CN103228787A - 用于分泌性蛋白表达的融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种适合于多于一种感兴趣多肽（POI）的分泌的融合蛋白，其包括信号肽、POI、包含来自自转运蛋白的β茎部结构域的载客结构域、以及来自自转运蛋白的易位蛋白结构域，其中该载客结构域的β茎部形成序列是基本上完整的并且该（这些）POI与该β茎部结构域融合。
Description
技术领域
本发明总体上涉及一种新的融合蛋白和一种用于分泌性蛋白表达的方法。
背景技术
分泌性蛋白表达是宿主细胞中蛋白质的表达，其中该蛋白质输出至细胞膜并且以可溶性方式释放至培养基中或保持与细胞膜连接。分泌性蛋白表达由处在蛋白质N端的信号肽介导，该信号肽指导多肽到达细胞膜。
]通常，在原核宿主如大肠杆菌中产生的重组蛋白以胞内方式产生。当蛋白质以这种方式回收时，不得不裂解细胞，这导致重组蛋白被细胞内容物污染。随后不得不从全细胞提取物中以多步骤纯化流程回收蛋白质，这费时并且导致低劣产率。
将重组蛋白分泌至培养基中是一项更好的策略，因为从用过的培养基中纯化蛋白质较容易并且与连续培养更相容。然而，现有系统不具有高效的产率。
其中蛋白质保持与细胞表面连接的分泌性蛋白表达具有其他用途。这种类型的蛋白质表达的用途的实例包括活疫苗开发、表位定位、生物吸附剂和生物传感器开发和为发现药物而高通量筛选蛋白质和肽文库。
在表面展示和分泌中，重组蛋白面临跨过复杂大肠杆菌细胞包膜易位的挑战，该细胞包膜由两个脂质膜（内膜和外膜）组成，在其间存在凝胶样区室（周质）。已经显示这种易位是十分困难的并且先前使用的方法具有低效力。
自转运蛋白是巨大的蛋白质，它们由革兰氏阴性细菌如（大肠杆菌）分泌。自转运蛋白系统在以下意义上是简单的：认为自转运蛋白，如其名称暗示，在蛋白质自身内部携带用于跨周质和外膜易位的全部信息。然而，借以自转运蛋白分泌的机制仍是不完全理解的。
自转运蛋白合成为巨大的前体蛋白，该前体蛋白含有3个主要结构域：(i)将蛋白质靶向Sec易位子并启动跨内膜转移的N端信号肽，(ii)包含待分泌的“载货”蛋白的载客结构域和(iii)包含β桶结构的C端成孔结构域（易位蛋白结构域），其中该β桶结构整合至外膜中并且在载客结构域跨越外膜易位至胞外空间中发挥关键但不清楚的作用。
在易位后，载客结构域从易位蛋白结构域中被切下并释放至胞外环境中。在一些情况下，载客结构域保持与细胞表面非共价地连接。可以通过（外部）蛋白酶对位于易位蛋白结构域和载客结构域之间的蛋白酶基序发挥作用来实现切割。可替代地，切割通过易位蛋白结构域和载客结构域之间特定位点处的分子内自催化事件发生。
自转运蛋白的载客结构域包含β茎部结构和侧面结构域。β茎部是由延长的β螺旋形成的伸长结构。载客结构域的C端包含已经参与载客结构域折叠和跨外膜易位的自伴侣结构域。
Hbp是属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）丝氨酸蛋白酶自转运蛋白（SPATE）亚家族的自转运蛋白。Hbp的载客结构域的晶体结构最近已经测定（Otto等人，2005,J.Biol Chem（《生物化学杂志》）280（17）：17339-45），并且如图11A显示。该结构展示这种多肽形成长的右手β-螺旋结构（“β茎部”）。Hbp的载客结构域包含两个较大的侧面结构域：结构域d1和结构域d2，其中d1包含该蛋白质的丝氨酸蛋白酶活并且d2具有未知的功能。还存在3个较小的侧面结构域：结构域3（d3）、结构域4（d4）和结构域5（d5）。
还已经显示了其他自转运蛋白如百日咳杆菌粘着素（Emsley等人，1996Nature（《自然》）381：90-92）和IgA蛋白酶（Johnson等人，2009J Mol Biol（《分子生物学杂志》）389（3）：559-74）的相似β茎部结构域。
先前已经尝试使用自转运蛋白用于大肠杆菌中的分泌性蛋白表达，大多使用经工程化用于表面展示目的的奈瑟氏菌IgA蛋白酶（Pyo等人，2009Vaccine（《疫苗》）272030-2036）和内源性大肠杆菌自转运蛋白AIDA-I（Van Gerven等人，2009Microbiology（《微生物学》）155:468-476）的变体。
使用IgA蛋白酶和AIDA-I用于分泌重组蛋白的尝试使用了导致分泌和表面暴露的蛋白质的低劣产率的构建体（Pyo等人，2009Vaccine（《疫苗》）272030-2036；Van Gerven等人，2009Microbiology（《微生物学》）155:468-476）。在大多数的这类研究中，完整或几乎完整的内源性载客结构域由重组蛋白替换。
迄今，自转运蛋白已经主要用作展示平台，而非用于可溶性形式的异源蛋白质的分泌，其中该蛋白质被分泌至培养基中。
IgA蛋白酶需要附属蛋白酶用于加工，而AIDA-I在切割后保持与外膜非共价地连接。因此，这些自转运蛋白可能仅用于表位和蛋白质的表面呈递。
先前已经显示了与Hbp载客结构域融合的钙调蛋白的高效展示和分泌（Jong等人，2007Molecular Microbiology（《分子微生物学》）63:1524-1536）。为了最小化对载客结构域的天然β-茎部的扰动，钙调蛋白替换Hbp载客结构域的结构域2。
对于某些应用，从细胞表面分泌或展示多于一种感兴趣蛋白（POI）的可能性是十分有用的。这类应用包括疫苗，例如其中两个或更多个表位展示在相同的细胞表面上；酶展示，其中多于一个酶展示在细胞表面上来以一系列步骤实施众多催化反应；肽文库暴露和抑制剂筛选。
对于多价疫苗，特别有用的是具有一种系统，其中一个宿主细胞群体可以表达并展示或分泌多种抗原，而非具有细胞群体的混合物，每个群体仅展示或分泌这些抗原之一。仅具有展示或分泌多种抗原的一个细胞群体具有更易生产和更好控制疫苗含量的优点。
总之，需要改进的分泌表达系统，这些系统用于展示异源蛋白质以及将异源蛋白质以可溶性形式分泌至培养基中。也需要的一种系统和一种方法，其能够在宿主细胞的细胞表面上使多于一个感兴趣蛋白进行分泌性蛋白表达或分泌多于一种蛋白质至培养基中。
发明目的
本发明的一个目的是提供感兴趣多肽（POI）从宿主细胞中的高效分泌。
本发明的第二目的是提供POI在宿主细胞表面上的高效展示。
本发明的第三目的是提供POI向其中培养宿主细胞的培养基中的高效可溶性分泌。
本发明的又一个目的是提供用于多于一种POI的高效分泌（即展示或可溶性分泌）的支架。
发明简述
在本发明的第一方面，提供了能够表达多于一种（如至少两种）POI（感兴趣蛋白）的宿主细胞。这些POI包含于一种融合蛋白中，该融合蛋白还包含载客结构域（其包含来自自转运蛋白的β茎部结构域）、来自自转运蛋白的易位蛋白结构域和能够将该融合蛋白靶向革兰氏阴性细菌内膜的信号肽。该载客结构域的β茎部形成序列是基本上完整的并且这些POI与该载客结构域融合。
与其他系统相比，用于分泌性蛋白表达的这种宿主细胞具有几个优点，包括但不限于更高效地分泌多于一种POI。另外，当目标是展示POI时，随着POI将进一步离开细胞表面并且更稳定，β茎部结构域将能够实现更高效的展示。
在本发明的宿主细胞的一个实施例中，自转运蛋白的天然形式的载客结构域包含从β茎部结构域突出的至少一个侧面结构域。POI随后可以插入、替代或部分替代这种侧面结构域。
在另一个实施例中，自转运蛋白的天然形式的载客结构域包含至少两个侧面结构域。每种POI随后可以插入、替代或部分替代独立的这种侧面结构域，或POI可以插入、替代或部分替代相同的侧面结构域。
POI也可以与来自自转运蛋白的独立的载客结构域、易位蛋白结构域和信号肽融合。
在本发明的第二方面，提供一种融合蛋白，该融合蛋白包含多于一种（如至少两种）POI（感兴趣蛋白）、载客结构域（其包含来自自转运蛋白的β茎部结构域）、来自自转运蛋白的易位蛋白结构域和任选地，将该融合蛋白靶向革兰氏阴性细菌内膜的信号肽。该载客结构域的β茎部形成序列是基本上完整的并且这些POI与该载客结构域融合。
在其天然形式下，该融合蛋白的载客结构域可以包含从β茎部结构域突出的至少一个侧面结构域，并且这些POI可以插入、替代或部分替代这种侧面结构域。在其天然形式下，该融合蛋白的载客结构域还可以包含至少两个侧面结构域，并且每种POI可以插入、替代或部分替代这类侧面结构域的独立结构域。可替代地，这些POI可以插入、替代或部分替代相同的侧面结构域。
在本发明的另一个方面，提供了经安排用于表达融合蛋白的核酸。在一个实施例中，该核酸在框内包含编码该融合蛋白的信号肽的序列，该信号肽能够将该融合蛋白靶向革兰氏阴性细菌的内膜；编码该融合蛋白的载客结构域的序列，该载客结构域包含来自自转运蛋白的β茎部结构域，和编码该融合蛋白的易位蛋白结构域的序列，该易位蛋白结构域源自自转运蛋白。编码该载客结构域的序列包含允许框内地克隆至少两个编码POI（感兴趣蛋白）的DNA序列的至少两段克隆位点序列。这些克隆位点序列如此安排，从而该载客结构域的所编码的β茎部形成蛋白序列是基本上完整的。也可能不使用克隆位点仅通过融合两段DNA，例如通过PCR，将POI插入一种自转运蛋白中，从而产生一种融合蛋白。
编码该自转运蛋白的载客结构域的序列可以在其天然形式下包含至少两段序列，这些序列编码从β茎部结构域突出的侧面结构域。该至少两段克隆位点序列随后可以插入、替代或部分替代独立的编码侧面结构域的这类片段。
在另一个实施例中，该核酸在框内包含编码该融合蛋白的信号肽的序列，该信号肽能够将该融合蛋白靶向革兰氏阴性细菌的内膜；编码该融合蛋白的载客结构域的序列，该载客结构域包含来自自转运蛋白的β茎部结构域；编码该融合蛋白的易位蛋白结构域的序列，该易位蛋白结构域源自自转运蛋白；和编码该融合蛋白的至少两种POI的序列。编码这些POI的序列与编码该载客结构域的序列融合并且如此安排，从而该载客结构域的所编码的β茎部形成蛋白序列是基本上完整的。
编码该自转运蛋白的载客结构域的序列在其天然形式下可以包含至少两段序列，这些序列编码从β茎部结构域突出的侧面结构域。编码POI的至少两个序列的每一个随后可以插入、替代或部分替代编码侧面结构域的这些片段的每一个。
可以如此安排该宿主细胞、融合蛋白或核酸，从而当表达时，该融合蛋白从细胞表面分泌。例如，该融合蛋白可以包含使得该融合蛋白被切割和从表达该融合蛋白的宿主细胞分泌的切割位点。并且，编码该融合蛋白的核酸可以编码这种切割位点。
可以如此安排该宿主细胞、融合蛋白或核酸，从而当表达时，该融合蛋白在细胞表面展示。例如，该融合蛋白可以不包含这类切割位点或可以包含破坏的切割位点。类似地，编码该融合蛋白的核酸则不编码这种切割位点或编码破坏的切割位点。可替代地，该融合蛋白和核酸可以包含切割位点并且所得到的融合蛋白经切割，但是保持与细胞表面非共价连接，并且因此在该细胞表面展示。
该载客结构域和易位蛋白结构域可以源自SPATE（肠杆菌科丝氨酸蛋白酶自转运蛋白）蛋白，如来自大肠杆菌的血红蛋白结合蛋白酶（Hbp）、胞外丝氨酸蛋白酶（EspC）或温度敏感性血凝素（Tsh）。
在本发明的一个方面，提供了一种包含本发明核酸的载体。
在本发明的另一个方面，提供了一种包含本发明核酸或载体的宿主细胞。
在一个实施例中，本发明的宿主细胞是革兰氏阴性细菌，该革兰氏阴性细菌可以选自肠杆菌科，如大肠杆菌、沙门氏菌属某些物种（Salmonella spp.）、弧菌属某些物种（Vibrio spp.）、志贺氏菌属某些物种（Shigella spp.）、假单胞菌属某些物种（Pseudomonads spp.）、伯克霍尔德菌属某些物种（Burkholderia spp.）或德特氏菌属某些物种（Bordetellaspp.）。
在一个方面，提供了展示根据本发明的融合蛋白的外膜小泡。在另一个方面，提供了一种展示根据本发明的融合蛋白的菌影。
在一个方面，提供了一种用于融合蛋白的分泌性蛋白表达的方法，该方法包括步骤：提供根据本发明的一种宿主细胞并诱导该融合蛋白的表达。
在一个实施例中，该方法包括另外的步骤：抑制该宿主细胞中具有蛋白酶活性的周质酶，如DegP。可以例如通过DegP催化位点中的突变抑制DegP。
在另一个实施例中，该方法包括另外的步骤：下调该宿主细胞的周质间隙内催化蛋白质中二硫键形成的至少一种酶，如DsbA或DsbB。
该方法能以可溶性方式提供该融合蛋白的分泌。可替代地，它可以提供该融合蛋白在细胞表面上的展示。
在一个实施例中，该方法包括另外的步骤：诱导小泡从该宿主细胞（其是革兰氏阴性细菌）的外膜排出，因此形成在它们的表面上展示该融合蛋白的外膜小泡。
在另一个实施例中，该方法包括另外的步骤：裂解该革兰氏阴性细菌，因此形成在它们的表面上展示该融合蛋白的菌影。可以通过使用来自噬菌体PhiX174的致死性裂解基因E进行裂解。
在一个实施例中，这些POI的至少一种可以包含抗原，例如来自感染性生物的抗原。该抗原例如是来自结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）的抗原，如ESAT-6、Ag85B、Rv2660c、TB10.4和TB10.3，或与这些蛋白质相似的蛋白质。
在一个方面，提供了包含根据本发明的宿主细胞、融合蛋白、外膜小泡或菌影的疫苗。
附图简述
本发明现在通过举例方式参考附图进行描述，在这些附图中：
图1-10显示在实例中所用的质粒的质粒图。
图11A-D显示Hbp载客结构域的结构的图，其中指出某些结构域。
图11E展示在实例1-15中使用的融合蛋白的多种构建体。
图12-33显示来自实例1-19的实验数据。对于细节，参见实例部分。
图34显示在实例中所用的质粒的质粒图。
定义
如本文所用，供应以下定义旨在促进对本发明的理解。
“自转运蛋白”是属于pfam自转运蛋白家族（‘自转运蛋白’PF03797）并且还已知或预测形成β茎部基序的蛋白质。用于序列分析的BETAWRAPPRO方法可以用来预测自转运蛋白的载客结构域是否将形成β茎部基序（Junker等人，2006Proc Natl Acad Sci U S A（《美国科学院院刊》）103（13）：4918-23）。
“感兴趣多肽”（POI）是本发明的使用者想要宿主细胞以可溶性形式分泌至培养基中或展示在细胞表面上或两者的多肽。典型地，该POI是使用者研究或想要表达的蛋白质，而融合蛋白的其他部分辅助分泌过程。典型地，该POI还相对于与其融合的自转运蛋白结构域是异源的。该POI具有至少4个氨基酸长度、至少10个氨基酸长度或至少20个氨基酸长度。
“β茎部形成序列”指形成β茎部结构的自转运蛋白的载客结构域的序列。可以使用晶体结构测定法鉴定载客结构域的β茎部形成序列。如上文所述，可以可替代地使用M4T同源性建模方法（Rykunov等人，2009J Struct Funct Genomics（《结构与功能基因组学杂志》）10：95-99）或相似的预测方法鉴定β茎部形成序列。
“侧面结构域”是一种结构域，它是载客结构域的部分但不是β茎部的部分。典型地，侧面结构域位于载客结构域中两段β茎部形成序列之间。侧面结构域始于居前β链之后的第一氨基酸处并且它止于后随于侧面结构域的β链的起始氨基酸之前的一个氨基酸。侧面结构域也可以位于载客结构域的N端处。自转运蛋白可以具有几个侧面结构域。
“相似的蛋白质”、“相似的序列”或“类似的蛋白质”指当两个氨基酸序列比较时，与另一种蛋白质具有高程度同源性的蛋白质。优选地，当两个序列最佳比对时，它至少80%、更优选地多于90%、更优选地多于95%、甚至更优选地多于97%与对比序列同源。使用公众可获得的软件如BLAST，可以轻易地测量序列同源性。
“宿主细胞”指已经向其中导入本发明的一个或多个载体或分离和纯化的核酸序列的原核细胞。应当理解本术语不仅指具体的对象细胞，还指这种细胞的子代或潜在子代。因为某些修饰可以因突变或环境影响而出现在后续世代中，所以这类子代实际上可以与亲代细胞不相同，但仍包含于如本文中所用的这个术语范围内。
“展示”：分泌性蛋白保持与宿主细胞外膜结合，从而它至少部分地在细胞外部突出时，这种分泌性蛋白展示在分泌性宿主细胞的表面上。该分泌性蛋白可以与细胞膜或存在于其中的组分（如来自自转运蛋白的易位蛋白结构域）以共价或非共价的方式连接。
“可溶性分泌”和“以可溶性方式分泌”指蛋白质的分泌，其中该蛋白质分泌入胞外空间中，从而不与宿主细胞结合，这与该蛋白质保持与宿主细胞外膜或整合至宿主细胞外膜中的蛋白质结合时相反。
“大约”指示在适用的情况下，偏离该值+/-10%。
描述
发明人已经发现，如果自转运蛋白的载客结构域的β茎部形成序列是基本上完整的，则该自转运蛋白可以用于改进的分泌性蛋白表达。尽管实际的β茎部形成序列是最佳分泌必需的，但是自转运蛋白的载客结构域的侧面结构域是用于插入POI的合适位点。这些侧面结构域可以由随后将被分泌的POI替换。可替代地，可以插入该POI，从而以便替代部分的侧面结构域或从而以便与侧面结构域融合。
发明人还已经发现，如果自转运蛋白的载客结构域的β茎部形成序列是基本上完整的，则该自转运蛋白可以用于多于一种（如至少两种）POI的改进的分泌性蛋白表达。通过将POI融合，即插入、替换或部分地替换载客结构域的一个或多个侧面结构域，同时保持β茎部结构完整，实现了一种高效和相对易用的用于同时展示或可溶性分泌两种或更多种POI的系统。
可以根据本发明被替换的侧面结构域是相对大的，如具有20、30、40、60、80个或更多个氨基酸残基。
因此，自转运蛋白的载客结构域可以视为由非β茎部形成序列连接在一起的几段β茎部形成序列。这些非β茎部形成序列是用于插入一种或多种POI的合适位点。因此，可以将POI置于β茎部形成序列的两个部分之间。POI也可以与载客结构域的N端融合。
用检测自转运蛋白的载客结构域的β茎部形成序列和侧面结构域的合适方法包括生物物理方法如X射线结晶学和生物信息学软件如结构预测工具。
X射线结晶学当今是高度高效及自动化并且为本领域技术人员已知的标准方法。载客结构域的高分辨率结构和用于确定自转运蛋白的载客结构域的结构的合适方法的实例存在于（Otto等人，2005J Biol Chem（《生物化学杂志》）280（17）:17339-45；Emsley等人，1996Nature（《自然》）381：90-92；Johnson等人，2009J Mol Biol（《分子生物学杂志》）389（3）：559-74）中。
适于确定β茎部结构的生物信息学方法的实例是M4T同源性建模方法（Rykunov等人，2009J Struct Funct Genomics（《结构与功能基因组学杂志》）10：95-99），该方法可在互联网上免费获得。
在蛋白质的三维模型用于鉴定β茎部结构域和侧面结构域的情况下，合适的是所获得的模型具有好于4埃的分辨率。侧面结构域随后将作为从β茎部突出的结构域可见到。通过观察自转运蛋白的载客结构域的结构，可以看到，序列的多个部分不是β茎部的部分，但形成从β茎部突出的结构域。
这些方法可以用于确定载客结构域的哪些结构域或氨基酸适于插入POI并且哪些应当保持基本上完整。
根据本发明，β茎部形成序列是基本上完整的。因此，应当尽可能少地移除β茎部形成序列。预测的结构域边界有助于确定POI应当在哪里插入。如果除去过多的β茎部形成序列，则分泌将不利地受到影响。β茎部形成序列基本上完整意指与破坏或完全除去β茎部相比时，蛋白质的分泌功能的效率维持在最佳水平。它也意指在分泌后，载客结构域的稳定性得到维持。本领域技术人员可以使用实验性方法来确定具体构建体是否允许高效分泌。
适于体外确定分泌效率的方法的实例包括：分析培养基中存在的POI的级分、用生物素或其他标记物标记表面蛋白、细胞分级、使表面蛋白暴露于蛋白酶（如蛋白酶K）和使用针对POI的抗体研究（如点印迹研究、免疫荧光显微术和免疫电子显微术）。
适于确定分泌后载客结构域的稳定性的方法的实例包括包括SDS-PAGE、蛋白质印迹法和上文在第76段下的全部方法。
因此，通过使用结构信息，本领域技术人员可以预测可在载客结构域中何处插入POI以便维持最佳分泌。可以用体外实验容易地测定实际分泌。
根据本发明，POI与载客结构域融合。这意指POI与形成载客结构域的肽融合，从而它们形成一条连续多肽。因为在DNA水平实施融合蛋白的设计，必须小心从事，从而POI的阅读框与载客结构域的阅读框相同。
优选地，POI具有小于200kD的分子量。更优选地，这个分子量小于200kD，如100kD、80kD、60kD、40kD、30kD、20kD、10kD或5kD。
融合蛋白可以包含多于一种POI。因此，融合蛋白可以包含2种、3种或多种感兴趣多肽。融合蛋白可以是这样的，从而它具有至少两种POI，每一种各自替代或部分替代或融合至载客结构域的独立或单独侧面结构域。可替代地，两种或更多种POI可以融合至、或替代或部分替代相同的侧面结构域。
融合蛋白由核酸编码并且在宿主细胞中表达。该核酸可以采用涉及限制性酶、DNA连接酶、PCR、寡核苷酸合成、DNA纯化的标准分子生物学技术和本领域技术人员熟知的其他方法构建。优选地，起点是自转运蛋白的阅读框，其中将编码POI的DNA片段插入该阅读框中，从而这些阅读框匹配。可替代地，融合蛋白的阅读框可以在计算机上设计并且使用多核苷酸合成法合成。
编码融合蛋白的阅读框优选地插在用于原核生物表达的表达载体中，该表达载体携带启动子和本领域技术人员熟知的其他元件。
融合蛋白包含指导蛋白质分泌的N端信号肽。当宿主细胞是革兰氏阴性细菌时，合适的信号肽是这样的，从而它指导蛋白质跨内膜易位。该信号肽可以源自自转运蛋白，合适地源自衍生载客结构域的相同自转运蛋白。该信号肽可以大致包含SEQ ID NO1的第1至52位氨基酸或相似的序列。
融合蛋白适当地包含自伴侣结构域，其适当地来自用来融合POI的自转运蛋白的载客结构域。自伴侣结构域的一个实例大致包含包含SEQID NO1的第1002至1100位氨基酸。
融合蛋白可以包含来自一个类型自转运蛋白的载客结构域和来自另一个类型自转运蛋白的易位蛋白结构域。
本发明中所用的自转运蛋白可以是具有丝氨酸蛋白酶结构域的自转运蛋白，如丝氨酸蛋白酶。
该自转运蛋白可以是SPATE蛋白（肠杆菌科的丝氨酸蛋白酶自转运蛋白）。因此，易位蛋白结构域和载客结构域可以来自SPATE蛋白。在一个实施例中，该SPATE蛋白是来自大肠杆菌的血红蛋白结合蛋白酶（Hbp）（SwissProt O88093）和温度敏感性血凝素（Tsh）（SwissProt Q47692）之一。Tsh的序列与Hbp的序列同源。
其他SPATE蛋白包括淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）和流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）的IgA蛋白酶、来自大肠杆菌的EspC、来自大肠杆菌的Pet、来自大肠杆菌的EspP、来自大肠杆菌的Pic、来自大肠杆菌的PicU、来自大肠杆菌的Sat、来自大肠杆菌的Vat、来自大肠杆菌的EspI、来自大肠杆菌的EaaA、来自大肠杆菌的EaaC、来自大肠杆菌的EatA、来自大肠杆菌的EpeA、来自大肠杆菌的PssA、来自大肠杆菌的AidA_B7A、来自乍得沙门氏菌（Salmonella bongori）的Boa、来自福氏志贺氏菌（Shigella flexneri）的SepA、来自福氏志贺氏菌的SigA、来自福氏志贺氏菌的Pic。
该SPATE蛋白可以包含SEQ ID NO1的多肽，该多肽是Hbp，或SEQ ID NO2的多肽，该多肽是其中易位蛋白结构域和载客结构域之间的切割位点已经遭到破坏的Hbp（HbpΔ-cleav），或与这些序列相似的序列。优选地，与这些序列的同一性多于80%、甚至更优选地多于90%、甚至更优选地多于95%并且最优选地多于97%。
这些SPATE组的蛋白质具有随本发明一起使用的几个优点。首先，它们的结构中一些是已知的，这利于鉴定它们的β茎部和侧面结构域。这种知识也可以用于预测晶体结构未知的相关SPATE的侧面结构域和β茎部结构。另一个优点是它们的切割结构，这种切割结构可以用于高效可溶性分泌并且在SPATE家族内部是保守的。
可以预测结构已知的其他自转运蛋白或它们将是已知的，从而它们的β茎部和侧面结构域结构可以确定，也可以随本发明一起使用。该自转运蛋白应当具有β茎部、侧面结构域和可任选地，高效用于可溶性分泌的切割系统。实例包括来自流感嗜血杆菌的自转运蛋白HapS，它不是SPATE家族的成员。最近已经发表HapS的载客结构域的结构（Meng等人，2011Aug12The EMBO Journal（《EMBO杂志》）,doi：10.1038/emboj.2011.279.[电子出版先于印刷版]）。这种结构十分接近于Hbp的结构，具有一种具有4个侧面结构域的β-茎部（SD1-4）。
图11A显示自转运蛋白Hbp的载客结构域的晶体结构（Otto等人，2005J Biol Chem（《生物化学杂志》）280（17）：17339-45）。结构域1（d1）、结构域2（d2）和自伴侣结构域（ac）为浅灰色。载客结构域的其余部分（包括β茎部结构域）着色为黑色。结构域d1和d2均适于POI的插入。此外，图11C中所示的结构域d3和图11D中所示的结构域d4和d5适于POI的替换或插入。
结构域d1大致包含作为Hbp序列的SEQ ID NO1的第53至308位氨基酸，d2大致包含第533-608位氨基酸，d3大致包含第657-697位氨基酸，d4大致包含第735至766位氨基酸，并且d5大致包含第898至922位氨基酸。
图11E显示野生型Hbp的结构域组成。此外，显示了在本文中所呈献的实施例中使用的融合蛋白。在野生型Hbp中，显示了包含β茎部（处于黑色）和侧面结构域d1、d2、d3、d4和d5的载客结构域。易位蛋白结构域位于蛋白质的C端部分处并且显示为“β-结构域”。“Ac”表示自伴侣结构域。信号肽由“ss”指示。数字指示从N端的氨基酸数。
可以使用大致包含SEQ ID NO1第53-1100位氨基酸或相似序列的载客结构域。
可以使用大致包含SEQ ID NO1第1101-1377位氨基酸或相似序列的易位蛋白结构域。
POI可以是分裂的蛋白质。分裂的蛋白质是一种蛋白质，该蛋白质在其天然形式下包含单条多肽或由二硫桥或其他分子内键连接的几条多肽并且对于本发明而言已经分裂成两个或更多个部分。这类部分的每一个与载客结构域融合，从而它们例如相隔一定距离地形成一种非天然结构。这两个或更多个部分可以例如与不同侧面结构域融合或与相同侧面结构域融合但是相隔一定距离。将这类部分的每一个视为一种POI，从而将分裂的蛋白质视为两种或更多种POI。例如当天然蛋白具有抑制高效分泌的庞大或复杂结构，例如包含二硫桥时，这可能是有利的。使蛋白质分裂可以使分泌更高效。
POI可以包含至少一种抗原，例如来自感染性生物（如结核分枝杆菌）的抗原。来自结核分枝杆菌的这类抗原的实例包括ESAT-6样蛋白（例如ESAT-6、TB10.4、TB10.3）、Ag85B样蛋白（例如Ag85B）、和Rv2660c。两种或更多种的这类抗原可以与相同的载客结构域（例如与独立的侧面结构域）融合。
ESAT-6（6kDa早期分泌性抗原靶）是一种10kDa蛋白质，该蛋白质是有力的T-细胞抗原和重要的毒力因子。
Rv2660c是功能未知的7.6kDa胞内蛋白。
TB10.3和TB10.4均是具有96个氨基酸的蛋白质。
Ag85B是35kDa的分泌性分枝酰转移酶（mycolyltransferase），包含3个半胱氨酸。它也是有力的T-细胞抗原。在其天然形式下，这种相当庞大和包含半胱氨酸的蛋白质对于利用自转运蛋白系统的最佳外膜易位而言太复杂。
在一个实施例中，该抗原如上文定义那样分裂。例如，Ag85B，作为庞大和相当复杂的蛋白质，可以分裂成N’部分（Ag85B（N’））和C’部分（Ag85B（C’））用于更高效的分泌。
在一个实施例中，POI包含一种多肽，该多肽具有与作为ESAT-6的序列的SEQ ID NO39相似至少80%、更优选90%、更优选95%、最优选97%的序列。在一个实施例中，POI包含SEQ ID NO39中定义的多肽。
在一个实施例中，POI包含一种多肽，该多肽具有与作为Rv2660c的序列的SEQ ID NO41相似至少80%、更优选90%、更优选95%、最优选97%的序列。在一个实施例中，POI包含SEQ ID NO41中定义的多肽。
在一个实施例中，POI包含一种多肽，该多肽具有与作为TB10.4的序列的SEQ ID NO42相似至少80%、更优选90%、更优选95%、最优选97%的序列。在一个实施例中，POI包含SEQ ID NO42中定义的多肽。
在一个实施例中，POI包含一种多肽，该多肽具有与作为TB10.3的序列的SEQ ID NO43相似至少80%、更优选90%、更优选95%、最优选97%的序列。在一个实施例中，POI包含SEQ ID NO43中定义的多肽。
在一个实施例中，POI包含一种多肽，该多肽具有与作为Ag85B的序列的SEQ ID NO40的至少1/4相似至少80%、更优选90%、更优选95%、最优选97%的序列。在一个实施例中，POI包含由SEQ ID NO40中的第1-126位或第118-285位氨基酸定义的多肽。
POI可以在侧翼分布有一个或多个接头区域。接头区域可以是1至20个或更多个氨基酸的柔性肽。该接头区域可以适当地在POI的C-端和N端处插入。接头的优点在于，它可以允许融合蛋白的多种结构域彼此更独立地移动。接头可以由本领域技术人员容易地设计。合适接头的实例包括SEQ ID NO44和45。
融合蛋白可以包含在SEQ ID NO：13-19、SEQ ID NO：22-26或SEQ ID NO38的任一者中定义的多肽或这些序列的任一个相似至少80%、更优选90%、更优选95%和最优选97%的多肽。
SEQ ID NO13是Hbp的序列，其中ESAT6已经替换结构域d1（Hbp(Δd1)-ESAT6，又命名为HbpSL-ESAT6）。SEQ ID NO14是相同的蛋白质，但是其中易位蛋白结构域和载客结构域之间的切割位点已经遭受破坏（HbpD（Δd1）-ESAT6，又命名为HbpDL-ESAT6）。SEQ ID NO15是Hbp的序列，其中ESAT6已经替换结构域d2（Hbp（Δd2）-ESAT6）。SEQ ID NO16是Hbp的序列，其中ESAT6已经替换结构域d2（Hbp（Δd2）-ESAT6，又命名为HbpDD2-ESAT6）并且其中易位蛋白结构域和载客结构域之间的切割位点已经遭受破坏。SEQ ID NO17是Hbp的序列，其中ESAT6已经替换结构域d3（Hbp（Δd3）-ESAT6）。SEQ ID NO18是Hbp的序列，其中ESAT6已经替换结构域d4（Hbp（Δd4）-ESAT6）。SEQ IDNO19是Hbp的序列，其中ESAT6已经替换结构域d5（Hbp（Δd5）-ESAT6）。
SEQ ID NO22是Hbp的序列，其中Rv2660c已经替换结构域d3（Hbp（Δd3）-Rv2660c）。SEQ ID NO23是Hbp的序列，其中Rv2660c已经替换结构域d4（Hbp（Δd4）-Rv2660c）。SEQ ID NO24是Hbp的序列，其中Rv2660c已经替换结构域d5（Hbp（Δd5）-Rv2660c）。SEQ IDNO25是Hbp的序列，其中TB10.4已经替换结构域d1（Hbp（Δd1）-TB10.4）。SEQ ID NO26是Hbp的序列，其中TB10.3已经替换结构域d2（Hbp（Δd2）-TB10.3）。
SEQ ID NO38是EspC的序列，其中ESAT6已经替换结构域d1（EspC（Δd1）-ESAT6）。
融合蛋白可以包含具有多于一种POI的多肽，如在SEQ ID NO：28-35的任一者中定义的多肽或这些序列的任一个相似至少80%、更优选90%、更优选95%和最优选97%的多肽。
SEQ ID NO28是Hbp的序列，其中Ag85B的残基1-126已经替换结构域d1并且Ag85B的残基118-285已经替换结构域2（Hbp-Ag85B[N+C]）。SEQ ID NO29是Hbp的序列，其中Ag85B的残基1-126已经替换结构域d1并且Ag85B的残基118-285已经替换结构域2，并且其中易位蛋白结构域和载客结构域之间的切割位点已经遭受破坏（HbpD-Ag85B[N+C]）。SEQID NO30是Hbp的序列，其中Ag85B的残基1-126已经替换结构域d2并且Ag85B的残基118-285已经替换结构域1（Hbp-Ag85B[C+N]）。SEQ ID NO31是Hbp的序列，其中Ag85B的残基1-126已经替换结构域d2并且Ag85B的残基118-285已经替换结构域1，并且其中易位蛋白结构域和载客结构域之间的切割位点已经遭受破坏（HbpD-Ag85B[C+N]）。
SEQ ID NO32是Hbp的序列，其中Ag85B的残基1-126已经替换结构域d2，Ag85B的残基118-285已经替换结构域1并且ESAT6已经替换结构域4（Hbp-Ag85B[C+N]-ESAT6）。SEQ ID NO33是相同的蛋白质，但是其中易位蛋白结构域和载客结构域之间的切割位点已经遭受破坏（HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6）。[00118]SEQ ID NO34是Hbp的序列，其中Ag85B的残基1-126已经替换结构域d2，Ag85B的残基118-285已经替换结构域1，ESAT6已经替换结构域4并且Rv2660c已经替换结构域5（Hbp-Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c）。SEQ ID NO35是相同的蛋白质，但是其中易位蛋白结构域和载客结构域之间的切割位点已经遭受破坏（HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c）。
优选地，融合蛋白的各结构域的顺序从N端至C端是：信号肽、载客结构域、易位蛋白结构域。
在本发明的第二方面，提供一种表达如本文定义的融合蛋白的细胞。该细胞优选地是可以通过本领域技术人员熟知的方法培养和操作并且能够表达异源蛋白质的宿主细胞。优选地，该宿主细胞是革兰氏阴性细菌如大肠杆菌、沙门氏菌属某些物种、弧菌属某些物种、志贺氏菌属某些物种、假单胞菌属某些物种、伯克霍尔德菌属某些物种或德特氏菌属某些物种多种表达系统是本领域技术人可获得和已知的。表达可以是稳定或瞬时性质的。表达系统可以是诱导型或非诱导型的。
在一个实施例中，融合蛋白由宿主细胞至少部分地可溶地分泌。当本发明用于产生例如作为商业酶或药品组分的重组蛋白时，可以使用这个实施例。POI随后可以在不破碎宿主细胞的情况下便利地从培养基中收获。破碎宿主细胞造成细胞残片和细胞内容物的污染。当融合蛋白在易位蛋白结构域和载客结构域之间包含蛋白酶切割位点时，可以实现融合蛋白的分泌。在易位蛋白结构域已经整合入外膜时，可以存在于融合蛋白自身内部的蛋白酶活性切割融合蛋白，从而载客结构域被释放至培养基中。可替代地，切割可以借助与蛋白酶活性无关的分子内自催化切割机制发生，如对于来自大肠杆菌的SPATE EspP（Dautin等人，2007EMBO J26（7）：1942-1952）和来自大肠杆菌的AIDA-I（Charbonneau等人，2009,J BiolChem（《生物化学杂志》）284（25）：17340-17353）所描述。
出于清晰目的，POI可以在一些情况下保持与细胞膜连接，即便多肽已经被切割。这类连接通常将非共价性质的。
在一个实施例中，POI保持与易位蛋白结构域共价连接。在自转运蛋白的序列携带切割位点的情况下，可以通过突变易位蛋白结构域和载客结构域之间的切割位点实现这一点，从而切割事件不发生。因此，宿主细胞在细胞表面上展示融合蛋白的至少一部分，该部分包含至少一种POI。
在某些方面，本发明提供在其表面上展示根据本发明的融合蛋白的外膜小泡（OMV）或菌影。
在某些条件下，可以诱导革兰氏阴性细菌开始从其外膜排出小泡。这类外膜小泡（OMV）已经显示例如可用作疫苗平台。当携带抗原时，如同源自它们的母体细胞那样，这些小泡能够增强这类抗原的免疫原性。OMV可以容易地源自在其表面上展示本发明融合蛋白的革兰氏阴性细菌。用于产生和分离外膜小泡的方法是本领域已知的（Chen等人，2010PNAS107:3099-3104；Bernadac等人，1998J Bacteriol（《细菌学杂志》）180：4872-4878；Kesty和Kuehn2004,J.Biol Chem（《生物化学杂志》）279：2069-2076）；Kolling和Matthews1999App Env Microbiol（《应用与环境微生物学》）65：1843-1848；Kitagawa等人，2010J Bacteriol（《细菌学杂志》）192：5645-5656）。
类似地，菌影是一种非活疫苗平台。菌影是已经通过裂解（例如使用来自噬菌体PhiX174的致死性裂解基因E）清空其细胞质的细菌细胞包膜（Langemann等人，2010Bioeng Bugs（《生物工程与昆虫》）1:326-336；Young1992Microbiol rev（《微生物学综述》）56：430-481；Mayr等人，2005Adv Drug Deliv rev（《高级药物递送综述》）57：1381-1391）。菌影保留母体细胞的全部形态特征、结构特征和抗原性特征并且包含在裂解之前表达并锚定至细胞包膜的蛋白质。可以通过本发明的分泌系统和融合蛋白促进例如抗原性蛋白质的递送。
本发明的一个方面是一种包含根据本发明的融合蛋白、细胞、外膜小泡或菌影的疫苗。这种疫苗可以包含在细胞表面展示融合蛋白的宿主细胞，其中该融合蛋白包含至少一种POI。优选地，该POI则是如上文所述的抗原。该宿主细胞可以是减毒的沙门氏菌菌株，如Curtiss R3rd等人，2010Crit Rev Immunol（《免疫学关键性综述》）30（3）：255-70中描述的菌株。该疫苗可以包含沙门氏菌活宿主细胞。
本发明的一个方面是编码如上文已经描述的根据本发明的融合蛋白的核酸。本发明的又一个方面是携带根据本发明的核酸的载体。
可以安排该核酸或载体用于表达多于一种的与相同载客结构域融合的POI。例如，编码载客结构域的序列可以包含允许框内地克隆至少两个编码POI的序列的至少两段克隆位点序列。这促进轻易克隆和表达任何所需的POI。可替代地，该核酸可以包含编码与载客结构域融合的POI的多于一个序列。
本发明的一个方面包括一种用于POI的分泌性蛋白表达的方法，该方法包括步骤：在宿主细胞中表达根据本发明的融合蛋白。表达载体是本领域技术人员熟知的。适当地，该载体具有适合于该宿主细胞的启动子，该启动子与编码根据本发明的融合蛋白的核酸可操作地连接。
这种方法可以包括步骤：鉴定自转运蛋白上的合适侧面结构域。这可以用上文描述的生物物理方法或生物信息学方法实施。
根据本发明的方法的一个方面包括步骤：用POI如此替换自转运蛋白的载客结构域的侧面结构域（或其部分），以至于该自转运蛋白的载客结构域的β茎部形成序列是基本上完整的。可替代地，该方法可以包括步骤：将POI如此插入载客结构域中，以至于β茎部形成序列是基本上完整的。
该方法包括步骤：在其中编码融合蛋白的核酸翻译成许多融合蛋白分子并且融合蛋白分子进入分泌途径的条件下培养宿主细胞。
在一个实施例中，该方法包括另外的步骤：抑制宿主细胞中具有蛋白酶活性的周质酶，如DegP。可以通过缺失、打断或失活宿主细胞染色体上的DegP编码基因来抑制DegP的蛋白酶活性。可以通过在DegP的催化位点导入突变实施失活。抑制蛋白酶具有可以改进产率的优点。
在一个实施例中，该方法包括另外的步骤：下调宿主细胞的周质间隙内催化蛋白质中二硫键形成的至少一种酶，如DsbA或DsbB。这具有可以改进产率的优点，尤其对于易于形成二硫桥的蛋白质，如真核来源的蛋白质。
在该方法的一个实施例中，POI以可溶性方式分泌。在该方法的一个实施例中，POI保持与细胞表面共价连接。
在一个实施例中，该方法包括又一个步骤：诱导小泡从宿主细胞的外膜排出，以产生在它们的表面上展示本发明的融合蛋白的外膜小泡。
在另一个实施例中，该方法包括另外的步骤：裂解革兰氏阴性细菌（例如使用来自噬菌体PhiX174的致死性裂解基因E裂解），因此形成在它们的表面上展示融合蛋白的菌影。
本发明的一个最后方面包括根据本发明方法而可获得的融合蛋白。
实例
方法
菌株和培养基
先前已经描述过大肠杆菌菌株MC1061（araD139Δ（araA-leu）7697ΔlacX74galK16galE15（GalS）λ-e14-mcrA0relA1rpsL150（strR）spoT1mcrB1hsdR2）（Casadaban和Cohen1980J Mol Biol（《分子生物学杂志》）138：179-207）。菌株TOP10F’从Invitrogen公司获得。
在37°C在补充有0.2%葡萄糖的LB培养基中常规培育细胞。在0.4%葡萄糖存在下培育过夜培养物。在适宜的情况下，将细胞在氯霉素（30μg/mL）和链霉素（25μg/mL）或四环素（6.25μg/mL）存在时培育。
质粒的构建
质粒pEH3-Hbp（图1）携带全长hbp基因，该全长hbp基因的表达处于诱导型LacUV5启动子的控制下。这个质粒的构建已经在（Jong等人，2007 Mol Microbiol（《分子微生物学》） 63（5）：1524-1536）中描述。
在图1-10中，易位蛋白结构域称作“β-结构域”。
表1：这项研究中使用的引物
质粒pEH3-Hbp[△β-cleav]（图2）是携带hbp突变体的pEH3-Hbp（Jong等人，2007）衍生物，该hbp突变体编码一种形式的Hbp，其中载客结构域和易位蛋白结构域之间的天然切割位点已经在Gly和Ser残基分别置换氨基酸残基Asn1100和Asn1101时遭受破坏。pEH3-Hbp[△β-cleav]的构建已经在（Jong等人，2007 Mol Microbiol（《分子微生物学》）63（5）：1524-1536）中描述。
质粒pHbpD（△d1），与pHbpDL相同，（图3）是携带hbp突变体的pEH3-Hbp[△β-cleav]（Jong等人，2007 Mol Microbiol（《分子微生物学》）63（5）：1524-1536）衍生物，该hbp突变体编码截短形式的Hbp[△β-cleav]（Jong等人，2007 Mol Microbiol（《分子微生物学》）63（5）：1524-1536），其中全长Hbp氨基酸序列的氨基酸残基54-307已经由氨基酸序列Ser-Ser-Cys-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly（SEQ ID NO 45）替换。编码后一种氨基酸序列的DNA序列含有SacI和BamHI限制性位点，这些限制性位点允许轻易地框内地将编码异源氨基酸序列的DNA序列克隆至HbpD（△d1）编码序列中。为产生pHbpD（△d1），首先，产生pEH3-Hbp[△β-cleav]（pEH3-Hbp[△β-cleav/△BamHI]）变体，其在Hbp[△β-cleav]编码区内部和外部缺少BamHI限制性位点。随后，实施一个3步骤‘重叠延伸PCR’方法。在第一步骤中，使用pEH3-Hbp（Jong等人，2007 Mol Microbiol（《分子微生物学》） 63（5）：1524-1536）作为模板以及引物pEH_XbaI_Hbp fw和Hbp（△dom1/Cas）rv，通过PCR扩增DNA片段。在第二步骤中，使用pEH3-Hbp（Jong等人，2007 MolMicrobiol（《分子微生物学》）63（5）：1524-1536）作为模板以及引物Hbp（△dom1/Cas）fw和Hbp1123-1104 rv，通过PCR扩增DNA片段。在第三步骤中，使用来自步骤1和2的PCR产物的混合物作为模板以及引物pEH_XbaI_Hbp fw和Hbp1123-1104rv，通过PCR扩增DNA片段。使用XbaI和NdeI限制性位点，将源自步骤3的PCR产物克隆至pEH3-Hbp[△β-cleav/△BamHI]中，产生质粒pHbpD（△d1）。
对于这项研究中使用的引物，见表1。
根据与pHbpD（△d1）相同的一般方法，产生质粒pHbpD（△d2），其与pHbpDD2相同（图5）但是具有以下修饰：全长Hbp氨基酸序列的氨基酸残基534-607由氨基酸序列Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly（SEQ ID NO44）替换。编码这种氨基酸序列的DNA序列还含有SacI和BamHI限制性位点，这些限制性位点用于轻易地框内地克隆编码异源氨基酸序列的DNA序列。对于第一PCR扩增步骤，使用引物Hbp944-962fw和Hbp（△dom2/Cas）rv。对于第二PCR扩增步骤，使用引物Hbp（△dom2/Cas）fw和Hbp2154-2137rv。并且对于第三步骤，使用引物HHbp944-962fw和Hbp2154-2137rv。使用NdeI和NsiI限制性位点，将源自步骤3的PCR产物克隆至pEH3-Hbp[△β-cleav/△BamHI]中。
质粒pHbp（△d1），与pHbpSL相同，（图7）是携带hbp突变体的pEH3-Hbp（Jong等人，2007Mol Microbiol（《分子微生物学》）63（5）：1524-1536）衍生物，该hbp突变体编码截短形式的Hbp[pHbp(△d1)]，其中全长Hbp氨基酸序列的氨基酸残基54-307已经由氨基酸序列Ser-Ser-Cys-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly（SEQ ID NO45）替换。编码后一种氨基酸序列的DNA序列含有SacI和BamHI限制性位点，这些限制性位点允许轻易地框内地将编码异源氨基酸序列的DNA序列克隆至Hbp（△d1）编码序列中。为构建pHbp（△d1），首先产生pEH3-Hbp（pEH3-Hbp/△BamHI）变体，其缺少hbp ORF下游的BamHI位点。随后，实施一个3步骤‘重叠延伸PCR’方法。在第一步骤中，使用pEH3-Hbp（Jong等人，2007MolMicrobiol（《分子微生物学》）63（5）：1524-1536）作为模板以及引物pEH_XbaI_Hbp fw和Hbp（△dom1/Cas）rv，通过PCR扩增DNA片段。在第二步骤中，使用pEH3-Hbp（Jong等人，2007Mol Microbiol（《分子微生物学》）63（5）：1524-1536）作为模板以及引物Hbp（△dom1/Cas）fw和Hbp1123-1104rv，通过PCR扩增DNA片段。在第三步骤中，使用来自步骤1和2的PCR产物的混合物作为模板以及引物pEH_XbaI_Hbp fw和Hbp1123-1104rv，通过PCR扩增DNA片段。使用Xba I和NdeI限制性位点，将源自步骤3的PCR产物克隆至pEH3-Hbp[△BamHI]（缺少hbp基因下游的BamHI限制性位点的pEH3-Hbp衍生物）中，产生质粒pHbp（△d1）。
根据与pHbpD（△d1）相同的一般方法，产生质粒pHbpSS（图9）、pHbp（△d2）、pHbp（△d3）、pHbp（△d4）、pHbp（△d5）、pHbp（d4ins）和pHbp（βins），但是具有以下修饰。
对于pHbpSS：全长Hbp氨基酸序列的氨基酸残基54-993由氨基酸序列Ser-Ser-Cys-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly（SEQ ID NO45）替换。对于第一PCR扩增步骤，使用引物pEH_XbaI_Hbp fw和Hbp（△dom1/Cas）rv。对于第二PCR扩增步骤，使用引物Hbp（△β-茎部/Cas）fw和EcoRI_Hbp rv。并且对于第三步骤，使用引物pEH_XbaI_Hbp fw和EcoRI_Hbp rv。使用XbaI和NdeI限制性位点，将源自步骤3的PCR产物克隆至pEH3-Hbp[△BamHI]中，产生质粒pHbpSS。
对于pHbp（△d2）：全长Hbp氨基酸序列的氨基酸残基534-607由氨基酸序列Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly（SEQ ID NO44）替换，其相应的DNA序列含有SacI和BamHI限制性位点，这些限制性位点用于轻易地框内地克隆DNA序列。对于第一PCR扩增步骤，使用引物Hbp944-962fw和Hbp（△dom2/Cas）rv。对于第二PCR扩增步骤，使用引物Hbp（△dom2/Cas）fw和Hbp2154-2137rv。并且对于第三步骤，使用引物HHbp944-962fw和Hbp2154-2137rv。使用NdeI和NsiI限制性位点，将源自步骤3的PCR产物克隆至pEH3-Hbp[△BamHI]中，产生质粒pHbp（△d2）。
对于pHbp（△d3）：全长Hbp氨基酸序列的氨基酸残基659-696由氨基酸序列Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly（SEQ ID NO44）替换。对于第一PCR扩增步骤，使用引物Hbp944-962fw和Hbp（△dom3/Cas）rv。对于第二PCR扩增步骤，使用引物Hbp（△dom3/Cas）fw和Hbp2838-2820rv。并且对于第三步骤，使用引物HHbp944-962fw和Hbp2838-2820rv。使用NdeI和KpnI限制性位点，将源自步骤3的PCR产物克隆至pEH3-Hbp[△BamHI]中，产生质粒pHbp（△d3）。
对于pHbp（△d4）：全长Hbp氨基酸序列的氨基酸残基736-765由氨基酸序列Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly（SEQ ID NO44）替换。对于第一PCR扩增步骤，使用引物Hbp1859-1879fw和Hbp（△dom4/Cas）rv。对于第二PCR扩增步骤，使用引物Hbp（△dom4/Cas）fw和Hbp2838-2820rv。并且对于第三步骤，使用引物Hbp1859-1879fw和Hbp2838-2820rv。使用NsiI和KpnI限制性位点，将源自步骤3的PCR产物克隆至pEH3-Hbp[△BamHI]中，产生质粒pHbp（△d4）。
对于pHbp（△d5）：全长Hbp氨基酸序列的氨基酸残基899-920由氨基酸序列Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly（SEQ ID NO44）替换。对于第一PCR扩增步骤，使用引物Hbp1859-1879fw和Hbp（△dom5/Cas）rv。对于第二PCR扩增步骤，使用引物Hbp（△dom5/Cas）fw和Hbp3003-3021rv。并且对于第三步骤，使用引物Hbp1859-1879fw和Hbp3003-3021rv。使用NsiI和KpnI限制性位点，将源自步骤3的PCR产物克隆至pEH3-Hbp[△BamHI]中，产生质粒pHbp（△d5）。
对于pHbp（d4ins）：全长Hbp氨基酸序列的氨基酸残基760-764由氨基酸序列Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly（SEQ ID NO44）替换。对于第一PCR扩增步骤，使用引物Hbp1859-1879fw和Hbp(d4ins/Cas)rv。对于第二PCR扩增步骤，使用引物Hbp（d4ins/Cas）fw和Hbp2838-2820rv。并且对于第三步骤，使用引物Hbp1859-1879fw和Hbp2838-2820rv。使用NsiI和KpnI限制性位点，将源自步骤3的PCR产物克隆至pEH3-Hbp[△BamHI]中，产生质粒（d4ins）。
对于pHbp（βins）：将氨基酸序列Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly（SEQ ID NO44）插入全长Hbp氨基酸序列的残基771和772之间。对于第一PCR扩增步骤，使用引物Hbp1859-1879fw和Hbp（βins/Cas）rv。对于第二PCR扩增步骤，使用引物Hbp（βins/Cas）fw和Hbp2838-2820rv。并且对于第三步骤，使用引物Hbp1859-1879fw和Hbp2838-2820rv。使用NsiI和KpnI限制性位点，将源自步骤3的PCR产物克隆至pEH3-Hbp[△BamHI]中，产生质粒pHbp（βins）。
通过对应于结核分枝杆菌ESAT6蛋白的异源插入物插入相应的质粒中，衍生以上质粒的ESAT6衍生物。为构建ESAT6衍生物，从BaseClear B.V.（Leiden，荷兰）获得编码ESAT6的合成DNA序列，该合成DNA序列的密码子使用针对在大肠杆菌中表达而进行优化。该合成DNA片段在ESAT6编码序列的5’侧和3’侧处分别拥有SacI和BamHI位点。这允许克隆至pHbpD（△d1）、pHbpD（△d2）、pHbp（△d1）、pHbpSS、pHbp（△d2）、pHbp（△d3）、pHbp（△d4）、pHbp（△d5）、pHbp（d4ins）和pHbp（βins）的SacI和BamHI位点中，分别产生pHbpD（△d1）-ESAT6（其与pHbpDL-ESAT6相同）（图4）、pHbpD（△d2）-ESAT6（其与pHbpDD2-ESAT6相同）（图6）、pHbp（△d1）-ESAT6（其与pHbpSL-ESAT6相同）（图8）、pHbpSS-ESAT6（图10）、pHbp（△d2）-ESAT6、pHbp（△d3）-ESAT6、pHbp（△d4）-ESAT6、pHbp（△d5）-ESAT6、pHbp（d4ins）-ESAT6和pHbp（βins）-ESAT6。
通过对应于结核分枝杆菌Rv2660c蛋白的异源插入物插入相应的质粒中，衍生以上质粒的Rv2660c衍生物。为构建Rv2660c衍生物，使用结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA作为模板，通过PCR扩增带有侧翼SacI/BamHI位点的编码Rv2660c的基因。所用的引物是Cas/Rv2660c fw和Cas/Rv2660c rv。使用SacI/BamHI位点，将PCR产物分别克隆至pHbp（△d3），pHbp（△d4）和pHbp（△d5）中，产生pHbp（△d3）-Rv2660c，pHbp（△d4）-Rv2660c和pHbp（△d5）-Rv2660c。
通过对应于结核分枝杆菌蛋白TB10.3或TB10.4的异源插入物插入相应的质粒中，衍生以上质粒的TB10.3和TB10.4衍生物。为构建TB10.3和TB10.4衍生物，使用结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA作为模板，通过PCR扩增带有侧翼SacI/BamHI位点的编码TB10.3或TB10.4的基因。用于TB10.3的引物是Cas/TB10.3fw和Cas/TB10.3rv。使用SacI/BamHI位点，将PCR产物克隆至pHbp（△d2）中，产生pHbp（△d2）-TB10.3。用于TB10.4的引物是Cas/TB10.4fw和Cas/TB10.4rv。使用SacI/BamHI位点，将PCR产物克隆至pHbp（△d1）中，产生pHbp（△d1）-TB10.4。
质粒pHbp（△d1）-hEGF（0ss）是一种pHbp（△d1）衍生物，其表达含有与无半胱氨酸形式的智人（Homo sapiens）hEGF蛋白相对应的异源插入物的Hbp（△d1）。为构建pHbp（△d1）-hEGF（0ss），获得编码hEGF（0ss）的合成DNA序列，该合成DNA序列在hEGF（0ss）编码序列的5’和3’侧分别拥有SacI和BamHI位点以允许克隆至pHbp（△d1）的SacI和BamHI位点中，从而产生pHbp（△d1）-hEGF（0ss）。
质粒pHbp-Ag85B(N+C)是表达Hbp突变体的pEH3-Hbp/△BamHI衍生物，其中，与来自结核分枝杆菌的蛋白Ag85B的成熟区域的残基1-126（Ag85B(N’)）相对应的氨基酸序列插入如对pHbp（△d1）所述那样定位的柔性接头中。此外，与蛋白Ag85B的成熟区域的残基118-285（Ag85B(C’)）相对应的氨基酸序列插入如对pHbp（△d2）该那样定位的柔性接头中。为构建pHbp-Ag85B(N+C)，使用结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA作为模板，产生带有侧翼SacI/BamHI位点的编码Ag85B(N)和Ag85B(C)的fbpA片段。对于Ag85B(N)，所用的引物是Cas/Ag85B fw和Cas/Ag85B(S126)rv。使用SacI/BamHI限制性位点，将所得到的PCR片段克隆至pHbp（△d1）中，产生pHbp（△d1）-Ag85B(N)。对于Ag85B(C)，所用的引物是Cas/Ag85B（T118）fw和Cas/Ag85B rv。使用SacI/BamHI限制性位点，将所得到的PCR片段插入pHbp（△d2）中，产生pHbp（△d2）-Ag85B(C)。随后，pHbp（△d2）-Ag85B(C)的XbaI/NdeI片段由pHbp（△d1）-Ag85B(N)的XbaI/NdeI片段替换，产生pHbp-Ag85B(N+C)。
根据与pHbp-Ag85B(N+C)相同的一般方法，产生质粒pHbp-Ag85B(C+N)、pHbpD-Ag85B(N+C)和pHbpD-Ag85B(C+N)，但是具有以下修饰。
对于pHbp-Ag85B(C+N)，将来自结核分枝杆菌的蛋白Ag85B的成熟区域的N端部分（残基1-126）（Ag85B(N’)）插入如对pHbp（△d2）所述那样定位的柔性接头中并且将C端部分（残基118-285）插入如对pHbp（△d1）所述那样定位的柔性接头中。在PCR后，使用与上文相同的引物，利用SacI/BamHI限制性位点，将Ag85B(N)PCR产物克隆至pHbp（△d2）中，并且利用SacI/BamHI限制性位点，将Ag85B(c)PCR产物克隆至pHbp（△d1）中，分别产生pHbp（△d2）-Ag85B(N)和pHbp（△d1）-Ag85B(C)。随后，pHbp（△d2）-Ag85B(N)的XbaI/NdeI片段由pHbp（△d1）-Ag85B(C)的XbaI/NdeI片段替换，产生pHbp-85B(C+N)。
对于pHbpD-Ag85B(N+C)和pHbpD-Ag85B(C+N)，分别使用如用于pHbpD-Ag85B(N+C)和pHbpD-Ag85B(C+N)的相同方法，例外在于使用质粒pHbpD（△d1）和pHbpD（△d2）而非质粒pHbp（△d1）和pHbp（△d2）。[00166]质粒pHbp-Ag85B[C+N]-ESAT6是pHbp-Ag85B[C+N]的衍生物，其编码一种形式的Hbp-Ag85B[C+N]，其中与ESAT6相对应的氨基酸序列插入如对pHbp（d4ins）所述那样定位的柔性接头中。为构建pHbp-Ag85B[C+N]-ESAT6,pHbp-Ag85B[C+N]的NsiI/KpnI片段由pHbp（d4in）-ESAT6的相应片段替换，从而产生pHbp-Ag85B[C+N]-ESAT6。相应地产生质粒pHbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6，例外在于pHbpD-Ag85B[C+N]的NsiI/KpnI片段由pHbp（d4in）-ESAT6的相应片段替换。
质粒pHbp-Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c是pHbp-Ag85B[C+N]-ESAT6的衍生物，其编码一种形式的Hbp-Ag85B[C+N]-ESAT6，其中与Rv2660c相对应的氨基酸序列插入如对pHbp（△d5）所述那样定位的柔性接头中。为构建pHbp-Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c,pHbp-Ag85B(C+N)-ESAT6的BstZ17i/KpnI片段由pHbp（△d5）-Rv2660c的相应片段替换，从而产生pHbp-Ag85B(C+N)-ESAT6-Rv2660c。相应地产生质粒pHbpD-Ag85B(C+N)-ESAT6-Rv2660c，例外在于pHbpD-Ag85B(C+N)-ESAT6的BstZ17i/KpnI片段由pHbp（△d5）-Rv2660c的相应片段替换。
质粒pEH3-EspC携带全长espC基因，该全长espC基因的表达处于诱导型LacUV5启动子的控制下。为构建pEH3-EspC，使用pJLM174（Dutta等人，2002Infect.Immun（《感染免疫学》）.70,7105-7113）作为模板以及引物pEH_XbaI_EspC fw和EcoRI_EspC rv，通过PCR扩增espC基因。将所得到的PCR产物克隆至pEH3-Hbp的XbaI/EcoRI位点中。这个步骤有效地把espC ORF交换为hbp的ORF，产生pEH3-EspC。
质粒pEH3-EspC（△d1）是携带espC突变体的pEH3-EspC衍生物，该espC突变体编码截短形式的EspC，其中全长EspC氨基酸序列的氨基酸残基54-300已经由氨基酸序列Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly（SEQ ID NO46）替换。编码后一种氨基酸序列的DNA序列含有SacI和BamHI限制性位点，这些限制性位点允许轻易地框内地将编码异源氨基酸序列的DNA序列克隆至EspC（△d1）编码序列中。为产生pEH3-EspC（△d1），实施一个3步骤‘重叠延伸PCR’方法。在第一步骤中，使用pEH3-EspC作为模板以及引物EH_XbaI_EspC fw和EspC（△dom1/Cas）rv，通过PCR扩增DNA片段。在第二步骤中，使用pEH3-EspC作为模板以及引物EspC（△dom1/Cas）fw和EspC（BglII）rv，通过PCR扩增DNA片段。在第三步骤中，使用来自步骤1和2的PCR产物的混合物作为模板以及引物pEH_XbaI_EspC fw和EspC（BglII）rv，通过PCR扩增DNA片段。使用XbaI和BglII限制性位点，将源自步骤3的PCR产物克隆至pEH3-EspC中，产生质粒pEH3-EspC（△d1）。
质粒pEH3-EspC（△d1）-ESAT6是一个pEH3-EspC（△d1）衍生物，其表达含有与结核分枝杆菌病ESAT6蛋白相对应的异源插入物的EspC（△d1）。为构建pEH3-EspC（△d1）-ESAT6，如上文所述获得编码ESAT6的合成DNA序列，该DNA序列在5’和3’侧拥有SacI和BamHI位点。这允许将编码ESAT6的合成DNA序列克隆至pEH3-EspC（△d1）的SacI和BamHI位点中，产生pEH3-EspC（△d1）-ESAT6。
质粒pEH3(p15a)-HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6（图34）与质粒pHbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6相同，除了携带pMB1复制起点的DNA片段已经由携带p15a复制起点的片替换之外。为产生pEH3(p15a)-HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6，首先产生质粒pEH3(p15a)-Hbp。使用pBAD33（Guzman等人，1995Journal of Bacteriology（《细菌学杂志》）177:4121-4130）作为模板以及引物p15a fw和p15a rv（见表1），产生这种质粒。使用SalI/EcoRI限制性位点，将所得到的携带p15a复制起点的PCR片段克隆至pEH3-Hbp中，产生pEH3(p15a)-Hbp。随后，pEH3(p15a)-Hbp的XbaI/EcoRI片段由pHbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6的相应片段替换，产生pEH3(p15a)-HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6。
对实例中所用构建体的描述
对于更详细的描述和怎样产生构建体，见上文“质粒的构建”下的内容。
图11A显示自转运蛋白Hbp的载客结构域的晶体结构（Otto等人，2005J Biol Chem（《生物化学杂志》）280（17）：17339-45）。结构域1（d1）、结构域2（d2）和自伴侣结构域（ac）为浅灰色。载客结构域的其余部分，包括β茎部结构域，着色为黑色。
图11B显示自转运蛋白Hbp的载客结构域的晶体结构（Otto等人，2005J Biol Chem（《生物化学杂志》）280（17）：17339-45），与图11A中描述的位置相比，绕y-轴转动（50°逆时针）。使用MacPyMol创建本图像。
图11C显示如图11B中那样的自转运蛋白Hbp的载客结构域的晶体结构，但是构成结构域1的残基隐藏。结构域3（d3）以浅灰色描绘。载客结构域的其余部分着色为黑色。使用MacPyMol创建本图像。
图11D显示如图11C中那样的自转运蛋白Hbp的载客结构域的晶体结构。结构域4（d4）和对应于Hbp残基898-922的侧面结构域（d5）以浅灰色描绘。载客结构域的其余部分着色为黑色。使用MacPyMol创建本图像。
图11E显示实例中所用的Hbp衍生构建体的示意图。对于本文中公开的实例，将图11E中所示的Hbp衍生构建体克隆至中质粒pEH3-Hbp[△BamHI]或pEH3-Hbp[△β-cleav/△BamHI]，因此形成与图3-10中所示的载体相对应的表达载体。图23显示这些实例中所用的EspC衍生构建体的示意图。对于构建体的SEQ ID NO:，见表2。
表2：这项研究中使用的构建体
将Hbp（野生型）作为1377个氨基酸（aa）的前体合成，该前体以3个结构域构成：(i)N端可切割的信号序列（ss；aa1-52），(ii)载客结构域（aa53-1100）和(iii)外膜整合的C端易位蛋白结构域（β-结构域；aa1101-1377）。显示载客结构域的结构域1（d1）、结构域2（d2）、结构域3（d3）、结构域4（d4）、结构域5（d5）和自伴侣结构域（ac）。“FL”指柔性接头。载客结构域的其余部分（包括β茎部结构域）着色为黑色。在通过外膜后，载客结构域借助自催化机制被从易位蛋白结构域切下，该自催化机制涉及水解Hbp前体的Asn1100和Asn1101之间的肽键。上文示意图中所示的数字对应于原始Hbp（野生型）前体的氨基酸位置，从N端算起。
“E-6”表示ESAT6。“26”表示Rv2660c。“10.3”表示TB10.3并且“10.4”表示TB10.4”。”EGF”表示hEGF(0ss)。“85[N]”表示Ag85B[N’]并且“85[C]”表示Ag85B[C’]。
Hbp（△β-cleav）代表Hbp（野生型）的突变体，其中载客结构域不能被从易位蛋白结构域切割，原因在于，Gly和Ser残基分别置换Asn1100和Asn1101破坏了切割位点（黑色叉）。
HbpSS代表Hbp的突变体，其中除自伴侣结构域之外，绝大部分的载客结构域已经由柔性接头（FL）替换，该柔性接头允许插入异源蛋白质序列。
Hbp（△d1）、Hbp（△d2）、Hbp（△d3）、Hbp（△d4）和Hbp（△d5）代表Hbp的突变体，其中载客结构域的结构域1、2、3、4和5已经分别地由柔性接头替换。Hbp（△d1）与HbpSL相同。
HbpD（△d1）和HbpD（△d2）分别与Hbp（△d1）和Hbp（△d2）相同，例外在于载客结构域和易位蛋白结构域之间的切割位点如对Hbp（△β-cleav）所述那样遭破坏。HbpD（△d1）已经还命名为HbpDL并且HbpD（△d2）已经命名为HppDD2。
Hbp（d4ins）是Hbp的突变体，其中位于结构域4中的残基760-764已经由柔性接头替换。
HbpSS-ESAT6、Hbp（△d1）-ESAT6、HbpD（△d1）-ESAT6、Hbp（△d2）-ESAT6、HbpD（△d2）-ESAT6、Hbp（△d3）-ESAT6、Hbp（△d4）-ESAT6、Hbp（△d5）-ESAT6和Hbp（d4ins）-ESAT6分别是HbpSS、Hbp（△d1）、HbpD（△d1）、Hbp（△d2）、HbpD（△d2）、Hbp（△d3）、Hbp（△d4）、Hbp（△d5）和Hbp（d4ins）的衍生物。在这些衍生物中，与结核分枝杆菌蛋白ESAT6相对应的氨基酸序列插入柔性接头中，从而在天然Hbp序列和ESAT6的N’端及C’之间留下包含Gly和Ser残基的短柔性间隔区。
Hbp（βins）-ESAT6是Hbp的突变体，其中与ESAT6和短N’和C’侧翼柔性间隔区相对应的氨基酸序列已经插入Hbp载客结构域的β-链形成序列中：在残基771和772之间。
Hbp（△d3）-Rv2660c、Hbp（△d4）-Rv2660c和Hbp（△d5）-Rv2660c分别是Hbp（△d3）、Hbp（△d4）和Hbp（△d5）的衍生物。在这些衍生物中，与结核分枝杆菌蛋白Rv2660c相对应的氨基酸序列插入如分别对Hbp（△d3）、Hbp（△d4）和Hbp（△d5）所述那样的柔性接头中。
Hbp（△d1）-TB10.4是Hbp（△d1）的衍生物，其中与结核分枝杆菌蛋白TB10.4相对应的氨基酸序列插入如对Hbp（△d1）所述那样的柔性接头中。
Hbp（△d2）-TB10.3是Hbp（△d2）的衍生物，其中与结核分枝杆菌蛋白TB10.3相对应的氨基酸序列插入如对Hbp（△d2）所述那样的柔性接头中。
Hbp（△d1）-hEGF（0ss）是Hbp（△d1）的衍生物，其中与智人蛋白hEGF的无半胱氨酸突变体相对应的氨基酸序列插入如对Hbp（△d1）所述那样的柔性接头中。
Hbp-Ag85B[N+C]是Hbp的突变体，其中，与来自结核分枝杆菌的蛋白Ag85B的成熟区域的残基1-126相对应的氨基酸序列（Ag85B[N’]）插入如对Hbp（△d1）所述那样定位的柔性接头中。此外，与蛋白Ag85B的成熟区域的残基118-285相对应的氨基酸序列（Ag85B[C’]）插入如对Hbp（△d2）所述那样定位的柔性接头中。
Hbp-Ag85B[C+N]是Hbp的突变体，其中，与来自结核分枝杆菌的蛋白Ag85B的成熟区域的残基1-126相对应的氨基酸序列（Ag85B[N’]）插入如对Hbp（△d2）所述那样定位的柔性接头中。此外，与蛋白Ag85B的成熟区域的残基118-285相对应的氨基酸序列（Ag85B[C’]）插入如对Hbp（△d1）所述那样定位的柔性接头中。
Hbp-Ag85B[C+N]-ESAT6是Hbp-Ag85B[C+N]的衍生物，其中与ESAT6相对应的氨基酸序列插入如对Hbp（d4ins）所述那样定位的柔性接头中。因此，Ag85B[C’]在d1处插入，Ag85B[N’]在d2处插入并且ESAT6在d4处插入。
Hbp-Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c是Hbp-Ag85B[C+N]-ESAT6的衍生物，其中与Rv2660c相对应的氨基酸序列插入如对Hbp（△d5）所述那样定位的柔性接头中。因此，Ag85B[C’]在d1处插入，Ag85B[N’]在d2处插入，ESAT6在d4处插入并且Rv2660c在d5处插入。
HbpD-Ag85B[C+N]、HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6和HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c分别是Hbp-Ag85B[C+N]、Hbp-Ag85B[C+N]-ESAT6和Hbp-Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c的衍生物，例外在于载客结构域和易位蛋白结构域之间的切割位点如对Hbp（△β-cleav）所述那样遭破坏。
一般方法
使用伴有MES-SDS运行缓冲液的4%-12%NuPAGE Bis-Tris凝胶（Invitrogen公司）进行SDS-PAGE。可替代地，使用10%、4%-15%或‘任何-kD’Biorad mini-Protean TGX凝胶或标准10%SDS-PAGE凝胶进行SDS-PAGE。在进行SDS-PAGE之前，将蛋白质样品溶解于SDS-PAGE样品缓冲液（63mM TrisHcl pH6.8，2%w/v SDS，10%甘油，0.01%w/v溴酚蓝，41mM DTT）中并且煮沸5分钟。凝胶用考马斯亮兰G-250染色并且使用Molecular Imager GS-800Calibrated Densitometer（Biorad公司）捕获。可替代地，对凝胶进行蛋白质印迹法。在适宜的情况下，蛋白质印迹物与针对Hbp载客结构域、Hbp易位蛋白结构域或外膜蛋白OmpA的兔多克隆抗体孵育。可替代地，蛋白质印迹物与针对结核分枝杆菌ESAT6或Ag85B的小鼠单克隆抗体或与针对Rv2660c的大鼠多克隆抗血清孵育。随后，在需要的情况下，蛋白质印迹物与辣根过氧化物酶（HRP）缀合的山羊抗兔抗体（Rockland Immunochemicals公司）、HRP缀合的兔抗小鼠抗体或HRP缀合的兔抗大鼠抗体孵育。使用化学发光LumiLight蛋白质印迹底物（Roche公司），将蛋白质印迹物显影。检测化学发光信号并且使用ChemiDoc XRS+Molecular Imager（BioRad公司）将其数字化。
实例1
Hbp分泌和展示构建体的表达和生物生成（图12）。
本实例显示经设计用于分泌或展示异源氨基酸序列的Hbp构建体的正确表达和生物生成。恰当地加工在载客结构域和易位蛋白结构域（HbpSS和HbpSL）之间携带完整切割位点的构建体，产生了整合至外膜中的易位蛋白结构域和分泌至培养基中的载客结构域。在载客结构域和易位蛋白结构域（HbpDL和HbpDD2）之间携带遭破坏的切割位点的构建体的表达产生了保持与易位蛋白结构域共价连接并且因此与细胞连接的载客结构域。
Hbp、Hbp（△β-cleav）、HbpSS、HbpSL（又命名为Hbp（△d1））、HbpDL（也命名为HbpD（△d1））和HbpDD2（又命名为HbpD（△d2））的表达和分泌。在新鲜的培养基中继代培养来自过夜培养物的大肠杆菌MC1061细胞（该MC1061细胞携带克隆至表达载体pEH3中的构建体），它们的生长得以继续。当培养物达到早对数期（OD660≈0.3）时，用1mMIPTG诱导Hbp（衍生物）的表达。从诱导后2小时的培养物收集样品，并且通过低速离心将细胞（c）和用过的培养基（m）分离。细胞直接溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中，而培养基样品首先进行TCA沉淀。通过SDS-PAGE和考马斯染色分析与0.03OD660单位相对应的细胞样品（A）。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析与0.03OD660单位相对应的细胞样品，该蛋白质印迹法使用针对全长Hbp载客结构域的多克隆抗体（B）或针对Hbp易位蛋白结构域的N端表位的多克隆抗体（C）。在各小图的左侧展示分子质量（kDa）标记。显示了构建体的经加工的载客结构域（>）、经加工的易位蛋白结构域（#）和包含载客结构域及易位蛋白结构域的未加工的原形式（*）。
实例2
携带异源蛋白质的Hbp分泌构建体的表达和生物生成（图13）。[00201]本实例显示，与Hbp载客结构域在载客结构域的结构域1的位置处融合（HbpSL-ESAT6）时，异源蛋白质ESAT6借助Hbp自转运蛋白系统高效转运至胞外环境（培养基）。本实例也展示对于异源蛋白质的分泌，需要保持Hbp载客结构域的β茎部完整。这由以下观察结果而来：与其载客结构域已经被N’截短直至自伴侣结构域的Hbp构建体的融合（HbpSS-ESAT6）没有在培养基中产生可检测量的ESAT6。
Hbp、HbpSS、HbpSS-ESAT6、HbpSL（Hbp（△d1））和HbpSL-ESAT6（又命名为Hbp（△d1）-ESAT6）的表达和分泌。在新鲜的培养基中继代培养来自过夜培养物的大肠杆菌MC1061细胞（该MC1061细胞携带克隆至表达载体pEH3中的构建体或空载体（泳道1）），并且它们的生长得以继续。当培养物达到早对数期（OD660≈0.3）时，用1mM IPTG诱导Hbp（衍生物）的表达。从诱导后2小时的培养物收集样品，并且通过低速离心将细胞（c）和用过的培养基（m）分离。细胞直接溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中，而培养基样品首先进行TCA沉淀。通过SDS-PAGE和考马斯染色分析与0.03OD660单位相对应的细胞样品（A）。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析与0.03OD660单位相对应的细胞样品，该蛋白质印迹法使用针对Hbp易位蛋白结构域N端表位的多克隆抗体（B）、针对全长Hbp载客结构域的多克隆抗体（C）或体针对10kDa结核分枝杆菌蛋白ESAT6（E6）的单克隆抗（D）。在各小图的左侧展示分子质量（kDa）标记。显示了构建体的经加工的载客结构域（>）、经加工的易位蛋白结构域（#）和包含载客结构域及易位蛋白结构域的未加工的原形式（*）。
实例3
携带异源蛋白质的Hbp展示构建体的表达和生物生成（图14）。
本实例显示，在Hbp衍生物（其在载客结构域和易位蛋白结构域之间携带遭破坏的切割位点）中的结构域1（HbpDL-ESAT6）或结构域2（HbpDD2-ESAT6）位置处与Hbp载客结构域融合时，异源蛋白质ESAT6稳定表达。
Hbp（△β-cleav）、HbpDL（HbpD（△d1））、HbpDL-ESAT6（Hbp（△d1）-ESAT6）、HbpDD2（HbpD（△d2）和HbpDD2-ESAT6（HbpD（△d2）-ESAT6）的表达和分泌。在新鲜的培养基中继代培养来自过夜培养物的大肠杆菌MC1061细胞（该MC1061细胞携带克隆至表达载体pEH3中的构建体），并且它们的生长得以继续。当培养物达到早对数期（OD660≈0.3）时，用1mM IPTG诱导Hbp-衍生物的表达。在2小时诱导后，通过低速离心收集细胞并且使其溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中。通过SDS-PAGE和考马斯染色分析与0.03OD660单位相对应的细胞样品（A）。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析与0.03OD660单位相对应的细胞样品，该蛋白质印迹法使用针对Hbp易位蛋白结构域N端表位的多克隆抗体（B）、针对全长Hbp载客结构域的多克隆抗体（C）或体针对10kDa结核分枝杆菌蛋白ESAT6(E6)的单克隆抗（D）。在各小图的左侧展示分子质量（kDa）标记。显示了构建体的包含载客结构域和易位蛋白结构域的未加工的原形式（*）。
实例4
在细胞表面展示的Hbp-ESAT6融合物的蛋白酶K可及性（图15）。
本实例显示，携带ESAT6的HbpDL和HbpDD2的载客结构域是添加至完整细胞的蛋白酶K可及的并且因此被蛋白酶K降解，这表明它们暴露于细胞表面。
Hbp（△β-cleav）、HbpDL（HbpD（△d1））、HbpDL-ESAT6（HbpD（△d1）-ESAT6）、HbpDD2（HbpD（△d2））和HbpDD2-ESAT6（HbpD（△d2）-ESAT6）的蛋白酶K可及性。在新鲜的培养基中继代培养来自过夜培养物的大肠杆菌MC1061细胞（该MC1061细胞携带克隆至表达载体pEH3中的构建体），并且它们的生长得以继续。当培养物达到早对数期（OD660≈0.3）时，用1mM IPTG诱导Hbp-衍生物的表达。通过低速离心从诱导后2小时的培养物收集细胞并且重悬于含有1mM CaCl2的50mM Tris-HCl，PH7.4中。在Hbp（△β-cleav）和HbpDL的情况下，使用尖头超声破碎器（Branson Sonifier250）通过超声波处理在冰上裂解一半细胞。随后，全部样品与蛋白酶K（pk）（100μg/mL）在37°C孵育1小时。通过添加0.1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）并且在冰上孵育5分钟终止反应。在溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中之前，将样品进行TCA沉淀。为检测完整细胞上展示的Hbp构建体对于蛋白酶K的可及性，通过SDS-PAGE和考马斯染色分析与0.03OD660单位相对应的细胞样品（A）。作为对照样品，与0.03OD660单位相对应的细胞样品通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析，该蛋白质印迹法使用针对外膜蛋白OmpA的多克隆抗体，其中该外膜蛋白OmpA是蛋白酶K天然不可及的，除非细胞由例如超声波处理（son）裂解（B）。显示了蛋白酶K处理时出现的OmpA降解产物（x）。在各小图的左侧展示分子质量（kDa）标记。显示了构建体的包含载客结构域和易位蛋白结构域的未加工的原形式（*）。在小图的右手侧显示蛋白酶K（pk）的位置。
实例5.
ESAT6在细胞表面的展示（图16）。
本实例显示，与HbpDL或HbpDD2的载客结构域融合的异源蛋白质ESAT6是向完整细胞添加的特异性抗体可及的，从而表明ESAT6在细胞上的高效展示。
Hbp（△β-cleav）、HbpDL（HbpD（△d1））、HbpDL-ESAT6（HbpD（△d1）-ESAT6）、HbpDD2（HbpD（△d2））和HbpDD2-ESAT6（HbpD（△d2）-ESAT6）的表面展示分析和无分泌能力的Hbp（ssTorA）和Hbp（OMPLA）。Hbp（ssTorA）是Hbp的突变体，该突变体的天然信号肽由蛋白质TorA的信号肽替换。因为TorA信号肽不将Hbp靶向Sec易位子，没有跨内膜易位发生并且Hbp保留在细胞质中。Hbp（OMPLA）是Hbp的突变体，该突变体的天然易位蛋白结构域由外膜蛋白OMPLA替换。OMPLA的确将Hbp载客结构域靶向外膜，但是不介导其跨外膜易位。因此，Hbp载客结构域保持指向周质并且不指向胞外环境。
在新鲜的培养基中继代培养来自过夜培养物的大肠杆菌MC1061细胞（该MC1061细胞携带克隆至表达载体pEH3中的构建体或空载体（EV）），并且它们的生长得以继续。当培养物达到早对数期（OD660≈0.3）时，用1mM IPTG诱导Hbp-衍生物的表达。在诱导后1小时通过低速离心收集细胞，将其在冰冷的50mM Tris-HCl，PH7.4中洗涤，并且最终重悬于冰冷的50mM Tris-HCl，PH7.4中并留在冰上。将每份样品的一半在冰上进行尖端超声波处理（Branson Sonifier250）以裂解细胞，而另一半细胞保持完整。随后，在冰冷的50mM Tris-HCl，PH7.4中制备每份样品的5倍稀释物系列。使用基于真空多支管的Bio-Dot设备（Biorad公司），将每份样品的稀释物施加在预浸泡的硝酸纤维素膜上。在TBS中的5%脱脂乳溶液内孵育20分钟时，将膜封闭。为检测Hbp-衍生物的载客结构域的表面暴露，将膜在TBS中与针对Hbp载客结构域的兔多克隆抗体孵育1小时，用TBS洗涤3次，在TBS中与HRP缀合的山羊抗兔抗体孵育45分钟，用TBS洗涤3次并且使用琥珀磺酸二辛钠（DONS）染色法显影（A）。这证实Hbp（△β-cleav）、HbpDL、HbpDL-ESAT6、HbpDD2和HbpDD2-ESAT6的载客结构域在完整细胞上的表面暴露，与不能分泌的突变体Hbp（ssTorA）和Hbp（OMPLA）的载客结构域相反，其中从超声处理的相应样品中显而易见所述突变体的表达。
为了显示ESAT6由HbpDL-ESAT6和HbpDD2-ESAT6在完整细胞上的展示，遵循与A下相同的方法，例外在于使用针对ESAT6的小鼠单克隆抗体和HRP缀合的兔抗小鼠抗体（B）。作为对照，显示不能在完整细胞上高效地检测到周质蛋白OppA，与超声处理的样品相反。对于这种情况，使用与A下所述的相同方法，例外在于使用针对OppA的兔多克隆抗血清（C）。在小图的左手侧处，指示所施加的材料的量（OD660单位）。
实例6
当（部分）缺失侧面结构域时Hbp的生物生成（图17）
本实例显示当侧面结构域1至5的任一个由柔性氨基酸接头序列（△d1-△d5）替换时Hbp的成功分泌。另外，显示了成功分泌插入突变体（d4ins），其中结构域4的仅4个氨基酸由柔性接头替换。
Hbp、Hbp（△d1）、Hbp（△d2）、Hbp（△d3）、Hbp（△d4）、Hbp（△d5）和Hbp（d4ins）的表达和分泌。在新鲜的培养基中继代培养来自过夜培养物的大肠杆菌MC1061细胞（该MC1061细胞携带克隆至表达载体pEH3中的构建体或空载体（-）），并且它们的生长得以继续。当培养物达到早对数期（OD660≈0.3）时，用1mM IPTG诱导Hbp（衍生物）的表达。从诱导后2小时的培养物收集样品，并且通过低速离心将细胞（c）和用过的培养基（m）分离。细胞直接溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中，而培养基样品首先进行TCA沉淀。通过SDS-PAGE和考马斯染色分析与0.03OD660单位相对应的细胞样品。
正确的分泌是从切割的载客结构域（>）在细胞部分（c）和培养基（m）中以及切割的易位蛋白结构域（β）在细胞部分中出现而得出的，与野生型Hbp（wt%）相似（图17）。在小图的左侧显示分子质量（kDa）标记。
实例7
与结构域d1至d5中任一个的位置融合的ESAT6的分泌（图18）
本实例显示与Hbp载客结构域在结构域d1至d5中任一个的位置处融合或插入结构域4（d4ins）时结核分枝杆菌抗原ESAT的高效分泌。[00220]Hbp（△d1）-ESAT6、Hbp（△d2）-ESAT6、Hbp（△d3）-ESAT6、Hbp（△d4）-ESAT6、Hbp（△d5）-ESAT6和Hbp（d4ins）-ESAT6的表达和分泌。（A）如实例6下所描述那样培育、诱导和分析大肠杆菌MC1061细胞，该MC1061细胞携带克隆至表达载体pEH3中的构建体。（B）使用针对ESAT6的单克隆抗体，通过蛋白质印迹法分析来自A的与0.003OD660单位相对应的细胞样品。
正确的分泌是从切割的载客结构域（>）在细胞部分（c）和培养基（m）中以及切割的易位蛋白结构域（β）在细胞部分中出现而得出的（图18A）。使用ESAT6特异性抗体，通过蛋白质印迹法证实ESAT6在相应的载客结构域中的存在（图18B）。在各小图的左侧展示分子质量（kDa）标记。
实例8
当替换结构域d1或d2时分泌TB10.3和TB10.4（图19）
本实例显示当分别替换Hbp载客结构域的结构域d2和结构域d1时结核分枝杆菌蛋白TB10.3和TB10.4的高效分泌。
Hbp（△d1）-TB10.4和Hbp（△d2）-TB10.3的表达和分泌。如描实例6下所描述那样培育和诱导大肠杆菌TOP10F’细胞，该TOP10F’细胞携带克隆至表达载体pEH3中的构建体或携带非表达性质粒（-）。从诱导后2小时的培养物抽取样品。随后，通过离心分离细胞，将其溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中并且通过考马斯染色的SDS-PAGE进行分析。
正确的分泌是从切割的载客结构域（>）在细胞部分（c）和培养基（m）中以及切割的易位蛋白结构域（β）在细胞部分中出现而得出的（图19）。在小图的左侧显示分子质量（kDa）标记。
实例9
与结构域d3、d4或d5中任一个的位置融合的Rv2660c的分泌（图20）
本实例显示与Hbp载客结构域在结构域3、结构域4或结构域5的位置处融合时结核分枝杆菌抗原Rv2660c的高效分泌。
Hbp（△d3）/Rv2660c、Hbp（△d4）/Rv2660c、Hbp（△d5）/Rv2660c的表达和分泌。如实例6下所描述那样培育、诱导和分析大肠杆菌MC1061细胞，该MC1061细胞携带克隆至表达载体pEH3中的构建体。
正确的分泌是从切割的载客结构域（>）在细胞部分（c）和培养基（m）中以及切割的易位蛋白结构域（β）在细胞部分中出现而得出的（图20）。在小图的左侧显示分子质量（kDa）标记。
实例10
无半胱氨酸的hEGF的分泌（图21）。
本实例显示与Hbp载客结构域在结构域1的位置处融合时智人蛋白质hEGF（EGF）的无半胱氨酸（0ss）形式的高效分泌。
Hbp（野生型）、Hbp（△d1）和Hbp（△d1）-hEGF（0ss）的表达和分泌。将大肠杆菌MC1061细胞在补充有葡萄糖（0.4%）、氯霉素（20μg/mL）和链霉素（30μg/mL）的M9培养基中在37°C培育过夜，其中该MC1061细胞携带克隆至表达载体pEH3中的构建体。次日早晨，在新鲜培养基中继代培养细胞并且它们的生长得以继续。当培养物达到早对数期（OD660≈0.3）时，用1mM IPTG诱导Hbp（衍生物）的表达。从诱导后3小时的培养物收集样品，并且通过低速离心将细胞（c）和用过的培养基（m）分离。细胞直接溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中，而培养基样品首先进行TCA沉淀。通过SDS-PAGE和考马斯染色分析与0.05OD660单位相对应的细胞样品和与0.1OD660单位相对应的培养基样品。
正确的分泌是从切割的载客结构域（>）在细胞部分（c）和培养基（m）中以及切割的易位蛋白结构域（β）在细胞部分中出现而得出的（图21）。在小图的左侧显示分子质量（kDa）标记。
实例11
插入β-茎部形成序列时ESAT6的受损的分泌（图22）
本实例显示ESAT6在Hbp载客结构域的β-茎部形成序列中的插入（βins-ESAT6）导致与ESAT6替换侧面结构域4（△d4-ESAT6）相比的低效分泌。值得注意的是，相应构建体中的ESAT6融合位点仅相隔5个氨基酸残基。
Hbp（野生型）、Hbp（△d4）-ESAT6和Hbp（βins）-ESAT6的表达和分泌。如实例6下所描述那样培育和诱导大肠杆菌MC1061细胞，该MC1061细胞携带克隆至表达载体pEH3中的构建体。从诱导后2小时的培养物抽取样品。随后，通过离心分离细胞，将其溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中并且通过考马斯染色的SDS-PAGE进行分析。在各小图的左侧展示分子质量（kDa）标记。显示切割的Hbp载客结构域种类（>）。
实例12
与替代性自转运蛋白融合时ESAT6的分泌（图23-24）
本实例显示了用来通过Hbp分泌系统分泌异源蛋白质的方法论适用于替代性自转运蛋白（AT）；EspC。
图23A显示EspC载客结构域结构的模型。使用M4T同源性建模方法（Rykunov等人，2009J Struct Funct Genomics（《结构与功能基因组学杂志》）10：95-99），以计算机方式预测该结构。使用与EspC载客结构域（登录号Q9EZE7的蛋白质的残基54-1028）相对应的一级氨基酸序列作为输入。鉴定到从β茎部突出的侧面结构域。结构域1（d1）为浅灰色。载客结构域的其余部分（包括β茎部结构域）着色为黑色。结构域d1适合由POI替换。
图23B显示这些实例中所用的EspC衍生物的示意图。将EspC（野生型）作为1306个氨基酸（aa）的前体合成，该前体以3个结构域构成：(i)N端可切割的信号序列（ss；aa1-53），(ii)载客结构域（aa54-1028）和(iii)外膜整合的C端易位蛋白结构域（β-结构域；aa1029-1306）。显示预测的结构域1（d1）。载客结构域的其余部分（包括β茎部结构域）着色为黑色。“FL”指柔性接头。“E-6”表示ESAT6。在通过外膜后，载客结构域借助自催化机制被从易位蛋白结构域（β-结构域）切下，该自催化机制涉及水解EspC前体的Asn1028和Asn1029之间的肽键。上文示意图中所示的数字对应于原始EspC（野生型）前体的氨基酸位置，从N端算起。
EspC、EspC（△d1）和EspC（△d1）-ESAT6的表达和分泌。（图24A）如实例6下所描述那样培育、诱导和分析大肠杆菌MC1061细胞，该MC1061细胞携带克隆至表达载体pEH3中的构建体。（图24B）使用针对ESAT6的单克隆抗体，通过蛋白质印迹法分析来自A的与0.003OD660单位相对应的细胞样品。
本文显示，当载客结构域的预测的dom1由柔性氨基酸序列（△d1）替换时，EspC载客结构域的分泌按照与野生型EspC（wt）相同的效率推进。另外，本实例显示，与EspC载客结构域在预测的结构域d1的位置处融合时（△d1/ESAT6），ESAT6可以高效地分泌。正确的分泌是从切割的载客结构域（>）在培养基部分（m）中和切割的易位蛋白结构域在细胞部分中（x）出现而得出的（图24A）。使用ESAT6特异性抗体，通过蛋白质印迹法证实ESAT6在EspC（d1/ESAT6）载客结构域中存在（图24B）。在各小图的左侧展示分子质量（kDa）标记。
实例13
分裂的Ag85B和ESAT6的分泌（图25）
本实例显示同时分泌分别大致与结核分枝杆菌抗原Ag85B的成熟区域的N’端和C’端半侧相对应的氨基酸段Ag85B[N’]和Ag85B[C’]。当Ag85B[N’]在结构域1的位置处并且Ag85B[C’]在相同Hbp载客结构域分子的结构域2的位置处与Hbp载客结构域翻译性融合（85[N+C]）时，实现这两个部分的分泌。可替代地，Ag85B[C’]在结构域1的位置融合并且Ag85B[N’]在结构域2的位置融合（85[N+C]）。
此外，本实例显示Ag85B[N’]、Ag85B[C’]和分支杆菌抗原ESAT6的同时分泌。当在相同Hbp载客结构域分子上Ag85B[N’]在结构域1的位置处、Ag85B[C’]在结构域2的位置处融合并且ESAT6插入结构域4（85[N+C]/E6）时，实现这种分泌。可替代地，Ag85B[C’]在结构域1的位置融合，Ag85B[N’]在结构域2的位置融合，并且ESAT6插入结构域4中（85[N+C]/E6）。
Hbp、Hbp（△β-cleav）、Hbp-Ag85B[N+C]、Hbp-Ag85B[C+N]、Hbp-Ag85B[N+C]/ESAT6、Hbp-Ag85B[C+N]/ESAT6的表达、分泌和蛋白酶K可及性。（图25A）如实例6下所描述那样培育、诱导和分析来自过夜培养物的大肠杆菌TOP10F’细胞，该MC1061细胞携带克隆至表达载体pEH3中的构建体或空载体（-）。（图25B）如A下所培养和诱导的细胞重悬于含有1mM CaCl2的50mM Tris-HCl，PH7.4中。随后，将样品于37°C在存在（+）或不存在（-）蛋白酶K（pk）（100μg/mL）的情况下孵育1小时。通过添加0.1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）并且在冰上孵育5分钟终止反应。在溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中之前，将样品进行TCA沉淀并且在考马斯染色的SDS-PAGE上分析。在各小图的左侧展示分子质量（kDa）标记。显示切割的载客结构域（>）和易位蛋白结构域（β）、蛋白酶K（pk）的位置。
正确的分泌是从切割的载客结构域（>）和易位蛋白结构域（β）在细胞部分（c）中出现而得出的，与野生型Hbp相似（A）。作为对照，对不可切割但是能够易位的Hbp（△β）形式，没有观察到切割的载客结构域和易位蛋白结构域。为证实它们的胞外位置，显示了这些载客结构域对添加至完整细胞的蛋白酶K的敏感性（B）。
实例14
分裂的Ag85B、ESAT6和Rv2660的同时分泌（图26）
本实例显示Ag85B[N’]、Ag85B[C’]、ESAT6和分支杆菌抗原Rv2660c与单个Hbp载客结构域融合时同时分泌。当Ag85B[N’]在结构域1的位置处与Hbp载客结构域翻译性融合、Ag85B[C’]在结构域2的位置处融合、ESAT6插入结构域4，并且Rv2660c在结构域5的位置处融合时（“85-E6-2660”），实现这些部分的分泌。为了比较，平行分析仅携带Ag85B[C’]及Ag85B[N’]（“85”）、或Ag85B[C’]、Ag85B[N’]和ESAT6（“85-E6”）的构建体的分泌。
Hbp-Ag85B[C+N]，Hbp-Ag85B[C+N]/ESAT6和Hbp-Ag85B[C+N]/ESAT6/Rv2660c的表达和分泌。如实例6下所描述那样培育和诱导大肠杆菌MC1061细胞，该MC1061细胞携带克隆至表达载体pEH3中的构建体。
正确的分泌是从切割的载客结构域（>）和易位蛋白结构域（x）在细胞部分（c）中出现而得出的（图26）。在小图的左侧显示分子质量（kDa）标记。
实例15
Ag85B、ESAT6和Rv2660c的同时展示（图27）
本实例显示Ag85B[N’]、Ag85B[C’]、ESAT6和Rv2660c与Hbp（△βcleav）（一种不可切割然而能够易位的Hbp形式）的单个载客结构域融合时同时展示。当Ag85B[N’]在结构域1的位置处与Hbp载客结构域翻译性融合、Ag85B[C’]在结构域2的位置处融合、ESAT6插入结构域4，并且Rv2660c在结构域5的位置处融合时（85-E6-2660），实现展示。为了比较，平行分析仅携带Ag85B[C’]及Ag85B[N’]（“85”）、或Ag85B[C’]、Ag85B[N’]和ESAT6（“85-E6”）的构建体的展示。另外，分析Hbp（△βcleav）（△β）的展示（图27A）。
在适宜的情况下，使用针对Ag85B[C’]、ESAT6和Rv2660c的特异性抗体实施蛋白质印迹以证实这些部分在相应的载客结构域中的存在（图27B）。
为证实相应的载客结构域跨细胞包膜易位和它们在细胞表面展示，显示了这些载客结构域对添加至完整细胞的蛋白酶K的敏感性（图27C）。
在图27中，在各小图的左侧展示分子质量（kDa）标记。显示了未切割的原形形式Hbp种类（*）。
Hbp（△βcleav）、HbpD-Ag85B[C+N]、HbpD-Ag85B[C+N]/ESAT6和HbpD-Ag85B[C+N]/ESAT6/Rv2660c的表达和展示。(A)如实例6下所描述那样培育和诱导大肠杆菌MC1061细胞，该MC1061细胞携带克隆至表达载体pEH3中的构建体。从诱导后2小时的培养物抽取样品。随后，通过离心分离细胞，将其溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中并且通过考马斯染色的SDS-PAGE进行分析。(B)使用针对Ag85B[C]的表位的单克隆抗体、针对ESAT6的单克隆抗体或针对Rv2660c的多克隆抗体，通过蛋白质印迹法分析来自A的与0.003OD660单位相对应的细胞样品。(C)如A下所培养和诱导的细胞重悬于含有1mM CaCl2的50mM Tris-HCl，PH7.4中。随后，将样品于0°C在存在（+）或不存在（-）蛋白酶K（pk）（100μg/mL）的情况下孵育30分钟。通过添加0.1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）并且在冰上孵育5分钟终止反应。在溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中并且在考马斯染色的SDS-PAGE上分析之前，将样品进行TCA沉淀。
实例16
Ag85B、ESAT6和Rv2660c由减毒的沙门氏菌菌株同时分泌（图28）
本实例显示与单个Hbp载客结构域融合时，Ag85B[N’]、Ag85B[C’]、ESAT6和分支杆菌抗原Rv2660c由减毒的鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）同时分泌。当Ag85B[C’]在结构域1的位置处与Hbp载客结构域翻译性融合、Ag85B[N’]在结构域2的位置处融合、ESAT6插入结构域4，并且Rv2660c在结构域5的位置处融合时（85[C+N]-E6-2660），实现这些部分的分泌。正确的分泌是从切割的载客结构域（>）在培养基部分（m）中出现而得出的（图28A）。
使用针对Ag85B[C’]、ESAT6和Rv2660c的特异性抗体实施蛋白质印迹以证实这些部分在分泌的载客结构域中存在。另外，使用针对Hbp易位蛋白结构域（α桶）的抗血清的蛋白质印迹法证实切割的易位蛋白结构域在细胞中出现（图28B）。
由减毒的鼠伤寒沙门氏菌表达和分泌Hbp-Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c。(A)将鼠伤寒沙门氏菌菌株SL3261（Hoiseth和Stocker1981Nature（《自然》）291：281-282）和衍生物在LB培养基中于37°C过夜培育至饱和，其中该衍生物在基因组上携带在组成型lacUV5启动子控制下编码Hbp-Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c的基因的单拷贝。对于沙门氏菌菌株的构建，见实例21。次日早晨，在新鲜培养基中继代培养细胞并且它们的生长得以继续。继代培养后2小时，从培养物收集样品，并且通过低速离心将细胞（c）和用过的培养基（m）分离。细胞直接溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中，而培养基样品首先进行TCA沉淀。通过SDS-PAGE和考马斯染色分析与0.03OD660单位相对应的细胞样品。(B)使用针对Ag85B[C]的表位的单克隆抗体、针对ESAT6的单克隆抗体、针对Rv2660c的多克隆抗体或针对Hbp易位蛋白结构域的多克隆抗体，通过蛋白质印迹法分析来自A的与0.003OD660单位相对应的细胞样品。
显示了一条身份未知的背景条带（*）。在各小图的左侧展示分子质量（kDa）标记。
实例17
Ag85B、ESAT6和Rv2660c由减毒的沙门氏菌菌株同时展示（图29）
本实例显示，与Hbp（△βcleav）（一种不可切割然而能够易位的Hbp形式（HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c））的载客结构域的单个Hbp载客结构域融合时，Ag85B[N’]、Ag85B[C’]、ESAT6和Rv2660c在减毒的鼠伤寒沙门氏菌的细胞表面表达并同时展示。还显示使用相同策略时单个ESAT6单元的表面展示（HbpD-ESAT6）。
构建体的正确表达是通过SDS-PAGE和考马斯染色分析而得出的，该分析显示分子量分别与HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c和HbpD-ESAT6的计算分子量相对应的蛋白质条带出现（*）。作为对照，这些条带不存在于不表达的对照细胞（-）中。
为证实相应的载客结构域跨细胞包膜的易位和在细胞表面展示，显示了它们对添加至完整细胞的蛋白酶K（pk）的敏感性。
HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c和HbpD-ESAT6在减毒的鼠伤寒沙门氏菌的细胞表面上的表达和展示。将鼠伤寒沙门氏菌菌株SL3261（Hoiseth和Stocker1981Nature（《自然》）291：281-282）（-）和衍生物在LB培养基中于37°C过夜培育至饱和，该衍生物在基因组上携带在组成型lacUV5启动子控制下编码HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c的基因的或编码HbpD-ESAT6的基因的单拷贝。对于沙门氏菌菌株的构建，见实例21。次日早晨，在新鲜培养基中继代培养细胞并且它们的生长得以继续。继代培养后2小时30分钟，从培养物收集细胞并且重悬于含有1mMCaCl2的50mM Tris-HCl，PH7.4中。随后，将样品于37°C在存在（+）或不存在（-）蛋白酶K（pk）（100μg/mL）的情况下孵育1小时。通过添加0.1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）并且在冰上孵育5分钟终止反应。将样品进行TCA沉淀，溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中，并且在考马斯染色的SDS-PAGE上分析。显示了构建体的未加工的原形式（*），其包含载客结构域和易位蛋白结构域。在小图的右手侧显示分子量标记（kDa）。
实例18
Ag85B、ESAT6和Rv2660c在外膜小泡上同时展示（图30A-D）。
这份样品显示Ag85B[C’]、Ag85B[N’]和ESAT6与Hbp（△βcleav）（一种不可切割然而能够易位的Hbp形式（85B-E6-2660））的单个载客结构域融合时同时展示在细菌外膜小泡（OMV）的表面上。此外，显示了Ag85B[C’]、Ag85B[N’]和ESAT6（85B-E6）以及单个ESAT6单元（△d1-E6）的组合展示。作为对照，分析了不携带异源配偶物（△d1）的HbpD（△d1）的展示。为实现展示在OMV上，将这些融合蛋白在tol-pal基因中携带突变的大肠杆菌菌株内表达，其中该突变诱导过度小泡化（hyper-vesiculating）表型。
这些融合蛋白在OMV中的定位由它们与外膜孔蛋白（porin）OmpA和OmpC在OMV分离物中的共定位显示，其中该OMV分离物源自经过滤并且因此无细胞的培养基部分（图30A和B）。这些融合蛋白在OMV表面的成功展示由它们对外在添加至OMV的蛋白酶K的敏感性显示（图30C和D）。为证实OMV的完整性，显示蛋白酶K敏感的OmpA胞内结构域是不可及的，除非使用去垢剂曲拉通x-100（tx-100）溶解OMV。
HbpD（△d1）、HbpD（△d1）-ESAT6、HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6和Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c在OMV上的表达和展示。(A)在新鲜的培养基中继代培养来自过夜培养物的大肠杆菌JC8031细胞（Barnadac等人，1998Journal of Bacteriology（《细菌学杂志》）180：4872-4878），该JC8031细胞携带克隆至表达载体pEH3中的构建体或空载体（-），并且它们的生长得以继续。当培养物达到早对数期（OD660≈0.2）时，用1mM IPTG诱导Hbp（衍生物）的表达。在诱导后3小时，将50ml培养物样品离心（5000转/分钟，4°C，15分钟）以将细胞与培养基分离。将细胞（总细胞）溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中，而将培养基经历再一次离心（5000转/分钟，4°C，15分钟）。将所得到的上清液经0.2μm孔径滤器过滤并且使用Kontron TFT70.38转子，进行高速离心（45,000转/分钟，4°C，1小时）。含有OMV的沉淀部分重悬于PBS中。将与1OD660单位相对应的细胞样品溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中并且通过考马斯染色的SDS-PAGE与0.02OD660单位的总细胞进行平行分析。已经在小图左侧指示外膜蛋白OmpA和OmpC，其身份通过质谱分析证实。(B)为证实融合蛋白的身份，使用针对Hbp易位蛋白结构域（α桶）的多克隆抗血清和针对ESAT6的单克隆抗体，通过蛋白质印迹法分析在A下制备的样品。(C)OMV的蛋白酶K处理。在A下所分离的OMV重悬于含有1mM CaCl2的50mM Tris-HCl，PH7.4中。将样品分成3个相等的等分试样，这些样品如所示那样与(+)或不与(-)蛋白酶K（pk）（100μg/ml）孵育。在添加蛋白酶K之前，将曲拉通X-100（tx-100）（1%）添加至等分试样之一。全部等分试样在37°C孵育30分钟，此后，通过添加0.1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）并且在冰上孵育5分钟终止反应。将样品进行TCA沉淀，溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中。与1OD660单位相对应的细胞样品由考马斯染色的SDS-PAGE分析。(D)为证实融合蛋白的身份，使用针对Hbp易位蛋白结构域（α桶）的多克隆抗血清和针对ESAT6的单克隆抗体，通过蛋白质印迹法分析在C下制备的样品。显示了构建体的未加工的原形式（*），其包含载客结构域和易位蛋白结构域。在小图的右手侧显示分子量标记（kDa）。
实例19
分裂的Ag85B和ESAT6在菌影上的展示（图31A-C）
在本实例19中，使用质粒pLargeRhaLysisE来利用本文中所述的方法学，将大肠杆菌细胞变成菌影。在实例20中描述pLargeRhaLysisE的构建。
这份样品显示Ag85B[C]、Ag85B[N]和ESAT6与Hbp（△βcleav）的单个载客结构域融合时同时展示在菌影的表面上。为了实现在菌影上表面展示，在用质粒转化的大肠杆菌细胞中表达HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6，其中该质粒携带在诱导型启动子的控制下编码噬菌体phiX174裂解蛋白E的基因。在表达HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6后，诱导裂解蛋白E的表达，导致细胞胞质内容物释放至培养基中。这导致出现在表面展示HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6的‘空’细菌细胞包膜（菌影）。
通过裂解蛋白E表达时表观细胞密度（OD600）的降低显示成功的裂解蛋白E介导的菌影形成（图31A）。另外，显示裂解蛋白E表达时，胞质标记蛋白（SecB,DnaK）释放至培养基中并且因此在离心后留在上清液部分中。相反，周质标记蛋白（SurA）和整合型膜蛋白（Lep）（主要）位于含有细菌细胞包膜（菌影）的离心沉淀物中（图31B）。HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6在菌影中的正确定位由它与沉淀物部分中的Lep共定位显示（图31B）。HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6在菌影以及对照细胞表面的成功展示由它对外在添加至这些菌影/细胞的蛋白酶K的敏感性显示（图31C）。
]HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6的表达和展示及菌影的后续形成。(A)用(i)pEH3(p15a)-HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6和(ii)携带下述基因的pLargeRhaLysisE共转化的大肠杆菌MC4100细胞在LB培养基中于30°C培育，其中该基因在鼠李糖诱导型启动子的控制下的、编码来自噬菌体phiX174的裂解蛋白E。当培养物达到OD600为0.5时，添加0.4mM IPTG以诱导HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6的表达，并且将培养物分开。在添加IPTG后1小时，将0.2%鼠李糖添加至一半的原始培养物以诱导裂解蛋白E的表达，而使用另一半培养物作为对照。随时间推移监测培养物的OD600。(B)在IPTG诱导后3小时，通过离心分离在A下所培育的对照细胞（未诱导的培养物）和菌影（诱导的培养物）。分离含有培养基的上清并且用TCA沉淀其蛋白质内容物。细胞/菌影沉淀物（P；细胞/菌影沉淀物）和TCA沉淀的物质（S；上清液）然后溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中并且由SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析。使用针对Hbp载客结构域（pass.）和易位蛋白结构域（桶）的多克隆抗体和针对ESAT6的单克隆抗体检测HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6的存在。使用针对胞质蛋白DnaK和SecB、周质蛋白SurA和整合型膜蛋白Lep的多克隆抗体监测菌影的形成。(C)对照细胞和菌影的蛋白酶K处理。在B下所分离的细胞和菌影的部分重悬于含有1mM CaCl2的50mM Tris-HCl，PH7.4中。将蛋白酶K（100μg/ml）添加至每份样品的一半（+），而留下另一半不作处理（-）。样品在37°C孵育1小时，此后，通过添加0.1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）并且在冰上孵育5分钟终止反应。将样品进行TCA沉淀，溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中并且使用针对Hbp载客结构域的抗血清，通过蛋白质印迹法进行分析。
实例20
以下实例涉及质粒pLargeRhaLysisE的构建。图32显示实例20中所用的pLargeRhaLysisE的质粒图。下表3和表4分别显示实例20中使用的引物序列和构建体。
质粒pLargeRhaLysisE携带在鼠李糖诱导型rhaBAD启动子控制下的、编码来自噬菌体phiX174的裂解蛋白E的基因。为构建pLargeRhaLysisE，首先构建了基于pSB3398（Wagner等人，2010Proc NatlAcad Sci USA（《美国科学院院刊》）107:17745-17750）和pRha67K的质粒pLarge。
质粒pRha67K是pRha67的衍生物（Giacalone等人，2006BioTechniques（《生物学技术》）40：355-364），其中使用USER克隆法（Bitinaite和Nichols2009Curr Protoc Mol Biol（《分子生物学现行方案》）第3章：3.21单元；
BMC Biotechnol10：21），将编码氨苄青霉素标记的基因从起始至终止密码子用编码来自pET28（a+）（EMDBiosciences公司）的卡那霉素标记的基因替换。使用pET28（a+）作为模板以及含有脱氧尿嘧啶（u）的引物kanR和kanF，扩增编码pET28（a+）的卡那霉素抗性标记的基因。使用含有脱氧尿嘧啶的引物pRhakanF和pRhakanR，扩增了编码pRha67的DNA，该pRha67不带编码氨苄青霉素标记的基因。使用含有脱氧尿嘧啶的引物，将PfuX7聚合酶用来扩增DNA（
BMC Biotechnol10：21）。随后，根据制造商的说明书，使用USER酶（New England Biolabs公司）构建pRha67K。
质粒pLarge是pRha67K的衍生物，其中使用USER克隆法（Bitinaite和Nichols2009Curr Protoc Mol Biol（《分子生物学现行方案》）第3章：3.21单元；
2010BMC Biotechnol10：21），将鼠李糖启动子（包括调节元件）、多克隆位点和终止子用来自pSB3398的对应物替换（Wagner等人，2010Proc Natl Acad Sci USA（《美国科学院院刊》）107:17745-17750）。使用pSB3398作为模板以及含有脱氧尿嘧啶的引物pSB3398正向和pSB3398反向，扩增调节元件(rhaR、rhaS PrhaBAD)和多克隆位点和转录终止子rrnB。使用pRha67K作为模板来扩增pRha67K的部分，该部分涵盖卡那霉素抗性标记（包括其启动子和终止子）和复制起点。所用的含有脱氧尿嘧啶的引物是67kF和pRhaR。PfuX7聚合酶用来扩增DNA，并且随后，根据制造商的说明书使用USER酶（New EnglandBiolabs）来构建pLarge。
为构建pLargeRhaLysisE，从MWG公司获得编码来自噬菌体phiX174的裂解蛋白E的合成DNA序列。这种合成DNA片段在编码序列的5’侧和3’侧处分别拥有EcoRI和BamHI位点。这允许克隆至pLarge的EcoRI和BamHI位点，从而产生pLargeRhaLysisE。
表3：实例20中使用的引物
注：在表3中，尿嘧啶用u指示。
表4.实例20中使用的构建体
实例21
以下实例21涉及沙门氏菌菌株的构建。图33显示hbp突变插入鼠伤寒沙门氏菌SL3261染色体中的位置的示意图。下表5显示实例21中所用的引物序列。
如下构建在染色体上携带编码Hbp-Ag85B（C+N）-ESAT6-Rv2660c、HbpD-ESAT6或HbpD-Ag85B（C+N）-ESAT6-Rv2660c的基因中的任一的单拷贝的鼠伤寒沙门氏菌菌株。将相关的hbp突变体基因借助双交换同源重组通过等位交换插入鼠伤寒沙门氏菌染色体（Kaniga等人，1991Gene（《基因》）109：137-141），替换malE和malK启动子区。简而言之，分别使用pHbp-Ag85B（C+N）-ESAT6-Rv2660c、pHbpD-ESAT6或pHbpD-Ag85B（C+N）-ESAT6-Rv2660c作为模板，通过PCR扩增包含lacUV5启动子区的hbp突变体。所用的引物是lacUV5_ScaI_f和pEH3Hbpbeta_ScaI_r。PCR产物用ScaI消化并克隆至SmaI切割的源自pSB890的自杀载体（Palmer等人，1998MolecularMicrobiology（《分子微生物学》）27：953-965）中，就在与malE和malK同源的1000bp区域之间（图33）。
将所得到的hbp突变体-自杀载体转化至大肠杆菌供体菌株SM10λpir（Miller和Mekalanos1998Journal of Bacteriology（《细菌学杂志》）170：2575-2583）中。SM10λpir在平板上与鼠伤寒沙门氏菌受体菌株SL3261交合过夜（Hoiseth和Stocker1981Nature（《自然》）291：281-282）。在平板上选择四环素耐受型鼠伤寒沙门氏菌转化接合子。
通过选择沙门氏菌突变体针对蔗糖的抗性实现部分二倍体的解析和用hbp突变体基因替换野生型基因座（Kaniga等人，1991Gene（《基因》）109：137-141）。使用引物malE_insert_seq和malK_insert_seq，通过malE和malK之间基因间区的PCR并将导入的等位基因测序，鉴定阳性克隆。
表5.实例21中使用的引物
Claims (52)
1.一种能够表达多于一种POI(感兴趣多肽)的宿主细胞，所述POI包含于一种融合蛋白中，该融合蛋白也包含
i.一种包含来自自转运蛋白的β茎部结构域的载客结构域；
ii.一种来自自转运蛋白的易位蛋白结构域；和
iii.一种能够将该融合蛋白靶向革兰氏阴性细菌内膜的信号肽；
其中该载客结构域的β茎部形成序列是基本上完整的并且这些POI与该载客结构域融合。
2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中该处于其天然形式的自转运蛋白的载客结构域包含该从β茎部结构域突出的至少一个侧面结构域，并且其中这些POI插入、替代或部分替代这种侧面结构域。
3.根据权利要求2所述的宿主细胞，其中该处于其天然形式的自转运蛋白的载客结构域包含至少两个侧面结构域，并且其中至少两种POI插入、替代或部分替代独立的侧面结构域。
4.根据权利要求2所述的宿主细胞，其中这些POI插入、替代或部分替代相同的侧面结构域。
5.根据权利要求1-4所述的宿主细胞，其中这些POI的每一种与独立的载客结构域、易位蛋白结构域和信号肽融合。
6.根据权利要求1-5所述的宿主细胞，其中在表达时，该融合蛋白在该细胞表面展示。
7.根据权利要求1-5所述的宿主细胞，其中在表达时，该融合蛋白从该细胞表面分泌并且释放。
8.根据权利要求1-7所述的宿主细胞，其中i)中的载客结构域和ii)中的易位蛋白结构域源自一种SPATE蛋白(肠杆菌科的丝氨酸蛋白酶自转运蛋白)。
9.根据权利要求所述8的宿主细胞，其中该SPATE蛋白是来自大肠杆菌的血红蛋白结合蛋白酶(Hbp)、胞外丝氨酸蛋白酶(EspC)或温度敏感性血凝素(Tsh)。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其中该SPATE蛋白包含一种多肽，该多肽具有与SEQ ID NO1或SEQ ID NO2相似至少90％的序列。
11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其中SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸53-308、533-608、657-697、735-766和898-922对应于多个侧面结构域，并且其中这些POI插入、替代或部分替代至少一个或至少两个这类侧面结构域。
12.一种融合蛋白，其包含
i.多于一种POI(感兴趣多肽)
ii.一种包含来自自转运蛋白的β茎部结构域的载客结构域；
iii.一种来自自转运蛋白的易位蛋白结构域；和
iv.可任选地，一种将该融合蛋白靶向革兰氏阴性细菌内膜的信号肽，
其中该载客结构域的β茎部形成序列是基本上完整的并且这些POI与该载客结构域融合。
13.根据权利要求12所述的融合蛋白，其中该处于其天然形式的自转运蛋白的载客结构域包含从该β茎部结构域突出的至少一个侧面结构域，并且其中这些POI替代或部分替代这种侧面结构域。
14.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中该处于其天然形式的自转运蛋白的载客结构域包含至少两个侧面结构域，并且其中至少两种POI替代或部分替代独立的侧面结构域。
15.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中这些POI插入、替代或部分替代相同的侧面结构域。
16.根据权利要求12-15所述的融合蛋白，其中i)中的载客结构域和ii)中的易位蛋白结构域源自一种SPATE蛋白(肠杆菌科的丝氨酸蛋白酶自转运蛋白)。
17.根据权利要求16所述的融合蛋白，其中该SPATE蛋白是来自大肠杆菌的血红蛋白结合蛋白酶(Hbp)、胞外丝氨酸蛋白酶(EspC)或温度敏感性血凝素(Tsh)。
18.根据权利要求17所述的融合蛋白，其中该SPATE蛋白包含一种多肽，该多肽具有与SEQ ID NO1或SEQ ID NO2相似至少90％的序列。
19.根据权利要求18所述的融合蛋白，其中SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸53-308、533-608、657-697、735-766和898-922对应于多个侧面结构域，并且其中这些POI插入、替代或部分替代至少一个或至少两个这类侧面结构域。
20.一种经安排用于表达融合蛋白的核酸，所述核酸在框内包含：
i.编码所述融合蛋白的信号肽的序列，该信号肽能够将该融合蛋白靶向革兰氏阴性细菌的内膜；
ii.编码所述融合蛋白的载客结构域的序列，该载客结构域包含来自自转运蛋白的β茎部结构域；以及
iii.编码所述融合蛋白的易位蛋白结构域的序列，该易位蛋白结构域源自自转运蛋白，
其中该编码载客结构域的序列包含允许框内地克隆至少两个编码POI(感兴趣多肽)的DNA序列的至少两段克隆位点序列，所述克隆位点序列如此安排，从而该载客结构域的所编码的β茎部形成蛋白序列是基本上完整的。
21.根据权利要求20所述的核酸，其中编码该处于其天然形式的自转运蛋白的载客结构域的序列包含至少两段序列，这些序列编码从该β茎部结构域突出的侧面结构域，并且其中该至少两段克隆位点序列的每一个插入、替代或部分替代所述编码侧面结构域的序列段的独立段。
22.一种经安排用于表达融合蛋白的核酸，所述核酸在框内包含：
i.编码所述融合蛋白的信号肽的序列，该信号肽能够将该融合蛋白靶向革兰氏阴性细菌的内膜；
ii.编码所述融合蛋白的载客结构域的序列，该载客结构域包含来自自转运蛋白的β茎部结构域；
iii.编码所述融合蛋白的易位蛋白结构域的序列，该易位蛋白结构域源自自转运蛋白；和
iv.编码所述融合蛋白的多于一种POI(感兴趣多肽)的序列，
其中这些编码POI的序列与该编码载客结构域的序列融合并且如此安排，从而该载客结构域的所编码的β茎部形成蛋白序列是基本上完整的。
23.根据权利要求22所述的核酸，其中该编码处于其天然形式的自转运蛋白的载客结构域的序列包含至少两段序列，这些序列编码从该β茎部结构域突出的侧面结构域，并且其中这些编码POI的序列的每一个插入、替代或部分替代所述编码侧面结构域的序列段的独立段。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的核酸，进一步包含编码一种切割位点的序列，该切割位点允许该编码的融合蛋白从携带所述核酸的宿主细胞中分泌。
25.根据权利要求20-23中任一项所述的核酸，不包含编码一种允许分泌的切割位点的序列，或包含一种破坏的切割位点，从而该编码的融合蛋白经安排以展示于携带所述核酸的宿主细胞的细胞表面上。
26.根据权利要求20-25中任一项所述的核酸，其中编码ii)中载客结构域和iii)中易位蛋白结构域的序列源自编码一种SPATE蛋白(肠杆菌科的丝氨酸蛋白酶自转运蛋白)的基因。
27.根据权利要求26所述的核酸，其中该SPATE蛋白是来自大肠杆菌的血红蛋白结合蛋白酶(Hbp)、胞外丝氨酸蛋白酶(EspC)或温度敏感性血凝素(Tsh)。
28.根据权利要求27所述的核酸，其中编码该SPATE蛋白的基因对与SEQID NO1或SEQ ID NO2相似至少90％的蛋白质序列进行编码。
29.根据权利要求28所述的核酸，其中SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸53-308、533-608、657-697、735-766和898-922对应于多个侧面结构域，并且其中安排这些克隆位点或编码POI的序列以替代或部分地替代至少一个或至少两个这类侧面结构域。
30.一种载体，其包含根据权利要求20-29中任一项所述的核酸。
31.一种宿主细胞，其包含根据权利要求20-30中任一项所述的核酸或载体。
32.根据权利要求1-11和31所述的宿主细胞，其是革兰氏阴性细菌。
33.根据权利要求32所述的宿主细胞，其选自肠杆菌科，如大肠杆菌、沙门氏菌属某些物种、弧菌属某些物种、志贺氏菌属某些物种、假单胞菌属某些物种、伯克霍尔德菌属某些物种或德特氏菌属某些物种。
34.一种外膜小泡，在其表面上展示根据权利要求的12-19中任一项所述融合蛋白。
35.一种菌影，在其表面上展示根据权利要求的12-19中任一项所述融合蛋白。
36.一种用于融合蛋白的分泌性蛋白表达的方法，该方法包括步骤
i.提供一种根据权利要求1-11或31-33中任一项所述的宿主细胞；
ii.诱导该融合蛋白的表达。
37.根据权利要求36所述的方法，该方法包括另外的步骤：抑制该宿主细胞中具有蛋白酶活性的周质酶。
38.根据权利要求37所述的方法，其中该酶是DegP。
39.根据权利要求38所述的方法，其中通过DegP催化位点中的突变抑制DegP。
40.根据权利要求35-39中任一项所述的方法，该方法包括另外的步骤：下调该宿主细胞的周质间隙内催化蛋白质中二硫键形成的至少一种酶。
41.根据权利要求40所述的方法，其中该酶是DsbA或DsbB。
42.根据权利要求36-41中任一项所述的方法，其中该融合蛋白以可溶性方式分泌。
43.根据权利要求36-41中任一项所述的方法，其中该融合蛋白展示在该细胞表面上。
44.根据权利要求36-43中任一项所述的方法，其中该宿主细胞是革兰氏阴性细菌并且其中该方法包括另外的步骤：诱导小泡从该革兰氏阴性细菌的外膜排出，因此形成在它们的表面上展示该融合蛋白的外膜小泡。
45.根据权利要求36-43中任一项所述的方法，其中该宿主细胞是革兰氏阴性细菌并且其中该方法包括另外的步骤：裂解该革兰氏阴性细菌以形成在它们的表面上展示该融合蛋白的菌影。
46.根据权利要求45所述的方法，其中通过使用来自噬菌体PhiX174的致死性裂解基因E进行该裂解。
47.根据权利要求1-11或31-33所述的宿主细胞、根据权利要求12-19所述的融合蛋白、根据权利要求20-29所述的核酸、根据权利要求30所述的载体、根据权利要求34所述的外膜小泡、根据权利要求35所述的菌影或根据权利要求36-46所述的方法，其中这些POI的至少一种包含抗原，例如来自感染性生物的抗原。
48.根据权利要求47所述的宿主细胞、核酸、载体、融合蛋白或方法，其中该抗原是来自结核分枝杆菌的抗原。
49.根据权利要求48所述的宿主细胞、核酸、载体、融合蛋白或方法，其中该来自结核分枝杆菌的抗原选自下组，该组由以下各项组成：ESAT-6、Ag85B、Rv2660c、TB10.4和TB10.3或与这些蛋白质相似的蛋白质。
50.根据权利要求49所述的宿主细胞、核酸、载体、融合蛋白或方法，其中该抗原是已经分裂成N’部分(Ag85B(N’))和C’部分(Ag85B(C’))的Ag85B，并且其中每个部份与来自自转运蛋白的载客结构域的独立侧面结构域融合。
51.根据权利要求49所述的宿主细胞、核酸、载体、融合蛋白或方法，其中抗原ESAT-6、Ag85B、Rv2660c、TB10.4和TB10.3的至少2种，如2、3或4种，每种以分裂或全序列形式融合至、插入、替代或部分替代来自自转运蛋白的载客结构域的独立侧面结构域。
52.一种疫苗，包含根据权利要求47-51中任一项所述的宿主细胞、融合蛋白、外膜小泡或菌影。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |