CN115725565A

CN115725565A - 一种去内毒素的质粒提取方法和试剂盒

Info

Publication number: CN115725565A
Application number: CN202111016375.3A
Authority: CN
Inventors: 郭敏; 邹燕; 于雪
Original assignee: Kangma Healthcode Shanghai Biotech Co Ltd
Current assignee: Kangma Healthcode Shanghai Biotech Co Ltd
Priority date: 2021-08-31
Filing date: 2021-08-31
Publication date: 2023-03-03

Abstract

本发明的去内毒素的质粒提取方法和试剂盒，在中和沉淀液中加入了多聚磷酸，执行步骤S3时：“加入中和沉淀液，离心后提取上清液，得到含内毒素的质粒上清液”，在所得到的含内毒素的质粒上清液中，质粒就被多聚磷酸保护着，这样在加入去内毒磁珠，对溶液中的内毒素进行吸附去除时，就可以减少因为在去内毒磁珠处理并吸附内毒素的时候，也会吸附质粒，而造成的质粒损失，从而增加经过去除内毒素处理后的质粒得率，实现在温和的条件下对质粒中内毒素的去除处理，既不会损失太多质粒，又不会影响质粒的生物活性。

Description

一种去内毒素的质粒提取方法和试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物实验技术领域，具体涉及一种去内毒素的质粒提取方法和试剂盒。

背景技术

在生物医学的许多研究中，尤其是基因治疗和DNA疫苗在癌症﹑单基因遗传病﹑心血管疾病等疾病的诊断和治疗方面，插入核酸信息成为了必要步骤。而作为基因传递工具，质粒可以携带要插入的核酸信息，例如一个通过基因重组技术生成的目的DNA片段。质粒被细胞吞噬后，就将携带的核酸信息导入到生物体细胞的遗传物质中，再由生物体细胞进行繁殖和表达，合成所需要的蛋白质。细菌质粒是重组技术中最常用的载体之一。

因此，在分子生物学研究中，质粒提取和纯化就成为了许多实验中的重要环节。但是，在许多分子生物学及药学相关研究中，用于表达和生成质粒的细胞是含有内毒素(endotoxin)成分的。内毒素是革兰氏阴性菌细胞外壁层的脂多糖类物质(lipopolysaccharides, LPS)，是一种脂多糖-蛋白质的复合物，分子量从几千到几万，在水中能够形成缔合物，相对分子质量可达400,000-1,000,000。当革兰氏阴性菌的细胞死亡或裂解后，细胞壁表面的内毒素就会释放出来，进入溶液中，在提取质粒时，就会与质粒混在一起被提取。

但内毒素会对原代细胞和敏感培养细胞的DNA转染过程造成重要影响，内毒素水平的升高会导致转染效率急剧下降，因此，在大部分的生化实验中，对提取的质粒，需要尽量去除其中混合的内毒素。

但是，细菌内毒素比细菌小得多，其化学组成、形态结构随菌种不同差别较大，但内毒素的热稳定性和化学稳定性极强。彻底灭活内毒素，需要250℃高温干烤一小时，或0.1M的HCL或0.1M的NaOH浸泡4小时，或3-5%双氧水，或重铬酸钾硫酸清洁液（重铬酸钾:硫酸:水为1:1:10或1:2:8）浸泡4小时以上。在医用领域中，现有的去除内毒素技术，通常是采用蒸馏+高温灭活法。但是，上述的技术手段，例如高温、加入强酸/强碱化学试剂等，都会导致溶液中的其他成分，如质粒等有用的成分，变性失效，或至少失去生物活性。故上述的蒸馏+高温灭活法、加入强酸/强碱等化学品法，都不适合在实验室中提取质粒时，用于去除内毒素。

因此，现有技术有待于进一步改进和提高。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种去内毒素的质粒提取方法和试剂盒。

本发明首先公开了一种去内毒素的质粒提取方法，接种培养含有目的质粒的菌群，离心去除上清液，得到菌群沉淀，对所述菌群沉淀，依次执行以下步骤：

S1. 向所述菌群沉淀中加入悬浮液，将细胞悬浮；

S2. 加入裂解液，裂解细胞膜后得到溶解有质粒的菌体裂解液；

S3. 加入中和沉淀液，离心后提取上清液，得到含内毒素的质粒上清液；

S4. 向所述质粒上清液中加入去内毒磁珠，震荡后磁吸，导出无内毒素的质粒上清液；

S5. 向所述无内毒素的质粒上清液中加入磁珠悬浮液，磁吸后收集磁珠，所述磁珠为含质粒磁珠；

S6. 向所述含质粒磁珠中加入漂洗液，磁吸固定并收集漂洗后的含质粒磁珠；

S7. 向所述含质粒磁珠中加入洗脱液，释放并回收所述质粒；

其中，所述中和沉淀液包括多聚磷酸。

本发明的去内毒素的质粒提取方法，在中和沉淀液中加入了多聚磷酸，执行步骤S3时：“加入中和沉淀液，离心后提取上清液，得到含内毒素的质粒上清液”，在所得到的含内毒素的质粒上清液中，质粒就被多聚磷酸保护着，这样在加入去内毒磁珠，对溶液中的内毒素进行吸附去除时，就可以减少因为在去内毒磁珠处理并吸附内毒素的时候，也会吸附质粒，而造成的质粒损失，从而增加经过去除内毒素处理后的质粒得率，实现在温和的条件下对质粒中内毒素的去除处理，既不会损失太多质粒，又不会影响质粒的生物活性。

根据上述去内毒素的质粒提取方法，本发明还公开了一种去内毒素的质粒提取试剂盒，包括悬浮液、裂解液、中和沉淀液、漂洗液、洗脱液、磁珠悬浮液，还包括去内毒磁珠；其中，所述中和沉淀液包括盐酸胍和乙酸钾，并使用叶酸调节为酸性；所述中和沉淀液还包括多聚磷酸；所述悬浮液包括Tris和EDTA，并使用NaOH调节为碱性；所述裂解液包括NaOH和SDS；所述漂洗液包括乙醇；所述洗脱液为包括Tris和EDTA的缓冲液或纯净水；所述磁珠悬浮液为包括粒径50~100nm的磁性纳米微球的悬浮液；所述去内毒磁珠包括磁珠本体，所述磁珠本体的表面连接有多粘菌素。

本发明的去内毒素的质粒提取试剂盒，将采用磁珠法提取质粒的各个质粒提取试剂和表面连接有多粘菌素的去内毒磁珠组合在一起，在质粒提取的过程中，就将内毒素去除，并且由于在提纯质粒的中和沉淀液中添加了多聚磷酸，保护了质粒，因此减少了在后续的去内毒磁珠处理中，因为也会吸附质粒而产生的质粒损失，增加了经过提纯处理的质粒得率，实现了在温和的条件下去除质粒中的内毒素，既不会损失太多质粒，又不会影响质粒的生物活性。

优选地，所述中和沉淀液包括4.5M盐酸胍和0.75M乙酸钾。

更优选地，所述中和沉淀液还包括15g/L的多聚磷酸。

优选地，所述中和沉淀液的PH值为4.3。

根据实验，具体确定了所述中和沉淀液的上述配方。

优选地，所述悬浮液包括10mM Tris和10mM EDTA，并使用NaOH调节PH至8.0。本发明使用所述悬浮液，使得含目的质粒的细胞在溶液中悬浮，方便后续裂解处理。

优选地，所述裂解液包括0.2M NaOH和1%m/V的SDS。即本发明的质粒提取，采用碱裂解法，将细胞裂解，释放质粒进溶液。

优选地，所述漂洗液包括体积浓度为80%的乙醇。使用所述漂洗液对磁性纳米微球及其上吸附的质粒加以漂洗，去除粘附的溶液成分，可进一步保证后续采集的质粒的纯度。

优选地，所述洗脱液为包括10mM Tris和1mM EDTA的缓冲液或纯净水。吸附在磁性纳米微球上的质粒，然后被所述洗脱液洗脱下来并被收集。

优选地，所述多粘菌素通过酰胺化反应连接羧基基团，所述羧基基团连接在磁珠本体的表面。本发明使用的去内毒磁珠，通过表面连接的多粘菌素，完成对内毒素的吸附。而多粘菌素又是通过羧基基团连接到磁珠本体的表面上的。

更优选地，所述去内毒磁珠还包括包被所述磁珠本体的二氧化硅层，所述羧基基团连接所述二氧化硅层和所述多粘菌素。设置二氧化硅层，对所述磁珠本体加以钝化，从而防止磁珠与其他化学物发生非预期的反应。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的去内毒素的质粒提取方法的流程图；

图2是本发明的去内毒素的质粒提取试剂盒的整体结构示意图；

图3是本发明的去内毒磁珠的结构示意图；

图中： 10-质粒提取组；11-悬浮液；12-裂解液；13-中和沉淀液；14-磁珠悬浮液；15-漂洗液；16-洗脱液；20-内毒去除组；21-磁珠本体；22-二氧化硅层；23-羧基基团；24-多粘菌素；25-内毒素。

具体实施方式

本发明提供了一种去内毒素的质粒提取方法和试剂盒，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供的去内毒素的质粒提取方法，在提取之前，接种培养含有目的质粒的菌群，离心去除上清液，得到菌群沉淀，再向所述菌群沉淀中，依次加入不同的试剂，使用碱裂解法裂解细胞膜，释放质粒，并在提取质粒的同时，执行去内毒素的处理。具体步骤如图1的流程图所示，首先执行步骤S1，向所述菌群沉淀中，加入悬浮液11，将细胞悬浮；然后执行步骤S2：加入裂解液12，裂解细胞膜，释放细胞内的成分，包括质粒、内毒素25等，进入溶液中；再执行步骤S3：加入中和沉淀液13，中和溶液中的强碱，并将溶液中的蛋白质等沉淀并清除。其中，所述中和沉淀液13中加入了多聚磷酸(Polyphosphoric acid, PPA)。离心后的上清液中基本只剩下内毒素25和经过多聚磷酸保护的质粒；然后执行步骤S4：加入去内毒磁珠，震荡后磁吸，内毒素25就被吸附在去内毒磁珠上，随后被去除，溶液中就基本只剩下质粒；再执行步骤S5：加入磁珠悬浮液14，吸附质粒至磁珠；然后执行步骤 S6：使用漂洗液15漂洗磁珠；最后执行步骤S7：使用洗脱液16，将质粒从磁珠上洗脱下来并收集，从而完成去内毒素的质粒提取。

具体地，首先接种培养含有目的质粒的菌群，离心去除上清液后，得到菌体沉淀。然后向所述菌体沉淀中依次加入本发明的去内毒素的质粒提取试剂盒中的各种试剂，如图2所示，包括质粒提取组10和内毒去除组20，其中，质粒提取组10具体包括悬浮液11、裂解液12、中和沉淀液13、磁珠悬浮液14、漂洗液15、和洗脱液16。详细描述如下：

悬浮液11，包括10mM Tris和10mM EDTA，并使用NaOH调节PH至8.0；用于将细胞悬浮，方便后续处理；

裂解液12，包括0.2M NaOH和质量体积比1%的SDS水溶液；在一个更佳的实施例中，还包括15mM Tris，用于缓冲裂解液12的PH值；NaOH用于裂解细胞膜，释放细胞内的成分至溶液中，包括质粒、内毒素、蛋白、细胞核中的长链核酸等；同时，SDS缠绕溶液中的蛋白和长链核酸等大分子，形成络合物；和

中和沉淀液13，包括4.5M盐酸胍和0.75M乙酸钾，并使用叶酸调节为酸性，以中和NaOH，而钾盐则与SDS生成沉淀，将溶液中的蛋白和长链核酸等与SDS缠绕形成的络合物，都通过沉淀去除。同时，在所述中和沉淀液13中还加入了15g/L的多聚磷酸，对质粒加以保护，减少在后续去除内毒素的时候，由于质粒也被去内毒磁珠吸附而造成的损失；所述中和沉淀液13的PH值为4.3。

在加入所述中和沉淀液13并完成反应后，离心去除沉淀，提取上清液，上清液中基本只剩下了多聚磷酸保护的质粒和内毒素。

然后向上清液中加入内毒去除组20中的去内毒磁珠，以对上清液中的内毒素加以吸附。加入所述去内毒磁珠后，震荡，促进上清液中的内毒素接触所述去内毒磁珠，并被吸附；然后磁吸固定住所述去内毒磁珠，就可以将去除了内毒素的质粒上清液导出。这样就完成了去除质粒中内毒素的操作。同时，所述上清液中的质粒，因为所述多聚磷酸的保护，基本不被加入的去内毒磁珠吸附，还继续保留在上清液中，形成质粒上清液。

然后再在去除了内毒素的所述质粒上清液中加入磁珠悬浮液14，对质粒加以吸附，磁吸后就获得含质粒磁珠。其中，所述磁珠悬浮液14为包括粒径50~100nm的磁性纳米微球的悬浮液。

为了进一步去除含质粒磁珠中的杂质，还需要使用漂洗液15来执行至少一次漂洗处理。所述漂洗液15优选为体积比80%的乙醇水溶液。

经过漂洗后的含质粒磁珠，仍然采用磁吸法固定于反应试管中，再加入洗脱液16，将质粒从磁珠上洗脱。其中，所述洗脱液16为包括10mM Tris和1mM EDTA的缓冲液或纯净水。

这样，就完成了全部的去内毒素的质粒提取纯化。

本发明所使用的所述去内毒磁珠的具体结构，如图3所示，包括磁珠本体21，例如四氧化三铁Fe₃O₄的纳米颗粒等。所述磁珠本体21的表面通过羧基基团23连接多粘菌素24。其中，所述羧基基团23可以直接连接在所述磁珠本体21的表面，也可以在所述磁珠本体21的表面先包被一层保护性的二氧化硅层22，厚度约为，例如磁珠本体21的尺寸的1/20，起钝化所述磁珠本体21的作用，再将所述羧基基团23的碳原子端，链接到所述二氧化硅层22的表面。

最后将多粘菌素24连接在所述羧基基团23的两个氧原子端，就制成本发明使用的通过吸附以去除内毒素的去内毒磁珠。

使用本发明的去内毒素的质粒提取试剂盒，进行了去内毒素的质粒提取对比实验。具体为：1号样品在中和沉淀液中加入了15g/L的多聚磷酸，2号样品的中和沉淀液中没有加多聚磷酸。实验结果如下表所示：

表1：去内毒素后质粒提取的对比实验：

表1中可见，1号样品中，在中和沉淀液里加入了多聚磷酸，经过三次去内毒素处理，溶液中的质粒含量基本没有变化（474.2、476.5、486.6、487.7）。而2号样品中，没有加入多聚磷酸，每次去内毒素处理，溶液中的质粒含量都下降较多（14.1%、18.2%、29.9%），三次共降低50.7%。

综上所述，本发明的去内毒素的质粒提取方法和试剂盒，将采用磁珠法提取质粒的质粒提取操作，和使用表面连接有多粘菌素24的去内毒磁珠吸附以去除内毒素的操作，组合在一起，在质粒提取的过程中，就将内毒素25去除，并且由于在提纯质粒的中和沉淀液13中添加了多聚磷酸，保护了质粒，不但大大减少了去内毒磁珠对质粒的吸附，增加了经过内毒素提纯处理后的质粒得率，还实现了在温和的条件下对质粒中内毒素的去除处理，故不影响质粒的生物活性。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.一种去内毒素的质粒提取方法，其特征在于，接种培养含有目的质粒的菌群，离心去除上清液，得到菌群沉淀，对所述菌群沉淀，依次执行以下步骤：

S1. 向所述菌群沉淀中加入悬浮液，将细胞悬浮；

S7. 向所述含质粒磁珠中加入洗脱液，释放并回收所述质粒；

其中，所述中和沉淀液包括多聚磷酸。

2.一种去内毒素的质粒提取试剂盒，其特征在于，包括悬浮液、裂解液、中和沉淀液、漂洗液、洗脱液、磁珠悬浮液，还包括去内毒磁珠；其中，

所述中和沉淀液包括盐酸胍和乙酸钾，并使用叶酸调节为酸性；

所述中和沉淀液还包括多聚磷酸；

所述悬浮液包括Tris和EDTA，并使用NaOH调节为碱性；

所述裂解液包括NaOH和SDS；

所述漂洗液包括乙醇；

所述洗脱液为包括Tris和EDTA的缓冲液或纯净水；

所述磁珠悬浮液为包括粒径50~100nm的磁性纳米微球的悬浮液；

所述去内毒磁珠包括磁珠本体，所述磁珠本体的表面连接有多粘菌素。

3.根据权利要求2所述的质粒提取试剂盒，其特征在于，所述中和沉淀液包括4.5M盐酸胍和0.75M乙酸钾。

4.根据权利要求3所述的质粒提取试剂盒，其特征在于，所述中和沉淀液还包括15g/L的多聚磷酸。

5.根据权利要求2或３或4所述的质粒提取试剂盒，其特征在于，所述中和沉淀液的PH值为4.3。

6.根据权利要求2或３或4所述的质粒提取试剂盒，其特征在于，所述悬浮液包括10mMTris和10mM EDTA，并使用NaOH调节PH至8.0。

7.根据权利要求2或３或4所述的质粒提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括0.2MNaOH和1%m/V的SDS。

8.根据权利要求2或３或4所述的质粒提取试剂盒，其特征在于，所述漂洗液包括80%V/V的乙醇。

9.根据权利要求2或３或4所述的质粒提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液为包括10mMTris和1mM EDTA的缓冲液或纯净水。

10.根据权利要求2或３或4所述的质粒提取试剂盒，其特征在于，所述多粘菌素通过酰胺化反应连接羧基基团，所述羧基基团连接在所述磁珠本体的表面。

11.根据权利要求10所述的质粒提取试剂盒，其特征在于，所述磁珠本体的表面包被二氧化硅层，所述羧基基团连接所述二氧化硅层和所述多粘菌素。