CN115786308A - 一种提高右旋糖酐酶热稳定性的方法及突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种提高右旋糖酐酶热稳定性的方法及突变体。本发明的突变体与野生型相比，在较大的温度范围内突变体酶对温度的耐受性均优于野生型酶，热稳定性得到了显著的提高。经过对野生酶的分子改造，其中突变体酶S326V的催化效率显著提高，突变体酶的半衰期有明显提高，这将进一步拓展该酶耐高温的特性，为后续的产品开发提供了良好的应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种提高右旋糖酐酶热稳定性的方法及突变体。
背景技术
右旋糖酐酶(Dextranase)归属于糖苷水解酶家族(EC 3.2.1.11)，能够专一性地作用于右旋糖酐中的α-1,6糖苷键，将分子量大、黏度较高的右旋糖酐水解为中低分子量右旋糖酐或其他小分子的单糖和寡糖等产物。右旋糖酐酶在食品、临床医疗和龋齿防治等方向具有非常广阔的应用前景与市场需求，例如在甘蔗制糖工业中用于水解高黏度右旋糖酐以缓解传热问题，或制备能够在临床上作为代血浆的中低分子量的右旋糖酐等，或添加至口腔清洁产品中依靠分解牙齿表面的右旋糖酐来防治牙菌斑及龋齿。然而，目前绝大多数天然右旋糖酐酶存在着热稳定性偏低的问题，这一问题成为提高右旋糖酐水解效率的限速步骤，因此获得热稳定的右旋糖酐酶是提升右旋糖酐产率和品质的关键。
随着蛋白质工程和结构生物学的迅速发展，利用基因工程和酶工程等技术对酶分子进行定向改造成为优化酶性质行之有效的手段，右旋糖酐酶作为糖苷水解酶家族中的常见酶类，部分酶的分子结构和催化性质已经比较明确，适合对右旋糖酐酶进行分子改造。
本发明涉及的右旋糖酐酶来源于海洋细菌Arthrobacter oxydans KQ11，研究表明其分泌的野生型右旋糖酐酶具有较高的耐受温度60℃，但60℃热处理30min后残余活性小于10％，存在热不稳定的问题。本发明在此野生酶的基础上通过分子改造技术获得右旋糖酐酶的系列突变体，能够进一步延长该酶的半衰期，提高该酶的热稳定性。
发明内容
本发明针对上述技术存在的不足，提供一种热稳定性高的右旋糖酐酶S326P和S326V，其中右旋糖酐酶S326P的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，右旋糖酐酶S326V的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明的再一目的是提供右旋糖酐酶S326P和右旋糖酐酶S326V的编码基因，其中右旋糖酐酶S326P的，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，右旋糖酐酶S326V的，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明的再一目的是提供包含上述右旋糖酐酶S326P和右旋糖酐酶S326V编码基因的重组载体，优选地，包含所述右旋糖酐酶S326P编码基因的载体为Aodex-pColdⅢ-S326P，包含所述右旋糖酐酶S326V编码基因的载体为Aodex-pColdⅢ-S326V。
本发明的再一目的是提供包含上述右旋糖酐酶S326P和右旋糖酐酶S326V的编码基因的重组菌株，优选地，包含所述右旋糖酐酶S326P编码基因的重组菌株为大肠杆菌Top10(DE3，Aodex-pColdⅢ-S326P)菌株，包含所述右旋糖酐酶S326V编码基因的重组菌株为大肠杆菌Top10(DE3，Aodex-pColdⅢ-S326V)菌株。
本发明的再一目的是提供制备热稳定性提高的右旋糖酐酶的方法，根据本发明的具体实施方式，对野生型右旋糖酐酶编码基因S326位点所在的氨基酸序列进行定点突变并进行表达，从而获得所述右旋糖酐酶。
具体的，对野生型右旋糖酐酶编码基因S326位点所在的氨基酸S突变为P，表达后获得右旋糖酐酶S326P，对野生型右旋糖酐酶编码基因S326位点所在的氨基酸S突变为V，表达后获得右旋糖酐酶S326V。
根据本发明的具体实施方式，制备热稳定性提高的右旋糖酐酶的方法，包括以下步骤：
1)对野生型右旋糖酐酶编码基因S326位点所在的基因序列分别设计正向和反向定点突变引物，以质粒Aodex-pColdⅢ为模板对整个质粒进行PCR扩增进行定点突变，扩增完成后加入DpnⅠ限制性内切酶对模板质粒进行消化，获得重组质粒；
2)以所述重组质粒转化至大肠杆菌Top10(DE3)菌株，获得重组菌株；
3)发酵培养所述的重组菌株，加入诱导剂表达并分离纯化右旋糖酐酶。
其中，步骤1)中右旋糖酐酶S326P的正向突变引物序列如SEQ ID NO.5所示，右旋糖酐酶S326P的反向突变引物序列如SEQ ID NO.6所示；右旋糖酐酶S326V的正向突变引物序列如SEQ ID NO.7所示，右旋糖酐酶S326P的反向突变引物序列如SEQ ID NO.8所示。
其中，步骤3)中诱导剂为IPTG，浓度为0.2mM。
其中，步骤3)中的蛋白纯化方法为：7000rpm离心10min收集菌体，将菌体悬浮于缓冲液中，用超声细胞破碎仪对菌体进行破壁，随后12000rpm离心30min，取上清液采用蛋白纯化仪进行分离纯化，纯化方式为镍柱亲和层析。
本发明的有益效果：右旋糖酐酶产业化的推动需要对该酶的热稳定性提出较高的要求，但目前右旋糖酐酶的热稳定性仍然较低，不利于产品的保存及广泛应用。本发明的突变体与野生型相比，在较大的温度范围内突变体酶对温度的耐受性均优于野生型酶，热稳定性得到了显著的提高。经过对野生酶的分子改造，其中突变体酶S326V的催化效率显著提高，突变体酶的半衰期有明显提高，这将进一步拓展该酶耐高温的特性，为后续的产品开发提供了良好的应用潜力。
相关说明
突变体酶S326P等同于右旋糖酐酶S326P。
突变体酶S326V等同于右旋糖酐酶S326V。
附图说明
图1突变体酶和野生酶的最适温度测定
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明涉及的培养基及缓冲液如下：
LB培养基：5g/L酵母粉，10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠
缓冲液A：20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，500mM氯化钠，20mM咪唑，pH 7.0
缓冲液B：20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，500mM氯化钠，500mM咪唑，pH 7.0
缓冲液C：20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，50mM氯化钠，20％甘油，pH 7.0。
实施例1突变体质粒的构建方法
含有野生型右旋糖酐酶编码基因的重组质粒Aodex-pColdⅢ(已去除信号肽序列)来源于江苏海洋大学王淑军实验室(已发表博士学位论文：海洋细菌来源右旋糖酐酶和脱氧核酶结构解析及功能研究-任伟；已发表SCI论文：见参考文献Journal of Agriculturaland Food Chemistry,2019,67(15):4355-4366.)。在该右旋糖酐酶S326位点所在的基因序列上分别设计正向和反向定点突变引物(表1)，以质粒Aodex-pColdⅢ为模板对整个质粒进行PCR扩增(体系配制见表2，反应程序见表3)。扩增完成后加入DpnⅠ限制性内切酶对模板质粒在37℃下消化2h(体系配制见表4)，随后转化至大肠杆菌Top10(DE3)菌株。挑取转化成功的菌株进行质粒提取及测序，最终选择和保存构建成功的突变体质粒。其中包含所述右旋糖酐酶S326P编码基因的载体为Aodex-pColdⅢ-S326P，包含所述右旋糖酐酶S326V编码基因的载体为Aodex-pColdⅢ-S326V；包含所述右旋糖酐酶S326P编码基因的重组菌株为大肠杆菌Top10(DE3，Aodex-pColdⅢ-S326P)菌株，包含所述右旋糖酐酶S326V编码基因的重组菌株为大肠杆菌Top10(DE3，Aodex-pColdⅢ-S326V)菌株。突变体酶S326P的基因序列为SEQIDNO.3，氨基酸序列为SEQ ID NO.1，突变体酶S326V的基因序列为SEQ ID NO.4，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
表1突变体质粒构建引物序列
表2PCR反应体系配制
表3PCR反应程序
表4DpnⅠ酶消化体系
实施例2突变体酶的表达与纯化方法
(1)诱导表达方法：将突变体质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株。将各个突变体的表达菌株置于恒温摇床中进行培养(37℃，转速180rpm)，当测得菌体OD600约为0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，置于恒温摇床中诱导表达约24h(16℃，转速110rpm)。
(2)纯化方法：离心收集菌体(7000rpm，10min)，将菌体悬浮于缓冲液A中，用超声细胞破碎仪对菌体进行破壁，随后离心(12000rpm，30min)取上清液采用AKTA蛋白纯化仪进行分离纯化，纯化方式为镍柱亲和层析。纯化步骤：①用缓冲液A对镍柱进行平衡(流速3ml/min)。②将细胞破碎后的上清液上样(流速2ml/min)。③用缓冲液B进行梯度洗脱(流速2ml/min，洗脱时间10min)，当吸光度值A280出现明显洗脱峰时，分管收集洗脱的目的蛋白。④经SDS-PAGE鉴定后，将洗脱后的蛋白用超滤离心管将原有缓冲液置换为缓冲液C使其稳定保存，以便于后续样品测定。
测试例1突变体酶的最适温度测定
突变体酶活性测定方法引用自文献(Journal of Agricultural and FoodChemistry,2019,67(15)：4355-4366)。在35℃-65℃范围内对野生型右旋糖酐酶WT、突变体酶S326P、突变体酶S326V测定了不同温度下的相对活性，以酶活性最高值设定为100％，结果如图1所示：两种突变体酶的最适温度与WT相同，均维持在55℃，但是与WT相比，在较大的温度范围内S326P与S326V对温度的耐受性均优于WT。
测试例2突变体酶的动力学常数测定方法
以右旋糖酐T-20为底物，分别配制浓度为0.047mM、0.094mM、0.188mM、0.375mM、0.75mM和1.5mM的底物溶液。每种突变体酶按照测试例1的酶活测定方法在55℃，pH 7.0环境下进行测定。根据米氏方程
采用双倒数作图法得到
其中：S为底物浓度，单位为mol·L-1；v为反应速率，vmax为最大反应速率，单位均为mol·L-1·min-1，Km为米氏常数，单位为μmol-1·L。将参加反应的酶浓度值及酶活性测定值代入上述公式，计算得到酶的Km和kcat值。
结果如表5所示：与野生型右旋糖酐酶WT相比，S326P和S326V的Km值略有升高，表明突变体酶对底物的亲和力有所下降；S326P的kcat值与WT接近，kcat/Km值为WT的72％，说明催化效率有一定程度下降；但S326V的kcat值相比于WT提高了1.62倍，kcat/Km值相比于WT提高了1.42倍，表明突变体S326V的催化效率显著提高。
表5野生型右旋糖酐酶及其突变体的动力学常数
测试例3突变体酶的半衰期测定方法
突变体酶的热稳定性采用半衰期thalf实验进行：将突变体酶与右旋糖酐底物T-20混合0-30min，按照测试例1所示的酶活测定方法进行测定，其中每处理5min后取出反应液置于冰上，测定相应时间的酶活性。在一定温度下，酶的失活动力学遵循一级反应速率：At/A0＝e-k×t(A0为酶的起始活性，At为在时间t时突变体酶的残余活性，k为酶的失活速率常数)。等式两边取对数经进一步计算得：thalf＝ln(2)/k，根据不同突变体的失活速率常数计算得到不同突变体的半衰期thalf。
本发明测定了突变体酶在60℃和65℃下的半衰期，结果如表6所示：与原有的野生型右旋糖酐酶WT相比，突变体S326P和S326V的半衰期均有不同程度的延长，其中在60℃时S326P和S326V的半衰期分别为WT的5.4倍和2.9倍，在65℃时S326P和S326V的半衰期分别为WT的2.1倍和1.5倍。结合两者的动力学常数测定值不难发现，即便S326P的催化效率下降，但是半衰期最长，仍具备了良好的热稳定性。由此可见，经过对野生酶的分子改造，突变体酶的半衰期有明显提高，这将进一步拓展该酶耐高温的特性，为后续的产品开发提供了良好的应用潜力。
表6野生型右旋糖酐酶及其突变体的半衰期thalf
Claims (10)
1.一种热稳定性高的右旋糖酐酶S326P和S326V，其中右旋糖酐酶S326P的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，右旋糖酐酶S326V的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述的右旋糖酐酶S326P和右旋糖酐酶S326V的编码基因，其特征在于，右旋糖酐酶S326P的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，右旋糖酐酶S326V的，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
3.包含权利要求1所述的右旋糖酐酶S326P和右旋糖酐酶S326V编码基因的重组载体；优选地，包含所述右旋糖酐酶S326P编码基因的载体为Aodex-pColdⅢ-S326P，包含所述右旋糖酐酶S326V编码基因的载体为Aodex-pColdⅢ-S326V。
4.包含权利要求1所述的右旋糖酐酶S326P和右旋糖酐酶S326V的编码基因的重组菌株；优选地，包含所述右旋糖酐酶S326P编码基因的重组菌株为大肠杆菌Top10(DE3，Aodex-pColdⅢ-S326P)菌株，包含所述右旋糖酐酶S326V编码基因的重组菌株为大肠杆菌Top10(DE3，Aodex-pColdⅢ-S326V)菌株。
5.制备权利要求1所述的右旋糖酐酶的方法，包括对野生型右旋糖酐酶编码基因S326位点所在的氨基酸序列进行定点突变并进行表达，获得所述右旋糖酐酶。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，对野生型右旋糖酐酶编码基因S326位点所在的氨基酸S突变为P，表达后获得右旋糖酐酶S326P，对野生型右旋糖酐酶编码基因S326位点所在的氨基酸S突变为V，表达后获得右旋糖酐酶S326V。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)对野生型右旋糖酐酶编码基因S326位点所在的基因序列分别设计正向和反向定点突变引物，以质粒Aodex-pColdⅢ为模板对整个质粒进行PCR扩增进行定点突变，扩增完成后加入DpnⅠ限制性内切酶对模板质粒进行消化，获得重组质粒；
2)以所述重组质粒转化至大肠杆菌Top10(DE3)菌株，获得重组菌株；
3)发酵培养所述的重组菌株，加入诱导剂表达并分离纯化右旋糖酐酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1)中右旋糖酐酶S326P的正向突变引物序列如SEQ ID NO.5所示，右旋糖酐酶S326P的反向突变引物序列如SEQ ID NO.6所示；右旋糖酐酶S326V的正向突变引物序列如SEQ ID NO.7所示，右旋糖酐酶S326P的反向突变引物序列如SEQ ID NO.8所示。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤3)中诱导剂为IPTG，浓度为0.2mM。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤3)中的蛋白纯化方法为：7000rpm离心10min收集菌体，将菌体悬浮于缓冲液中，用超声细胞破碎仪对菌体进行破壁，随后12000rpm离心30min，取上清液采用蛋白纯化仪进行分离纯化，纯化方式为镍柱亲和层析。
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