CN115737910A - 一种促进软骨高效分泌粘多糖的硫酸软骨素/甘油二酯纳米乳液制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进软骨高效分泌粘多糖的硫酸软骨素/甘油二酯纳米乳液制备方法。制备出硫酸软骨素和甘油二酯的纳米乳液，可刺激软骨细胞高效分泌粘多糖。以硫酸软骨素为原料与甘油二酯混合进行修饰得到纳米乳液，通过明显促进软骨分泌粘多糖以解决传统软骨修复材料韧性差、支撑性能低、在植入后无法及时有效地发挥承重/缓冲等难题，为其在软骨组织工程中应用提供实验基础。
Description
技术领域
本发明属于生物组织工程技术领域，具体涉及一种促进软骨高效分泌粘多糖的硫酸软骨素/甘油二酯纳米乳液的制备方法。
背景技术
硫酸软骨素不仅能够抑制关节炎的发生，而且能够缓解骨关节炎带来的关节疼痛、僵硬和肿胀，能从根本上改善关节问题，具有止痛等功效[Raynauld J P, Pelletier JP, Abram F, et al. Long-term effects of glucosamine/chondroitin sulfate onthe progression of structural changes in knee osteoarthritis: 6-year follow-up data from the osteoarthritis initiative[J]. Arthritis Care & Research,2016, 68(10): 1560-1566]。同时，硫酸软骨素能够抑制癌症，促进软骨再生以及促进软骨分泌粘多糖[Jin R, Moreira Teixeira L S, Dijkstra P J, et al. Chondrogenesisin injectable enzymatically crosslinked heparin/dextran hydrogels [J].Journal of Controlled Release, 2011, 152:186- 195.]。
甘油二酯（Diacylglycerol，DAG）包括1,3-DAG和1,2-DAG两种异构体。Maki等（Maki K C, Davidson M H, Tsushima R, et al. Consumption of diacylglycerol oilas part of a reduced-energy diet enhances loss of body weight and fat incomparison with consumption of a triacylglycerol control oil[J]. AmericanJournal of Clinical Nutrition, 2002, 76(3): 1230-1236.）发现长期食用DAG，可显着抑制腹部和内脏脂肪堆积，减少TAG在人体内的积累。最近研究表明甘油二酯是患有轻度认知障碍（MCI）的患者中的免疫激活的生物标志物[Paul L W, John E C, Randall L W.Diacylglycerols as biomarkers of sustained immune activation inProteinopathies associated with dementia[J]. Clinica Chimica Acta,2018,476:107–110.]。
陈峰.仿生注射性水凝胶的制备及在软骨组织工程中的应用研究[D].上海交通大学,2017.]以软骨细胞外基质（ECM）中分子(透明质酸和硫酸软骨素)和FDA认证的天然多糖(普兰多糖和果胶)为基质，交联形成生物相容性良好的天然多糖仿生注射性水凝胶来促进软骨再生。软骨粘多糖对辐照损伤雄性小鼠具有保护作用，能够抑制肿瘤生长，能够降血脂[蒋定文,沈先荣,栾洁,陈伟,杨翊方.鲨鱼软骨粘多糖对辐照损伤雄性小鼠的保护作用[J].解放军预防医学杂志,2014,32(05):395-398]。
目前硫酸软骨素和甘油二酯复合的作用还未见报道。
发明内容
本发明旨在提供一种促进软骨高效分泌粘多糖的硫酸软骨素/甘油二酯纳米乳液制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种促进软骨高效分泌多糖的硫酸软骨素/甘油二酯纳米乳液制备方法，包括以下步骤：
S1、将一定质量比的硫酸软骨素和甘油二酯(CS+DAG)在在60℃下搅拌 2 h 至混合均匀，得到油相。
S2、将茶皂甙在60℃下溶于蒸馏水中搅拌至完全溶解，得到水相。
S3、将步骤S1的油相等体积且缓慢均匀加入步骤S2的水相中，在60℃下用高剪切混合器处理，混合均匀后得到粗乳液。
S4、将步骤S3的粗乳液在60℃、高压微射流作用下均质 2 次，收集得到纳米乳液，冷却后于 4 ℃密封冷藏。
S5、选取无特定病原体( SPF) 级成年雄性 SD 大鼠 1只，将其麻醉、处死，无菌操作摘取膝关节软骨。
S6、将步骤S5的关节软骨无菌操作剪成 1 mm3 左右的小碎块后，放入 50 mL无菌小烧杯中，按1倍体积加入0.25 %胰蛋白酶水溶液，按一定体积比加入0.2%Ⅱ型胶原蛋白酶水溶液，37℃摇床消化6 h以上, 经200目不锈钢筛网过滤后离心去上清，加入已在 37 ℃恒温箱中复温的RPMI 1640培养液30mL，得到软骨细胞悬液。
S7、将步骤S6的软骨细胞悬液分装入3只25 mL的培养皿中，补足RPMI 1640培养液至15mL/皿，于培养箱中进行培养，隔日换培养液1次，每周传代1次，传至第 3 代，取第3代软骨细胞待用。
S8、将步骤S7的第3代软骨细胞稀释成细胞悬液，然后按照一定体积比加入白细胞介素-1β溶液，混匀，于培养箱中孵育72 h，1 500 rpm，10 min离心去上清，得到骨关节炎细胞模型。
S9、将步骤S8的骨关节炎细胞模型加入100 μL的步骤S4的纳米乳液，再加RPMI1640培养液至15mL/皿，于培养箱中孵育4周、8周、12周分别得到不同孵育周期的骨关节炎细胞培养液，对其进行粘多糖含量测定。
S10、称取步骤S9的骨关节炎细胞培养液50g，加入pH7.0、0.2 mol/L 500mL磷酸缓冲液50mL，先进行37℃加热预处理5min，加入一定浓度胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶，利用恒温水浴反应装置在恒定 pH7.2和温度37℃下进行酶解反应90 min，用0.1mol/L NaOH溶液滴定维持 pH恒定(变动范围为±0.1 )。
S11、酶解反应完毕后，在100℃沸水中加热5min，冷却至室温，接着离心分离得一次上清液，加入饱和硫酸铵溶液进行沉淀，在4℃下静置12h，离心后得二次上清液，加入3倍无水乙醇，再离心得沉淀物，最后用无水乙醇洗涤后，冷冻升华干燥得到粘多糖，结果换算为ug /mg(粘多糖/骨关节炎细胞培养液)。
进一步地，步骤 S1中，硫酸软骨素和甘油二酯的质量比为3:1。
进一步地，步骤S2中，茶皂甙的质量分数为 2 %。
进一步地，步骤S3中，高剪切混合器处理转速为9500 r/min ，时间为3 min。
进一步地，步骤S4中，高压微射流均质的调节压力为22 000 psi。
进一步地，步骤S6中，胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶的加入体积比为1 :10，离心条件为1 500 rpm，10 min。
进一步地，步骤S7中，培养液为 RPM I 1640，含10%的胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL，培养箱培养条件为 37℃、5%CO2、饱和湿度。
进一步地，步骤S8中，细胞悬液的稀释浓度为4×107cell /L，白细胞介素-1β 溶液的浓度为1000 μg /L，细胞悬液和白细胞介素-1β 溶液的体积比为100:1，培养箱培养条件为 37℃、 5%CO2、饱和湿度。
进一步地，步骤 S9中RPMI 1640培养液，含10%的胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL，培养箱孵育条件为 37℃、5%CO2、饱和湿度。
进一步地，步骤S10中，胰蛋白酶浓度为0.5 %、Ⅱ型胶原蛋白酶浓度为0.05%。
进一步地，步骤S11中，三次离心条件为5000r/min，20min。
本发明的有益效果在于：制备出硫酸软骨素/甘油二酯纳米乳液，刺激软骨细胞促进其分泌粘多糖。软骨在人体中具有承重，力量传导以及缓冲等重要作用。传统的软骨修复材料，韧性差，支撑性能低，在植入后无法及时有效地发挥承重、缓冲等重要作用。以硫酸软骨素为原料与甘油二酯混合进行修饰得到纳米乳液，可在软骨分泌粘多糖中具有明显的促进作用，为其在软骨组织工程中应用提供实验基础。
具体实施方式
以下将对本发明作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围并不局限于本实施例。
实施例
S1、将硫酸软骨素和甘油二酯(CS+DAG)以质量比3:1在60℃下搅拌 2 h 至混合均匀，得到油相12mL。
S2、将茶皂甙在60℃下溶于蒸馏水中搅拌至完全溶解，得到质量分数为2%的水相12mL。
S3、将步骤S1的油相10mL缓慢均匀加入步骤S2的水相10mL中，在60℃下用高剪切混合器于9500 r/min，3 min处理，混合均匀后得到粗乳液。
S4、将步骤S3的粗乳液在60℃、压力为22 000 psi的高压微射流作用下均质 2次，收集得到纳米乳液，冷却后于 4 ℃密封冷藏。
S5、选取无特定病原体( SPF) 级成年雄性 SD 大鼠 1只，将其麻醉、处死，无菌操作摘取膝关节软骨。
S6、将步骤S5的关节软骨无菌操作剪成 1 mm3 左右的小碎块后，放入 50 mL无菌小烧杯中，按1倍体积加入0.25 %胰蛋白酶水溶液，按体积比1:10加入0.2%Ⅱ型胶原蛋白酶水溶液，37℃摇床消化6.5h, 经200目不锈钢筛网过滤后于1 500 rpm离心10 min，去上清，加入已在 37 ℃恒温箱中复温的RPMI 1640培养液30mL，得到软骨细胞悬液。
S7、将步骤S6的软骨细胞悬液分装入3只25 mL的培养皿中，补足含10%的胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL的RPMI 1640培养液至15mL/皿，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中进行培养，隔日换培养液1次，每周传代1次，传至第 3 代，取第3代软骨细胞待用。
S8、将步骤S7的第3代软骨细胞稀释成细胞悬液，其浓度为4×107cell /L，然后按照体积比100:1加入浓度为1000 μg /L的白细胞介素-1β溶液，混匀，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中孵育72 h，1 500 rpm，10 min离心去上清，得到骨关节炎细胞模型。
S9、将步骤S8的骨关节炎细胞模型加入100 μL的步骤S4的硫酸软骨素和甘油二酯(SA+DAG)纳米乳液，再加含10%的胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL的RPMI1640培养液至15mL/皿，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中孵育4周、8周、12周分别得到不同孵育周期的骨关节炎细胞培养液，对其进行粘多糖含量测定。
S10、称取步骤S9的骨关节炎细胞培养液50g，加入pH7.0、0.2 mol/L 500mL磷酸缓冲液50mL，先进行37℃加热预处理5min，加入0.5%胰蛋白酶和0.05%Ⅱ型胶原蛋白酶，利用恒温水浴反应装置在恒定pH7.2和温度37℃下进行酶解反应90 min，用0.1mol/L NaOH溶液滴定维持 pH恒定(变动范围为±0.1 )。
S11、酶解反应完毕后，在100℃沸水中加热5min，冷却至室温，接着于5000r/min离心20min，分离得一次上清液，加入饱和硫酸铵溶液进行沉淀，在4℃下静置12h，于5000r/min离心20min后得二次上清液，加入3倍无水乙醇，再于5000r/min离心20min得沉淀物，最后用无水乙醇洗涤后，冷冻升华干燥得到粘多糖，结果换算为ug /mg(粘多糖/骨关节炎细胞培养液)。
对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种促进软骨高效分泌粘多糖的硫酸软骨素/甘油二酯纳米乳液制备方法，包括以下步骤：
S1、将一定质量比的硫酸软骨素和甘油二酯(CS+DAG)在60℃下搅拌 2 h 至混合均匀，得到油相；
S2、将茶皂甙在60℃下溶于蒸馏水中搅拌至完全溶解，得到水相；
S3、将步骤S1的油相等体积且缓慢均匀加入步骤S2的水相中，在60℃下用高剪切混合器处理，混合均匀后得到粗乳液；
S4、将步骤S3的粗乳液在60℃、高压微射流作用下均质 2 次，收集得到纳米乳液，冷却后于 4 ℃密封冷藏；
S5、选取无特定病原体( SPF) 级成年雄性 SD 大鼠 1只，将其麻醉、处死，无菌操作摘取膝关节软骨；
S6、将步骤S5的关节软骨无菌操作剪成 1 mm3 左右的小碎块后，放入 50 mL无菌小烧杯中，按1倍体积加入0.25 %胰蛋白酶水溶液，按一定体积比加入0.2%Ⅱ型胶原蛋白酶水溶液，37℃摇床消化6 h以上, 经200目不锈钢筛网过滤后离心去上清，加入已在 37 ℃恒温箱中复温的RPMI 1640培养液30mL，得到软骨细胞悬液；
S7、将步骤S6的软骨细胞悬液分装入3只25 mL的培养皿中，补足RPMI 1640培养液至15mL/皿，于培养箱中进行培养，隔日换培养液1次，每周传代1次，传至第 3 代，取第3代软骨细胞待用；
S8、将步骤S7的第3代软骨细胞稀释成细胞悬液，然后按照一定体积比加入白细胞介素-1β溶液，混匀，于培养箱中孵育72 h，1 500 rpm，10 min离心去上清，得到骨关节炎细胞模型；
S9、将步骤S8的骨关节炎细胞模型加入100 μL的步骤S4的纳米乳液，再加RPMI 1640培养液至15mL/皿，于培养箱中孵育4周、8周、12周分别得到不同孵育周期的骨关节炎细胞培养液，对其进行粘多糖含量测定；
S10、称取步骤S9的骨关节炎细胞培养液50g，加入pH7.0、0.2 mol/L 500mL磷酸缓冲液50mL，先进行37℃加热预处理5min，加入一定浓度胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶，利用恒温水浴反应装置在恒定 pH7.2和温度37℃下进行酶解反应90 min，用0.1mol/L NaOH溶液滴定维持 pH恒定(变动范围为±0.1 )；
S11、酶解反应完毕后，在100℃沸水中加热5min，冷却至室温，接着离心分离得一次上清液，加入饱和硫酸铵溶液进行沉淀，在4℃下静置12h，离心后得二次上清液，加入3倍无水乙醇，再离心得沉淀物，最后用无水乙醇洗涤后，冷冻升华干燥得到粘多糖，结果换算为ug/mg（粘多糖/骨关节炎细胞培养液)。
2.根据权利要求1所述的一种促进软骨高效分泌粘多糖的硫酸软骨素/甘油二酯纳米乳液制备方法，其特征在于，步骤 S1中，硫酸软骨素和甘油二酯的质量比为3:1; 步骤 S2中，茶皂甙的质量分数为 2 %;步骤 S3中，高剪切混合器处理转速为9500 r/min ，时间为3min; 步骤 S4中，高压微射流均质的调节压力为22 000 psi; 步骤 S6中，胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶的加入体积比为1 :10，离心条件为1 500 rpm，10 min。
3.根据权利要求1所述的一种促进软骨高效分泌粘多糖的硫酸软骨素/甘油二酯纳米乳液制备方法，其特征在于，步骤 S7中，培养液为 RPM I 1640，含10%的胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL，培养箱培养条件为 37℃、 5%CO2、饱和湿度。
4.根据权利要求1所述的一种促进软骨高效分泌粘多糖的硫酸软骨素/甘油二酯纳米乳液制备方法，其特征在于，步骤 S8中，细胞悬液的稀释浓度为4×107cell /L，白细胞介素-1β 溶液的浓度为1000 μg /L，细胞悬液和白细胞介素-1β 溶液的体积比为100:1，培养箱培养条件为 37℃、5%CO2、饱和湿度。
5.根据权利要求1所述的一种促进软骨高效分泌粘多糖的硫酸软骨素/甘油二酯纳米乳液制备方法，其特征在于，步骤 S9中RPMI 1640培养液，含10%的胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL，培养箱孵育条件为 37℃、5%CO2、饱和湿度。
6.根据权利要求1所述的一种促进软骨高效分泌粘多糖的硫酸软骨素/甘油二酯纳米乳液制备方法，其特征在于，步骤 S10中，胰蛋白酶浓度为0.5 %、Ⅱ型胶原蛋白酶浓度为0.05%。
7.根据权利要求1所述的一种促进软骨高效分泌粘多糖的硫酸软骨素/甘油二酯纳米乳液制备方法，其特征在于，步骤 S11中，三次离心条件为5000r/min，20min。
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