CN115786310A - 一种弱酸性条件下诱导膜融合的蛋白突变体5h-psi及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种弱酸性条件下诱导膜融合的蛋白突变体5H‑PSI及其编码基因和应用。本发明提供了一种诱导膜融合的蛋白突变体5H‑PSI，所述蛋白突变体5H‑PSI的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明在野生型PSI蛋白中引入5个组氨酸突变，改变蛋白的等电点，进而可以在弱酸性条件下，通过自身表面电荷的分布，实现在4.5≤pH<7的范围内，具有介导膜融合的活性。本发明提供的诱导膜融合的蛋白突变体5H‑PSI突破了原有蛋白仅能在较强酸性条件下进行膜融合的特性，显著提升了此蛋白细胞膜融合的适用范围。

Description

一种弱酸性条件下诱导膜融合的蛋白突变体5H-PSI及其编码 基因和应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种弱酸性条件下诱导膜融合的蛋白突变体5H-PSI及其编码基因和应用。

背景技术

天冬氨酸蛋白酶(Aspartic Protease，AP)是一类重要的蛋白水解酶，参与机体的新陈代谢及生物调控作用，广泛存在于动物、植物、病原菌细胞内，在植物的花、叶、茎等器官组织中均发现了AP。在植物中，AP与蛋白前体加工、蛋白质消化、细胞程序性凋亡等生理过程相关。植物的APs主要由N端结构域、植物特有插入序列(plant-specific insert，PSI)和C端结构与三部分组成。其中N端区域和C端区域与哺乳动物、微生物中AP蛋白中N端和C端结构域同源性较高。而PSI序列为植物APs所特有，在哺乳动物细胞中的AP不含有PSI结构域，为植物细胞中特有。

在植物细胞中，PSI作为AP酶的一部分，以酶原的形式存在植物细胞内，具有植物细胞抗菌防御功能。在受到外源病原菌感染后，AP酶原运输至液泡内，在液泡酸性环境下，加工变为成熟的AP水解酶。在这一过程中，PSI从APs中分离，并以与液泡的生物膜相互作用，诱导液泡膜和细胞膜的融合。利用基因工程，重组表达的PSI蛋白也同样具有抗菌活性，表现出对多种感染植物或人类细胞病原菌的抗性。然而，天然的PSI蛋白只有在pH低于4.5的条件下才具有高效诱导膜融合的活性，以及发挥抑菌作用。而在生物体内，大多数细胞所处的微环境为中性溶液环境，pH在7.0-7.4之间；或某些局部感染的部位，细胞处于弱酸环境中，即pH在6.0-7.0之间。因此，在在这种环境中天然的PSI蛋白不具备诱导膜融合的能力。因此，改造PSI蛋白，使PSI蛋白在近中性条件下具有膜融合活性，显得尤为迫切。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种弱酸性条件下诱导膜融合的蛋白突变体5H-PSI及其编码基因和应用，在pH值高于4.5的条件下高效诱导膜融合。

本发明提供了一种诱导膜融合蛋白突变体5H-PSI，所述蛋白突变体5H-PSI的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了编码上述技术方案所述的蛋白突变体5H-PSI的基因。

优选的，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了编码上述技术方案所述的蛋白突变体5H-PSI的重组载体。

优选的，所述重组载体包括出发载体和编码上述技术方案所述的蛋白突变体5H-PSI的基因。

本发明还提供了上述技术方案所述的蛋白突变体5H-PSI的制备方法，包括以下步骤：

以pET-32a(+)为出发载体，在所述pET-32a(+)的Msc I和Xho I酶切位点之间插入权利要求2或3所述的编码基因，删除pET-32a(+)本身携带的His标签，且保持pET-32a(+)的其他序列不变，得到重组载体；

将所述的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌；

培养所述重组菌，得到含有表达蛋白的培养液；

对所述含有表达蛋白的培养液进行回收和纯化，得所述蛋白突变体5H-PSI。

本发明还提供了表达上述技术方案所述蛋白突变体5H-PSI的重组菌。

本发明还提供了上述技术方案所述的蛋白突变体5H-PSI或基因或制备方法得到的蛋白突变体5H-PSI在诱导膜融合的产品中的应用。

优选的，利用所述产品诱导膜融合时，4.5≤pH<7。

本发明一种诱导膜融合蛋白突变体5H-PSI，所述诱导膜融合蛋白突变体5H-PSI的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明根据野生型PSI蛋白在与膜结合过程中不同氨基酸的动态性质不同，在野生型PSI蛋白中引入突变，将野生型PSI蛋白中部分谷氨酸和天冬氨酸残基突变为组氨酸，具体为将野生型PSI蛋白第40位的D突变为H，第54位的E突变为H，第56位的E突变为H，第58位的E突变为H，第64位的E突变为H。本发明所述突变使PSI蛋白表面的正电荷数量提高，更易于PSI蛋白与细胞膜的结合，在4.5≤pH<7条件下，依然具有很强的介导膜融合的活性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例2进行SDS-PAGE实验的结果；

图2为对比例1步骤(5)进行SDS-PAGE实验的结果；

图3为对比例1步骤(7)进行SDS-PAGE实验的结果；

图4为野生型蛋白PSI在不同pH条件下介导膜融合的效率；

图5为本发明蛋白突变体5H-PSI在不同pH条件下介导膜融合的效率。

具体实施方式

本发明提供了一种诱导膜融合蛋白突变体5H-PSI，所述诱导膜融合蛋白突变体5H-PSI的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明中，所述SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具体为：IVSMECKTIVSQY GEMIWDLLVSGVRPDQVCSQAGLCFVHGAQHVSSNIKTVVHRHTHGSSVGHAP LCTACEMAVVWMQNQLKQEGTKEKVLEYVNQLCEKIP。本发明所述诱导膜融合蛋白突变体5H-PSI是将野生型PSI蛋白第40位的D突变为H，第54位的E突变为H，第56位的E突变为H，第58位的E突变为H，第64位的E突变为H。本发明所述的野生型PSI蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，具体为：IVSMEC KTIVSQYGEMIWDLLVSGVRPDQVCSQAGLCFVDGAQHVSSNIKTVVERETEGSS VGEAPLCTACEMAVVWMQNQLKQEGTKEKVLEYVNQLCEKIP。

本发明还提供了编码上述技术方案所述的蛋白突变体5H-PSI的基因。在本发明中所述基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示，具体为5’-ATCGTTTCCATGGAATGCAAGACTATTGTTTCTCAGTATGGTGAGATGATCTG GGACCTGCTGGTGTCTGGTGTGCGTCCGGACCAGGTGTGTTCTCAGGCAGGTCTGTGCTTCGTGCACGGCGCGCAGCACGTATCCTCCAACATCAAAACCGTTGTTCATCGCCACACTCACGGTTCCAGCGTTGGCCACGCCCCGCTGTGCACCGCATGCGAGATGGCCGTGGTTTGGATGCAGAACCAGCTGAAACAGGAGGGTACTAAGGAGAAAGTCCTGGAGTACGTTAACCAGCTGTGCGAAAAAATTCCG-3’。

本发明还提供了编码上述技术方案所述蛋白突变体5H-PSI的重组载体。在本发明中，所述重组载体优选包括出发载体和上述技术方案所述的编码基因。本发明所述出发载体优选包括pET-32a(+)。本发明在具体实施过程中，优选将上述技术方案所述的编码基因插入pET-32a(+)的Msc I和Xho I酶切位点之间，删除原质粒载体本身携带的His标签，且保持pET-32a(+)的其他序列不变得到所述重组载体。本发明所述质粒pET-32a(+)优选携带氨苄青霉素抗性。本发明对构建所述重组载体的方法没有严格要求，采用本领域熟知的方式即可。

本发明还提供了上述技术方案所述的蛋白突变体5H-PSI的制备方法，包括以下步骤：

以pET-32a(+)为载体，在所述pET-32a(+)的Msc I和Xho I酶切位点之间插入上述技术方案所述的编码基因，删除pET-32a(+)本身携带的His标签，且保持pET-32a(+)的其他序列不变，得到重组载体；

将所述的重组载体转化至大肠杆菌宿主细胞，得到重组工程菌；

培养所述重组工程菌，得到含有表达蛋白的培养液；

对所述含有表达蛋白的培养液进行回收和纯化，得所述蛋白突变体5H-PSI。

本发明将上述技术方案所述的重组载体转化宿主细胞，得到重组工程菌。在本发明中，所述宿主细胞优选包括大肠杆菌感受态细胞，进一步优选为Rosetta-gamiB(DE3)pLysS。本发明所述Rosetta-gamiB(DE3)pLysS购买自上海晶抗生物有限公司。本发明对所述转化的方式没有严格要求，采用本领域熟知的方式即可。

得到所述重组菌后，本发明培养所述重组菌，得到含有表达蛋白的培养液。本发明优选使用含有抗生素的LB培养基培养所述重组菌。本发明所述抗生素优选包括卡那霉素(Kana)，氯霉素(Chl)，四环素(Tet)和氨苄青霉素(Amp)；所述LB培养基中卡那霉素的浓度优选为15μg/mL，氯霉素的浓度优选为34μg/mL，四环素的浓度优选为12.5μg/mL，氨苄青霉素的浓度优选为50μg/mL。本发明所述培养的温度优选为37℃，所述培养的时间优选为16小时，所述培养的转速优选为250rpm。本发明优选使用培养箱进行所述培养。

得到所述含有表达蛋白的培养液后，本发明对所述含有表达蛋白的培养液进行回收和纯化，得到所述蛋白突变体5H-PSI。在本发明中，所述回收和纯化优选使用Ni-NTA柱。本发明所述回收和纯化的步骤优选包括：将培养后的蛋白与平衡后的Ni-NTA柱结合，依次利用缓冲液1、缓冲液2和缓冲液3流洗，收集缓冲液3柱后洗脱液；对所述缓冲液3柱后洗脱液进行第一次透析，得透析液；对透析液进行酶切处理后依次利用缓冲液1和缓冲液3流洗，收集缓冲液3柱后洗脱液；对所述缓冲液3柱后洗脱液进行第二次透析，得纯化后的蛋白。本发明所述缓冲液1中包括Tris和NaCl；所述所述缓冲液1中Tris的浓度优选为20mM，NaCl的浓度优选为300mM；所述缓冲液1的pH优选为7.4。本发明所述缓冲液2中包括Tris、NaCl和咪唑；所述缓冲液2中Tris的浓度优选为20mM，NaCl的浓度优选为300mM，咪唑的浓度优选为20mM；所述缓冲液2的pH优选为7.4。本发明所述缓冲液3中包括Tris、NaCl和咪唑；所述缓冲液4中Tris的浓度优选为20mM，NaCl的浓度优选为300mM，咪唑的浓度优选为300mM；所述缓冲液3的pH优选为7.4。

在本发明中，所述第一次透析优选使用截留分子量为7kDa的透析袋；所述第二透析优选使用截留分子量为1kDa的透析袋。

在本发明中，对所述第一次透析所得透析液进行酶切处理时，优选使用凝血酶；所述凝血酶的活力优选为0.5U/μL；所述凝血酶的用量优选为1μL/mg蛋白。本发明利用凝血酶进行酶切能够去除与蛋白相连的TrxA助溶标签，避免影响蛋白本身性质。

本发明还提供了表达上述技术方案所述的蛋白突变体5H-PSI的重组菌。

本发明还提供了上述技术方案所述的蛋白突变体5H-PSI或基因或制备方法得到的蛋白突变体5H-PSI在诱导膜融合的产品中的应用。在本发明中，利用所述产品诱导膜融合时，pH优选4.5≤pH<7，进一步优选为4.8～6.0，更优选为5.4。

本发明通过在野生型PSI蛋白中的关键位置引入突变，影响蛋白携带电荷的情况，使理论等电点由4.63变为6.56，使突变后的蛋白可以在4.5≤pH<7的条件下，带有正电荷，因此具有膜融合的活性。实施例结果表明，本发明提供的蛋白突变体5H-PSI在pH＝3.4的条件下，诱导1200s后，脂质体融合的效率达到39.78％；在pH＝4.8的条件下，诱导1200s后，脂质体融合的效率达到51.93％；在pH＝5.4的条件下，诱导1200s后，脂质体融合的效率达到70.97％，在pH＝6.0的条件下，诱导1200s后，使脂质体融合的效率达到46.00％。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种弱酸性条件下诱导膜融合的蛋白突变体5H-PSI及其编码基因和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

重组载体pET-32a(+)-5H-PSI的构建

(1)定点突变

以含有野生型PSI蛋白的编码基因(具体核苷酸序列为SEQ ID NO.4：5’-ATCGTTTCCATGGAATGCAAGACTATTGTTTCTCAGTATGGTGAGATGATCTGG GACCTGCTGGTGTCTGGTGTGCGTCCGGACCAGGTGTGTTCTCAGGCAGGTCTGTGCTTCGTGGACGGCGCGCAGCACGTATCCTCCAACATCAAAACCGTTGTTGAGCGCGAGACTGAAGGTTCCAGCGTTGGCGAGGCCCCGCTGTGCACCGCATGCGAGATGGCCGTGGTTTGGATGCAGAACCAGCTGAAACAGGAGGGTACTAAGGAGAAAGTCCTGGAGTACGTTAACCAGCTGTGCGAAAAAATTCCG-3’)的质粒为模板，进行定点突变，获得SEQ ID NO.2所示的编码基因；

(2)将SEQ ID NO.2所示的编码基因插入PET-32a(+)的Msc I和Xho I酶切位点之间，删除原质粒载体本身携带的His标签，获得重组载体pET-32a(+)-5H-PSI。

以上步骤委托南京金斯瑞生物科技股份有限公司完成。

实施例2

(1)感受态细胞的制备：取500μL的Rosetta-gami B(DE3)pLysS菌株接种于50mLLB液体培养基中，在37℃，220rpm的摇床培养4h。待菌液培养至OD₆₀₀介于0.4～0.5，将菌液转移至50mL离心管中，冰浴20min，在4℃，4000rpm的离心机中离心10min，弃上清。在沉淀中加入10mL预冷的0.1M CaCl2，将细胞沉淀重悬，使用4℃离心机，4000rpm离心10min，弃上清，重复两次。最后加入3mL预冷的0.1M CaCl₂，再次重悬细胞，利用移液枪分装感受态细胞，每个1.5mL EP管中加入100μL，再加入等体积的体积浓度为50％的甘油，放入-80℃中保存。

(2)转化：取出实施例1得到的重组载体pET-32a(+)-5H-PSI干粉4μg，加入80μL的ddH₂O溶解。取10μL质粒水溶液加入步骤(1)制备的感受态细胞中，轻轻震荡混匀，冰浴25min。然后将菌液置于42℃水浴中，热激45s，热激后冰浴菌液2min。之后在菌液中加入2mL的LB液体培养基，置于37℃，220rpm的摇床中震荡培养60min。取50μL菌液涂布于在已添加15μg/mLKana，34μg/mL Chl，12.5μg/mL Tet和50μg/mLAmp的LB固体培养基上，培养过夜。

(3)测序和保存：取过夜培养后的单菌落，质粒抽提，测序。测序结果发现存在与SEQ ID NO.2一致的核苷酸序列，得到重组菌；将重组菌接种到已添加15μg/mLKana，34μg/mL Chl，12.5μg/mLTet和50μg/mLAmp的LB液体培养液中，在250rpm，37℃摇床中振荡培养16h。取菌液700μL注入冻存管，按照体积比1:1加入50％甘油，甘油菌制作完成。

(4)重组菌的培养：取甘油菌1mL，加入50mL已添加抗生素的LB液体培养液(含15μg/mL Kana，34μg/mL Chl，12.5μg/mL Tet和50μg/mLAmp)中，在37℃，220rpm的摇床中，培养8h。接着将50mL菌液加入900mL已添加抗生素的LB液体培养液(含15μg/mL Kana，34μg/mLChl，12.5μg/mL Tet和50μg/mL Amp)中，37℃，220rpm条件下振荡培养3h，使用紫外分光光度计测得菌液OD600在0.6～0.8(记为诱导前菌液)。向诱导前菌液加入500μL浓度为1M的IPTG溶液，冰浴10min后，转入30℃，200rpm摇床中培养14h，得到诱导后菌液，诱导后菌液在4℃，4000rpm，离心10min，收集细胞沉淀。使用50mL的20mM tris缓冲液(pH值为7.4)重悬细胞沉淀。将重悬后的菌液加入4℃预冷的高压匀浆机，在820bar和860bar条件下，各循环破菌3min。高压匀浆机破碎后菌液回收，在4℃，12000rpm条件下离心30min，收集上清。

(5)将步骤(4)离心后的上清加入Ni-NTA柱(已使用pH＝7.4的20mM的tris缓冲液润洗)，放入摇床4℃，200rpm振荡结合3h。结合完成后，依次使用50mL的缓冲液1(由Tris和NaCl的水溶液组成，pH＝7.4，其中Tris浓度为20mM，NaCl浓度为300mM)、缓冲液2(由Tris、NaCl和咪唑的水溶液组成，pH＝7.4，其中Tris浓度为20mM，NaCl浓度为300mM，咪唑浓度为20mM)、缓冲液3(由Tris、NaCl和咪唑的水溶液组成，pH＝7.4，其中Tris浓度为20mM，NaCl浓度为300mM，咪唑浓度为300mM)进行流洗，分别收集柱后洗脱液，以步骤(4)诱导前菌液(记为诱导前)、步骤(4)诱导后菌液(记为诱导后)、步骤(4)收集的上清液(记为破菌后)、步骤(4)离心后的上清结合Ni-NTA柱后的流穿液(记为流穿)、缓冲液1流洗后的洗脱液(记为缓冲液1)、缓冲液2流洗后的洗脱液(记为缓冲液2)和缓冲液3流洗后的洗脱液(记为缓冲液3)为样品进行SDS-PAGE实验，结果如图1所示。

根据图1可以看出，利用缓冲液3进行流洗后，出现26.7kDa蛋白条带，确定目的蛋白在经缓冲液3流洗后的洗脱液中。

(6)将目的蛋白所在的洗脱液(即利用缓冲液3进行流洗后的洗脱液)转移至截留分子量为7kDa透析袋，在pH＝8.0的3L透析液(20mM Tris，100mM NaCl)中透析过夜。之后将透析后的蛋白转移至50mL离心管，按照每1mg蛋白加入1μL凝血酶(0.5U/μL)，酶切过夜，得到酶切后的蛋白溶液；

(7)将酶切后的蛋白溶液与清洗后的Ni-NTA柱在16℃，200rpm摇床中震荡结合2h，收集流穿液。依次使用步骤(5)中的缓冲液1与缓冲液3对结合后的Ni-NTA柱进行流洗，分别收集缓冲液1流洗后的洗脱液和缓冲液3流洗后的洗脱液；

以步骤(6)得到的酶切后的蛋白溶液(记为酶切后)、步骤(7)流穿液(记为切后流穿)、步骤(7)缓冲液1流洗后的洗脱液(记为切后缓冲液1)和步骤(7)缓冲液3流洗后的洗脱液(记为切后缓冲液3)为样品进行SDS-PAGE实验，结果如图1所示。

根据图1可以看出，步骤(7)缓冲液3进行流洗后的洗脱液出现大小12kDa的条带，确定目的蛋白5H-PSI在经缓冲液3流洗后的洗脱液中。

(8)将步骤(7)缓冲液3流洗后的洗脱液转移至1kDa透析袋，在3L纯水中透析24h，获得蛋白的水溶液，记为5H-PSI蛋白的水溶液。

(9)等电点检测

使用在线预测软件ExPASy Compute pI/Mw，输入SEQ ID NO.2所示的编码基因对应的氨基酸序列，计算出理论等电点，即6.56，说明本发明得到的5H-PSI蛋白的等电点为6.56。

对比例1

1.重组载体pET-32a(+)-PSI的构建

同实施例1，区别在于以含有野生型PSI蛋白的编码基因(具体核苷酸序列如SEQID NO.4所示)的质粒为模板，不进行定点突变，并且不删除原pET-32a(+)质粒载体的His标签。将编码野生型PSI蛋白的核苷酸序列插入PET-32a(+)质粒Msc I和Xho I酶切位点之间，获得重组载体pET-32a(+)-PSI。

2.PSI蛋白水溶液的

(1)按照实施例2步骤(1)的方法制备感受态细胞；

(2)按照实施例2步骤(2)的方法进行转化，区别在于将实施例2中步骤(2)重组载体pET-32a(+)-5H-PSI干粉替换为重组载体pET-32a(+)-PSI干粉；

(3)按照实施例2步骤(3)的方法进行测序和保存；

(4)按照实施例2步骤(4)的方法培养重组菌；

(5)同实施例2步骤(5)，以步骤(4)诱导后菌液(记为诱导后)、骤(4)离心后的上清结合Ni-NTA柱后的流穿液(记为流穿)、缓冲液1流洗后的洗脱液(记为缓冲液1)、缓冲液2流洗后的洗脱液(记为缓冲液2)和缓冲液3流洗后的洗脱液(记为缓冲液3)为样品进行SDS-PAGE实验，结果如图2所示。

根据图2可以看出，利用缓冲液3进行流洗后，出现26.7kDa蛋白条带，确定目的蛋白在经缓冲液3流洗后的洗脱液中；

(6)将目的蛋白所在的洗脱液(即利用缓冲液3进行流洗后的洗脱液)转移至截留分子量为7kDa透析袋，在pH＝8.0的3L透析液(20mM tris，100mMNaCl)中透析过夜。之后将透析后的蛋白转移至50mL离心管，按照每1mg蛋白加入1μL凝血酶(0.5U/μL)，酶切过夜，得到酶切后的蛋白；

(7)将酶切后的蛋白溶液与清洗后的Ni-NTA柱在16℃，200rpm摇床中震荡结合2h，收集流穿液。依次使用步骤(5)中的缓冲液1与缓冲液3对结合后的Ni-NTA柱进行流洗，分别收集缓冲液1流洗后的洗脱液和缓冲液3流洗后的洗脱液，以步骤(5)缓冲液3流洗后的洗脱液(酶切前)、步骤(6)得到的酶切后的蛋白溶液(记为酶切后)、步骤(7)流穿液(记为切后流穿)、缓冲液1流洗后的洗脱液(记为缓冲液1)和缓冲液3流洗后的的洗脱液(记为缓冲液3)为样品进行SDS-PAGE实验，结果如图3所示。

根据图3可以看出，步骤(7)流穿液出现PSI蛋白条带，条带大小12kDa，确定目的蛋白在步骤(7)流穿液中。

(8)将步骤(7)流穿液转移至截留分子量为1kDa透析袋，在3L纯水中透析24h，获得蛋白的水溶液，即为PSI蛋白的水溶液。

应用例1

1.构建非荧光标记脂质体，将非荧光标记的磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺按照摩尔比为1:1:1溶解于氯仿，并混合搅拌30分钟。使用N₂吹干，使用不同pH磷酸盐缓冲液溶解，超声振荡5分钟形成脂质体，在液氮和37摄氏度水浴中反复冻融十次，形成单层的脂质体，经过十次孔径为100nm的聚碳酸酯膜反复挤压，形成直径分布在100nm内的脂质体；

2.构建荧光标记脂质体：将非荧光标记的磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、罗丹明标记的乙醇胺和NBD标记的乙醇胺按照摩尔比1:1:1:0.6:0.6溶解于氯仿，并混合搅拌30分钟。使用N₂吹干，使用不同pH磷酸盐缓冲液溶解，超声振荡5分钟形成脂质体，在液氮和37摄氏度水浴中反复冻融十次，形成单层的脂质体，经过十次孔径为100nm的聚碳酸酯膜反复挤压，形成直径分布在100nm内的脂质体(该步骤均在避光条件下进行)；

3.将构建好的荧光标记脂质体与构建好的非荧光标记的脂质体按照物质的量之比为1:9的比例混合，并稀释至300μM，将混合液随机分为测试1组、测试2组、测试3组和测试4组，将测试1组的混合液pH调整为3.4、测试2组的混合液pH调整为4.8、测试3组的混合液pH调整为5.4、测试4组的混合液pH调整为6.0、测试5组的混合液pH调整为7.0；

将测试1～5组均随机等分为空白组、对照组、PSI组和5H-PSI组，分别进行如下操作：

空白组：混合液中不添加任何成分；

对照组：混合液中加入TritonX-100，使其体积浓度为0.2％；

PSI组：混合液中加入对比例1得到的PSI蛋白水溶液，使其体积浓度为20μM；

5H-PSI组；混合液中加入实施例2得到的5H-PSI蛋白水溶液，使终体积浓度为20μM；

4.监测步骤3各处理组不同反应时间荧光信号强度，按照下述公式计算融合效率，反应1200s各组别信号强度和融合效率如表1～2和图4～5。

融合效率(％)＝(f_t-f₀)/(f₁₀₀-f₀)

其中，f_t表示t时间PSI组或5H-PSI组荧光强度，f₀表示t时间空白组荧光强度，f₁₀₀表示t时间对照组荧光强度。

表1反应1200s时各处理组荧光信号强度

表2反应1200s时PSI组和5H-PSI组融合效率(％)

注：当融合效率出现负值时即蛋白未显现诱导膜融合的活性，当作蛋白促进膜融合效率为0处理。

根据图4～5和表1～2可以看出，本发明得到的蛋白突变体5H-PSI相比野生型PSI蛋白在pH＝4.8及更高的pH条件下，依然具有很强的介导膜融合的活性。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一种诱导膜融合的蛋白突变体5H-PSI，其特征在于，所述诱导膜融合蛋白突变体5H-PSI的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的蛋白突变体5H-PSI的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

4.编码权利要求1所述的蛋白突变体5H-PSI的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括出发载体和权利要求2或3所述的编码基因。

6.权利要求1所述的蛋白突变体5H-PSI的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

以pET-32a(+)为出发载体，在所述pET-32a(+)的MscI和XhoI酶切位点之间插入权利要求2或3所述的编码基因，删除pET-32a(+)本身携带的His标签，且保持pET-32a(+)的其他序列不变，得到重组载体；

将所述的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌；

培养所述重组菌，得到含有表达蛋白的培养液；

对所述含有表达蛋白的培养液进行回收和纯化，得所述蛋白突变体5H-PSI。

7.表达权利要求1所述的蛋白突变体5H-PSI的重组菌。

8.权利要求1所述的蛋白突变体5H-PSI或权利要求2或3所述的基因或权利要求6所述的制备方法得到的蛋白突变体5H-PSI在制备诱导膜融合的产品中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，利用所述产品诱导膜融合时，4.5≤pH<7。

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