CN115735774B - 一种蒙古栎的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种蒙古栎的组织培养方法。一种蒙古栎的组织培养方法包括以下步骤：外植体的选择、外植体的灭菌处理、外植体的诱导培养、外植体的增殖培养、外植体的生根培养、无菌苗的炼苗驯化。本发明通过在外植体的灭菌处理中采用洗洁精浸泡、75％酒精擦拭、0.1％氯化汞消毒、无菌水冲洗等前期消毒手段，对外植体的灭菌效果更好，保证培养期间避免出现受污染、褐化、黄化等问题，提高蒙古栎的组织培养的效果。
Description
技术领域
本发明属于木本植物组织培养繁育技术领域，具体涉及一种蒙古栎的组织培养方法。
背景技术
蒙古栎是国家二级珍贵树种，也称柞树，是中国东北林区中主要的次生林树种。蒙古栎树的根很深，主根发达，但不耐移植，材质坚硬、比重大、纹理美观、具有抗腐耐水湿等特点。蒙古栎为喜光树种，适应性强，是营造防风林、水源涵养林及防火林的优良树种，孤植、丛植或与其它树木混交成林均甚适宜；在园林中可植作园景树或行道树，树形好者可为孤植树做观赏用；木材边材淡褐色，心材淡灰褐色，材质坚硬，耐腐蚀强度高，可供车船、建筑、坑木等用材，压缩木可供作机械零件；树叶含蛋白质12.4%，可饲柞蚕；种子含淀粉47.4%，可酿酒或作饲料；树皮入药有收敛止泻及治痢疾之效。总之，蒙古栎是集用材、生态、能源和景观绿化于一体的多用途树种，具有极高的研究和经济价值。
目前，蒙古栎的繁育方式主要包括扦插、播种等，催芽方法复杂、周期长，出芽率不高，严重影响蒙古栎在市场上的推广应用。为了能实现大规模、工厂化育苗，现采用组织培养技术对蒙古栎进行繁育。但是，木本植物的生理构造比草本植物复杂，生长繁殖周期要更长，植物组织培养中存在易受污染、褐化、黄化等诸多问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种蒙古栎的组织培养方法，旨在利用植物的组织器官，在无菌体系条件下，通过人工控制外界环境条件进行培养，达到快速繁殖苗木的目的。该培养方法让外植体培养期间避免出现受污染、褐化、黄化等诸多问题，具有周期短、生根速度快、生根率高的优点。
一种蒙古栎的组织培养方法，包含如下步骤：
S1：外植体的选择
选取多年生健壮、无病虫害的蒙古栎，以其当年生、未木质化的枝条作为外植体母本，将作为外植体母本的枝条在室内进行水培至催生出新的嫩枝长出，取嫩枝作为外植体；
S2：外植体的灭菌处理
将上述步骤S1中的外植体除去叶片、叶柄，修剪成至少带一个腋芽或顶芽的茎段，茎段用洗洁精浸泡，流水冲洗，用75％酒精进行消毒，再冲洗，置于无菌吸水纸上吸去其表面多余水分，再切除茎段两端消毒死亡部分，得到无菌外植体；
S3：外植体的诱导培养
在MS基础培养基中添加0.5mg/L的TDZ、0.5mg/L的IBA、30g/L的d-山梨醇、7g/L琼脂、0.8mg/L的硝酸银和60mg/L的纳米硅配置诱导培养基，调节诱导培养基pH至5.8，将步骤S2中的无菌外植体形态学下端插入诱导培养基中进行芽的分化诱导培养，促进芽的萌发和生长，得到萌发和生长的蒙古栎腋芽；
S4：外植体的增殖培养
在MS基础培养基中添加0.1-1.0mg/L的6-BA、0.1-1.0mg/L的GA3、0.1-1.0mg/L的NAA、7g/L琼脂和30g/L的d-山梨醇配置增殖培养基，调节增殖培养基pH至5.8，将步骤S3中的得到萌发和生长的蒙古栎腋芽整个接入增殖培养基进行增殖培养，得到蒙古栎幼苗；
S5：外植体的生根培养
在1/2MS基础培养基中添加0.1-1.0mg/L的IBA、7g/L琼脂、30g/L的d-山梨醇和0.5-1.5g/L的活性炭配置生根培养基，调节生根培养基pH至5.8，将步骤S4中的蒙古栎幼苗接入生根培养基进行生根培养，得到蒙古栎生根无菌幼苗；
S6：无菌苗的炼苗驯化
将步骤S5中的蒙古栎生根无菌幼苗从培养室移至温室大棚培养，然后移入轻基质中继续培育成完整的再生植株。
进一步地，所述步骤S1中的择取外植体的时间为春季的3月中旬至4月中旬。
进一步地，所述步骤S2中的外植体的灭菌处理，具体包含如下步骤：
S2.1：外植体在不损伤腋芽和顶芽的基础上除去叶片、叶柄，修剪成至少带一个腋芽或顶芽的茎段；
S2.2：将茎段用洗洁精浸泡30min，再用流水冲洗1～1.5h；
S2.3：将冲洗过后的茎段放置在超净工作台上，用75％酒精进行擦拭消毒20～35s，再用无菌水冲洗3～5次；
S2.4：将无菌水冲洗过后的茎段用0.1%氯化汞消毒3～10min，再用无菌水冲洗3～5次；
S2.5：用无菌吸水纸吸去茎段表面的多余水分，再切除茎段两端消毒死亡部分，得到无菌外植体。
进一步地，所述步骤S3中的诱导培养和S4中的增殖培养，培养温度24～26℃，光照时间12～14h/d，光照强度为2000～2500lx，光照培养20～30d。
进一步地，所述步骤S5中的生根培养，培养温度20～25℃，光照时间10～16h/d，光照强度为2000～2500lx，培养15～20d。
进一步地，所述步骤S3中的诱导培养期间，S4中的增殖培养期间，S5中的生根培养期间，每隔10～13d，转瓶一次。
进一步地，所述步骤S3中的诱导培养期间，采用蓝光进行光照，S4中的增殖培养期间，采用远红光进行光照，S5中的生根培养期间，采用红光进行光照。
进一步地，所述步骤S3、S4和S5中均用1mol/L的氢氧化钠溶液调节培养基pH值。
进一步地，所述步骤S3、S4和S5中的培养过程均在无菌体系条件下进行，通过人工控制外界环境条件进行培养。
进一步地，所述步骤S6中的无菌苗的炼苗驯化，具体包含如下步骤：
S6.1：将步骤S5中的蒙古栎生根无菌幼苗从培养室移至温室大棚，松开瓶盖培养3～5d，再打开瓶盖培养5～7d；
S6.2：将开瓶盖培养5～7d的蒙古栎生根无菌幼苗从培养基中移入轻基质中继续培育成完整的再生植株，其中轻基质由泥炭土、稻谷壳和黄心土以6∶3∶1的体积比混合并用高锰酸钾消毒制成；
S6.3：在培育成完整的再生植株期间，每隔一周喷施多菌灵一次；
S6.4：于外界气温持续1周低于30℃以下时移至大田苗床中，适度密植，温度大于30℃时搭遮阳网，保证水分供应。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：
1、本发明蒙古栎的组织培养方法，通过在外植体的灭菌处理中采用洗洁精浸泡、75％酒精擦拭、0.1%氯化汞消毒、无菌水冲洗等前期消毒手段，对外植体的灭菌效果更好，保证培养期间避免出现受污染、褐化、黄化等问题，提高蒙古栎的组织培养的效果。
2、本发明蒙古栎的组织培养方法，通过在配置诱导培养基中添加硝酸银，硝酸银与TDZ和IBA组合，有利于叶片愈伤组织诱导不定芽，硝酸银通过竞争乙烯的作用位点抑制乙烯的合成及信号的传导，能够控制和逆转组培苗的玻璃化现象。
3、本发明蒙古栎的组织培养方法，通过在配置诱导培养基中添加纳米硅，纳米硅通过参与植物自身组织或细胞器的构建，影响其生理活性物质的合成，从而调节生理代谢活动，改善外植体的生长和对压力的耐受性。
4、本发明蒙古栎的组织培养方法，通过在诱导培养期间，采用蓝光进行光照，蓝光促进愈伤组织的重量增加，增殖培养期间，采用远红光进行光照，远红光有利于枝梢数量的增加，生根培养期间，采用红光进行光照，红光更有利于生根，提高蒙古栎的生根率。
5、本发明蒙古栎的组织培养方法，通过在生根培养基中添加活性炭，活性炭可吸附植物分泌的有害物质，同时可提供蒙古栎幼苗生根的暗环境，有利于根的诱导和根系生长，防止褐变，提高蒙古栎幼苗内可溶性蛋白和总糖的含量。
6、本发明蒙古栎的组织培养方法，通过在春季的3月中旬至4月中旬将作为外植体母本的枝条在室内进行水培至催生出新的嫩枝长出，取嫩枝作为外植体，由于外植体中酚类物质含量及多酚氧化酶的氧化活性在春季较弱，培苗外植体内的多酚物质含量大大低于田间外植体材料，使得外植体在培养的过程中发生褐化的概率降低，且室内进行水培后催生出的嫩枝因不受外界环境影响，使得外植体本身携带的细菌就更少，让外植体在培养期间避免出现受污染的问题；通过在培养期间每隔10天左右转瓶一次，保证茎段正常生长并且色泽正常，同时培养基中不会有浑浊物出现，降低褐化率。
附图说明
图1为本发明实施例所采用的蒙古栎的组织培养方法的流程图。
图2为本发明实施例所采用的诱导培养基不同激素配比图。
图3为本发明实施例所采用的增殖培养基不同激素配比图。
图4为本发明实施例所采用的生根培养基不同激素配比图。
图5为本发明实施例所采用的光照不同和转瓶时间不同的生根率图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1
一种蒙古栎的组织培养方法，如图1、图2、图3和图4所示，包含如下步骤：
S1：外植体的选择
在春季的3月中旬至4月中旬，选取多年生健壮、无病虫害的蒙古栎，以其当年生、未木质化的枝条作为外植体母本，将作为外植体母本的枝条在室内进行水培至催生出新的嫩枝长出，取嫩枝作为外植体，由于外植体中酚类物质含量及多酚氧化酶的氧化活性在春季较弱，培苗外植体内的多酚物质含量大大低于田间外植体材料，使得外植体在培养的过程中发生褐化的概率降低，且室内进行水培后催生出的嫩枝因不受外界环境影响，使得外植体本身携带的细菌就更少，让外植体在培养期间避免出现受污染的问题；
S2：外植体的灭菌处理
外植体在不损伤腋芽和顶芽的基础上除去叶片、叶柄，修剪成至少带一个腋芽或顶芽的茎段，茎段的长度3.5cm，将茎段用洗洁精浸泡30min，再用流水冲洗1h，将冲洗过后的茎段放置在超净工作台上，用75％酒精进行擦拭消毒30s，再用无菌水冲洗5次，将无菌水冲洗过后的茎段用0.1%氯化汞消毒4min，再用无菌水冲洗5次，用无菌吸水纸吸去茎段表面的多余水分，再切除茎段两端消毒死亡部分，得到无菌外植体，通过在外植体的灭菌处理中采用洗洁精浸泡、75％酒精擦拭、0.1%氯化汞消毒、无菌水冲洗等前期消毒手段，对外植体的灭菌效果更好，保证培养期间避免出现受污染、褐化、黄化等问题，提高蒙古栎的组织培养的效果；
S3：外植体的诱导培养
在MS基础培养基中添加0.5mg/L的TDZ、0.5mg/L的IBA、30g/L的d-山梨醇、7g/L琼脂、0.8mg/L的硝酸银和60mg/L的纳米硅配置诱导培养基，通过在配置诱导培养基中添加硝酸银，硝酸银与TDZ和IBA组合，有利于叶片愈伤组织诱导不定芽，硝酸银通过竞争乙烯的作用位点抑制乙烯的合成及信号的传导，能够控制和逆转组培苗的玻璃化现象，通过在配置诱导培养基中添加纳米硅，纳米硅通过参与植物自身组织或细胞器的构建，影响其生理活性物质的合成，从而调节生理代谢活动，改善外植体的生长和对压力的耐受性，用1mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值至5.8，培养温度25℃，采用蓝光进行光照，蓝光促进愈伤组织的重量增加，光照时间12h/d，光照强度为2200lx，光照培养26d，每隔10d，转瓶一次，保证茎段正常生长并且色泽正常，同时培养基中不会有浑浊物出现，降低褐化率，将步骤S2中的无菌外植体形态学下端插入诱导培养基中进行芽的分化诱导培养，促进芽的萌发和生长，得到萌发和生长的蒙古栎腋芽；
S4：外植体的增殖培养
在MS基础培养基中添加0.5mg/L的6-BA、0.2mg/L的GA3、0.5mg/L的NAA、7g/L琼脂和30g/L的d-山梨醇配置增殖培养基，用1mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值至5.8，培养温度25℃，采用远红光进行光照，远红光有利于枝梢数量的增加，光照时间13h/d，光照强度为2400lx，光照培养28d，每隔12d，转瓶一次，保证茎段正常生长并且色泽正常，同时培养基中不会有浑浊物出现，降低褐化率，将步骤S3中的萌发和生长的蒙古栎腋芽整个接入增殖培养基进行增殖培养，得到蒙古栎幼苗；
S5：外植体的生根培养
在1/2MS基础培养基中添加0.5mg/L的IBA、7g/L琼脂、30g/L的d-山梨醇和0.5g/L的活性炭配置生根培养基，通过在生根培养基中添加活性炭，活性炭可吸附植物分泌的有害物质，同时可提供蒙古栎幼苗生根的暗环境，有利于根的诱导和根系生长，防止褐变，提高蒙古栎幼苗内可溶性蛋白和总糖的含量，用1mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值至5.8，培养温度24℃，采用红光进行光照，红光更有利于生根，提高蒙古栎的生根率，光照时间14h/d，光照强度为2500lx，培养18d，每隔10d，转瓶一次，保证茎段正常生长并且色泽正常，同时培养基中不会有浑浊物出现，降低褐化率，将步骤S4中的蒙古栎幼苗接入生根培养基进行生根培养，得到蒙古栎生根无菌幼苗；
S6：无菌苗的炼苗驯化
将步骤S5中的蒙古栎生根无菌幼苗从培养室移至温室大棚，松开瓶盖培养5d，再打开瓶盖培养7d，将开瓶盖培养7d的蒙古栎生根无菌幼苗从培养基中移入轻基质中继续培育成完整的再生植株，其中轻基质由泥炭土、稻谷壳和黄心土以6:3:1的体积比混合并用高锰酸钾消毒制成，在培育成完整的再生植株期间，每隔一周喷施多菌灵一次，于外界气温持续1周低于30℃以下时移至大田苗床中，适度密植，温度大于30℃时搭遮阳网，保证水分供应。
通过上述蒙古栎的组织培养方法的步骤，如图5所示，所得蒙古栎外植体的生根率为84.8%。
实施例2
一种蒙古栎的组织培养方法，如图1、图2、图3和图4所示，包含如下步骤：
S1：外植体的选择
在春季的3月中旬至4月中旬，选取多年生健壮、无病虫害的蒙古栎，以其当年生、未木质化的枝条作为外植体母本，将作为外植体母本的枝条在室内进行水培至催生出新的嫩枝长出，取嫩枝作为外植体，由于外植体中酚类物质含量及多酚氧化酶的氧化活性在春季较弱，培苗外植体内的多酚物质含量大大低于田间外植体材料，使得外植体在培养的过程中发生褐化的概率降低，且室内进行水培后催生出的嫩枝因不受外界环境影响，使得外植体本身携带的细菌就更少，让外植体在培养期间避免出现受污染的问题；
S2：外植体的灭菌处理
外植体在不损伤腋芽和顶芽的基础上除去叶片、叶柄，修剪成至少带一个腋芽或顶芽的茎段，茎段的长度3.5cm，将茎段用洗洁精浸泡30min，再用流水冲洗1h，将冲洗过后的茎段放置在超净工作台上，用75％酒精进行擦拭消毒30s，再用无菌水冲洗5次，将无菌水冲洗过后的茎段用0.1%氯化汞消毒4min，再用无菌水冲洗5次，用无菌吸水纸吸去茎段表面的多余水分，再切除茎段两端消毒死亡部分，得到无菌外植体，通过在外植体的灭菌处理中采用洗洁精浸泡、75％酒精擦拭、0.1%氯化汞消毒、无菌水冲洗等前期消毒手段，对外植体的灭菌效果更好，保证培养期间避免出现受污染、褐化、黄化等问题，提高蒙古栎的组织培养的效果；
S3：外植体的诱导培养
在MS基础培养基中添加0.5mg/L的TDZ、0.1mg/L的IBA、30g/L的d-山梨醇、7g/L琼脂、1.2mg/L的硝酸银和68mg/L的纳米硅配置诱导培养基，通过在配置诱导培养基中添加硝酸银，硝酸银与TDZ和IBA组合，有利于叶片愈伤组织诱导不定芽，硝酸银通过竞争乙烯的作用位点抑制乙烯的合成及信号的传导，能够控制和逆转组培苗的玻璃化现象，通过在配置诱导培养基中添加纳米硅，纳米硅通过参与植物自身组织或细胞器的构建，影响其生理活性物质的合成，从而调节生理代谢活动，改善外植体的生长和对压力的耐受性，用1mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值至5.8，培养温度25℃，采用蓝光进行光照，蓝光促进愈伤组织的重量增加，光照时间12h/d，光照强度为2200lx，光照培养26d，每隔10d，转瓶一次，保证茎段正常生长并且色泽正常，同时培养基中不会有浑浊物出现，降低褐化率，将步骤S2中的无菌外植体形态学下端插入诱导培养基中进行芽的分化诱导培养，促进芽的萌发和生长，得到萌发和生长的蒙古栎腋芽；
S4：外植体的增殖培养
在MS基础培养基中添加0.8mg/L的6-BA、0.5mg/L的GA3、0.8mg/L的NAA、7g/L琼脂和30g/L的d-山梨醇配置增殖培养基，用1mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值至5.8，培养温度25℃，采用远红光进行光照，远红光有利于枝梢数量的增加，光照时间13h/d，光照强度为2400lx，光照培养28d，每隔12d，转瓶一次，保证茎段正常生长并且色泽正常，同时培养基中不会有浑浊物出现，降低褐化率，将步骤S3中的萌发和生长的蒙古栎腋芽整个接入增殖培养基进行增殖培养，得到蒙古栎幼苗；
S5：外植体的生根培养
在1/2MS基础培养基中添加0.2mg/L的IBA、7g/L琼脂、30g/L的d-山梨醇和1g/L的活性炭配置生根培养基，通过在生根培养基中添加活性炭，活性炭可吸附植物分泌的有害物质，同时可提供蒙古栎幼苗生根的暗环境，有利于根的诱导和根系生长，防止褐变，提高蒙古栎幼苗内可溶性蛋白和总糖的含量，用1mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值至5.8，培养温度24℃，采用红光进行光照，红光更有利于生根，提高蒙古栎的生根率，光照时间14h/d，光照强度为2500lx，培养18d，每隔10d，转瓶一次，保证茎段正常生长并且色泽正常，同时培养基中不会有浑浊物出现，降低褐化率，将步骤S4中的蒙古栎幼苗接入生根培养基进行生根培养，得到蒙古栎生根无菌幼苗；
S6：无菌苗的炼苗驯化
将步骤S5中的蒙古栎生根无菌幼苗从培养室移至温室大棚，松开瓶盖培养5d，再打开瓶盖培养7d，将开瓶盖培养7d的蒙古栎生根无菌幼苗从培养基中移入轻基质中继续培育成完整的再生植株，其中轻基质由泥炭土、稻谷壳和黄心土以6:3:1的体积比混合并用高锰酸钾消毒制成，在培育成完整的再生植株期间，每隔一周喷施多菌灵一次，于外界气温持续1周低于30℃以下时移至大田苗床中，适度密植，温度大于30℃时搭遮阳网，保证水分供应。
通过上述蒙古栎的组织培养方法的步骤，如图5所示，所得蒙古栎外植体的生根率为77.4%。
实施例3
一种蒙古栎的组织培养方法，如图1、图2、图3和图4所示，包含如下步骤：
S1：外植体的选择
在春季的3月中旬至4月中旬，选取多年生健壮、无病虫害的蒙古栎，以其当年生、未木质化的枝条作为外植体母本，将作为外植体母本的枝条在室内进行水培至催生出新的嫩枝长出，取嫩枝作为外植体，由于外植体中酚类物质含量及多酚氧化酶的氧化活性在春季较弱，培苗外植体内的多酚物质含量大大低于田间外植体材料，使得外植体在培养的过程中发生褐化的概率降低，且室内进行水培后催生出的嫩枝因不受外界环境影响，使得外植体本身携带的细菌就更少，让外植体在培养期间避免出现受污染的问题；
S2：外植体的灭菌处理
外植体在不损伤腋芽和顶芽的基础上除去叶片、叶柄，修剪成至少带一个腋芽或顶芽的茎段，茎段的长度3.5cm，将茎段用洗洁精浸泡30min，再用流水冲洗1h，将冲洗过后的茎段放置在超净工作台上，用75％酒精进行擦拭消毒30s，再用无菌水冲洗5次，将无菌水冲洗过后的茎段用0.1%氯化汞消毒4min，再用无菌水冲洗5次，用无菌吸水纸吸去茎段表面的多余水分，再切除茎段两端消毒死亡部分，得到无菌外植体，通过在外植体的灭菌处理中采用洗洁精浸泡、75％酒精擦拭、0.1%氯化汞消毒、无菌水冲洗等前期消毒手段，对外植体的灭菌效果更好，保证培养期间避免出现受污染、褐化、黄化等问题，提高蒙古栎的组织培养的效果；
S3：外植体的诱导培养
在MS基础培养基中添加0.35mg/L的TDZ、1mg/L的IBA、30g/L的d-山梨醇、7g/L琼脂、0.5mg/L的硝酸银和75mg/L的纳米硅配置诱导培养基，通过在配置诱导培养基中添加硝酸银，硝酸银与TDZ和IBA组合，有利于叶片愈伤组织诱导不定芽，硝酸银通过竞争乙烯的作用位点抑制乙烯的合成及信号的传导，能够控制和逆转组培苗的玻璃化现象，通过在配置诱导培养基中添加纳米硅，纳米硅通过参与植物自身组织或细胞器的构建，影响其生理活性物质的合成，从而调节生理代谢活动，改善外植体的生长和对压力的耐受性，用1mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值至5.8，培养温度25℃，采用蓝光进行光照，蓝光促进愈伤组织的重量增加，光照时间12h/d，光照强度为2200lx，光照培养26d，每隔10d，转瓶一次，保证茎段正常生长并且色泽正常，同时培养基中不会有浑浊物出现，降低褐化率，将步骤S2中的无菌外植体形态学下端插入诱导培养基中进行芽的分化诱导培养，促进芽的萌发和生长，得到萌发和生长的蒙古栎腋芽；
S4：外植体的增殖培养
在MS基础培养基中添加0.5mg/L的6-BA、0.6mg/L的GA3、0.2mg/L的NAA、7g/L琼脂和30g/L的d-山梨醇配置增殖培养基，用1mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值至5.8，培养温度25℃，采用远红光进行光照，远红光有利于枝梢数量的增加，光照时间13h/d，光照强度为2400lx，光照培养28d，每隔12d，转瓶一次，保证茎段正常生长并且色泽正常，同时培养基中不会有浑浊物出现，降低褐化率，将步骤S3中的萌发和生长的蒙古栎腋芽整个接入增殖培养基进行增殖培养，得到蒙古栎幼苗；
S5：外植体的生根培养
在1/2MS基础培养基中添加0.8mg/L的IBA、7g/L琼脂、30g/L的d-山梨醇和1.2g/L的活性炭配置生根培养基，通过在生根培养基中添加活性炭，活性炭可吸附植物分泌的有害物质，同时可提供蒙古栎幼苗生根的暗环境，有利于根的诱导和根系生长，防止褐变，提高蒙古栎幼苗内可溶性蛋白和总糖的含量，用1mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值至5.8，培养温度24℃，采用红光进行光照，红光更有利于生根，提高蒙古栎的生根率，光照时间14h/d，光照强度为2500lx，培养18d，每隔10d，转瓶一次，保证茎段正常生长并且色泽正常，同时培养基中不会有浑浊物出现，降低褐化率，将步骤S4中的蒙古栎幼苗接入生根培养基进行生根培养，得到蒙古栎生根无菌幼苗；
S6：无菌苗的炼苗驯化
将步骤S5中的蒙古栎生根无菌幼苗从培养室移至温室大棚，松开瓶盖培养5d，再打开瓶盖培养7d，将开瓶盖培养7d的蒙古栎生根无菌幼苗从培养基中移入轻基质中继续培育成完整的再生植株，其中轻基质由泥炭土、稻谷壳和黄心土以6:3:1的体积比混合并用高锰酸钾消毒制成，在培育成完整的再生植株期间，每隔一周喷施多菌灵一次，于外界气温持续1周低于30℃以下时移至大田苗床中，适度密植，温度大于30℃时搭遮阳网，保证水分供应。
通过上述蒙古栎的组织培养方法的步骤，如图5所示，所得蒙古栎外植体的生根率为79.2%。
对比实施例1
一种蒙古栎的组织培养方法，如图1、图2、图3和图4所示，包含如下步骤：
S1：外植体的选择
在春季的3月中旬至4月中旬，选取多年生健壮、无病虫害的蒙古栎，以其当年生、未木质化的枝条作为外植体母本，将作为外植体母本的枝条在室内进行水培至催生出新的嫩枝长出，取嫩枝作为外植体，由于外植体中酚类物质含量及多酚氧化酶的氧化活性在春季较弱，培苗外植体内的多酚物质含量大大低于田间外植体材料，使得外植体在培养的过程中发生褐化的概率降低，且室内进行水培后催生出的嫩枝因不受外界环境影响，使得外植体本身携带的细菌就更少，让外植体在培养期间避免出现受污染的问题；
S2：外植体的灭菌处理
外植体在不损伤腋芽和顶芽的基础上除去叶片、叶柄，修剪成至少带一个腋芽或顶芽的茎段，茎段的长度3.5cm，将茎段用洗洁精浸泡30min，再用流水冲洗1h，将冲洗过后的茎段放置在超净工作台上，用75％酒精进行擦拭消毒30s，再用无菌水冲洗5次，将无菌水冲洗过后的茎段用0.1%氯化汞消毒4min，再用无菌水冲洗5次，用无菌吸水纸吸去茎段表面的多余水分，再切除茎段两端消毒死亡部分，得到无菌外植体，通过在外植体的灭菌处理中采用洗洁精浸泡、75％酒精擦拭、0.1%氯化汞消毒、无菌水冲洗等前期消毒手段，对外植体的灭菌效果更好，保证培养期间避免出现受污染、褐化、黄化等问题，提高蒙古栎的组织培养的效果；
S3：外植体的诱导培养
在MS基础培养基中添加0.5mg/L的TDZ、0.5mg/L的IBA、30g/L的d-山梨醇、适量琼脂配置诱导培养基，用1mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值至5.8，培养温度25℃，采用蓝光进行光照，蓝光促进愈伤组织的重量增加，光照时间12h/d，光照强度为2200lx，光照培养26d，每隔10d，转瓶一次，保证茎段正常生长并且色泽正常，同时培养基中不会有浑浊物出现，降低褐化率，将步骤S2中的无菌外植体形态学下端插入诱导培养基中进行芽的分化诱导培养，促进芽的萌发和生长，得到萌发和生长的蒙古栎腋芽；
S4：外植体的增殖培养
在MS基础培养基中添加0.5mg/L的6-BA、0.2mg/L的GA3、0.5mg/L的NAA、7g/L琼脂和30g/L的d-山梨醇配置增殖培养基，用1mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值至5.8，培养温度25℃，采用远红光进行光照，远红光有利于枝梢数量的增加，光照时间13h/d，光照强度为2400lx，光照培养28d，每隔12d，转瓶一次，保证茎段正常生长并且色泽正常，同时培养基中不会有浑浊物出现，降低褐化率，将步骤S3中的萌发和生长的蒙古栎腋芽整个接入增殖培养基进行增殖培养，得到蒙古栎幼苗；
S5：外植体的生根培养
在1/2MS基础培养基中添加0.5mg/L的IBA、7g/L琼脂、30g/L的d-山梨醇和0.5g/L的活性炭配置生根培养基，通过在生根培养基中添加活性炭，活性炭可吸附植物分泌的有害物质，同时可提供蒙古栎幼苗生根的暗环境，有利于根的诱导和根系生长，防止褐变，提高蒙古栎幼苗内可溶性蛋白和总糖的含量，用1mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值至5.8，培养温度24℃，采用红光进行光照，红光更有利于生根，提高蒙古栎的生根率，光照时间14h/d，光照强度为2500lx，培养18d，每隔10d，转瓶一次，保证茎段正常生长并且色泽正常，同时培养基中不会有浑浊物出现，降低褐化率，将步骤S4中的蒙古栎幼苗接入生根培养基进行生根培养，得到蒙古栎生根无菌幼苗；
S6：无菌苗的炼苗驯化
将步骤S5中的蒙古栎生根无菌幼苗从培养室移至温室大棚，松开瓶盖培养5d，再打开瓶盖培养7d，将开瓶盖培养7d的蒙古栎生根无菌幼苗从培养基中移入轻基质中继续培育成完整的再生植株，其中轻基质由泥炭土、稻谷壳和黄心土以6:3:1的体积比混合并用高锰酸钾消毒制成，在培育成完整的再生植株期间，每隔一周喷施多菌灵一次，于外界气温持续1周低于30℃以下时移至大田苗床中，适度密植，温度大于30℃时搭遮阳网，保证水分供应。
通过上述蒙古栎的组织培养方法的步骤，如图5所示，所得蒙古栎外植体的生根率为75.2%。
对比实施例2
一种蒙古栎的组织培养方法，如图1、图2、图3和图4所示，包含如下步骤：
S1：外植体的选择
在春季的3月中旬至4月中旬，选取多年生健壮、无病虫害的蒙古栎，以其当年生、未木质化的枝条作为外植体母本，将作为外植体母本的枝条在室内进行水培至催生出新的嫩枝长出，取嫩枝作为外植体，由于外植体中酚类物质含量及多酚氧化酶的氧化活性在春季较弱，培苗外植体内的多酚物质含量大大低于田间外植体材料，使得外植体在培养的过程中发生褐化的概率降低，且室内进行水培后催生出的嫩枝因不受外界环境影响，使得外植体本身携带的细菌就更少，让外植体在培养期间避免出现受污染的问题；
S2：外植体的灭菌处理
外植体在不损伤腋芽和顶芽的基础上除去叶片、叶柄，修剪成至少带一个腋芽或顶芽的茎段，茎段的长度3.5cm，将茎段用洗洁精浸泡30min，再用流水冲洗1h，将冲洗过后的茎段放置在超净工作台上，用75％酒精进行擦拭消毒30s，再用无菌水冲洗5次，将无菌水冲洗过后的茎段用0.1%氯化汞消毒4min，再用无菌水冲洗5次，用无菌吸水纸吸去茎段表面的多余水分，再切除茎段两端消毒死亡部分，得到无菌外植体，通过在外植体的灭菌处理中采用洗洁精浸泡、75％酒精擦拭、0.1%氯化汞消毒、无菌水冲洗等前期消毒手段，对外植体的灭菌效果更好，保证培养期间避免出现受污染、褐化、黄化等问题，提高蒙古栎的组织培养的效果；
S3：外植体的诱导培养
在MS基础培养基中添加0.5mg/L的TDZ、0.5mg/L的IBA、30g/L的d-山梨醇、7g/L琼脂、0.8mg/L的硝酸银和60mg/L的纳米硅配置诱导培养基，通过在配置诱导培养基中添加硝酸银，硝酸银与TDZ和IBA组合，有利于叶片愈伤组织诱导不定芽，硝酸银通过竞争乙烯的作用位点抑制乙烯的合成及信号的传导，能够控制和逆转组培苗的玻璃化现象，通过在配置诱导培养基中添加纳米硅，纳米硅通过参与植物自身组织或细胞器的构建，影响其生理活性物质的合成，从而调节生理代谢活动，改善外植体的生长和对压力的耐受性，用1mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值至5.8，培养温度25℃，采用蓝光进行光照，蓝光促进愈伤组织的重量增加，光照时间12h/d，光照强度为2200lx，光照培养26d，每隔10d，转瓶一次，保证茎段正常生长并且色泽正常，同时培养基中不会有浑浊物出现，降低褐化率，将步骤S2中的无菌外植体形态学下端插入诱导培养基中进行芽的分化诱导培养，促进芽的萌发和生长，得到萌发和生长的蒙古栎腋芽；
S4：外植体的增殖培养
在MS基础培养基中添加0.5mg/L的6-BA、0.2mg/L的GA3、0.5mg/L的NAA、7g/L琼脂和30g/L的d-山梨醇配置增殖培养基，用1mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值至5.8，培养温度25℃，采用远红光进行光照，远红光有利于枝梢数量的增加，光照时间13h/d，光照强度为2400lx，光照培养28d，每隔12d，转瓶一次，保证茎段正常生长并且色泽正常，同时培养基中不会有浑浊物出现，降低褐化率，将步骤S3中的萌发和生长的蒙古栎腋芽整个接入增殖培养基进行增殖培养，得到蒙古栎幼苗；
S5：外植体的生根培养
在1/2MS基础培养基中添加0.5mg/L的IBA、适量琼脂、30g/L的d-山梨醇配置生根培养基，用1mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值至5.8，培养温度24℃，采用红光进行光照，红光更有利于生根，提高蒙古栎的生根率，光照时间14h/d，光照强度为2500lx，培养18d，每隔10d，转瓶一次，保证茎段正常生长并且色泽正常，同时培养基中不会有浑浊物出现，降低褐化率，将步骤S4中的蒙古栎幼苗接入生根培养基进行生根培养，得到蒙古栎生根无菌幼苗；
S6：无菌苗的炼苗驯化
将步骤S5中的蒙古栎生根无菌幼苗从培养室移至温室大棚，松开瓶盖培养5d，再打开瓶盖培养7d，将开瓶盖培养7d的蒙古栎生根无菌幼苗从培养基中移入轻基质中继续培育成完整的再生植株，其中轻基质由泥炭土、稻谷壳和黄心土以6:3:1的体积比混合并用高锰酸钾消毒制成，在培育成完整的再生植株期间，每隔一周喷施多菌灵一次，于外界气温持续1周低于30℃以下时移至大田苗床中，适度密植，温度大于30℃时搭遮阳网，保证水分供应。
通过上述蒙古栎的组织培养方法的步骤，如图5所示，所得蒙古栎外植体的生根率为81.4%。
对比实施例3
一种蒙古栎的组织培养方法，如图1、图2、图3和图4所示，包含如下步骤：
S1：外植体的选择
在春季的3月中旬至4月中旬，选取多年生健壮、无病虫害的蒙古栎，以其当年生、未木质化的枝条作为外植体母本，将作为外植体母本的枝条在室内进行水培至催生出新的嫩枝长出，取嫩枝作为外植体，由于外植体中酚类物质含量及多酚氧化酶的氧化活性在春季较弱，培苗外植体内的多酚物质含量大大低于田间外植体材料，使得外植体在培养的过程中发生褐化的概率降低，且室内进行水培后催生出的嫩枝因不受外界环境影响，使得外植体本身携带的细菌就更少，让外植体在培养期间避免出现受污染的问题；
S2：外植体的灭菌处理
外植体在不损伤腋芽和顶芽的基础上除去叶片、叶柄，修剪成至少带一个腋芽或顶芽的茎段，茎段的长度3.5cm，将茎段用洗洁精浸泡30min，再用流水冲洗1h，将冲洗过后的茎段放置在超净工作台上，用75％酒精进行擦拭消毒30s，再用无菌水冲洗5次，将无菌水冲洗过后的茎段用0.1%氯化汞消毒4min，再用无菌水冲洗5次，用无菌吸水纸吸去茎段表面的多余水分，再切除茎段两端消毒死亡部分，得到无菌外植体，通过在外植体的灭菌处理中采用洗洁精浸泡、75％酒精擦拭、0.1%氯化汞消毒、无菌水冲洗等前期消毒手段，对外植体的灭菌效果更好，保证培养期间避免出现受污染、褐化、黄化等问题，提高蒙古栎的组织培养的效果；
S3：外植体的诱导培养
在MS基础培养基中添加0.5mg/L的TDZ、0.5mg/L的IBA、30g/L的d-山梨醇、7g/L琼脂、0.8mg/L的硝酸银和60mg/L的纳米硅配置诱导培养基，通过在配置诱导培养基中添加硝酸银，硝酸银与TDZ和IBA组合，有利于叶片愈伤组织诱导不定芽，硝酸银通过竞争乙烯的作用位点抑制乙烯的合成及信号的传导，能够控制和逆转组培苗的玻璃化现象，通过在配置诱导培养基中添加纳米硅，纳米硅通过参与植物自身组织或细胞器的构建，影响其生理活性物质的合成，从而调节生理代谢活动，改善外植体的生长和对压力的耐受性，用1mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值至5.8，培养温度25℃，采用自然光进行光照，光照时间12h/d，光照强度为2200lx，光照培养26d，每隔10d，转瓶一次，保证茎段正常生长并且色泽正常，同时培养基中不会有浑浊物出现，降低褐化率，将步骤S2中的无菌外植体形态学下端插入诱导培养基中进行芽的分化诱导培养，促进芽的萌发和生长，得到萌发和生长的蒙古栎腋芽；
S4：外植体的增殖培养
在MS基础培养基中添加0.5mg/L的6-BA、0.2mg/L的GA3、0.5mg/L的NAA、7g/L琼脂和30g/L的d-山梨醇配置增殖培养基，用1mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值至5.8，培养温度25℃，采用自然光进行光照，光照时间13h/d，光照强度为2400lx，光照培养28d，每隔12d，转瓶一次，保证茎段正常生长并且色泽正常，同时培养基中不会有浑浊物出现，降低褐化率，将步骤S3中的萌发和生长的蒙古栎腋芽整个接入增殖培养基进行增殖培养，得到蒙古栎幼苗；
S5：外植体的生根培养
在1/2MS基础培养基中添加0.5mg/L的IBA、7g/L琼脂、30g/L的d-山梨醇和0.5g/L的活性炭配置生根培养基，通过在生根培养基中添加活性炭，活性炭可吸附植物分泌的有害物质，同时可提供蒙古栎幼苗生根的暗环境，有利于根的诱导和根系生长，防止褐变，提高蒙古栎幼苗内可溶性蛋白和总糖的含量，用1mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值至5.8，培养温度24℃，采用自然光进行光照，光照时间14h/d，光照强度为2500lx，培养18d，每隔10d，转瓶一次，保证茎段正常生长并且色泽正常，同时培养基中不会有浑浊物出现，降低褐化率，将步骤S4中的蒙古栎幼苗接入生根培养基进行生根培养，得到蒙古栎生根无菌幼苗；
S6：无菌苗的炼苗驯化
将步骤S5中的蒙古栎生根无菌幼苗从培养室移至温室大棚，松开瓶盖培养5d，再打开瓶盖培养7d，将开瓶盖培养7d的蒙古栎生根无菌幼苗从培养基中移入轻基质中继续培育成完整的再生植株，其中轻基质由泥炭土、稻谷壳和黄心土以6:3:1的体积比混合并用高锰酸钾消毒制成，在培育成完整的再生植株期间，每隔一周喷施多菌灵一次，于外界气温持续1周低于30℃以下时移至大田苗床中，适度密植，温度大于30℃时搭遮阳网，保证水分供应。
通过上述蒙古栎的组织培养方法的步骤，如图5所示，所得蒙古栎外植体的生根率为82.5%。
对比实施例4
一种蒙古栎的组织培养方法，如图1、图2、图3和图4所示，包含如下步骤：
S1：外植体的选择
在春季的3月中旬至4月中旬，选取多年生健壮、无病虫害的蒙古栎，以其当年生、未木质化的枝条作为外植体母本，将作为外植体母本的枝条在室内进行水培至催生出新的嫩枝长出，取嫩枝作为外植体，由于外植体中酚类物质含量及多酚氧化酶的氧化活性在春季较弱，培苗外植体内的多酚物质含量大大低于田间外植体材料，使得外植体在培养的过程中发生褐化的概率降低，且室内进行水培后催生出的嫩枝因不受外界环境影响，使得外植体本身携带的细菌就更少，让外植体在培养期间避免出现受污染的问题；
S2：外植体的灭菌处理
外植体在不损伤腋芽和顶芽的基础上除去叶片、叶柄，修剪成至少带一个腋芽或顶芽的茎段，茎段的长度3.5cm，将茎段用洗洁精浸泡30min，再用流水冲洗1h，将冲洗过后的茎段放置在超净工作台上，用75％酒精进行擦拭消毒30s，再用无菌水冲洗5次，将无菌水冲洗过后的茎段用0.1%氯化汞消毒4min，再用无菌水冲洗5次，用无菌吸水纸吸去茎段表面的多余水分，再切除茎段两端消毒死亡部分，得到无菌外植体，通过在外植体的灭菌处理中采用洗洁精浸泡、75％酒精擦拭、0.1%氯化汞消毒、无菌水冲洗等前期消毒手段，对外植体的灭菌效果更好，保证培养期间避免出现受污染、褐化、黄化等问题，提高蒙古栎的组织培养的效果；
S3：外植体的诱导培养
在MS基础培养基中添加0.5mg/L的TDZ、0.5mg/L的IBA、30g/L的d-山梨醇、7g/L琼脂、0.8mg/L的硝酸银和60mg/L的纳米硅配置诱导培养基，通过在配置诱导培养基中添加硝酸银，硝酸银与TDZ和IBA组合，有利于叶片愈伤组织诱导不定芽，硝酸银通过竞争乙烯的作用位点抑制乙烯的合成及信号的传导，能够控制和逆转组培苗的玻璃化现象，通过在配置诱导培养基中添加纳米硅，纳米硅通过参与植物自身组织或细胞器的构建，影响其生理活性物质的合成，从而调节生理代谢活动，改善外植体的生长和对压力的耐受性，用1mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值至5.8，培养温度25℃，采用蓝光进行光照，蓝光促进愈伤组织的重量增加，光照时间12h/d，光照强度为2200lx，光照培养26d，将步骤S2中的无菌外植体形态学下端插入诱导培养基中进行芽的分化诱导培养，促进芽的萌发和生长，得到萌发和生长的蒙古栎腋芽；
S4：外植体的增殖培养
在MS基础培养基中添加0.5mg/L的6-BA、0.2mg/L的GA3、0.5mg/L的NAA、7g/L琼脂和30g/L的d-山梨醇配置增殖培养基，用1mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值至5.8，培养温度25℃，采用远红光进行光照，远红光有利于枝梢数量的增加，光照时间13h/d，光照强度为2400lx，光照培养28d，将步骤S3中的萌发和生长的蒙古栎腋芽整个接入增殖培养基进行增殖培养，得到蒙古栎幼苗；
S5：外植体的生根培养
在1/2MS基础培养基中添加0.5mg/L的IBA、7g/L琼脂、30g/L的d-山梨醇和0.5g/L的活性炭配置生根培养基，通过在生根培养基中添加活性炭，活性炭可吸附植物分泌的有害物质，同时可提供蒙古栎幼苗生根的暗环境，有利于根的诱导和根系生长，防止褐变，提高蒙古栎幼苗内可溶性蛋白和总糖的含量，用1mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值至5.8，培养温度24℃，采用红光进行光照，红光更有利于生根，提高蒙古栎的生根率，光照时间14h/d，光照强度为2500lx，培养18d，将步骤S4中的蒙古栎幼苗接入生根培养基进行生根培养，得到蒙古栎生根无菌幼苗；
S6：无菌苗的炼苗驯化
将步骤S5中的蒙古栎生根无菌幼苗从培养室移至温室大棚，松开瓶盖培养5d，再打开瓶盖培养7d，将开瓶盖培养7d的蒙古栎生根无菌幼苗从培养基中移入轻基质中继续培育成完整的再生植株，其中轻基质由泥炭土、稻谷壳和黄心土以6:3:1的体积比混合并用高锰酸钾消毒制成，在培育成完整的再生植株期间，每隔一周喷施多菌灵一次，于外界气温持续1周低于30℃以下时移至大田苗床中，适度密植，温度大于30℃时搭遮阳网，保证水分供应。
通过上述蒙古栎的组织培养方法的步骤，如图5所示，所得蒙古栎外植体的生根率为64.4%。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (9)
1.一种蒙古栎的组织培养方法，其特征在于，包含如下步骤：
S1：外植体的选择
选取多年生健壮、无病虫害的蒙古栎，以其当年生、未木质化的枝条作为外植体母本，将作为外植体母本的枝条在室内进行水培至催生出新的嫩枝长出，取嫩枝作为外植体；
S2：外植体的灭菌处理
将上述步骤S1中的外植体除去叶片、叶柄，修剪成至少带一个腋芽或顶芽的茎段，茎段用洗洁精浸泡，流水冲洗，用75％酒精进行消毒，再冲洗，置于无菌吸水纸上吸去其表面多余水分，再切除茎段两端消毒死亡部分，得到无菌外植体；
S3：外植体的诱导培养
在MS基础培养基中添加0.5mg/L的TDZ、0.5mg/L的IBA、30g/L的d-山梨醇、7g/L琼脂、0.8mg/L的硝酸银和60mg/L的纳米硅配置诱导培养基，调节诱导培养基pH至5.8，将步骤S2中的无菌外植体形态学下端插入诱导培养基中进行芽的分化诱导培养，促进芽的萌发和生长，得到萌发和生长的蒙古栎腋芽；
S4：外植体的增殖培养
在MS基础培养基中添加0.1-1.0mg/L的6-BA、0.1-1.0mg/L的GA3、0.1-1.0mg/L的NAA、7g/L琼脂和30g/L的d-山梨醇配置增殖培养基，调节增殖培养基pH至5.8，将步骤S3中的得到萌发和生长的蒙古栎腋芽整个接入增殖培养基进行增殖培养，得到蒙古栎幼苗；
S5：外植体的生根培养
在1/2MS基础培养基中添加0.1-1.0mg/L的IBA、7g/L琼脂、30g/L的d-山梨醇和0.5-1.5g/L的活性炭配置生根培养基，调节生根培养基pH至5.8，将步骤S4中的蒙古栎幼苗接入生根培养基进行生根培养，得到蒙古栎生根无菌幼苗；
S6：无菌苗的炼苗驯化
将步骤S5中的蒙古栎生根无菌幼苗从培养室移至温室大棚培养，然后移入轻基质中继续培育成完整的再生植株；
所述步骤S3中的诱导培养期间，采用蓝光进行光照，S4中的增殖培养期间，采用远红光进行光照，S5中的生根培养期间，采用红光进行光照。
2.根据权利要求1所述的一种蒙古栎的组织培养方法，其特征在于，所述步骤S1中的择取外植体的时间为春季的3月中旬至4月中旬。
3.根据权利要求1所述的一种蒙古栎的组织培养方法，其特征在于，所述步骤S2中的外植体的灭菌处理，具体包含如下步骤：
S2.1：外植体在不损伤腋芽和顶芽的基础上除去叶片、叶柄，修剪成至少带一个腋芽或顶芽的茎段；
S2.2：将茎段用洗洁精浸泡30min，再用流水冲洗1～1.5h；
S2.3：将冲洗过后的茎段放置在超净工作台上，用75％酒精进行擦拭消毒20～35s，再用无菌水冲洗3～5次；
S2.4：将无菌水冲洗过后的茎段用0.1%氯化汞消毒3～10min，再用无菌水冲洗3～5次；
S2.5：用无菌吸水纸吸去茎段表面的多余水分，再切除茎段两端消毒死亡部分，得到无菌外植体。
4.根据权利要求1所述的一种蒙古栎的组织培养方法，其特征在于，所述步骤S3中的诱导培养和S4中的增殖培养，培养温度24～26℃，光照时间12～14h/d，光照强度为2000～2500lx，光照培养20～30d。
5.根据权利要求1所述的一种蒙古栎的组织培养方法，其特征在于，所述步骤S5中的生根培养，培养温度20～25℃，光照时间10～16h/d，光照强度为2000～2500lx，培养15～20d。
6.根据权利要求1所述的一种蒙古栎的组织培养方法，其特征在于，所述步骤S3中的诱导培养期间，S4中的增殖培养期间，S5中的生根培养期间，每隔10～13d，转瓶一次。
7.根据权利要求1所述的一种蒙古栎的组织培养方法，其特征在于，所述步骤S3、S4和S5中均用1mol/L的氢氧化钠溶液调节培养基pH值。
8.根据权利要求1所述的一种蒙古栎的组织培养方法，其特征在于，所述步骤S3、S4和S5中的培养过程均在无菌体系条件下进行，通过人工控制外界环境条件进行培养。
9.根据权利要求1所述的一种蒙古栎的组织培养方法，其特征在于，所述步骤S6中的无菌苗的炼苗驯化，具体包含如下步骤：
S6.1：将步骤S5中的蒙古栎生根无菌幼苗从培养室移至温室大棚，松开瓶盖培养3～5d，再打开瓶盖培养5～7d；
S6.2：将开瓶盖培养5～7d的蒙古栎生根无菌幼苗从培养基中移入轻基质中继续培育成完整的再生植株，其中轻基质由泥炭土、稻谷壳和黄心土以6:3:1的体积比混合并用高锰酸钾消毒制成；
S6.3：在培育成完整的再生植株期间，每隔一周喷施多菌灵一次；
S6.4：于外界气温持续1周低于30℃以下时移至大田苗床中，适度密植，温度大于30℃时搭遮阳网，保证水分供应。
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