CN115770210A - 一种用于化妆品的大米紫甘薯复合发酵滤液及其制备方法与应用 - Google Patents

一种用于化妆品的大米紫甘薯复合发酵滤液及其制备方法与应用 Download PDF

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杜晶
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Abstract

本发明公开一种用于化妆品的大米紫甘薯复合发酵滤液及其制备方法与应用，属于生物发酵技术领域。本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中植物提取工艺众多，难于筛选出便于从大米和紫甘薯中提取可用于化妆品领域活性成分的方法的缺陷。本发明提供一种用于化妆品的大米紫甘薯复合发酵滤液的制备方法：取由蒸熟的糯米、紫薯和水混合后作为发酵底物，接种根霉菌、酵母菌和乳酸菌中的任意一种或多种进行发酵，然后经过灭菌、过滤获得大米紫甘薯复合发酵滤液。大米紫甘薯复合发酵滤液对皮肤无刺激性，具有抗氧化、清除自由基的作用可被广泛应用于化妆品领域。

Description

一种用于化妆品的大米紫甘薯复合发酵滤液及其制备方法与 应用
技术领域
本公开属于生物发酵技术领域，具体涉及一种用于化妆品的大米紫甘薯复合发酵滤液及其制备方法与应用。
背景技术
大米是稻谷经清理、砻谷、碾米和成品整理等工序后制成的成品，大米含有稻米中近64％的营养物质和90％以上的人体所需的营养元素，同时是中国大部分地区人民的主要食品。大米还具有护肤用途功效，以大米为底物，接种有益微生物进行生物发酵而获得的发酵滤液，富含核酸、蛋白质、活性肽(谷胱甘肽等)和多种游离氨基酸，性质温和安全。应用于护肤，具有较强的润白功效，并可补充肌肤所缺失水分，使肌肤光滑细腻，充满弹性。随着稻米栽培业迅速发展及应用范围拓宽，对大米营养成分及在医疗保健作用方面研究也逐步深入。
紫甘薯又称紫薯，是旋花科甘薯种中的一个栽培种，是多年生草本块根植物。紫薯富含多种营养物质，淀粉、膳食纤维，粗蛋白,含量均高于普通红薯。紫薯富含各类微量元素，相比小麦等粮食作物，其活性微量元素硒、和必需微量元素钙、锌的含量均高出十倍。紫甘薯薯皮和肉呈紫色至深紫色，除具有普通甘薯的营养成分外，最高价值在于其富含大量的酰化花青素。花青素是一种纯天然的，也是最有效的抗氧化剂，在欧洲，人们称它为可以口服的“皮肤化妆品”。花青素就如同是抵抗自由基的卫士，不仅能够消除自由基，而且还能够改善肌肤的纹路，淡化皮肤细纹；花青素对弹性蛋白酶和胶原蛋白酶有抑制效果，这样就能使皮肤变得光滑还富有弹性；此外，花青素还能够有效阻止紫外线，避免皮肤细胞受到紫外线的射伤。
由于化妆品领域常用的活性物质提取方法有水提取法、有机溶剂提取、超声波提取法、微波提取法、超临界流体萃取法和微生物发酵法等多种，其中，微生物发酵法不需要添加其它的催化剂，只需先培养出大量的微生物菌种，然后加入底物进行能实现的反应，所以微生物法比化学试剂的反应法更专一、更有效；反应条件温和，微生物发酵一般都是在常温和pH为7左右的条件下进行催化反应，不需要高温、高压等苛刻的条件；设备的运行操作也比较简单、安全，产生的公害较少，一般不会造成环境污染，后处理也相对简单；筛选不同的菌种与优化反应条件可提高转化率，对同一底物进行微生物转化的菌种可能有多种，通过筛选选出最佳菌种，可以保证较高的转化率。微生物发酵技术在天然活性物质的研究开发中发挥着越来越重要的作用。发酵技术在护肤品中应用已有大量报道，最著名的例子就是SK II神仙水。目前化妆品中植物提取工艺众多，难于筛选出便于从作物中提取可用于化妆品领域活性成分的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中植物提取工艺众多，难于筛选出便于从大米和紫甘薯中提取可用于化妆品领域活性成分的方法等缺陷，提供一种复合发酵滤液及其制备方法。本发明制得的复合发酵滤液具有良好的安全性和抗氧化功效，还具有良好的稳定性，对皮肤无刺激性，可被广泛应用于化妆品领域。
本发明提供一种用于化妆品的大米紫甘薯复合发酵滤液的制备方法，取由蒸熟的糯米、紫薯和水混合后作为发酵底物，接种根霉菌、酵母菌和乳酸菌中的任意一种或多种进行发酵，然后经过灭菌、过滤获得大米紫甘薯复合发酵滤液。
在一种实施方式中，发酵底物包括：蒸熟的糯米与水的质量比为(1-5):10，蒸熟的紫甘薯和水的质量比为(1-3):10。
在一种实施方式中，所述发酵的方法如下：
(1)向权利要求1中所述的发酵底物接种根霉菌进行第一次发酵培养后，加入无菌水获得第一次发酵液；
(2)向步骤(1)获得第一次发酵液中接种酵母菌进行第二次发酵获得第二次发酵液；
(3)向第二次发酵液中接种乳酸菌进行第三次发酵培养获得大米紫甘薯复合发酵滤液。
在一种实施方式中，步骤(1)中所述的根霉菌为以下菌种中的任意一种或两种：米根霉(Rhizopus oryzae)和少根根霉(Rhizopus arrhizus)；
步骤(2)中所述酵母菌为以下菌种中的一种或两种：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)；
步骤(3)中所述乳酸菌为以下菌种中的任意一种或两种：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。
在一种实施方式中，步骤(1)中根霉菌质量/发酵底物的质量比为1％-10％；接种的根霉菌的孢子浓度为105-108CFU/mL。
在一种实施方式中，步骤(2)中酵母菌质量/发酵底物的质量比为1％-10％；接种的酵母菌的浓度为105-108CFU/mL。
在一种实施方式中，步骤(3)中乳酸菌质量/所述发酵底物的质量比为1％-10％；用于接种的乳酸菌菌液的浓度为105-108CFU/mL。
在一种实施方式中，所述发酵，采用根霉菌发酵，则发酵培养的温度为25℃-30℃，时间为30-50h；采用酵母菌则发酵培养的温度为28℃-32℃，时间为20-30h；采用乳酸菌，则发酵培养的温度为35-40℃，时间为5-12h。
本发明提供上述的制备方法获得的大米紫甘薯复合发酵滤液。
本发明提供上述的制备方法或上述的大米紫甘薯复合发酵滤液在制备化妆品中的应用。
有益效果：本发明提供了一种大米紫甘薯复合发酵滤液制备方法，该方法选择合适的菌种对原料进行发酵而得，产品更加天然，且不需要添加酶等外来物质，不仅节约生产成本，而且最大化的简化了生产步骤，使该发酵技术能够实现大量生产、工业化生产，并能够充分保证产品质量的稳定性。制得的大米紫甘薯复合发酵滤液含有多糖、多肽等活性物质，且花色苷含量高，具有抗氧化、清除自由基的作用，可以添加到包括但是不限于：面膜、精华液、爽肤水、乳液等化妆品中。
利用大米发酵液所具有的美白功效和紫甘薯花青素所具有的的清除自由基功效。通过微生物发酵温和提取花青素，同时增加发酵滤液中低分子量活性物质含量，便于皮肤吸收。使用菌种有先后顺序，不能改变，根霉能够利用淀粉产糖，后续酵母及乳酸菌不能利用淀粉，只能利用糖。如果不优先接入根霉，其它微生物无法生长。
附图说明
图1为大米紫甘薯复合发酵滤液样品实物图。
图2为不同浓度大米紫甘薯复合发酵滤液清除DPPH自由基结果示意图。
图3为大米紫甘薯复合发酵滤液的多肽分子量分布图。
具体实施方式
原料说明：
下述实施例中所用的糯米，紫甘薯等实验材料、培养基试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明涉及的检测方法如下：
总氮含量检测采用凯氏定氮法参照GB5009.5-2016；总酸、总糖、总醇含量检测方法参照GB/T13662-2018。pH示差法测定花色苷含量参照：李甜,王越,安家彦.紫薯酒发酵过程颜色变化规律及颜色特征[J].食品与发酵工业,2016,42(01):48-52。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS液体培养基(g/L)：10g/L蛋白胨，10g/L牛肉膏，5g/L酵母粉，20g/L葡萄糖，5g/L乙酸钠，2g/L柠檬酸铵，2g/L磷酸氢二钾，1mL/L吐温-80，0.58g/L七水合硫酸镁，0.25g/L一水合硫酸锰。
MRS固体培养基(g/L)：10g/L蛋白胨，10g/L牛肉膏，5g/L酵母粉，20g/L葡萄糖，5g/L乙酸钠，2g/L柠檬酸铵，2g/L磷酸氢二钾，1mL/L吐温-80，0.58g/L七水合硫酸镁，0.25g/L一水合硫酸锰，20g/L琼脂。
YPD液体培养基(g/L)：10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，20g/L葡萄糖。
YPD固体培养基(g/L)：10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，20g/L葡萄糖，20g/L琼脂。
下述实施例中的菌种，根霉菌、酵母菌、乳酸菌等，均可从CGMCC(菌种购买网址https://cgmcc.net/)和CICC(菌种购买网址：http://m.china-cicc.org/)购买得到。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，保藏编号为CICC 1299；扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)保藏编号为CICC 31025；
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保藏编号为CICC 21790；类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，保藏编号为CICC 20284；
米根霉(Rhizopus oryzae)，保藏编号为CICC 3010；少根根霉(Rhizopusarrhizus)，保藏编号为CGMCC No.3.866。
实施例1、一种大米紫甘薯复合发酵滤液制备方法
1.菌种制备：
根霉菌种子液制备：将保藏编号为CGMCC No.3.866的少根根霉菌接种至YPD固体培养基平板上，30℃培养3-4天待平板菌丝表面长满黑色孢子，在超净台上使用无菌水冲洗平板，使用灭菌擦镜纸过滤获得孢子悬浮液，用无菌水调整孢子液浓度为107CFU/mL，即为根霉菌种子液。
酵母菌种子液制备：将保藏编号为CICC 1299的酿酒酵母菌划线接种至YPD固体培养基平板上，30℃培养48小时活化，挑取单菌落接种至50mLYPD液体培养基，30℃、150rpm培养24小时，用无菌水调整细胞浓度为107CFU/mL，得到酵母菌种子液。
乳酸菌种子液制备：将保藏编号为CICC 21790的植物乳酸菌划线接种至MRS固体培养基平板上，37℃培养48小时活化，挑取单菌落接种至50mLMRS液体培养基，37℃静置培养12小时，用无菌水调整细胞浓度为107CFU/mL，得到乳酸菌种子液。
2.发酵底物配制：
取糯米500克，新鲜紫甘薯300克切块1-2㎝，加水1000克(糯米的质量/水的质量＝500/1000＝5:10；紫甘薯的质量/水的质量＝300/1000＝3:10)，浸泡30分钟后，放入带盖不锈钢盆，放入蒸饭机蒸20-30分钟至米粒无夹心，冷却至室温即为发酵底物。
3.大米紫甘薯复合发酵滤液的获得：
将20mL步骤1中制备的根霉菌种子液接种至步骤2配制的发酵底物中(根霉菌菌液质量/发酵底物的质量＝20/2000＝1:100)，搅拌均匀，得到发酵体系1，将发酵体系1放入30℃培养箱静置培养48小时后，加入2000克无菌水(这个步骤加水是必须的，否则后续添加微生物无法生长)，同时接入40mL步骤1中制备的酵母菌种子液(酵母菌菌液质量/发酵底物的质量比＝40/4000＝1:100)，搅拌均匀得到发酵体系2，将发酵体系2继续放入30℃培养箱静置培养48小时后，接入40mL步骤1中制备的乳酸菌种子液(乳酸菌菌液质量/发酵底物的质量比＝40/4000＝1:100)，搅拌均匀得到发酵体系3，将发酵体系3放入37℃培养箱静置培养12小时后得到发酵产物。使用落地离心机将发酵产物在9000g离心力下离心10min，弃沉淀，收集上清液，于65℃灭菌20min，添加防腐剂(0.5％戊二醇和0.4％对羟基苯乙酮)，冷却后使用0.1μm滤膜过滤，得到的发酵产物即为大米紫甘薯复合发酵滤液。
结果显示：制备所得的大米紫甘薯复合发酵滤液澄清透明、颜色为樱桃红色，样品见图1。pH值4.2，可溶性固含物含量1.5-5.0％，菌落总数小于50CFU/ml，无致病菌检出。根据化妆品卫生标准GB7916-87，化妆品细菌总数不高于1000CFU/ml，所以此发酵提取物符合化妆品质量要求。
对该发酵滤液进行成分分析，本发明制得的大米紫甘薯复合发酵滤液的总氮0.82g/L、总糖4.3g/L、总酸6.2g/L、醇含量5％(体积比)、花色苷138mg/L。
实施例2、大米紫甘薯复合发酵滤液在作为化妆品中的应用
一、大米紫甘薯复合发酵滤液的安全性检测
人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本公开根据《化妆品安全技术规范》(2022)对实施例1获得的大米紫甘薯复合发酵滤液进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其潜在皮肤刺激性进行评估。
1、试验对象：
严格按照《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》要求，选择受试对象，皮肤的待测部位出现瘢痕、鲜红斑痣等影响结果判定的受试者、体质高度敏感者均不能参与试验。本试验选择合适的志愿者30人作为受试对象，年龄范围在18-60岁随机选择。
2、试验方法：
将液体样品(100％大米紫甘薯复合发酵滤液，无稀释)0.02mL滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。每个样品均设置空白对照(水)，在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂蒸馏水。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后(等待压痕消失)，24h和48h观察皮肤的反应。人体斑贴试验皮肤不良反应分级标准参见表1。
表1人体试用试验皮肤反应分级标准
皮肤反应 分级
无反应 0
微弱红斑 1
红斑、浸润、丘疹 2
红斑、水肿、丘疹、水疱 3
红斑、水肿、大疱 4
3、试验结果：
见表2。从表中可以看出：使用实施例1得到的大米紫甘薯复合发酵滤液后都是阴性反应，说明本发明提供的大米紫甘薯复合发酵滤液具有安全性，不会给人体带来不良反应。
表2、实施例1获得的大米紫甘薯复合发酵滤液的斑贴试验
Figure BDA0003977001090000061
二、大米紫甘薯复合发酵滤液的抗氧化性能检测
DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，DPPH的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。
DPPH自由基清除实验的具体实验步骤为：以实施例1所得大米紫甘薯复合发酵滤液作为待测物；用无水乙醇配置1×10 -4mol/L的DPPH溶液，取1mL的待测物与等体积的DPPH溶液混匀(A1管)；取1mL蒸馏水与等体积的DPPH溶液混匀(A2管)；取1mL蒸馏水与等体积待测物混匀(A3管)；反应30min后，分别在517nm下测A1，A2，A3管吸光度值。
清除率计算公式为：清除率(％)＝[(A2+A3)-A1]/A2
测定不同浓度大米紫甘薯复合发酵滤液物对DPPH自由基清除作用，作附图2。
由图可知，实施例1所得大米紫甘薯复合发酵滤液对DPPH清除作用的IC50＝5％，说明大米紫甘薯复合发酵滤具有较强的抗氧化能力，可清除自由基，促进细胞代谢，增强细胞活力，从而延缓细胞老化，发挥其抗衰老的作用。
三、大米紫甘薯复合发酵滤液的多肽分子量分布
分子量大小是检验产品是否能够有效进行皮肤渗透的重要因素。本发明通过高效液相色谱(HPLC)测定实施例1制备的大米紫甘薯复合发酵滤液的多肽分子量大小分布。具体试验如下：
1、试验方法
(1)仪器：Waters2695高效液相色谱仪(配2487紫外检测器和Empower工作软件)
(2)色谱柱：TsKgel 2000SWXL 300mm×7.8mm。
(3)流动相：乙腈:水:三氟乙酸＝40:60:0.1(v/v/v)。
(4)色谱条件：检测波长：UV 220nm；流速：0.5mL/min；柱温：30℃。
(5)样品制备：取实施例1所得大米紫甘薯复合发酵滤液100mg左右于10mL容量瓶，用流动相稀释至刻度，超声5min，再用微孔膜(0.45μm)过滤后供进样。
(6)分子量校正曲线标准品(均购于Sigma公司)：细胞色素C(Mw12384)；抑肽酶(Mw6500)；杆菌肽(Mw1422)；乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(Mw451)；乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(Mw189)。
2、将已知分子量的标准品通过高效液相色谱仪进行HPLC分析，绘制分子量对数与洗脱时间的标准曲线。根据凝胶柱渗透层析原理，多肽分子量大的物质先被洗脱出来，洗脱时间与分子量的对数呈线性关系。再按照同样的方法将实施例1中的大米紫甘薯复合发酵滤液进行HPLC分析，得到相应峰的洗脱时间，将洗脱时间代入标准曲线，即可得到实施例1制备的大米紫甘薯复合发酵滤液的多肽分子量分布，见表3。
表3大米紫甘薯复合发酵滤液的多肽分子量大小分布
Figure BDA0003977001090000071
Figure BDA0003977001090000081
一般认为肽的分子量段在3000-5000Da的都属于大肽，分子量段在1000-3000Da的为多肽，分子量段在1000Da以下的均属于小肽(也叫寡肽)，分子量段在180-500Da活性肽成分吸收最佳，与小肽相比，其价值大有不同。小肽的生理功能比大肽多数十倍。分子量越小，吸收越好，活性越强。实施例1制备的大米紫甘薯复合发酵滤液的HPLC图谱如图3所示：从表3及图3中可以看出，大米紫甘薯复合发酵滤液中肽分子量在1000Da以下占比97.05％。分子量500Da以下占比77.14％。所以大米紫甘薯复合发酵滤液中存在大量的活性肽。
四、大米紫甘薯复合发酵滤液的美白功效分析
酪氨酸酶是黑色素生成过程中的关键酶和限速酶，它控制着黑色素的形成过程,其活性程度对黑色素的沉积起主要作用。目前市场上的许多美白产品都是以抑制酪氨酸酶达到美白功效,故对酪氨酸酶抑制作用的强弱是评价化妆品美白能力的主要指标。通过测定样品对酪氨酸酶的影响来评价样品的美白功能，具体方法如下：按表4配制反应溶液：
表4、溶液配制列表
反应成分(mL) C<sub>1</sub> C<sub>2</sub> T<sub>1</sub> T<sub>2</sub>
样品 0 0 2 2
磷酸盐缓冲液 4 5 2 3
L-酪氨酸 2 2 2 2
酪氨酸酶 1 0 1 0
总体积 7 7 7 7
注：磷酸盐缓冲液为25mM(pH 6.8)，酪氨酸酶酶活为100U/mL。样品为实施例1所得大米紫甘薯复合发酵滤液。
(1)C2管配好摇匀后，在37℃水浴锅中水浴加热10min，波长475nm下调零。
(2)C1管溶液配好摇匀，37℃水浴10min后，加酪氨酸酶1mL，继续水浴10分钟，测定C1吸光度值。
(3)按(1)(2)同样方法，以T2调零测定T1吸光度值。
(4)计算样品对酪氨酸酶的活性抑制率T(％)：T(％)＝(C1-T1)/C1×100％
实验证明，本发明实施例1所得大米紫甘薯复合发酵滤液对酪氨酸酶活性的抑制率为82.1％，即产品具有较强的美白功效。

Claims (10)

1.一种用于化妆品的大米紫甘薯复合发酵滤液的制备方法，其特征在于，取由蒸熟的糯米、紫薯和水混合后作为发酵底物，接种根霉菌、酵母菌和乳酸菌中的任意一种或多种进行发酵，然后经过灭菌、过滤获得大米紫甘薯复合发酵滤液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，发酵底物包括：蒸熟的糯米与水的质量比为(1-5):10，蒸熟的紫甘薯和水的质量比为(1-3):10。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的方法如下：
(1)向权利要求1中所述的发酵底物接种根霉菌进行第一次发酵培养后，加入无菌水获得第一次发酵液；
(2)向步骤(1)获得第一次发酵液中接种酵母菌进行第二次发酵获得第二次发酵液；
(3)向第二次发酵液中接种乳酸菌进行第三次发酵培养获得大米紫甘薯复合发酵滤液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的根霉菌为以下菌种中的任意一种或两种：米根霉(Rhizopus oryzae)和少根根霉(Rhizopus arrhizus)；
步骤(2)中所述酵母菌为以下菌种中的一种或两种：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)；
步骤(3)中所述乳酸菌为以下菌种中的任意一种或两种：植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中根霉菌质量/发酵底物的质量比为1％-10％；接种的根霉菌的孢子浓度为105-108CFU/mL。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中酵母菌质量/发酵底物的质量比为1％-10％；接种的酵母菌的浓度为105-108CFU/mL。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中乳酸菌质量/所述发酵底物的质量比为1％-10％；用于接种的乳酸菌菌液的浓度为105-108CFU/mL。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵，采用根霉菌发酵，则发酵培养的温度为25℃-30℃，时间为30-50h；采用酵母菌则发酵培养的温度为28℃-32℃，时间为20-30h；采用乳酸菌，则发酵培养的温度为35-40℃，时间为5-12h。
9.权利要求1-8任一项所述的制备方法获得的大米紫甘薯复合发酵滤液。
10.权利要求1-8任一项所述的制备方法或权利要求9所述的大米紫甘薯复合发酵滤液在制备化妆品中的应用。
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