CN115927263A - 一种IgA蛋白酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的IgA蛋白酶的制备方法。本发明所述的IgA蛋白酶来自于人致病性微生物。通过基因工程方法诱导表达制备该IgA蛋白酶，能够在相对安全的环境下提取，避免致病性微生物对人体的伤害。表达纯化结果表明，该IgA蛋白酶能够在16℃条件下可溶性表达，并且发生自裂解。使用WB的方法进行活性鉴定，结果表明该IgA蛋白酶酶活较高哦，且与之前报导的IgA蛋白酶具有不同的裂解位点，可将IgA完全水解。

Description

一种IgA蛋白酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种来源于人类致病性微生物的IgA蛋白酶的表达制备和应用。

背景技术

IgA蛋白酶是一种可以切割IgA1铰链区的酶，通常由脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)、淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)等人病原菌产生。不同菌种的IgA蛋白酶可从IgA1铰链区不同的氨基酸结合位点将IgA1切割成Fc和Fab片段。有些菌株还能产生多种IgA蛋白酶，可以切割不同的铰链区位点。

IgA蛋白酶的结构主要由四部分组成，分别是信号肽，酶活性结构域，连接结构域以及β结构域，是一种通过信号肽通过细菌内膜的自身转运体。IgA蛋白酶进入周质中后，其β结构域在外膜上形成孔结构，酶活性结构域和连接结构域通过β结构域通道并发生自裂解，酶活结构域和连接结构域释放到胞外。在之前的研究中，IgA蛋白酶可从病原菌培养液提取制备，也可以通过大肠杆菌基因工程表达纯化IgA蛋白酶。一方面，从病原菌培养液直接提取IgA蛋白酶危险性比较大，具有感染风险；而通过基因工程手段制备IgA蛋白酶的方案包括只表达其酶活部分或表达在裂解位点前加上His标签的完整蛋白，这些方案制备的IgA蛋白酶活性较低或产量较低。而本专利制备的IgA蛋白酶，产量较高且活性强，并且与之前所文献报导的IgA蛋白酶具有不同的裂解方式，可以完全水解IgA，具有一定的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种IgA蛋白酶。

本发明的另一目的在于提供一种核酸分子。

本发明的另一目的在于提供一种载体。

本发明的另一目的在于提供一种重组工程菌。

本发明的另一目的在于提供一种制备上述IgA蛋白酶的方法。

本发明采取的技术方案如下：

来自于Neisseriagonorrhoeae的IgA蛋白酶序列，经过密码子优化后，将化学方法合成的基因序列连接到载体上，导入大肠后诱导表达纯化后产生有活性的IgA蛋白酶。

本发明的IgA蛋白酶序列来自于人类HMP数据库，以NCBI蛋白数据库中的参考IgA蛋白酶序列为原始序列，通过比对的方法，得到来自于Neisseriagonorrhoeae的IgA蛋白酶，且该序列与参考数据库中IgA蛋白酶原始序列相似度在80％-99％之间。

在本发明的一些实施方案中，IgA蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

另一方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码上述的IgA蛋白酶。

在本发明的一些实施方案中，核酸分子序列如SEQ ID NO.2所示。

将该核酸分子连接到表达载体上，导入大肠杆菌，可在诱导剂的诱导下表达IgA蛋白酶。

另一方面，本发明还提供了一种载体，该载体连接有上述核酸分子。

在本发明的一些实施方案中，大肠杆菌表达载体为pET-28(a+)，核酸分子的插入位点为载体的NdeI和XhoI酶切位点之间。

另一方面，本发明提供了一种重组工程菌，其含有上述的载体。

在本发明的一些实施方案中，重组工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明提供了一种制备上述的IgA蛋白酶的方法，其包括：培养上述的重组工程菌；根据IgA蛋白酶两端His标签进行亲和纯化；根据分子量大小进行脱盐；脱盐后溶液进行冷冻干燥，继而得到高纯度易保存运输的IgA蛋白酶。

在本发明的一些实施方案中，使用商品化镍交换柱亲和层析得到IgA蛋白酶粗产品，使用商品化脱盐柱对IgA蛋白酶粗产品进行脱盐，得到纯度高的IgA蛋白酶溶液，再经过冷冻干燥得到高纯度容易保存和运输的IgA蛋白酶。

本发明提供的IgA蛋白酶可以应用于IgA的水解。

附图说明

图1为本发明中来自Neisseria gonorrhoeae的IgA蛋白酶表达载体示意图。

图2为构建的IgA蛋白酶原核表达系统在未诱导和IPTG诱导下不同温度培养条件下的表达情况。

图3为重组IgA蛋白酶纯化后的条带。

图4为纯化后重组IgA蛋白酶活性检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1含IgA蛋白酶序列的表达系统的构建

IgA蛋白酶蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，根据表达宿主优化IgA蛋白酶基因表达序列，为SEQ IDNO.2所示，提高IgA蛋白酶在大肠杆菌中的表达。IgA蛋白酶基因序列由化学方法合成，并克隆到pET-28(a+)载体，克隆位点为NdeI和XhoI，重组表达载体示意图见图1。

上述IgA蛋白酶表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到表达重组IgA蛋白酶的原核表达系统。该原核表达系统在IPTG或乳糖的诱导下表达的重组IgA蛋白酶包含N端和C端两个His6标签。

实施例2

重组IgA蛋白酶的诱导表达和纯化。

实施例1中所得到的IgA蛋白酶原核表达系统经过平板活化，挑选耐卡那霉素的单菌落到5毫升LB液体培养基中37℃，200rpm过夜培养。

以1％的接种量接过夜培养的菌液到30mL卡那霉素终浓度为100μg/mL的LB培养基中，37℃200rpm培养到对数生长期后(600nm处的吸光值为0.6-0.8)，不加或加入IPTG(终浓度为5mM)后在37℃，200rpm再培养4小时或16℃，200rpm再培养16小时。

培养结束后离心，使用5mLPBS重悬并超声破碎。分别取超声后菌液，超声后菌液上清和超声后菌液沉淀制样并电泳，鉴定IgA蛋白酶经过IPTG诱导，在不同温度下的表达情况。结果如图2所示。

由图2可以得知，在37℃的条件下，IgA蛋白酶有三个诱导表达条带，分别在150kD以上，140kD左右以及100kD左右。但是在16℃诱导表达条件下，IgA蛋白酶只在100kD左右有条带，为IgA蛋白酶自裂解后蛋白条带。

根据图2结果，我们选择在16℃诱导表达IgA蛋白酶。并进行后续分离纯化，过程如下：

离心收集诱导表达结束后的大肠杆菌，每克菌体使用10mLPBS重悬，使用60％功率超声破壁。破壁后的菌液离心后收集上清，过0.45μm水系滤膜。因为表达的IgA蛋白酶具有His×6标签，使用商品化的镍柱进行亲和纯化，并使用咪唑洗脱。含有蛋白的洗脱液使用SephadexG-25脱盐柱按照说明书所述脱盐，脱盐后的蛋白溶液冷冻干燥。600mL菌培养液共获得4mg蛋白，IgA蛋白酶产量约为6.67mg/L。

冷冻干燥后的蛋白电泳结果如图3所示。

实施例3

IgA蛋白酶活性验证。

IgA蛋白酶可以裂解IgA的铰链区，将其裂解为Fab和Fc片段，利用这一原理，通过电泳银染检测IgA完整和裂解片段的分布来确定IgA蛋白酶的活性。具体实验流程如下：

称量一定量的通过实施例2所述方法纯化的冷冻干燥后的IgA蛋白酶，使用PBS溶解，BCA比色法定量IgA蛋白酶溶液的含量为0.3mg/mL。取75μLIgA蛋白酶与3μgIgA在37℃下共同孵育16-18个小时。孵育结束后，加入20μL5×loadingbuffer和5μL1MDTT，在100℃煮沸5分钟，电泳方法分离IgA完整片段和裂解片段，电泳结束后，350mA恒流电转90分钟将蛋白转到PVDF膜上。电转结束后取下膜，使用1％的BSA封闭2小时，而后使用抗人IgA抗体4℃孵育过夜，第二天洗膜后使用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育两小时，结束后加入化学发光底物显色，并在显影仪下曝光，保存图片。

重组IgA蛋白酶活性检测结果如图4所示。可以确定，与单独IgA相比，加入IgA蛋白酶后完整条带完全被分解，但只有很浅的IgA裂解后条带，证明重组IgA蛋白酶具有一定的活性，且可以将IgA完全裂解，与之前所报道的IgA蛋白酶裂解方式不同。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种IgA蛋白酶的体外基因工程表达制备方法，包括以下步骤：

来源于人类共生微生物Neisseria gonorrhoeae 的IgA蛋白酶的筛选；

IgA蛋白酶基因密码子优化；

通过大肠杆菌进行原核表达；

通过His标签进行纯化，获得IgA蛋白酶。

2.根据权利要求1所述的一种IgA蛋白酶的体外基因工程表达制备方法，其特征在于：所述步骤1）中IgA蛋白酶的蛋白序列通过生信方法从人类肠道微生物数据库获得，其序列信息如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的一种IgA蛋白酶的体外基因工程表达制备方法，其特征在于：所述步骤2）中IgA蛋白酶序列经过密码子优化后，基因序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的一种IgA蛋白酶的体外基因工程表达制备方法，其特征在于：所述步骤3）中IgA蛋白酶基因序列通过化学方法合成，连接到特定载体上并由大肠杆菌诱导表达。

5.根据权利要求1所述的方法制备获得的IgA蛋白酶在治疗肾病药物中的应用。

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