CN115754305A - 一种用于流式检测的细胞固定破膜剂及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及流式细胞术领域，具体涉及一种用于流式检测的细胞固定破膜剂及其使用方法。所述细胞固定破膜剂的成分包括：多聚甲醛、甲醇、破膜剂、胎牛血清、磷酸盐缓冲液，本发明通过合理适当的调整甲醇与多聚甲醛的浓度配比，可以达到优势互补的作用，减小对细胞形态及细胞散射特性的改变，细胞固定破膜后，固定效果好，细胞抗原活性较好，且可以实现固定破膜一步完成，操作简便。

Description

一种用于流式检测的细胞固定破膜剂及其使用方法

技术领域

本发明涉及流式细胞术领域，具体涉及一种用于流式检测的细胞固定破膜剂及其使用方法。

背景技术

随着流式细胞检测技术的广泛应用，以及胞内染色技术的成熟，结合细胞内染色技术可用流式检测多种胞内蛋白以及细胞因子，流式细胞技术能够对细胞进行多参数检测，具有速度快、精度高、准确性好的特点，通过流式细胞技术检测多种胞内蛋白以及细胞因子得到广泛应用。

实验室在检测细胞因子、细胞器和胞浆转录因子等胞浆蛋白以及转录因子、DNA结合蛋白、修饰蛋白等核蛋白时，需要先对细胞形态以及胞内蛋白进行固定。固定剂能够较好的维持细胞固有形态和形态，防止细胞自溶，以避免细胞透膜时发生破裂，使胞内蛋白凝固，维持细胞抗原活性，使抗原不发生弥散。并且对具有传染性的标本能够杀死病原菌，从而起到防止疾病传播的作用。

固定细胞时应尽可能保证样本新鲜，保证加入足量的固剂，固定时间不宜过长。不同种类的固定剂对细胞的穿透力不同，可能导致多糖、蛋白质、核酸、脂类和低分子质量物质等不同程度的丢失，由于固定剂因素会导致组织细胞形态的改变，以及影响抗体的荧光强度，所以需要选择适合的固定剂，良好的固定剂可使组织固定均匀、收缩小、结构清晰，利于保存组织细胞的抗原性。常见的固定剂主要包含醛类、氧化剂类、蛋白变性类等类型。其中甲醛是最常用的固定剂之一，甲醛具有对组织细胞损伤较少，能较好保存固有物质，对细胞穿透力较强，固定均匀，成本低等有点，常用于多种混合固定剂的配置。

在细胞正常生理状态下，荧光标记的抗体无法通过完整的细胞膜进入胞内与抗原结合，需要在染色前先加入破膜剂，利用破膜剂在细胞膜上打孔，以便抗体进入胞内。破膜不足以及破膜过度都会影响荧光染色效果和结果分析。常见的破膜剂包括皂苷、TritonX-100、Twe en-20、有机溶剂等。皂素相较其他破膜剂更温和，但其破膜效果是可逆的，且无法破核膜，若经过后期多步洗涤操作，容易导致破膜失败。TritonX-100、Tween-20不仅可以破坏所有脂质层，也可破核膜。有机溶剂可实现固定和破膜，如甲醇、乙醇、丙酮等。

流式检测时固定细胞的方法通常为向细胞样品管中加入适量的4％多聚甲醛先进行固定，固定完成后使用洗涤液进行多次洗涤，将固定剂彻底洗去，再进行破膜，多次洗涤，抗体孵育，上机检测样品，实验步骤繁琐。多聚甲醛固定细胞时起主要作用的是甲醛单体，甲醛中的醛基能与蛋白质中的氨基基团之间形成亚甲基桥和羟甲基衍生物，使甲醛与蛋白质末端基团之前形成交联链，从而导致蛋白质沉淀。这种蛋白质变性能够固定结构蛋白，抑制内源性酶，防止细胞的裂解和组织的自溶，较好地保护了组织细胞的形态结构。但固定后往往会影响细胞形态，改变细胞的散射特性，导致细胞分群变化较大，并且使用的多聚甲醛浓度较高，毒性较大，对实验人员本身会造成一定损伤。

发明内容

为了解决传统的流式细胞检测胞内蛋白或细胞因子的方法样品制备步骤繁琐，且细胞固定破膜后，会导致细胞形态大小以及散射特性的变化较大，导致细胞分群的改变的技术问题，本发明提供了一种用于流式检测的细胞固定破膜剂。

具体的，本发明的技术方案如下：

一种用于流式检测的细胞固定破膜剂，所述试剂的成分和含量如下：

进一步的，所述破膜剂为TritonX-100、皂苷、Tween-20中的一种。

一种用于流式细胞检测的细胞固定破膜剂的使用方法，步骤如下：

S1：收取细胞样品，取10⁶-10⁷个细胞加入500μL固定破膜剂，固定透化10min；

S2：对固定透化后的细胞进行离心，弃去上清，使用洗涤液进行重悬，再次离心，弃去上清，重复一次；

S3：按流式方法对细胞进行染色，上机检测。

进一步的，所述细胞为人外周血细胞。

进一步的，所述细胞固定破膜剂pH为7.0-7.4。

进一步的，所述细胞固定破膜剂使用前过滤除菌。

本发明的有益效果在于：

1)固定后细胞形态大小及粒度变化较小：本发明通过合理适当的调整甲醇与多聚甲醛的浓度配比，可以达到优势互补的作用，减小对细胞形态及细胞散射特性的改变。甲醇，对组织渗透性强，能迅速沉淀清蛋白、球蛋白和核蛋白，可以固定核染色质及其部分内容物、核膜、细胞质及胶质等并且基本能保持细胞的正常形态。多聚甲醛是最常用的固定剂之一，具有穿透力强，固定均匀，抑制内源性酶，防止细胞的裂解和组织的自溶，较好地保护了组织细胞的形态结构等优势，并且不会引起细胞收缩，其缺点是无法沉淀核蛋白。二者的混合固定剂能弥补单独使用多聚甲醛引起的细胞大小及粒度的改变。

2)pH值稳定，固定效果好：本发明通过使用pH 7.0-7.4的磷酸盐缓冲溶液作为溶剂，使固定破膜剂成为pH值稳定的中性溶液。固定剂的pH是影响固定效果的关键因素之一，氨基在酸性环境下不与水合甲醛发生反应，使细胞结构发生改变，导致细胞变形等问题；而在碱性环境下，细胞易出现核溶解，抗原物质被破坏等现象。甲醛长久存放容易导致氧化产生甲酸，从而影响pH值，使溶液呈酸性。因此使用pH值为7.0-7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液作为溶剂，以维持固定剂的pH值的稳定性。

3)毒性低，安全环保：本发明降低了甲醇与多聚甲醛的使用浓度，在仍可达到理想的固定效果的基础上，进一步减小对操作人员的毒性。

4)细胞抗原活性较好：本发明添加一定比例的胎牛血清，为维持细胞活力提供营养物质，并起到酸碱缓冲液的作用，在一定程度上保护细胞抗原活性。

5)固定破膜一步完成，操作简便：本发明提出了对细胞同时进行固定和破膜的方法，传统的流式检测胞内蛋白或胞内因子的方法，步骤繁琐，耗时较长。该方法在保证实验效果的前提下，将固定、破膜一步完成，操作简便，缩短实验时间。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例1、实施例2与对照组的细胞分群情况；

图2为实施例1、实施例2与对照组检测PBMC在PMA、离子霉素刺激下，细胞因子IFN-γ的表达情况。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1

本发明提供一种用于流式检测的细胞固定破膜剂，所述试剂的成分和含量如下：

实施例2

本发明提供一种用于流式检测的细胞固定破膜剂，所述试剂的成分和含量如下：

实施例1、实施例2的差异在于配制比例的不同。

实施例3

用于流式细胞检测的细胞固定破膜剂的使用方法为

一、收取细胞样品，取10⁶-10⁷个细胞加入500μL固定破膜剂，固定透化10min。

二、对固定透化后的细胞进行离心，弃去上清，使用洗涤液进行重悬，再次离心，弃去上清，重复一次。

三、按照流式方法对细胞进行染色，上机检测。

对照组

采用的固定剂为4％多聚甲醛，pH 7.2-7.4；破膜剂为0.1％Trito nX-100。

稳定性试验：

实施例1的试剂进行开瓶后pH值稳定性及外观形态变化的检测。结果如下表所示：

表1：自配试剂理化性质(pH)和外观形态变化情况。

采用实施例1、实施例2、和对照组的试剂对刺激后的人外周血单个核细胞(PBMC)进行固定破膜，抗体染色，检测细胞相同抗原表达率以及细胞分群差异。

详细操作如下：

取人的抗凝全血，密度梯度离心法分离出人外周血单个核细胞，并调整每孔细胞的密度为1×10^6-7/mL，加入PMA和离子霉素(终浓度分别为25μg/L和1mg/L)，同时加入10mg/L蛋白转运抑制剂BFA，在37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养5h，收集培养后的PBMC，用PBS洗涤两次，每管加入固定破膜剂500μL，固定透化10min。对固定透化后的细胞进行离心，弃去上清，使用洗涤液进行重悬，再次离心，弃去上清，重复一次。按照流式方法对细胞进行CD45/CD8/IFN-γ染色，上机检测。

采用实施例1、实施例2、和对照组的试剂对细胞样品进行处理，检测细胞大小及粒度的差异，结果如图1所示；使用实施例1与实施例2所述的试剂固定细胞，其淋巴细胞形态大小、粒度受对照组影响较对照组小，细胞团更密集。实施例1与实施例2配制所得的试剂对细胞固定破膜后，其淋巴细胞分群类似。

采用实施例1、实施例2、和对照组的试剂对细胞样品进行处理，检测细胞因子的表达，结果如图2所示；使用实施例1与实施例2所述的试剂同时对细胞进行固定破膜，与使用对照组先进行固定再破膜，检测到细胞因子表达率无明显差异。实施例1检测到的表达细胞因子IFN-γ的细胞占CD8阳性细胞总量的28.91％，实施例2检测到的表达细胞因子IFN-γ的细胞占CD8阳性细胞总量的25.03％，对照组检测到的表达细胞因子IFN-γ的细胞占CD8阳性细胞总量的21.48％。实施例1与实施例2配制所得的试剂对细胞固定破膜后，其检测到细胞因子表达率较为一致，无显著差异。

Claims (6)

1.一种用于流式细胞检测的细胞固定破膜剂，所述细胞固定破膜剂的成分和含量如下：

2.根据权利要求1所述的一种用于流式细胞检测的细胞固定破膜剂，其特征在于，所述破膜剂为TritonX-100、皂苷、Tween-20中的一种。

3.权利要求1所述的一种用于流式细胞检测的细胞固定破膜剂的使用方法，其特征在于，使用方法如下：

S1：收取细胞样品，取10⁶-10⁷个细胞加入500μL固定破膜剂，固定透化10min；

S2：对固定透化后的细胞进行离心，弃去上清，使用洗涤液进行重悬，再次离心，弃去上清，重复一次；

S3：按流式方法对细胞进行染色，上机检测。

4.根据权利要求1所述的一种用于流式细胞检测的细胞固定破膜剂，其特征在于，细胞为人外周血细胞。

5.根据权利要求1所述的一种用于流式细胞检测的细胞固定破膜剂，其特征在于，所述细胞固定破膜剂的pH为7.0-7.4。

6.根据权利要求1所述的一种用于流式细胞检测的细胞固定破膜剂，其特征在于，所述细胞固定破膜剂使用前过滤除菌。

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