CN115792007A - 高效液相色谱法测定脂肪乳类注射液中杂质铝元素含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及高效液相色谱法测定脂肪乳类注射液中杂质铝元素含量的方法。精密加入9mL供试品样品和1mL酸试剂，于石墨消解仪中先80℃加热30min，再升温至100℃加热1h，所得产物120℃浓缩后，冷却，用纯化水转移并定容至10mL，加入3mL正庚烷萃取，静置分层，取水相过滤，取滤液，得到供试品样品溶液。分别精密量取铝元素系列对照品溶液、空白对照溶液、供试品样品溶液和空白供试品溶液各0.1mL，分别精密加入衍生试剂0.9mL，混匀后，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。本发明的方法，选择合适的破乳酸溶剂，破坏脂肪乳水包油的结构，使包裹的杂质铝元素释放，同时得到澄清的溶液，满足高效液相色谱进样的要求。

Description

高效液相色谱法测定脂肪乳类注射液中杂质铝元素含量的 方法

技术领域

本发明属于药品检测领域，具体涉及一种基于高效液相色谱法测定脂肪乳类注射液中杂质铝元素含量的方法。

背景技术

铝元素是地壳中含量最多的金属元素之一。铝元素在人体内蓄积会增加患病风险。大容量注射液中杂质铝元素的测定已受到广泛关注。现有技术中，检测药品中铝元素的方法主要有：比色法、原子吸收光谱、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)及电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)等，脂肪乳类注射液成分较为复杂，铝元素的形态也较为多样化，比色法灵敏度低；脂肪乳高温易碳化，不宜使用原子吸收光谱法；ICP-AES和ICP-MS仪器价格昂贵，不利于实验室推广使用。脂肪乳类注射液是一类广泛应用于临床的大容量肠外营养注射液，其可能存在的杂质铝元素，会直接进入血液，在人体内蓄积，对人体，尤其对于肾功能不全者和婴幼儿，造成更大的伤害。

高效液相色谱法具有高速、高压、高效、高灵敏度、应用范围广、柱子可反复使用和样品量少等优点。但是由于脂肪乳类注射液具有如下难点，其杂质铝元素在高效液相色谱法检测中还处于空白：(1)脂肪乳类注射液组成复杂，不能直接进样，也不能简单的通过纯化水或溶剂稀释进样，会造成色谱柱和高效液相系统的堵塞。(2)样品中铝元素杂质的含量较低(美国药典对肠外营养注射液中铝元素的限度规定为不得过25μg/L)，因此不能通过增加稀释倍数，满足进样要求，否则测定方法的检测限和定量限无法满足测定要求。(3)脂肪乳的水包油结构，有可能将来源于原料杂质铝元素包裹，导致测定结果不准确。

发明内容

为了解决上述存在的技术问题，本发明提供一种高效液相色谱法测定脂肪乳类注射液中杂质铝元素含量的方法，在满足高效液相色谱法定量限和检测限要求的前提下，通过选择合适的溶剂破坏脂肪乳水包油的结构，使包裹的杂质铝元素释放，同时得到澄清的溶液，满足高效液相色谱进样的要求。

本发明采用的技术方案是：高效液相色谱法测定脂肪乳类注射液中杂质铝元素含量的方法，包括如下步骤：

1)试剂配制：分别配制衍生试剂、铝元素系列对照品溶液、空白对照溶液和流动相，现用现配；

2)供试品样品溶液制备：取聚四氟乙烯材质消解管，精密加入9mL供试品样品和1mL酸试剂，加塞后置于石墨消解仪中，先80℃加热30min，再升温至100℃加热1h，所得产物120℃浓缩后，冷却，用纯化水转移并定容至10mL，加入3mL正庚烷萃取，振荡摇匀，静置分层，弃去油相，取水相过滤，取滤液，得到供试品样品溶液；所述供试品样品为脂肪乳类注射液；

3)空白供试品溶液制备：取聚四氟乙烯材质消解管，精密加入9mL纯化水和1mL酸试剂，加塞后置于石墨消解仪中，先80℃加热30min，再升温至100℃加热1h，所得产物120℃浓缩后，冷却，用纯化水转移并定容至10mL，加入3mL正庚烷萃取，振荡摇匀，静置分层，取下层水相过滤，取滤液，得到空白供试品溶液；

4)测定：分别精密量取铝元素系列对照品溶液、空白对照溶液、供试品样品溶液和空白供试品溶液各0.1mL，分别精密加入衍生试剂0.9mL，混匀后，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；

5)以铝元素系列对照品溶液的浓度对应其相应的峰面积扣除空白对照溶液的峰面积作直线回归，求得线性回归方程，根据供试品样品溶液的峰面积扣除空白供试品溶液的峰面积，计算供试品样品中铝元素的含量。

优选的，步骤1)中，所述衍生试剂的配制方法，包括如下步骤：按体积比，质量百分浓度为0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液:0.2mol/L的乙酸铵溶液＝45:55；取50mL的0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液和0.2mol/L的乙酸铵溶液的混合溶液，加入0.3mL质量百分浓度为50％的NaOH，混合均匀。

优选的，步骤1)中，所述铝元素系列对照品溶液的浓度分别为200μg/L、100μg/L、50μg/L、25μg/L、10μg/L和5μg/L。

优选的，步骤1)中，所述流动相的配制方法，包括如下步骤：按体积比，质量百分浓度为0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液:0.2mol/L的乙酸铵溶液＝45:55；取0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液和0.2mol/L的乙酸铵溶液，混合均匀。

优选的，步骤2)中，所述酸试剂为硫酸、硝酸或盐酸。

更优选的，所述酸试剂为盐酸。

优选的，步骤3)中，液相色谱条件是：采用苯乙基键合硅胶为基质的苯基色谱柱，柱温为30℃；流速为1.0mL/min；进样体积为100μL；荧光检测器的激发波长为380nm，发射波长为520nm。

优选的，所述脂肪乳类注射液为C₆-C₂₄的中长链脂肪乳注射液、或脂肪乳氨基酸(17)葡萄糖(11％)脂肪乳注射液、或中长链脂肪乳氨基酸(16)葡萄糖(16％)脂肪乳注射液。

本发明提供的方法在测定脂肪乳类注射液中杂质铝元素含量中的应用。

本发明的有益效果是：

1、本发明的方法，选择合适的破乳酸溶剂，破坏脂肪乳水包油的结构，使包裹的杂质铝元素释放，同时得到澄清的溶液，满足高效液相色谱进样的要求。

2、本发明的方法，优化样品前处理条件，减少铝元素的引入，提高样品中杂质铝元素测定的准确性。

3、本发明的方法，选择适当的前处理方法和色谱条件，实现了高效液相色谱法测定脂肪乳类注射液中的杂质铝元素的含量。

附图说明

图1是实施例1中，酸溶剂为硫酸，样品与硫酸体积比为9:1的高效液相色谱图。

图2是实施例1中，酸溶剂为硫酸，样品与硫酸体积比为8:2的高效液相色谱图。

图3是实施例1中，酸溶剂为盐酸，样品与盐酸体积比为9:1的高效液相色谱图。

图4是实施例1中，酸溶剂为盐酸，样品与盐酸体积比为8:2的高效液相色谱图。

图5是实施例1中，酸溶剂为硝酸，样品与硝酸体积比为9:1的高效液相色谱图。

图6是实施例1中，酸溶剂为硝酸，样品与硝酸体积比为8:2的高效液相色谱图。

图7是实施例1中，碱溶剂为NaOH的高效液相色谱图。

图8是实施例1中，酸溶剂为盐酸，60℃水浴5h的高效液相色谱图。

图9是实施例1中，酸溶剂为盐酸，70℃水浴5h的高效液相色谱图。

图10是实施例1中，酸溶剂为盐酸，80℃水浴5h的高效液相色谱图。

图11是实施例1中，酸溶剂为盐酸，石墨消解仪为加热方式，正庚烷萃取的高效液相色谱图。

图12是实施例3中，铝元素系列对照品溶液的标准曲线。

具体实施方式

高效液相色谱法测定脂肪乳类注射液中杂质铝元素含量的方法，包括如下步骤：

1)试剂配制：

分别配制衍生试剂、铝元素系列对照品溶液、空白对照溶液和流动相，现用现配。

1.1)衍生试剂的配制：按体积比，质量百分浓度为0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液:0.2mol/L的乙酸铵溶液＝45:55；取50mL的0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液和0.2mol/L的乙酸铵溶液的混合溶液，加入0.3mL质量百分浓度为50％的NaOH，混合均匀。

1.2)铝元素系列对照品溶液的配制：铝元素系列对照品溶液的浓度分别为200μg/L、100μg/L、50μg/L、25μg/L、10μg/L和5μg/L。

1.3)空白对照溶液：以纯化水为空白对照溶液。

1.4)流动相的配制：按体积比，质量百分浓度为0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液:0.2mol/L的乙酸铵溶液＝45:55；取0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液和0.2mol/L的乙酸铵溶液，混合均匀。

2)供试品样品溶液制备：

取聚四氟乙烯材质消解管，精密加入9mL供试品样品和1mL酸试剂，加塞后置于石墨消解仪中，先80℃加热30min，再升温至100℃加热1h，所得产物120℃浓缩后，冷却，用纯化水转移并定容至10mL，加入3mL正庚烷萃取，振荡摇匀，静置分层，弃去油相，水相过滤，取滤液，得到供试品样品溶液；所述供试品样品为脂肪乳类注射液。

所述酸试剂为硫酸、硝酸或盐酸。优选，酸试剂为盐酸。

3)空白供试品溶液：

取聚四氟乙烯材质消解管，精密加入9mL纯化水和1mL酸试剂，加塞后置于石墨消解仪中，先80℃加热30min，再升温至100℃加热1h，所得产物120℃浓缩后，冷却，用纯化水转移并定容至10mL，加入3mL正庚烷萃取，振荡摇匀，静置分层，取下层水相过滤，取滤液，得到空白供试品溶液。

所述酸试剂为硫酸、硝酸或盐酸。优选，酸试剂为盐酸。

4)测定：

分别精密量取铝元素系列对照品溶液、空白对照溶液、供试品样品溶液和空白供试品溶液各0.1mL，分别精密加入衍生试剂0.9mL，混匀后，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

液相色谱条件是：采用苯乙基键合硅胶为基质的苯基色谱柱，柱温为30℃；流速为1.0mL/min；进样体积为100μL；荧光检测器的激发波长为380nm，发射波长为520nm。

5)绘制标准曲线和计算：

以铝元素系列对照品溶液的浓度对应其相应的峰面积扣除空白对照溶液的峰面积作直线回归，求得线性回归方程，根据供试品样品溶液的峰面积扣除空白供试品溶液的峰面积，计算供试品样品中铝元素的含量。

实施例1

本实施例采用以下对照品和供试品样品进行条件筛选试验。

对照品：金属铝单元素标准溶液，国家有色金属及电子材料分析测试中心，浓度为1000μg/mL。

供试品样品：中长链脂肪乳注射液(C₆-C₂₄)，辽宁海思科制药有限公司。

(一)破坏脂肪乳水包油结构溶剂的选择

1、有机溶剂

如表1，分别选择乙醇、异丙醇、正丙醇、四氢呋喃、正己烷或其中两种试剂按一定体积比的混合作为有机溶剂与供试品样品进行破乳试验，研究破坏水包油结构的情况，结果如表1。

表1破乳条件筛选(有机溶剂)

由表1可见，乙醇、异丙醇、正丙醇和正己烷等，无法破坏水包油结构。四氢呋喃可破坏水包油结构，但稀释倍数较大。而通常供试品样品中铝含量较低，较大的稀释倍数前处理样品，可能导致最终进样浓度较低，无法达到方法检测限和定量限的要求。因此，有机溶剂无法作为本发明中脂肪乳类注射液的破乳溶剂。

2、酸试剂

分别选择硫酸、盐酸和硝酸作为酸试剂。

衍生试剂：按体积比，0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液:0.2mol/L的乙酸铵溶液＝45:55；取50mL的0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液和0.2mol/L的乙酸铵溶液的混合溶液，加入0.3mL质量百分浓度为50％的NaOH，混合均匀即可。

供试品样品溶液的制备：取聚四氟乙烯材质消解管，精密加入8mL供试品样品和2mL酸试剂或精密加入9mL供试品样品和1mL酸试剂，60℃水浴加热3h，分别得到不同酸试剂不同体积比的供试品样品溶液，观察破乳情况。

精密量取不同酸试剂不同体积比的供试品样品溶液各0.1mL，分别精密加入衍生试剂0.9mL，混匀后，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。液相色谱条件是：采用苯乙基键合硅胶为基质的苯基色谱柱，流动相为质量百分浓度为0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液和浓度为0.2mol/L的乙酸铵溶液按体积比45:55的混合；柱温为30℃；流速为1.0mL/min；进样体积为100μL；荧光检测器的激发波长为380nm，发射波长为520nm。采用高效液相色谱法法分析，对峰形及相应情况进行分析，结果如表2和图1-图6。

3、碱试剂

以NaOH作为碱试剂。

衍生试剂：按体积比，0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液:0.2mol/L的乙酸铵溶液＝45:55；取50mL的0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液和0.2mol/L的乙酸铵溶液的混合溶液，加入0.3mL质量百分浓度为50％的NaOH，混合均匀即可。

供试品样品溶液的制备：取聚四氟乙烯材质消解管，精密加入5mL供试品样品和0.5mg氢氧化钠，60℃水浴加热3h，得供试品样品溶液，观察破乳情况。

精密量取供试品样品溶液0.1mL，精密加入衍生试剂0.9mL，混匀后，注入液相色谱仪，记录色谱图。液相色谱条件是：采用苯乙基键合硅胶为基质的苯基色谱柱，流动相为质量百分浓度为0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液和浓度为0.2mol/L的乙酸铵溶液按体积比45:55的混合；柱温为30℃；流速为1.0mL/min；进样体积为100μL；荧光检测器的激发波长为380nm，发射波长为520nm。采用高效液相色谱法法分析，对峰形及相应情况进行分析，结果如表2和图7。

表2破乳条件筛选(酸试剂和碱试剂结合HPLC分析)

由表2、图2、图4和图6可见，在供试品样品和酸试剂体积比为8:2时，均能使样品破乳，达到油水分离的状态。经0.45μm滤膜过滤，高效液相色谱进样后，结果表明，硫酸破乳后样品响应较低；盐酸和硝酸破乳后样品峰前沿，峰型较差。调整衍生剂中碱的加入量，峰型未改善。

由表2、图1、图3和图5可见，在供试品样品和酸试剂体积比为9:1时，均能使样品破乳，达到油水分离的状态，经0.45μm滤膜过滤，高效液相色谱进样后，结果表明，硫酸破乳后样品响应较低，硝酸破乳后样品峰分叉，峰型较差，盐酸破乳后样品峰型较好。

由表2和图7可见，供试品样品加入氢氧化钠后，破乳，达到油水分离的状态，高效液相色谱进样分析，响应值过高，这是由于氢氧化钠试剂本身含有一定量铝元素，加入氢氧化钠会引入外来铝元素杂质。

综上考察，本发明优选盐酸作为酸化破乳试剂，供试品样品与盐酸的体积比为9:1。

(二)样品前处理加热条件的筛选

通过对处理后的供试品样品采用HPLC法进行测定，结合供试品，加标供试品以及标准曲线的情况进行分析，筛选样品前处理过程。

1、水浴加热对测定结果的影响

1.1)试剂配制

铝元素标准贮备液：取金属铝单元素标准溶液，用纯化水稀释配制浓度为500μg/L的铝元素标准贮备液。

铝元素系列对照品溶液的配制：精密量取铝元素标准贮备液适量，加纯化水定量稀释，分别配制成浓度为200μg/L、100μg/L、50μg/L、25μg/L、10μg/L和5μg/L的铝元素系列对照品溶液。

空白对照溶液：以纯化水为空白对照溶液。

供试品样品溶液：取15mL聚丙烯材质刻度离心管，按体积比9:1，加入供试品样品4.5mL和盐酸0.5mL，密封，置水浴中，分别在60℃、70℃和80℃下加热3-5h，取出，过滤，得到不同温度下获得的供试品样品溶液。

加标样品溶液：精密量取浓度为500μg/L的铝元素标准贮备液4.5mL，加入供试品样品溶液85.5mL，混匀，得加标样品。取15mL聚丙烯材质刻度离心管，按体积比9:1，加入上述加标样品4.5mL和盐酸0.5mL，密封，置水浴中，分别在60℃、70℃和80℃下加热3-5h，取出，过滤，得到含标准铝元素25μg/L的不同温度下获得的加标样品溶液。

衍生试剂：按体积比，0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液:0.2mol/L的乙酸铵溶液＝45:55；取50mL的0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液和0.2mol/L的乙酸铵溶液的混合溶液，加入0.3mL质量百分浓度为50％的NaOH，混合均匀即可。

1.2)方法

分别精密量取铝元素系列对照品溶液、空白对照溶液、不同温度下获得的供试品样品溶液和不同温度下获得的加标样品溶液各0.1mL，分别精密加入衍生试剂0.9mL，混匀，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

液相色谱条件是：采用苯乙基键合硅胶为基质的苯基色谱柱，流动相为质量百分浓度为0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液和浓度为0.2mol/L的乙酸铵溶液按体积比45:55的混合；柱温为30℃；流速为1.0mL/min；进样体积为100μL；荧光检测器的激发波长为380nm，发射波长为520nm。

以铝元素系列对照品溶液的浓度对应其相应的峰面积作直线回归，求得直线回归方程，根据不同温度下获得的供试品样品溶液和不同温度的加标样品的峰面积分别计算溶液中铝元素的含量。计算回收率，结果如表3。

表3水浴加热条件筛选：

由图8-10可见，选择盐酸作为破坏水包油结构的破乳溶剂，色谱峰形较好。但是由表3可见，回收率过高，平行样品之间偏差较大。这是由于，盐酸加入量少，通过加热，虽然破坏水包油结构，但是水相和油相不能完全混溶，导致测定结果不准确，液相系统也有堵塞风险。同时水浴加热温度低，破坏水包油结构需要时间较长。温度高，加热时间长，液体量有一定损失，同时水浴的蒸汽环境对样品也有一定影响。

综合上述因素，水浴加热造成整体结果加标回收率高，不适宜本发明。

2、石墨消解仪加热，有机溶剂萃取剂的选择

为了缩短提取时间，增加溶剂破坏乳状结构的效率，同时考虑到铝元素应完全溶解于水相中等因素，采用无水环境的石墨消解仪作为加热装置。因为杂质铝元素以铝离子的形式存在于水溶液中，所以拟增加有机溶剂萃取步骤，使油相物质全部溶于萃取溶剂中，与水相实现完全分离，从而避免油相物质进入液相系统，影响结果准确性，增加液相系统堵塞风险。

2.1)试剂配制

铝元素标准贮备液：取金属铝单元素标准溶液，用纯化水稀释配制浓度为500μg/L的铝元素标准贮备液。

铝元素系列对照品溶液的配制：精密量取铝元素标准贮备液适量，加纯化水定量稀释，分别配制成浓度为200μg/L、100μg/L、50μg/L、25μg/L、10μg/L和5μg/L的铝元素系列对照品溶液。

空白对照溶液：以纯化水为空白对照溶液。

供试品样品溶液：取聚四氟乙烯材质消解管，按体积比9:1，加入供试品样品9mL和盐酸1mL，加塞，置石墨消解仪中，80℃加热30min后，升温至100℃加热1h，脂肪乳水包油结构被破坏，溶液呈油水分离的浑浊状态，120℃下浓缩，放冷，用纯化水转移定定容至10mL。如表4分别加入萃取剂，振荡摇匀，静置分层，弃去油相，水相过滤，得不同萃取剂获得的供试品样品溶液。

加标样品溶液：精密量取浓度为500μg/L的铝元素标准贮备液4.5mL，加入供试品样品溶液85.5mL，混匀，得加标样品。取聚四氟乙烯材质消解管，按体积比9:1，加入上述加标样品9mL和盐酸1mL，加塞，置石墨消解仪中，80℃加热30min后，升温至100℃加热1h，脂肪乳水包油结构被破坏，溶液呈油水分离的浑浊状态，120℃下浓缩，放冷，用纯化水转移并定容至10mL。如表4分别加入萃取剂，振荡摇匀，水相过滤，制成含标准铝元素25μg/L的不同萃取剂的加标样品。

衍生试剂：按体积比，0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液:0.2mol/L的乙酸铵溶液＝45:55；取50mL的0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液和0.2mol/L的乙酸铵溶液的混合溶液，加入0.3mL质量百分浓度为50％的NaOH，混合均匀即可。

2.2)方法

分别精密量取铝元素系列对照品溶液、空白对照溶液、不同萃取剂下获得的供试品样品溶液和不同萃取剂的加标样品溶液各0.1mL，分别精密加入衍生试剂0.9mL，混匀，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

液相色谱条件是：采用苯乙基键合硅胶为基质的苯基色谱柱，流动相为质量百分浓度为0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液和浓度为0.2mol/L的乙酸铵溶液按体积比45:55的混合；柱温为30℃；流速为1.0mL/min；进样体积为100μL；荧光检测器的激发波长为380nm，发射波长为520nm。

以铝元素系列对照品溶液的浓度对应其相应的峰面积作直线回归，求得直线回归方程，根据不同温度下获得的供试品样品溶液和不同温度的加标样品的峰面积分别计算溶液中铝元素的含量。计算回收率，结果如表4。

表4萃取剂筛选：

由表4可见，本发明优选石墨消解仪加热方式，正庚烷作为萃取剂。分别用正庚烷1ml、2ml和3ml萃取，当使用正庚烷1ml萃取，水相和油相之间仍有少量未溶于两相的油相杂质，当使用正庚烷2ml和3ml萃取，水相和油相完全分离。本发明优选正庚烷加入量为2-3mL，更优选3mL，典型色谱图见图11。

综上考察，本发明优选供试品样品溶液的制备为：取聚四氟乙烯材质消解管，按体积比9:1，加入供试品样品9mL和盐酸1mL，加塞，置石墨消解仪中，80℃加热30min后，升温至100℃加热1h，脂肪乳水包油结构被破坏，溶液呈油水分离的浑浊状态，120℃下浓缩，放冷，用纯化水转移并定容至10mL。加入正庚烷3mL，振荡摇匀，静置分层，弃去油相，水相过滤，得供试品样品溶液。

(三)流动相及衍生试剂浓度的选择

1、8-羟基喹啉浓度的选择

8-羟基喹啉与铝离子结合，形成荧光络合物，通过使用荧光检测器测定该络合物的含量，从而定量铝元素。8-羟基喹啉为有色物质，在测定系统中，8-羟基喹啉系以衍生试剂和流动相组成成分的双重身份存在，消除背景的影响。本发明对8-羟基喹啉乙腈溶液浓度进行筛选：分别选择8-羟基喹啉为0.1％，0.3％，1％，3％。

经试验考察，结合样品的响应值、方法的耐用性、以及流动相的稳定性等因素，本发明优选，流动相和衍生试剂组成中8-羟基喹啉的浓度为0.3％，溶剂为乙腈。

2、衍生试剂中氢氧化钠的浓度8-羟基喹啉与铝离子结合，形成的荧光络合物在大于pH7的溶液环境下，峰形更好，因此通过在流动相中添加一定浓度的氢氧化钠溶液，来改变样品pH环境，从而改善色谱峰峰形。本发明对衍生试剂中NaOH的浓度进行了筛选：NaOH的浓度分别为0，0.3％，0.5％。

经试验考察，结合色谱峰峰形，以及减少外来铝元素的引入，选择50％NaOH溶液，少量添加至流动相中，使流动相中NaOH的浓度为0.3％。

实施例2

(一)高效液相色谱法测定脂肪乳注射液中杂质铝元素含量的方法，包括如下步骤：

1、试剂配制：

1.1)配制衍生试剂：

按体积比，0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液:0.2mol/L的乙酸铵溶液＝45:55；取50mL的0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液和0.2mol/L的乙酸铵溶液的混合溶液，加入0.3mL质量百分浓度为50％的NaOH，混合均匀，即可。

1.2)配制铝元素系列对照品溶液：

铝元素标准贮备液配制：配制浓度为500μg/L的铝元素标准贮备液。

铝元素系列对照品溶液的配制：精密量取铝元素标准贮备液适量，加纯化水定量稀释，分别配制成浓度为200μg/L、100μg/L、50μg/L、25μg/L、10μg/L和5μg/L的铝元素系列对照品溶液。

1.3)空白对照溶液：

以纯化水作为空白对照溶液。

1.4)流动相配制：

按体积比，0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液:0.2mol/L的乙酸铵溶液＝45:55；取0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液和0.2mol/L的乙酸铵溶液，混合均匀即可。

2、供试品样品溶液制备：

取聚四氟乙烯材质消解管，精密加入9mL供试品样品和1mL盐酸，加塞，置于石墨消解仪中，先80℃加热30min，再升温至100℃加热1h，所得产物120℃浓缩后，冷却，用纯化水转移并定容至10mL，然后加入3mL正庚烷萃取，振荡摇匀，静置分层，弃去油相，水相过滤，取滤液，得到供试品样品溶液。以下所述供试品样品均为中长链脂肪乳注射液(C₆-C₂₄)。

3、空白供试品溶液：

取聚四氟乙烯材质消解管，精密加入9mL纯化水和1mL盐酸，加塞，置于石墨消解仪中，先80℃加热30min，再升温至100℃加热1h，所得产物120℃浓缩后，冷却，用纯化水定容至10ml，加入3mL正庚烷萃取，振荡摇匀，静置分层，弃去油相，取下层水相过滤，取滤液，得到空白供试品溶液；

4、测定

仪器：日本岛津20A型高效液相色谱仪，日本岛津RF-20A型荧光检测器。

分别精密量取铝元素系列对照品溶液、空白对照品溶液、供试品样品溶液和空白供试品样品溶液各0.1mL，分别精密加入衍生试剂0.9mL，混匀，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

液相色谱条件是：采用苯乙基键合硅胶为基质的苯基色谱柱(CAPCELL PAKPhenyl4.6mm×250mm，5μm)，流动相为质量百分浓度为0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液和浓度为0.2mol/L的乙酸铵溶液按体积比45:55的混合(临用新制)；柱温为30℃；流速为1.0mL/min；进样体积为100μL；荧光检测器的激发波长为380nm，发射波长为520nm。

5、标准曲线绘制和计算

以铝元素系列对照品溶液的浓度对应其相应的峰面积扣除空白对照溶液峰面积作直线回归，求得直线回归方程，根据供试品溶液的峰面积扣除空白供试品溶液峰面积计算供试品溶液中铝元素的含量。

(二)精密度试验

取铝元素系列对照品溶液中，浓度为25μg/L的铝元素对照品溶液，如(一)中4测定的方法进行测定，连续进样6次，结果如表5。

表5进样精密度试验结果

如表5可见，本发明的方法，进样精密度RSD为0.62％，方法进样精密度良好。

(三)重复性试验

按(一)中2供试品样品溶液制备，共制备6份供试品样品溶液，然后按(一)的方法进行重复性实验，结果如表6。

表6重复性试验结果

如表6可见，本发明的方法，RSD为5.5％，方法重复性良好。

(四)准确度试验(加样回收率)：

铝元素对照品浓溶液：精密量取浓度为500μg/L的铝元素标准贮备液25mL于100mL量瓶内，加纯化水定量稀释制成浓度为125μg/L的铝元素对照品溶液。

供试品样品溶液：取聚四氟乙烯材质消解管，精密加入1mL盐酸和9mL供试品样品，加塞后置于石墨消解仪中，先80℃加热30min，再升温至100℃加热1h，所得产物120℃浓缩后，冷却，用纯化水转移并定容至10mL，加入3mL正庚烷萃取，振荡摇匀，静置分层，弃去油相，水相过滤，取滤液，得到供试品样品溶液。

空白供试品溶液：取聚四氟乙烯材质消解管，精密加入1mL盐酸和9mL纯化水，加塞后置于石墨消解仪中，先80℃加热30min，再升温至100℃加热1h，所得产物120℃浓缩后，冷却，用纯化水转移并定容至10mL，加入3mL正庚烷萃取，振荡摇匀，静置分层，取下层水相过滤，取滤液，得到空白供试品溶液。

加标回收率供试品溶液：分别精密量取浓度为125μg/L的铝元素对照品浓溶液0.5、1和1.5mL，分置聚四氟乙烯消解管中，分别精密加入纯化水4、3.5和3ml，再分别精密加入4.5mL供试品样品，混匀，精密加入1mL盐酸(每个浓度制备3份)，加塞，于石墨消解仪中80℃加热30min，升温至100℃加热1h，脂肪乳水包油结构被破坏，溶液呈油水分离的浑浊状态，120℃浓缩。放冷，用纯化水转移并定量至10mL。加入正庚烷3ml萃取，振荡摇匀，静置分层，弃去油相，水相过滤，作为加标回收率供试品溶液。以9mL纯化水代替供试品样品，同法制备空白加标回收率供试品溶液。

分别精密量取铝元素系列对照品溶液、空白对照溶液、供试品样品溶液、空白供试品溶液、加标回收率供试品溶液和空白加标回收率供试品溶液0.1mL，精密加入衍生试剂0.9mL，混匀，如(一)中4测定的方法进行测定，结果如表7。

表7回收率测定结果

由表7可见，本发明的方法，加样回收率为109.4％，RSD为1.4％(n＝9)，方法准确度良好。

实施例3实际应用

(一)高效液相色谱法测定脂肪乳注射液中杂质铝元素含量的方法，包括如下步骤：

1、试剂配制：

1.1)配制衍生试剂：

按体积比，0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液:0.2mol/L的乙酸铵溶液＝45:55；取50mL的0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液和0.2mol/L的乙酸铵溶液的混合溶液，加入0.3mL质量百分浓度为50％的NaOH，混合均匀，即可。

1.2)配制铝元素系列对照品溶液：

铝元素标准贮备液配制：取金属铝单元素标准溶液(国家有色金属及电子材料分析测试中心，浓度为1000μg/ml)，用纯化水稀释配制浓度为500μg/L的铝元素标准贮备液。

铝元素系列对照品溶液的配制：精密量取铝元素标准贮备液适量，加纯化水定量稀释，分别配制成浓度为200μg/L、100μg/L、50μg/L、25μg/L、10μg/L和5μg/L的铝元素系列对照品溶液。

1.3)空白对照溶液：以纯化水作为空白对照溶液。

1.4)流动相配制：按体积比，0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液:0.2mol/L的乙酸铵溶液＝45:55；取0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液和0.2mol/L的乙酸铵溶液，混合均匀即可。

2、供试品样品溶液制备：

取聚四氟乙烯材质消解管，精密加入9mL供试品样品和1mL盐酸，加塞，置于石墨消解仪中，先80℃加热30min，再升温至100℃加热1h，所得产物120℃浓缩后，冷却，用纯化水转移并定容至10mL，然后加入3mL正庚烷萃取，振荡摇匀，静置分层，弃去油相，水相过滤，取滤液，得到供试品样品溶液。

如表8，取不同品种不同批次的脂肪乳类注射液为供试品样品。

3、空白供试品溶液：

取聚四氟乙烯材质消解管，精密加入9mL纯化水和1mL盐酸，加塞后置于石墨消解仪中，先80℃加热30min，再升温至100℃加热1h，所得产物120℃浓缩后，冷却，用纯化水转移并定容至10mL，加入3mL正庚烷萃取，振荡摇匀，静置分层，取下层水相过滤，取滤液，得到空白供试品溶液；

4、测定

仪器：日本岛津20A型高效液相色谱仪。

分别精密量取铝元素系列对照品溶液、空白对照溶液、供试品样品溶液和空白供试品样品溶液各0.1mL，分别精密加入衍生试剂0.9mL，混匀，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

液相色谱条件是：采用苯乙基键合硅胶为基质的苯基色谱柱(CAPCELL PAKPhenyl4.6mm×250mm，5μm)，流动相为质量百分浓度为0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液和浓度为0.2mol/L的乙酸铵溶液按体积比45:55的混合(临用新制)；柱温为30℃；流速为1.0mL/min；进样体积为100μL；荧光检测器的激发波长为380nm，发射波长为520nm。

5、结果

如图12，以铝元素系列对照品溶液的浓度对应其相应的峰面积扣除空白对照峰面积作标准曲线，并作直线回归，求得线性回归方程为：y＝1480.66x+14529.46，R²＝0.9994。在5～200ug/L范围内，线性关系良好。

采用标准曲线法，根据供试品样品溶液的峰面积扣除空白供试品峰面积，求出供试品样品溶液中铝元素的含量(C₀)，然后按公式(1)求得供试品样品中铝元素含量，结果如表8。

其中，C：供试品样品中铝元素含量，g/mL

C₀：供试品样品溶液中铝元素的含量，μg/L

C_油：供试品样品的油相浓度，g/mL

ρ_油：供试品样品的油相密度，g/mL

注：供试品样品的油相浓度和供试品样品的油相密度，由药品生产企业提供。

表8样品测定

由表8可见，本申请的方法，测量结果准确，方法仪器设备简单，价格低，更易于实验室推广使用。

Claims (9)

1.高效液相色谱法测定脂肪乳类注射液中杂质铝元素含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)试剂配制：分别配制衍生试剂、铝元素系列对照品溶液、空白对照溶液和流动相，

现用现配；

2)供试品样品溶液制备：取聚四氟乙烯材质消解管，精密加入9mL供试品样品和1mL酸试剂，加塞后置于石墨消解仪中，先80℃加热30min，再升温至100℃加热1h，所得产物120℃浓缩后，冷却，用纯化水转移并定容至10mL，加入3mL正庚烷萃取，振荡摇匀，静置分层，弃去油相，取水相过滤，取滤液，得到供试品样品溶液；所述供试品样品为脂肪乳类注射液；

3)空白供试品溶液制备：取聚四氟乙烯材质消解管，精密加入9mL纯化水和1mL酸试剂，加塞后置于石墨消解仪中，先80℃加热30min，再升温至100℃加热1h，所得产物120℃浓缩后，冷却，用纯化水转移并定容至10mL，加入3mL正庚烷萃取，振荡摇匀，静置分层，取下层水相过滤，取滤液，得到空白供试品溶液；

4)测定：分别精密量取铝元素系列对照品溶液、空白对照溶液、供试品样品溶液和空白供试品溶液各0.1mL，分别精密加入衍生试剂0.9mL，混匀后，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；

5)以铝元素系列对照品溶液的浓度对应其相应的峰面积扣除空白对照溶液的峰面积作直线回归，求得线性回归方程，根据供试品样品溶液的峰面积扣除空白供试品溶液的峰面积，计算供试品样品中铝元素的含量。

2.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定脂肪乳类注射液中杂质铝元素含量的方法，其特征在于，步骤1)中，所述衍生试剂的配制方法，包括如下步骤：按体积比，质量百分浓度为0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液:0.2mol/L的乙酸铵溶液＝45:55；取50mL的0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液和0.2mol/L的乙酸铵溶液的混合溶液，加入0.3mL质量百分浓度为50％的NaOH，混合均匀。

3.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定脂肪乳类注射液中杂质铝元素含量的方法，其特征在于，步骤1)中，所述铝元素系列对照品溶液的浓度分别为200μg/L、100μg/L、50μg/L、25μg/L、10μg/L和5μg/L。

4.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定脂肪乳类注射液中杂质铝元素含量的方法，其特征在于，步骤1)中，所述流动相的配制方法，包括如下步骤：按体积比，质量百分浓度为0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液:0.2mol/L的乙酸铵溶液＝45:55；取0.3％的8-羟基喹啉乙腈溶液和0.2mol/L的乙酸铵溶液，混合均匀。

5.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定脂肪乳类注射液中杂质铝元素含量的方法，其特征在于，步骤2)中，所述酸试剂为硫酸、硝酸或盐酸。

6.根据权利要求5所述的高效液相色谱法测定脂肪乳类注射液中杂质铝元素含量的方法，其特征在于，所述酸试剂为盐酸。

7.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定脂肪乳类注射液中杂质铝元素含量的方法，其特征在于，步骤3)中，液相色谱条件是：采用苯乙基键合硅胶为基质的苯基色谱柱，柱温为30℃；流速为1.0mL/min；进样体积为100μL；荧光检测器的激发波长为380nm，发射波长为520nm。

8.根据权利要求1-7任一项所述的高效液相色谱法测定脂肪乳类注射液中杂质铝元素含量的方法，其特征在于，所述脂肪乳类注射液为C₆-C₂₄的中长链脂肪乳注射液、或脂肪乳氨基酸(17)葡萄糖(11％)脂肪乳注射液、或中长链脂肪乳氨基酸(16)葡萄糖(16％)脂肪乳注射液。

9.权利要求1-7任一项所述的方法在测定脂肪乳类注射液中杂质铝元素含量中的应用。

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