富含7E,3E-几何异构体。
在一个更具体的实施方案中,高法呢醇混合物为至少55/45重量的7E,3E/7E,3Z。
在一个更具体的实施方案中,高法呢醇混合物为至少70/30重量的7E,3E/7E,3Z。
在一个仍然更具体的实施方案中,高法呢醇混合物为至少80/20重量的7E,3E/7E,3Z。
在一个仍然更具体的实施方案中,高法呢醇混合物为至少90/10重量的7E,3E/7E,3Z。
在一个仍然更具体的实施方案中,高法呢醇混合物为至少95/5重量的7E,3E/7E,3Z。
在一个更具体的实施方案中,高法呢醇混合物由7E,3E/Z-几何异构体组成且无其他的高法呢醇几何异构体。
本领域技术人员可以理解,术语7E、7Z、3E或3Z与高法呢醇结合使用分别是指高法呢醇的7-位和3-位上的双键的取向。7E,3E-高法呢醇化合物具有CAS No.459-89-2,而7E,3Z-高法呢醇化合物具有CAS No.138152-06-4。术语7E,3E/Z-高法呢醇的应用是指化合物的混合物。
得到用作本发明方法环化反应中的底物的高法呢醇混合物的方法在上文涉及的悬而未决的申请PCT/EP2014/072891(公布为WO2015/059293)和PCT/EP2014/072882(公布为WO2015/059290)中举出,其作为引用整体导入。一般而言,它们描述高法呢醇混合物的合成,其通过使用N-烷基-N-亚硝基脲的有机溶液将法呢烯、更具体地为α-法呢烯和/或β-法呢烯转化成其相应的环丙烷化法呢烯衍生物来进行。然后环丙烷化衍生物在布朗斯台德酸存在下进行开环和重排反应,得到高法呢醇混合物,其对7E,3E几何异构体具有选择性。使用法呢烯作为原料是特别优选的,因为它确保高法呢醇的7位上的双键的E-构型被固定。
形成本发明具体的实施方案的特定反应条件在悬而未决的申请以及下文实施例中举出且在此处无需更详细描述。
高法呢醇环化得到包含(-)-降龙涎香醚的反应混合物可以由角鲨烯何帕烯环化酶(SHC)催化。SHC可以是野生型酶(例如SEQ ID No.1)或其变体(例如SEQ ID No.2或SEQID No.4)。SHC可以得自酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)(酸热芽胞杆菌(Bacillus acidocaldarius))、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)或大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)(如US2012/0135477A1的实施例3b所举出)。
然而,还可以通过重组方式,使用本领域一般公知的技术生产酶。
作为在产生酶的方面使用的术语“重组”应是指通过重组DNA技术产生的酶,即由编码所需酶的外源DNA构建体转化的细胞产生。因此,术语“重组DNA”包括导入载体、导入自主复制质粒或病毒的重组DNA,或导入原核生物或真核生物的基因组DNA(或在除了非天然染色体位置之外的位置上的同源细胞基因组)的重组DNA。
核酸分子可操作地连接至表达控制序列,从而允许在原核和/或真核宿主细胞中的表达。如本文所用,“可操作地连接”是指导入遗传构建体,使得表达控制序列有效地控制所关注编码序列的表达。上文涉及的转录/翻译调控元件包括、但不限于诱导型和非诱导型、组成型、细胞周期调控型、代谢调控的启动子、增强子、操纵子、沉默子、阻抑物和本领域技术人员已知和驱动否则就是调节基因表达的其他元件。这类调控元件包括但不限于指导组成型表达的调控元件或允许诱导型表达的调控元件,例如CUP-1启动子,如所使用的tet-阻抑物,例如,在tet-on或tet-off系统中的tet-阻抑物,lac系统、trp系统调控元件。作为实例,异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)是在100μM至1.0mM的浓度范围内的蛋白质表达的有效诱导物。该化合物是异乳糖的分子模拟物,它是触发lac操纵子的转录的乳糖代谢物,因此它用于诱导蛋白质表达,其中基因在lac操纵子的控制下。
类似地,核酸分子可以形成编码另外的多肽序列的杂合基因的一部分,例如,用作标记或报道分子的序列。标记和报道基因的实例包括β-内酰胺酶,氯霉素乙酰转移酶(CAT),腺苷脱氨酶(ADA),氨基糖苷磷酸转移酶二氢叶酸还原酶(DHFR),潮霉素-B-磷酸转移酶(HPH),胸苷激酶(TK),lacZ(编码β-半乳糖苷酶)和黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)。与许多与实施本公开相关的标准方法一样,本领域技术人员将知晓其他有用的试剂,例如,可以起标记物或报道分子功能的其他序列。
重组多核苷酸可以编码SHC酶,例如野生型SHC或其变体,其可以插入载体中用于表达和任选的纯化。一种类型的载体是代表连入额外的DNA片段的环状双链DNA环的质粒。某些载体可以控制它们功能性连接的基因的表达。这些载体被称为“表达载体”。通常,适合于DNA重组技术的表达载体属于质粒类型。典型地,表达载体包含基因,例如野生型SHC或其变体。在本说明书中,术语“质粒”和“载体”可互换使用,因为质粒是最常使用的载体类型。
这类载体可包括DNA序列,其包括但不限于天然存在于宿主细胞中的DNA序列,通常不转录成RNA或翻译成蛋白质(“表达”)的DNA序列和期望导入非重组宿主中的其他基因或DNA序列。可以理解,典型地,通过稳定导入一种或多种重组基因来增强重组宿主的基因组。然而,自主或复制质粒或载体也可以在本公开的范围内使用。而且,本公开可以使用低拷贝数实施,例如单拷贝或高拷贝数质粒或载体。
在一个优选的实施方案中,本公开的载体包含质粒,噬菌粒,噬菌体,粘粒,人工细菌和人工酵母染色体,敲除或敲入构建体,合成核酸序列或弹夹,且子集可以以线性多核苷酸,质粒,大质粒,合成或人工染色体例如植物,细菌,哺乳动物或酵母人工染色体的形式产生。
优选的是,导入的多核苷酸编码的蛋白质在导入载体后在细胞内产生。可以将多种基因底物导入质粒中。质粒通常是标准克隆载体,例如细菌多拷贝质粒。底物可以导入相同或不同的质粒中。通常使用具有不同类型的选择标记的至少两种不同类型的质粒来选择含有至少两种类型载体的细胞。
典型地,细菌或酵母细胞可以用本领域众所周知的任何一种或多种下列核苷酸序列进行转化。对于体内重组,将与基因组或其他基因重组的基因用于使用标准转化技术转化宿主。在适合的实施方案中,提供复制起点的DNA包括在构建体中。复制起点可由技术人员适当选择。取决于基因的性质,如果序列已经存在于可作为复制起点本身的基因或基因组中,则可能不需要补充的复制起点。
当这类DNA被导入细胞内时,细菌或酵母细胞可被外源或异源DNA转化。转化DNA可以整合或不整合,即共价连接到细胞基因组中。例如,在原核生物和酵母中,转化DNA可以维持在游离元件如质粒上。对于真核细胞,稳定转化的细胞是转染的DNA已整合到染色体中的细胞,使得通过染色体复制由子细胞遗传。这种稳定性通过真核细胞建立由含有转化DNA的子细胞群组成的细胞系或克隆的能力来证明。
通常,导入的DNA最初不是驻留在作为DNA接受者的宿主中,但是从给定宿主中分离DNA片段并随后导入其中的一个或多个其他拷贝也在本公开的范围内,即DNA进入相同的宿主,例如,以增强基因产物的产生或改变基因的表达模式。在某些情况下,引入的DNA将通过例如同源重组或定点诱变来修饰或甚至替换内源基因或DNA序列。适合的重组宿主包括微生物,植物细胞和植物。
本公开还涉及重组宿主。术语“重组宿主”,也称为“遗传修饰的宿主细胞”或“转基因细胞”,表示包含异源核酸或其基因组已被至少一个导入的DNA序列增强的宿主细胞。可以用如上概述的多核苷酸或载体对本公开的宿主细胞进行遗传改造。
可用于本公开目的的宿主细胞包括但不限于原核细胞,例如细菌(例如,大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)),其可以用例如重组噬菌体DNA、质粒DNA、细菌人造染色体或包含本公开多核苷酸分子的粘粒DNA表达载体转化;简单的真核细胞如酵母(例如,糖酵母属(Saccharomyces)和毕赤氏酵母属(Pichia)),其可以用例如含有本发明的多核苷酸分子的重组酵母表达载体转化。根据宿主细胞和用于导入多核苷酸的相应载体的不同,多核苷酸可以被整合到例如染色体或线粒体DNA中,或者可以在染色体外维持,例如,附加地或者可以仅短暂地包含在细胞中。
本文中使用的术语“细胞”特别是涉及遗传工程并将一个或多个基因或组装的基因簇导入细胞或生产细胞中,应理解为指任何原核或真核细胞。根据本公开内容考虑使用原核和真核宿主细胞,包括细菌宿主细胞如大肠杆菌或芽孢杆菌属(Bacillus sp),酵母宿主细胞如酿酒酵母(S.cerevisiae),昆虫宿主细胞如Spodoptora frugiperda或人宿主细胞如HeLa和Jurkat。
具体地,细胞是真核细胞,优选真菌,哺乳动物或植物细胞,或原核细胞。适合的真核细胞包括,例如但不限于,哺乳动物细胞,酵母细胞或昆虫细胞(包括Sf9),两栖动物细胞(包括载黑素细胞),或蠕虫细胞,包括新杆状线虫(Caenorhabditis)细胞(包括秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans))。适合的哺乳动物细胞包括,例如但不限于,COS细胞(包括Cos-1和Cos-7),CHO细胞,HEK293细胞,HEK293T细胞,HEK293T-RexTM细胞或其他可转染的真核细胞系。适合的细菌细胞包括但不限于大肠杆菌。
优选地,可以使用原核生物,例如大肠杆菌,芽孢杆菌属,链霉菌属(Streptomyces)或哺乳动物细胞,如HeLa细胞或Jurkat细胞,或植物细胞,如拟南芥属(Arabidopsis)。
优选地,细胞是曲霉菌属(Aspergillus sp)或真菌细胞,优选其可以选自糖酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyces)、子囊菌酵母属(Yarrowia)、毕赤氏酵母属和曲霉菌属。
优选地,大肠杆菌宿主细胞是被工业和监管机构认可的大肠杆菌宿主细胞(包括但不限于大肠杆菌K12宿主细胞或在实施例中证明的大肠杆菌BL21宿主细胞)。
与本公开一起使用的一种优选宿主细胞是大肠杆菌,其可以如本文所述重组制备。因此,重组宿主可以是重组大肠杆菌宿主细胞。存在突变体文库,质粒,代谢的详细计算机模型和大肠杆菌可用的其他信息,允许合理设计各种模块以提高产品收率。类似于上述酵母菌属的方法可用于制备重组大肠杆菌微生物。
在一个实施方案中,重组大肠杆菌微生物包含编码SHC基因或其功能等同物/同源物的核苷酸序列,包括但不限于其变体,同源突变体,衍生物或片段。
与本公开一起使用的另一种优选的宿主细胞是酿酒酵母,其是合成生物学中广泛使用的底物生物。因此,重组宿主可以是酿酒酵母。存在突变体文库,质粒,代谢的详细计算机模型和可用于酿酒酵母的其他信息,允许合理设计各种模块以提高产物收率。已知制备重组酿酒酵母微生物的方法。
以常规方式进行细胞培养。培养基含有碳源,至少一种氮源和无机盐,并向其中加入维生素。该培养基的成分可以是通常用于培养所述微生物种类的成分。
本方法中使用的碳源包括可以被重组宿主细胞代谢以促进(-)-降龙涎香醚的生长和/或产生的任何分子。适合碳源的实例包括但不限于蔗糖(例如,如在糖蜜中所发现的),果糖,木糖,甘油,葡萄糖,纤维素,淀粉,纤维二糖或其他含葡萄糖的聚合物。
在使用酵母作为宿主的实施方案中,例如,碳源如蔗糖,果糖,木糖,乙醇,甘油和葡萄糖是适合的。碳源可以在整个培养期间提供给宿主生物体,或者可选地,生物体可以在另一种能量源(例如蛋白质)的存在下生长一段时间,然后仅在补料分批阶段提供。
用于本公开内容的方法的重组宿主细胞微生物的适合性可以通过使用众所周知的方法的简单测试程序来确定。例如,待测微生物可以在丰富培养基(例如,LB培养基,Bacto-胰蛋白胨酵母提取物培养基,营养培养基等)中在通常用于微生物繁殖的pH、温度和通气条件下繁殖。一旦选择产生所需生物转化产物的重组微生物(即重组宿主细胞),产物典型地通过适合的表达系统和发酵,例如通过细胞培养中的微生物生产大规模生产宿主细胞系产生。
在本公开的一个实施方案中,定义的基本培养基例如M9A用于细胞培养。M9A培养基的成分包含:14g/L KH2PO4、16g/L K2HPO4、1g/L Na3柠檬酸.2H2O、7.5g/L(NH4)2SO4、0.25g/L MgSO4.7H2O、0.015g/L CaCl2.2H2O、5g/L葡萄糖和1.25g/L酵母提取物)。
在本公开的另一个实施方案中,使用营养丰富的培养基如LB(Luria-Bertani)。LB的成分包含:10g/L胰蛋白胨,5g/L酵母提取物,5g/L NaCl)。
矿物培养基和M9矿物培养基的其他实例公开于例如US6,524,831B2和US2003/0092143A1中。
重组微生物可以以分批、补料分批或连续过程或其组合生长。典型地,重组微生物在发酵罐中在适合的营养源(例如碳源)存在下在限定的温度下生长所需的时间段,以便将高法呢醇生物转化为所需量的(-)-降龙涎香醚。
可以以任何适合的方式培养重组宿主细胞,例如通过分批培养或补料分批培养。如本文所用,术语“分批培养”是在培养期间既不添加也不取出培养基的培养方法。如本文所用,术语“补料分批”是指在培养期间添加培养基、但不取出培养基的培养方法。
本公开的一个实施方案提供了在细胞系统中产生(-)-降龙涎香醚的方法,所述方法包括在细胞系统中在适合的条件下产生野生型SHC或其变体,将高法呢醇喂养至细胞系统,使用SHC或使用细胞系统所产生的变体将高法呢醇转化为(-)-降龙涎香醚,从细胞系统收集(-)-降龙涎香醚并从系统中分离(-)-降龙涎香醚。其他核苷酸序列的表达可用于增强该方法。生物转化方法可以包括在细胞系统中额外表达其他核苷酸序列。其他核苷酸序列的表达可以强化制备(-)-降龙涎香醚的生物转化途径。
本公开的另一个实施方案是制备(-)-降龙涎香醚的生物转化方法,其包括使包含野生型SHC或变体基因的宿主细胞生长,在宿主细胞中产生野生型SHC或变体酶,将高法呢醇(例如EEH)供给宿主细胞,在适于促进高法呢醇转化成降龙涎香醚的pH、温度和增溶剂条件下温育宿主细胞,并收集(-)-降龙涎香醚。宿主细胞中野生型SHC或变体酶的产生提供了一种制备(-)-降龙涎香醚的方法,此时高法呢醇在适合的反应条件下被加入到宿主细胞中。通过向反应混合物中加入更多的生物催化剂和SDS可以提高转化率。
可以以多种方式培养重组宿主细胞微生物,以提供表达野生型SHC或变体酶的适合量的细胞用于随后的生物转化步骤。由于适用于生物转化步骤的微生物广泛变化(例如酵母,细菌和真菌),因此培养条件当然可根据每个物种的具体要求进行调整,这些条件是众所周知的并有文献记载。用于培养重组宿主细胞微生物细胞的任何本领域已知方法可用于产生可用于本公开的后续生物转化步骤的细胞。通常,细胞生长至特定密度(可测量为光密度(OD)),以产生用于生物转化反应的足够生物质。选择的培养条件不仅影响获得的细胞(生物质)的量,而且培养条件的质量也影响生物质如何成为生物催化剂。表达野生型SHC或变体基因并产生野生型SHC或变体酶的重组宿主细胞微生物被称为生物催化剂,其适用于生物转化反应。在一些实施方案中,生物催化剂是产生野生型SHC或变体酶的重组全细胞或它可以是悬浮的或固定的形式。
在一个实施方案中,生物催化剂以足量产生(以生成足够的生物质),收获并且洗涤(并且任选地储存(例如冷冻或冻干)),然后进行生物转化步骤。
在另一个实施方案中,以足够的量产生细胞(以产生足够的生物催化剂),然后调节反应条件,而不需要收获和洗涤生物催化剂用于生物转化反应。该一步(或“单罐”)方法是有利的,因为它简化了工艺,同时降低了成本。用于生长细胞的培养基也适用于生物转化反应,条件是调节反应条件以促进生物转化反应。
本公开的生物转化方法在时间,温度,pH和增溶剂的条件下进行,以提供高法呢醇原料向(-)-降龙涎香醚的转化。反应混合物的pH对于SHC变体酶可以为4-8,优选5-6.5,更优选4.8-6.0,而对于野生型SHC酶在约pH5.0至约pH7.0的范围内,并且可以通过向所述SHC酶添加缓冲液来维持。用于此目的的示例性缓冲液是柠檬酸缓冲液。或者,当调节至pH时,补充有或不含0.5%或0.9%NaCl的自来水或去离子水可用作缓冲剂替代物,这提供了最佳的生物催化剂活性,包括但不限于5.0至8.0的pH范围。
因此,本发明另一方面提供了通过本文公开的生物转化过程形成或可获得的固体形式的(-)-降龙涎香醚,其中生物转化反应在使用自来水或去离子水作为缓冲液替代物的培养基中且在确保最佳生物催化活性的pH范围内进行,优选pH范围5.0-8.0。
优选的温度为约15℃至约45℃,优选约20℃至约40℃,但对于嗜热生物可以更高,至多为55℃,特别是如果使用来自嗜热微生物的野生型酶。温度可以保持恒定或可以在生物转化过程中改变。
在生物转化反应中包括增溶剂(例如表面活性剂,去污剂,溶解度增强剂,水混溶性有机溶剂等)可能是有用的。表面活性剂的实例包括但不限于Triton X-100,吐温80,牛磺酸-羟基胆酸盐,牛磺酸脱氧胆酸钠,十二烷基硫酸钠(SDS)和/或月桂基硫酸钠(SLS)。
申请人从其他不太有用的增溶剂长列清单中选择并鉴定了SDS作为特别有用的增溶剂。具体地,在高法呢醇向(-)-降龙涎香醚生物转化反应的反应速度和收率方面,申请人鉴定SDS为比例如Triton X-100更好的增溶剂。
不希望受理论束缚,SDS与重组微生物宿主细胞的使用可能是有利的,因为SDS可以有利地与宿主细胞膜相互作用,以使SHC酶(其是膜结合酶)更容易被高法呢醇底物接近。此外,在反应混合物中以适合的水平包含SDS可以改善乳液(在水中的高法呢醇)的性质和/或改善高法呢醇底物与宿主细胞内的SHC酶的接近,同时防止破坏(例如野生型SHC或变体酶的变性/失活)。
生物转化反应中使用的增溶剂(例如SDS)的浓度受生物质的量和底物(EEH)浓度的影响。也就是说,增溶剂(例如SDS)浓度,生物质的量和底物(EEH)浓度之间存在一定程度的相互依赖性。作为实例,随着高法呢醇底物浓度的增加,需要足够量的生物催化剂和增溶剂(例如SDS)才能进行有效的生物转化反应。例如,如果增溶剂(例如SDS)浓度太低,则可能会观察到次优的高法呢醇转化。另一方面,例如,如果增溶剂(例如SDS)浓度太高,则可能存在生物催化剂受到完整的微生物细胞破坏和/或SHC/HAC酶的变性/失活影响的风险。
在生物质的量和底物(EEH)浓度的背景下选择适合浓度的SDS在本领域技术人员的知识范围内。举例来说,本领域技术人员可获得预测模型以确定适合的SDS、底物(EEH)和生物质浓度。
野生型SHC酶的生物转化反应的温度为约45-60℃,优选55℃。
野生型SHC酶的生物转化反应的pH范围为约5.0至7.0,更优选约5.6至约6.2,甚至更优选约6.0。
SHC变体酶的生物转化反应的温度为约34℃至约50℃,优选约35℃。
SHC变体酶的生物转化反应的pH为约4.8-6.4,优选约5.2-6.0。
优选地,生物转化反应中使用的增溶剂是SDS。
当生物催化剂与EEH高法呢醇的比例为约2:1时,[SDS]/[细胞]之比为约10:1-20:1,优选约15:1-18:1,优选约16:1。
当高法呢醇浓度为约125g/l EEH且生物催化剂浓度为250g/l(相当于OD为约175(650nm))时,对于SHC变体酶,生物转化反应中的SDS浓度为约1-2%,优选约1.4-1.7%,甚至更优选约1.5%。
生物催化剂与EEH高法呢醇底物之比在约0.5:1-2:1的范围内,在一些实施方案中为2:1,优选约1:1或0.5:1。
在一些实施方案中,使用生物催化剂生产(-)-降龙涎香醚,向其中加入高法呢醇底物。可以通过使用已知方法(例如蠕动泵,输注注射器等)进料来添加底物。高法呢醇是一种油溶性化合物,并且以油的形式提供。鉴于生物催化剂存在于水相中,当将高法呢醇加入到生物转化反应混合物中时,生物转化反应可被视为两相体系。即使存在增溶剂(例如SDS)也是如此。
适合的生物转化过程条件的进一步细节在下文列出的实施例中公开。
生物转化过程产生含有所需(-)-降龙涎香醚以及许多副产物的生物转化培养基。更特别地,除了(-)-降龙涎香醚之外,该培养基还含有副产物的复杂混合物,包括新的式(II)的(-)-降龙涎香醚结构异构体,以及已知的式(III)和(IV)的(-)-降龙涎香醚的立体异构体
申请人认为,尽管不希望受任何特定理论的束缚,但式(II)化合物通过高法呢醇的7E,3Z-几何异构体的环化形成。它被描述为几乎无气味,检测阈值>500ng/l。
如上所述,申请人认为式(II)化合物是新分子,因此,该化合物构成本发明的另一方面。
香料成分和由化合物(II)组成或包含化合物(II)的香料组合物,以及含有它们的香料制品形成本发明的另外方面。
式(II)化合物在香料用品例如精细香料或功能性香料组合物如个人护理、家庭护理和织物护理组合物中作为香料成分的用途形成本发明的另外的其他方面。
(-)-降龙涎香醚和嗅觉可接受量的化合物(II)的混合物形成本发明的另一个方面。
本文所用的术语“嗅觉可接受量”与式(II)化合物或任何其他副产物(III)或(IV)或实际上可作为根据本发明的方法形成的(-)-降龙涎香醚中的杂质存在的任何材料有关,应将其理解为化合物或材料存在于与(-)-降龙涎香醚的混合物中,化合物或材料的存在量低于其气味检测阈值,或化合物或材料的存在量不会以影响(-)-降龙涎香醚的嗅觉特征的方式贡献其嗅觉特征。含有嗅觉可接受量的任何这类化合物或材料的(-)-降龙涎香醚可以被熟练的调香师识别为具有商品级(-)-降龙涎香醚例如AMBROFIXTM的气味特征,AMBROFIXTM通过合成方法前-香紫苏醇(ex-sclareol)得到并且可以得自奇华顿。
在本发明的优选实施方案中,所述反应混合物不含或基本上不含未反应的高法呢醇。
申请人发现高法呢醇是(-)-降龙涎香醚以及上述生物转化过程副产物的有效溶剂。因此,在可观量的高法呢醇的情况下,(-)-降龙涎香醚和副产物仍然一起溶解在粗的难处理的混合物中,从该混合物中分离并最终以嗅觉纯形式分离(-)-降龙涎香醚是困难的、拖延时间的和昂贵的。发现降低与(-)-降龙涎香醚和化合物(II)、(III)和(IV)的混合物中的未反应高法呢醇的水平显著促进(-)-降龙涎香醚的下游加工和分离/纯化。
如本领域技术人员所理解的,下游加工是制备通过生物转化过程形成的有用化合物的关键操作。作为化合物合成的一部分,它可以影响化合物的物理性质。在通过生物技术方法制备香料成分的情况下,希望目标化合物可以以嗅觉纯的形式从反应混合物中分离,以使目标化合物的所需气味特征不会被可能存在于发酵培养基或生物催化剂中的污染物和副产物的复杂混合物的气味贡献所扭曲。
因此,本发明提供了从生物转化培养基中分离和纯化(-)-降龙涎香醚的方法,所述生物转化培养基包含化合物(II)、(III)和(IV)的一种或多种。
本发明的另一个方面提供了改善或增强(-)-降龙涎香醚的香味的方法,所述方法包括从包含化合物(II)、(III)和(IV)的一种或多种的生物转化培养基中分离和纯化(-)-降龙涎香醚的步骤。
在分离和纯化形式中,(-)-降龙涎香醚不含化合物(II)、(III)或(IV)的任一种,或者,如果确实包含任意所述化合物,则每种应以嗅觉可接受的量存在。
从上文所述的生物转化过程获得的生物转化培养基通常包含含有粗(-)-降龙涎香醚的固相和由水和油相组成的液相,所述油相可含有任何残留的高法呢醇和任何其他油性或油溶性杂质或副产物。副产物(II)、(III)和(IV)中的一种或多种可以存在于这类油相中。
可以通过过滤(例如离心过滤或滗析)将固相与液相分离。此外,关于通过过滤分离,通过选择具有适当筛网尺寸的过滤器,还可以将(-)-降龙涎香醚的固体形式与生物转化介质中的颗粒材料例如细胞材料和/或碎片分离。滗析,类似于过滤,利用这种颗粒物质和(-)-降龙涎香醚的固体形式之间的颗粒尺寸的差异,以允许它们分离,前者保持悬浮在上清液中,可以将其丢弃,同时后者可以被分离作为沉淀物,待回收并任选地进行进一步的纯化步骤。
一旦(-)-降龙涎香醚与颗粒材料(例如细胞材料和/或碎片)以及液相或液相分离,则可以在进行进一步的后处理程序之前对其进行洗涤以便从任何剩余杂质例如化合物(II)、(III)和(IV)中分离(-)-降龙涎香醚。
在本发明的一个具体的实施方案中,所述分离和纯化(-)-降龙涎香醚的方法包括从可能含有化合物(II)、(III)或(IV)的一种或多种以及在生物转化培养基中形成的任何其他杂质的混合物中选择性结晶(-)-降龙涎香醚的步骤。
短语“选择性结晶”是指使(-)-降龙涎香醚从溶剂中结晶的工艺步骤,同时副产物,例如化合物(II)、(III)和(IV)或任何其他杂质溶解在结晶溶剂中,分离的结晶材料仅包含(-)-降龙涎香醚的程度,或者如果它含有任何副产物,如化合物(II)、(III)或(IV),或任何其他杂质,则它们仅以嗅觉可接受的量存在。
当(-)-降龙涎香醚从生物转化培养基中结晶时,可发生选择性结晶,而生物转化培养基中可能存在的任何杂质,如副产物(II)、(III)或(IV)保留在油相中。在这种情况下,生物转化培养基中存在的任何化合物(II)、(III)和(IV)可以通过滗析和/或过滤和在与(-)-降龙涎香醚与任何颗粒物质如细胞和细胞碎片分离的相同的工艺步骤中洗涤而与结晶(-)-降龙涎香醚分离。
从生物转化培养基中结晶的(-)-降龙涎香醚可以以上述方式通过过滤和/或滗析分离。此后,可以将晶体溶解在适合的溶剂中,并且也以上述方式进一步处理溶液。特别地,溶液可以进行微过滤以除去任何残留的颗粒材料例如细胞或细胞碎片;将其通过适合的漂白剂进行脱色;和/或从溶剂中选择性地结晶以将结晶(-)-降龙涎香醚与副产物的任何残留物例如化合物(II)、(III)或(IV)或任何其他残留杂质分离。
结晶可以在适合的有机溶剂中进行。溶剂的选择基于多种考虑因素,例如室温和高温下或沸腾溶剂中的溶解度差异;和在冷溶剂中回收大量的晶体的需求。通常,将待分离的化合物溶解在相对极性的溶剂中,然后加入相对较小极性的溶剂以使溶解的化合物达到其溶解度极限,此时开始结晶。此外,在工业化过程中,成本问题和处理安全性也是关切的。适合的溶剂包括但不限于甲醇,丙酮,石油醚,己烷,叔丁基甲基醚,THF和乙酸乙酯。优选的溶剂包括乙醇。也可以使用溶剂对。
在本发明特别优选的实施方案中,选择性结晶如下进行:通过将含有(-)-降龙涎香醚和一种或多种化合物(II)、(III)和(IV)的混合物溶解在温乙醇中并允许(-)-降龙涎香醚通过向冷却的乙醇溶液中缓慢加入非溶剂(如水)而选择性地结晶。
考虑到(-)-降龙涎香醚与副产物化合物(II)、(III)和(IV)的紧密结构相关性,它们分别是(-)-降龙涎香醚的构成异构体和两种立体异构体,值得注意的是(-)-降龙涎香醚可以从这种混合物中选择性地结晶,以嗅觉纯形式提供(-)-降龙涎香醚,并且收率高。本领域技术人员会合理地预期化合物的一种或多种会在与(-)-降龙涎香醚相同或基本相似的条件下结晶,使得下游加工远比发现的情况更加复杂、耗时且昂贵。
其中(-)-降龙涎香醚可通过结晶从含有化合物(II)、(III)和/或(IV)的混合物中分离出来的令人惊讶的简便方式代表了本发明的一个特别的优点。
(-)-降龙涎香醚可以通过结晶分离的容易可以与(-)-降龙涎香醚无法以如此简便的方式和如此高的收率从包含(II)、(III)和/或(IV)的混合物中通过其他纯化技术、例如通过精馏(由于(-)-降龙涎香醚和副产物(II)、(III)和(IV)非常相似的沸点)或通过溶剂萃取回收的观察结果形成对比。
与(-)-降龙涎香醚有关的术语“嗅觉纯”,意指(-)-降龙涎香醚不含化合物(II)、(III)或(IV)或在反应混合物中的任何其他物质,或者如果存在这些化合物或材料,它们以嗅觉可接受的量存在,该术语如本文所定义。
在本发明的一个实施方案中,嗅觉纯形式的(-)-降龙涎香醚包含低于5%重量的任意化合物(II)、(III)或(IV)。
在更具体的实施方案中,嗅觉纯形式的(-)-降龙涎香醚包含低于4%、低于3%、低于2%、低于1%、低于0.9%、低于0.8%、低于0.7%、低于0.6%、低于0.5%、低于0.4%、低于0.3%、低于0.2%、低于0.1%或低于0.05%重量的化合物(II)、(III)或(IV)的每一种。
通过选择性结晶从化合物(II)、(III)和/或(IV)的混合物中分离(-)-降龙涎香醚的质量可能受到分离它们的混合物的组成的影响。更具体地,当(-)-降龙涎香醚与其他化合物(II)、(III)和(IV)在混合物中的重量比大于70:30,更特别是80:20,更特别是90:10,更特别是95:5,更特别是97:3时,通过结晶分离(-)-降龙涎香醚与化合物(II)、(III)和/或(IV)的混合物的质量得到改善。
此外,通过结晶分离(-)-降龙涎香醚的质量可能受到分离的混合物中存在的未反应的高法呢醇的量的影响。更特别地,当未反应的高法呢醇的水平低于30%重量、更具体地低于20wt%、更具体地低于10%重量、仍然更具体地低于5wt%且仍然更具体地低于3%重量、仍然更具体地低于2%重量且仍然更具体地低于1%重量时,分离质量得到改善,以从其中结晶(-)-降龙涎香醚的混合物的重量为基准。
优选地,在本发明的生物转化过程中使用的试剂和反应条件使得反应以100%的高法呢醇转化率进行,或基本上如此,因此在生物转化培养基中不留下未反应的高法呢醇。然而,如果存在未反应的高法呢醇,虽然在经济上是不利的,但它可以例如通过蒸馏或者用适合的溶剂洗涤(-)-降龙涎香醚的晶体而与(-)-降龙涎香醚和其他副产物分离。
因此,在本发明的一个具体的实施方案中,提供了从包含化合物(II)、(III)和(IV)的一种或多种的混合物中分离和纯化(-)-降龙涎香醚的方法,该混合物不含或基本上不含高法呢醇。
在一个更具体的实施方案中,从包含化合物(II)、(III)和(IV)的一种或多种并且不含或基本上不含高法呢醇的混合物中分离和纯化(-)-降龙涎香醚通过(-)-降龙涎香醚的选择性结晶来进行。
根据本发明方法得到的(-)-降龙涎香醚以嗅觉纯的形式得到。嗅觉纯的(-)-降龙涎香醚形成本发明的另一个方面。
结晶形式的(-)-降龙涎香醚形成本发明的另一个方面。
可以将根据本发明方法形成的(-)-降龙涎香醚与一种或多种另外的香料成分混合,形成应用于香味用品的香料组合物,包括用于精细香料,以及用于消费品,例如个人护理、织物护理和家庭护理用品。
因此,本发明在其另一个方面提供了包含(-)-降龙涎香醚和至少另一种香料成分的香料组合物,其中所述香料组合物包含嗅觉可接受量的化合物(II)、(III)或(IV)的一种或多种。
附图简述
为了更好地理解本发明,参照附图,其中:-
图1展示出X-射线衍射图案,其中横坐标刻度是2-θ度且纵坐标是以计数计的强度。
图2展示出单晶的显微图像,其清楚地展示出晶体的细长形状及沿其长尺寸超过330微米(338.21微米)的长度。
图3比较生物转化培养基中(-)-降龙涎香醚及其异构体(II)、(III)和(IV);甲苯提取物;晶型;和晶体收集后的滤液的相对量。
图4展示出生成(-)-降龙涎香醚的下游工艺的概要。获得的(-)-降龙涎香醚提取物可以进行进一步的除臭或脱色步骤,如下文更详细描述的。
参考以下实施例进一步示例本发明。
实施例1:
高法呢醇的制备
一般分析条件:
非极性GC/MS:50℃/2min,20℃/min 200℃,35℃/min 270℃。带有HP 7890ASeries GC系统的GC/MS Agilent 5975C MSD。非极性柱:来自SGE的BPX5,5%苯基95%二甲基聚硅氧烷0.22mm x0.25mm x 12m。载气:氦。注射器温度:230℃。分流比1:50。流速:1.0ml/min。转移管线:250℃。MS-四极:106℃。MS-源:230℃。
A)在THF中制备MNU
将脲(175g,2.9mol)和甲胺盐酸盐(198g,2.9mol)在水(400ml)中的溶液在搅拌下加热回流(105℃)3.5h。在40℃下,加入溶于水(200ml)中的NaNO2(101g,1.45mol)。15min后,加入THF(1000ml),得到透明的2-相混合物。在0-5℃下加入浓H2SO4(110g,1.1mol)并在1.5h内搅拌。在0-5℃再经过0.5h后,将两个透明相在25℃下分离。将有机相(A)(1065ml,理论上1.35M)在0-5℃下储存几天或立即转移到环丙烷化反应器中。
相分离后,水相用THF(2x 1l)萃取两次。这得到1100ml的B相和1075的C相。而A相在随后的环丙烷化反应中得到51%的末端烯烃转化为环丙烷的转化率,B相得到<0.5%的环丙烷,而C相没有得到可检测的转化率。我们得出结论,在第一相分离后提取>99%的MNU。因此通常在用浓KOH和乙酸处理后在第一相分离(来自有机相A)后丢弃水相。
B)使用在THF中的MNU制备E-Δ-法呢烯
在0℃下,将N-甲基-N-亚硝基脲1.35M的THF溶液(136ml,184mmol)逐滴加入到在0-5℃下快速搅拌的E-β-法呢烯(CAS18794-84-8)(25g,122mmol)和KOH水溶液(50ml,40%)的混合物中。加入4ml MNU溶液后,加入预先溶解在0.5ml二氯甲烷中的Pd(acac)2(7.4mg,0.024mmol,0.02%)。在0-5℃下,在4小时内加入剩余的MNU溶液。该阶段的GC展示出28%未转化的E-β-法呢烯,65%的所需单环丙烷(如上所示)和3%的双环丙烷化的化合物5。在25℃下16h后,在0-5℃加入乙酸(100ml),然后加入叔丁基甲基醚(250ml)。相分离后,有机相用2M HCl(250ml)洗涤,水相用叔丁基甲基醚(250ml)萃取。将合并的有机层用水(2×100ml),10%NaOH水溶液(2×100ml)和水(2×100ml)洗涤,用MgSO4干燥,过滤并浓缩,得到26.9g淡黄色液体,其含有9%E-β-法呢烯、82%所需的单环丙烷化合物和6%双环丙烷化的副产物。
可通过蒸馏纯化进一步分离期望的化合物。
添加1g K2CO3(1g)并在135-145℃在40-60mbar在30cm钢旋管柱上蒸馏,得到147g单环丙烷化合物(68%corr)。汇集级分,得到92g单环丙烷化合物,纯度为100%。
E-Δ法呢烯的分析数据:
1H-NMR(CDCl3,400MHz):5.1(2m,2H),4.6(2H),2.2(2H),2.1(4H),2.0(2H),1.7(s,3H),1.6(2s,6H),1.3(1H),0.6(2H),0.45(2H)ppm。13C-NMR(CDCl3,400MHz):150.9(s),135.1(s),131.2(s),124.4(d),124.1(d),106.0(t),39.7(t),35.9(t),26.7(t),25.7(q),17.7(q),16.0(d),6.0(t)ppm。GC/MS:218(2%、M+),203(5%、[M-15]+),175(11%),147(31%),134(15%),133(20%),121(12%),107(55%),95(16%),93(30%),91(20%),82(11%),81(33%),79(42%),69(100%),67(22%),55(20%),53(21%),41(75%)。IR(膜):3081(w),2967(m),2915(m),2854(m),1642(m),1439(m),1377(m),1107(w),1047(w),1018(m),875(s),819(m),629(w)。计算值C16H26:C,88.00;H,12.00。测定值:C,87.80;H,12.01。
C)(7E)-4,8,12-三甲基十三碳-3,7,11-三烯-1-醇((7E)-高法呢醇)的制备
将在压力管中的(E)-(6,10-二甲基十一碳-1,5,9-三烯-2-基)环丙烷(E-Δ法呢烯)(1g,4.6mmol)、十二烷(0.2g,1.15mmol,内标)和L-(+)-酒石酸(1g,6.9mmol)的混合物在搅拌下在150℃下加热。在18h且完全转化后(根据GC),将混合物倾入水(50ml)和甲苯(50ml)中。分离各相,水相用甲苯(50ml)萃取。将合并的有机层用浓Na2CO3(50ml)和浓NaCl(2x 50ml)洗涤,用MgSO4干燥,过滤并减压蒸发,得到褐色树脂(1.35g),将其与30%KOH水溶液(4.3ml)混合,并在25℃下搅拌2h。GC分析根据内标显示形成了96%的(7E)-4,8,12-三甲基十三碳-3,7,11-三烯-1-醇。E/Z比68:22。E-异构体的分析数据与文献中的分析数据一致,参见例如P.Kocienski,S.Wadman J.Org.Chem.54,1215(1989)。
实施例2
SHC质粒制备和生物催化剂生产
SHC质粒制备
将编码酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)角鲨烯何帕烯环化酶(AacSHC)的基因(GenBank M73834,Swissprot P33247)插入质粒pET-28a(+),其中其在IPTG诱导型T7-启动子控制下用于大肠杆菌中蛋白质生产。使用标准热激转化方案将质粒转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)。
锥形瓶培养
为了蛋白质生产,使用丰富培养基(LB培养基)或基本培养基。M9是基本培养基的一个实例,其成功地得到应用。
培养基制备
如下对于350ml培养物制备选作默认的基本培养基:向35ml柠檬酸/磷酸盐储备溶液(133g/l KH2PO4,40g/l(NH4)2HPO4,17g/g柠檬酸.H2O,pH调节至6.3)中加入307ml H2O,根据需要用32%NaOH将pH调节至6.8。高压灭菌后,加入0.850ml 50%MgSO4、0.035ml微量元素溶液(下一部分中的组成)、0.035ml硫胺素溶液和7ml 20%葡萄糖。
SHC生物催化剂生产(生物催化剂生产)
对于小规模生物催化剂生产(野生型SHC或SHC变体),从含有SHC产生质粒的大肠杆菌菌株BL21(DE3)的预培养物中接种350ml培养物(补充有50μg/ml卡那霉素的培养基)。在恒定搅拌(250rpm)下,使细胞在37℃下生长至大约0.5(OD650nm)的光密度。
然后通过加入IPTG至300μM浓度诱导蛋白质产生,然后在不断摇动下再温育5-6小时。最后通过离心收集所得生物质,用50mM Tris-HCl缓冲液pH7.5洗涤。将细胞作为沉淀物储存在4℃或-20℃直至进一步使用。通常,从1升培养物中获得2.5至4克细胞(湿重),与所用培养基无关。
准备发酵并在750ml InforsHT反应器中进行。向发酵容器中加入168ml去离子水。反应容器装有所有需要的探针(pO2,pH,取样,消泡剂),C+N进料和氢氧化钠瓶并高压灭菌。高压灭菌后,将以下成分加入反应器中:-
20ml 10x磷酸盐/柠檬酸缓冲液
14ml 50%葡萄糖
0.53ml MgSO4溶液
2ml(NH4)2SO4溶液
0.020ml微量元素溶液
0.400ml硫胺素溶液
0.200ml卡那霉素储备溶液
反应条件设定如下:pH=6.95,pO2=40%,T=30℃,以300rpm搅拌。级联:rpm设定点在300,min 300,max 1000,流速l/min设定点0.1,min 0,max 0.6。消泡剂控制:1:9。
将发酵罐从接种培养物接种至OD650nm为0.4-0.5。使该接种培养物在LB培养基(+卡那霉素)中于37℃、220rpm下生长8h。首先以分批模式进行发酵11.5h,其中开始后用进料溶液(灭菌葡萄糖溶液(143ml H2O+35g葡萄糖)进行C+N进料,灭菌后加入其中:17.5ml(NH4)2SO4溶液,1.8ml MgSO4溶液,0.018ml微量元素溶液,0.360ml硫胺素溶液,0.180ml卡那霉素储备溶液。进料以约4.2ml/h的恒定流速运行。葡萄糖和NH4 +测量在外部进行以评估培养物中的C-和N-来源的可用性。通常葡萄糖水平保持极低。
培养物总共生长大约25小时,其中它们典型地达到40-45的OD650nm。然后通过添加IPTG至在发酵罐中最终浓度为约1mM(作为IPTG脉冲或使用输注注射器3-4小时)来开始SHC生产,将温度设定为40℃并将pO2设定为20%。SHC生产的诱导在40℃下持续16h。在诱导结束时,通过离心收集细胞,用pH5.4的0.1M柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液洗涤,并在4℃或-20℃下储存,直至进一步使用。
结果Ia
通常,在所有其他条件不变的情况下,当使用基本培养基与丰富培养基比较时,所产生的生物催化剂的比活性更高。
诱导在30或37℃下成功地进行。注意到,当在40-43℃下进行诱导时,得到更高比活性的生物催化剂。
结果Ib
下表1展示出对于两个实施例的培养物体积、光密度和诱导开始时和诱导结束时的细胞量以及收集的生物质的量(湿重)。
表1
接种时的OD650nm:0.45(实施例1)和0.40(实施例2)。起始体积:205ml。
野生型SHC氨基酸序列(SEQ ID No.1)(GenBank M73834,Swissprot P33247)
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
变体F601Y SHC氨基酸序列(SEQ ID No.2)─与SEQ ID No.1相关的变体
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGYPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
变体F605W SHC核苷酸序列(SEQ ID No.3)
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGATGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACATCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTTCCCAGGGGATTGGTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
变体F605W SHC氨基酸序列(SEQ ID No.4)─与SEQ ID No.1相关的变体
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDWYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
实施例3a
7E,3E/Z-高法呢醇混合物的生物转化
使用如下反应条件进行生物转化:
反应(150.1g总体积)在包含146g/l总高法呢醇的InforsHT 750ml发酵罐中在0.1M柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液pH 5.4中使用高法呢醇底物(其为7E,3E:7E,3Z 86:14的混合物)、250g/l细胞(根据实施例2的方法形成,发酵)和1.55%SDS来进行。该反应在恒定搅拌下(900rpm)在35℃下进行,使用10-40%柠檬酸水溶液进行pH控制。
使反应混合物进行如下实施例4中举出的分离和纯化。
实施例3b
7E,3E/Z-高法呢醇混合物的生物转化
使用如下反应条件进行生物转化:
在Heidolph Synthesis 1装置上的11ml玻璃反应容器中,在50℃和pH 6.0下,在0.1M柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液中剧烈振荡(800rpm)下进行反应(总体积2.5ml)。该反应体系含有1g/l E,E-高法呢醇(来自EE:EZ之比为86:14的高法呢醇储备溶液)、按照实施例2中描述的方法产生野生型SHC酶至OD650nm为30的细胞和0.12%SDS。反应开始后约48h,E,E-高法呢醇转化率为约60%。当反应冷却至室温时,在从反应混合物中取出的样品的显微镜分析中出现降龙涎香醚(Ambrofix)晶体。进一步加入相当于OD650nm增加10倍的细胞并进一步温育24小时,使E,E-高法呢醇完全转化。显微镜观察反应混合物样品表明存在增加数量的降龙涎香醚晶体。
该反应也在InforsHT 750ml发酵罐中进行,总体积为150.1g,pH6.0,在0.1M柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液中。反应体系含有1g/l E,E-高法呢醇、0.12%SDS和产生118g/l湿重的野生型SHC的细胞,并在50℃下剧烈摇动(700rpm)温育。反应开始大约30小时后,E,E-高法呢醇转化率为约85%。显微镜观察反应混合物样品,可以鉴定降龙涎香醚。再加入高法呢醇至相当于1g/l,反应再进行约50个小时;也加入相当于32g/l(湿重)的细胞。总反应时间为约66小时,E,E-高法呢醇转化率为约85%。通过显微镜观察反应混合物,可以观察到增加数量的降龙涎香醚晶体。
实施例4
一般下游工艺在如下图4中举出,用于参考。
在第一步中,将生物转化培养基加热至约80-85℃的温度下约15分钟期限,熔化(-)-降龙涎香醚晶体。在该阶段为液体的(-)-降龙涎香醚通过以约5℃/小时的速率将反应混合物冷却至20℃的温度重结晶。
在第二步中,在(-)-降龙涎香醚结晶后,通过过滤将晶体与生物转化培养基分离。过滤在连续筛式离心机(Siebtechnic H250)中进行,筛目尺寸为100微米。离心机以2028G加速度、430kg/小时进料速度运行。由于晶体和细胞碎片之间存在显著尺寸差异,所以大多数晶体保留在筛上,并且可以用水洗涤并通过为此目的提供的刀具进行机械收集。
在第三步中,将来自第二步的滤液加入连续的滗析器中,该滗析器设置成将保留在上清液中的细胞碎片与通过步骤2中的过滤器的任何晶体分离,所述晶体在沉降器中沉降为沉淀物。滗析器在1170G进行操作,进料速率为370kg/小时。将收集在滗析器中的晶体用水洗涤,并与步骤2中得到的晶体合并。洗涤合并的晶体并静态滗析以除去上清液中的任何残留细胞碎片,并且将洗涤的晶体准备好进一步加工。
在第四步中,将洗涤的晶体用乙醇(96%工业级)以1质量晶体与4质量乙醇的量再溶解。在环境温度和1巴压力下,用亚微米过滤器(0.6至1.0微米,KDS15)过滤该溶液,然后再次通过0.22微米过滤器过滤。
如此形成的(-)-降龙涎香醚提取物可以进行进一步的除臭和脱色步骤,如下所述。
将乙醇溶液在真空浓缩至干。将浓缩物重新溶解在工业级变性乙醇中,并在搅拌下加入漂白剂(Tonsil 412FF)和硅藻土过滤剂(CELATOM FW 50)。将混合物在80-85℃下搅拌回流30分钟,然后冷却至55-60℃。将混合物用25微米过滤器过滤以除去固体物质。
通过常压蒸馏从澄清的漂白溶液中除去过量的变性醇。然后将水加入热溶液中,并将所得混合物在75-80℃下搅拌15分钟。通过将该溶液逐渐冷却至-10至-15℃使(-)-降龙涎香醚结晶。滤出结晶的(-)-降龙涎香醚并在真空烘箱(50-60℃;1-5mbar)中干燥。
实施例5a
下游加工:作为从生物转化培养基中选择性分离(-)-降龙涎香醚的手段的固液分
离和甲苯萃取的比较
用MTBE萃取200ml灭活生物转化培养基并且通过气相色谱法分析。
固-液分离
离心200ml灭活生物转化培养基以将固体与液相分离(Sorvall GS3,5000rpm,10min,10℃)。这分离了大约80ml固体颗粒与大约120ml液体上清液。除去上清液,用MTBE萃取并通过气相色谱分析。类似地,用MTBE提取沉淀,并通过气相色谱分析MTBE提取物。
甲苯萃取
用6×45ml甲苯萃取200ml生物转化培养基。收集有机相并过滤以除去任何细胞碎片。反萃取出甲苯,将残留物溶解在MTBE中,然后通过气相色谱分析。
分析
GC分析结果如下图3所示。从结果可以清楚地看出,通过离心机收集的固相含有极高水平的(-)-降龙涎香醚,以及极为少量的副产物II、III和IV。另一方面,与粗生物转化培养基相比,甲苯提取物不富含(-)-降龙涎香醚。结果表明,在(-)-降龙涎香醚从生物转化培养基中结晶的同时;结构相关的化合物(II)、(III)和(IV)保留在液相中。在固相分析中发现的(II)、(III)和(IV)残留物仅是可以通过彻底洗涤固相而去除的残留物。可以从该实验中得出结论,不仅颗粒离析步骤(如过滤和/或滗析)允许分离(-)-降龙涎香醚的固体形式与细胞碎片,而且可用于完全或基本上分离固体(-)-降龙涎香醚与结构相关的副产物,例如化合物(II)、(III)和(IV)。
实施例5b
感官分析
目的:为了对以粗材料和结晶的材料中形成的(-)-降龙涎香醚和化合物(II)、
(III)和(IV)进行感官分析
E,E-高法呢醇的生物转化得到(-)-降龙涎香醚和化合物(IV)。
E,Z-高法呢醇的生物转化得到大环醚化合物(II)和表-降龙涎香醚化合物(III)。
(-)-降龙涎香醚的粗混合物包含期望的(-)-降龙涎香醚、化合物(II)、(III)和(IV),其存在量分别为87.1wt%、2.8wt%、2.5wt%和7.6wt%。
当粗混合物选择性结晶(实验室规模)时,结晶的材料在通过气相色谱分析时具有与粗混合物相同的成分,但它们分别以99.1wt%、0.1wt%、0.1wt%和0.7wt%的量存在。认为(II)、(III)和(IV)的残留物是附着在(-)-降龙涎香醚晶体上的油性残留物。
感官分析结果如下:
(-)-降龙涎香醚:气味阈值0.2ng/l。
化合物(IV):弱,IsoE,木香,GC-检测阈值5-10ng。
化合物(II):“无味”(GC-阈值>500ng)。
化合物(III):GC-阈值约高于(-)-降龙涎香醚10x(约2ng)。
3种副产物(化合物II、III和IV)的感官分析表明,气味比(-)-降龙涎香醚气味弱。事实上,表-降龙涎香醚(化合物III)的气味比(-)-降龙涎香醚弱约10倍,这启示它基本上没有气味。
感官分析表明,从(-)-降龙涎香醚中除去一种或多种副产物化合物可以改善剩余化合物(即()降龙涎香醚)的气味,即使去除的化合物本身实际上是无味化合物。也就是说,在不存在化合物II、III和IV的情况下,观察到由训练过的调香师(使用公认的可接受的嗅觉纯度的基准)确定的嗅觉纯度方面的降龙涎香醚香味增强。
实施例6
通过微生物发酵方法形成的(-)-降龙涎香醚的固体形式的X-射线表征
使用STOE STADI P X-射线衍射仪获取粉末X-射线衍射图案。
系统描述:通过使用位置敏感检测器,以透射模式使用衍射仪(扁平样品架,弧形锗(111)单色仪和CuKa1辐射1.54060埃)。发生器电压为40kV,电流为40mA。检测器:Mythen1K。
实验参数:在2θ=约4°至26°之间进行图案测量。确定的衍射角的精度为大约+/-0.2°2θ。
Claims (15)
2.根据权利要求1的固体形式,其中它包含低于3%重量的任意化合物(II)、(III)或(IV)。
3.根据权利要求2的固体形式,其中它包含低于2%重量的任意化合物(II)、(III)或(IV)。
5.根据权利要求4的固体形式,其中分离步骤是过滤步骤,滗析步骤,或过滤步骤和滗析步骤两者的组合。
8.制备根据权利要求1-3任一项的(-)-降龙涎香醚的固体形式的方法,
其中所述(-)-降龙涎香醚的固体形式通过生物转化过程形成,所述方法包括以下步骤:
I)通过生物催化过程在生物转化培养基中形成结晶(-)-降龙涎香醚;和
II)将结晶(-)-降龙涎香醚与生物转化培养基分离;
其中所述生物转化过程是高法呢醇的酶催化环化,所述高法呢醇包括高法呢醇的7E,3E和7E,3Z几何异构体的混合物,其中所述环化反应在能够将高法呢醇生物转化成(-)-降龙涎香醚的SHC生物催化剂存在下进行。
9.根据权利要求7或8的方法,其中分离步骤是过滤步骤,滗析步骤,或过滤步骤和滗析步骤两者的组合。
10.根据权利要求7-9任一项的方法,其中在分离步骤之前,将生物转化培养基加热至至少55℃的温度以熔化结晶(-)-降龙涎香醚;且然后缓慢冷却,以使(-)-降龙涎香醚从生物转化培养基中重结晶。
11.根据权利要求7-10任一项的方法,其中将回收的(-)-降龙涎香醚晶体溶解在溶剂中,并通过亚微米过滤器过滤溶液以除去存在于生物转化培养基中的任何残留的颗粒材料,然后通过蒸发除去溶剂或重结晶而使其呈固体形式。
12.根据权利要求7-11任一项的方法,其中酶是野生型角鲨烯何帕烯环化酶,或野生型角鲨烯何帕烯环化酶的变体。
13.根据权利要求7-12任一项的方法,其中使用水、与水混溶的溶剂或其混合物洗涤晶体。
14.根据权利要求7-13任一项的方法,其中(-)-降龙涎香醚的回收是通过将其从过滤器或滗析设备或带式过滤器中机械除去、收集和干燥来实现的。
15.根据权利要求7-14任一项的方法,其中使增溶的(-)-降龙涎香醚晶体溶液与漂白剂接触。
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