JP2005531329A - 沈殿剤としてポリカチオン性ポリマーを用いる核酸の単離 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明の方法は、生物学的溶液に対してポリカチオン性沈殿剤を添加すること、及び所望の核酸との複合体を形成させることによってこの所望の核酸を選択的に沈殿させる工程を含み、ここで、この沈殿剤は四級アミノ基を含む高度に荷電した直鎖状ポリマーである。このポリカチオン性沈殿剤は好ましくは、ポリカチオン性沈殿剤と核酸との間の電荷比[+]/[−]が、沈殿の間に0.5以上、好ましくは0.9以上、そして最も好ましくは1以上であるような量に添加されて、塩濃度の存在下で、核酸/ポリカチオン複合体の定量的な特異的な沈殿を確実にする。
Description
本発明の目的は、他の核酸、タンパク質、他の高分子量化合物、塩及び他の低分子量物質を含み得る溶液から、この溶液中にこのような他の種を残したままで、核酸を単離する選択的方法を提供することである。これは、添付の特許請求の範囲に記載の方法によって達成される。
「生物学的溶液」という用語は、本明細書においては、核酸のような生物学的物質が存在し得る任意の溶液について用いる。従って、この用語は水溶液、例えば、緩衝液、細胞溶解物などを包含する。
本発明の第一の局面は、生物学的溶液から核酸を単離する方法であって、この方法は、この溶液に対してポリカチオン性沈殿剤を添加すること、及びこの所望の核酸との可溶性の複合体を形成させることによって、この所望の核酸を選択的に沈殿させる方法を含み、ここで、この沈殿剤は四級アミノ基を含む高度に荷電した直鎖状ポリマーである。この方法は、所望の核酸が沈殿されるが、この溶液中の他の核酸及び他の分子は沈殿されないという点に関して選択性である。好ましくは、この薬剤は、塩の存在下で、ポリカチオン性沈殿剤と核酸との間の電荷比[+]/[−]が、沈殿の間に約0.5以上であるような量に添加される。以下にさらに詳細に考察するとおり、塩濃度は好ましくは沈殿の間に制御される。有利な実施形態では、この電荷比は、沈殿の間、約9以上、好ましくは1以上である。
必要に応じて、この沈殿物を例えば、水又は適切な緩衝液を用いて、その溶解の前に洗浄してもよい。
図1は、異なる電荷比、すなわち異なる[+]/[−]における、異なるプラスミド又はRNAを用いたポリカチオン性沈殿剤によって形成された複合体の溶解度が1M酢酸カリウムでどうであるかという研究を示す溶解度クロマトグラムである(実施例7を参照のこと)。プラスミドDNA又はRNAとポリカチオン性沈殿剤との混合を研究して得られたデータを上清に残留するDNAの部分対[+]/[−]として示す。
以下の実施例は、例示の目的のためにのみ提供しており、添付の特許請求の範囲によって規定されるように本発明を制限すると解釈されるべきではない。本出願において以下に又は他のいずれかに示される全ての引用文献は本明細書に参考として援用される。
発酵培地:
30g Tryptone soya broth/L(OXOID)
10g 酵母エキス/L(Gistex)
10g デキストロース/L
100mg アンピシリン)/L(Sigma(米国ミズーリ州セントルイス))
発現プラスミド及び細菌株:
総プラスミドサイズ5.9kbpを与えるRhodothermus marinus(3kbp)由来のキシラナーゼ遺伝子インサートを有するプラスミドpBluescript II KS(+/−)2.9kbpを有するE.coli XL1 Blue(Eva Nordberg Karlsson,Xylan degradation by the thermophilic bacterium Rhodothermus marinus:Characterization and function of thermostable xylanase.Doctoral thesis,Department of Biotechnology,Lund University,Sweden,1999,ISBN 91−628−3598−X)。
100mlの発酵培地を含有する500mlの振盪スラスコ(37℃、160rpm、9h)中で、プラスミドを保有するE.coli細胞を2(OD600nm)の光学密度まで増殖させた。この一晩培養物の各々10mlを用いて、各々が100mlの発酵培地を含む4個の500mlの振盪フラスコに接種して、細胞をさらに9時間(37℃、160rpm)、6.5の光学密度(OD600nm)まで増殖させた。この培養物の全て(400ml)を用いて、10Lの発酵培地を含む15Lの発酵槽(Electrolux)に接種した。この細胞を8.5時間(37℃、600rpm)、12.5の光学密度(OD600nm)まで増殖させた。発酵の間、1M NaOHの添加によってこの培地のpHを7に保ち、そしてときおりアデカノール(旭電化工業株式会社)を添加することによって、発泡を阻害した。10L の細胞培養物を無菌の配管を通して、400Lの発酵培地を含む784Lの発酵槽(Belach bioteknik AB(スウェーデン、ストックホルム))中にポンピングした。この細胞を10時間(37℃)、13の光学密度(OD600nm)まで増殖させた。発酵の間、5M NaOHの添加によってこの培地のpHを7に保ち、そしてアデカノールの添加によって、発泡を阻害した(コントロールユニット)。3.5kgのデキストロースを含有する8Lの水をまた、培養の間発酵槽中にポンピングした(供給バッチ、コントロールユニット)。酸素要求によって撹拌速度をコントロールした。1.2L/分の供給速度に操作したシャープレス遠心分離において15000rpmでの遠心分離によって細胞を収集した。得られた細胞ペーストを5g、25g、及び300gのアリコートとして−80℃で貯蔵した。
以下のようなアルカリ溶解方法によって細胞溶解を行なった:
実施例1からの5gの細胞ペーストを解凍して、穏やかなボルテックスによって、36mlの10mM Tris−HCl(pH8)61mMグルコース、50mM EDTA中に完全に再懸濁した。磁気撹拌装置を備えたプラスチックビーカーに細胞懸濁液を移して、78mlの0.2M NaOH含有1%SDSを添加して、穏やかな撹拌を室温で7分間継続した。このインキュベーション期間後に、59mlの冷(5℃)3M KAc(pH5.5)を添加して、その溶液を氷浴中で20分間、磁気撹拌によって穏やかに混合した。形成された白色沈殿物をSorvall GSAローター中での4℃で10000rpmの30分間の遠心分離によって除去した。この上清を最後にナイロンネット(Falcon Cell Strainer、孔径35μm)を通して濾過した。
実施例2からの清澄化溶解物を4℃で6日間保管した。形成された沈殿物をSorvall GSAローター中での4℃で10000rpmの30分間の遠心分離によって除去した。
固体ゼオライトY(モル比430のSiO2/Al2O3を有するゼオライトYは、東ソー株式会社から入手した)と25mM Tris−HCl(pH8)及びNaClとを混合することによって、ゼオライト上清(160mg/ml)を調製した。Tris−HClの最終濃度は2mMであって、NaCl濃度は0.2Mであった。20分間の穏やかな混合の間に上清を室温でインキュベートした。次いで、52.5mlのゼオライト上清を、実施例2に記載されるとおり調製した105mlの清澄化溶解物に添加して、60秒間混合し、次いで13000×gで4℃で10分間遠心分離した。この上清を収集して、使用するまで冷蔵庫に保管した。
実施例1からの細胞ペーストを解凍して、プラスミドDNAを、Qiagen Plasmid Megaキット(Qiagen GmbH(ドイツ、ヒルデン))によって、製造業者の指示に従って精製した。
Sephacryl(商標)S−500ビーズ(Amersham Biosciences AB(スウェーデン、ウプサラ))をXK 16/20カラム(Amersham Biosciences AB(スウェーデン、ウプサラ))に充填して、AKTA(商標)explorer 10システム(Amersham Biosciences AB(スウェーデン、ウプサラ))に取り入れた。このカラムを2M KAc(pH5.5)で平衡化して、1mlのサンプルを注入して、1ml/分の流速で泳動した(30cm/h)。この溶出したピークを260nm及び280nmで検出した。
TBE緩衝液(0.089M Tris−ホウ酸塩(pH8.0)、2mM EDTA)中において0.7%アガロースゲル上でゲル電気泳動を行なった。15μlのサンプルを各々のウェルにロードして、電気泳動用電源(EPS 301,Amersham Biosciences AB(スウェーデン、ウプサラ))によって電力を供給したHoefer(商標)HE33 Mini水平サブマリンユニット(Amersham Biosciences AB(スウェーデン、ウプサラ))上で60Vで60分間、このサンプルを泳動した。泳動後、1ml当たり1.5μg臭化エチジウムを含有する100mlのTBE緩衝液にゲルを浸漬することによって、このアガロースゲルを臭化エチジウムで染色した。Alpha Innotech Corporation(米国カリフォルニア州サンレアンドロ)のゲルドキュメンテーションソフトウェアAlphaImager 2200 v5.5を用いて、このアガロースゲルを解析して写真撮影した。
260nmで吸光度を測定すること、及び1リン酸基について計算されるようにモル吸光係数6500M−1cm−1を仮定することによって核酸の濃度を決定した。核酸の濃度は、リン酸基の濃度、すなわち負電荷の濃度として示される。
実施例3に記載されるように調製した0.1mlのプラスミドDNA溶液(pJV4又はpBluescript,6kbp)又は0.1mlのRNA溶液(Sigma(米国ミズーリ州セントルイス)のパン酵母より)を0.05mg/mlの濃度で3M酢酸カリウム溶液(pH5.5)及びポリカチオン溶液(2mMの濃度で2〜50μl(対応するモノマー濃度に基づく))と混合した。最終容積は1.0mlであって、最終酢酸カリウム濃度は1Mであった。少なくとも1分間の激しい振盪及び14100gで10分間の遠心分離後、上清中の残留する核酸の量(260nmでの吸光度)を測定することによって、多価電解質複合体の形成をモニターした。この結果を溶液中に残留する核酸対電荷の比[+]/[−]として図1に示す。
0.75mlのプラスミドDNA溶液(pJV4,実施例3に記載のとおり調製)を0.05mg/mlの濃度で、0.075ml RNA溶液(Sigma(米国ミズーリ州セントルイス)、パン酵母から)を10mg/mlで、0.5ml 3M酢酸カリウム溶液(pH5.5)及び0.175ml蒸留水を、0.08ml 2mM(対応する単量体濃度に基づく)のポリカチオン性沈殿剤([+]/[−]=1.4に相当)と激しく混合した。14100gで10分間の遠心分離後、上清を取り出して、ペレットを1.5ml 2M酢酸カリウム(pH5.5)に溶解した。この解析を、実施例4に記載の方法に従って、出発溶液(プラスミドDNA、RNA及び緩衝液(ポリカチオン性沈殿剤の添加なし))、上清及び溶解したペレットで行なった。結果を図2に示す。
実施例2.1に従って調製された0.5mlの溶解物に0.5mlの蒸留水を添加した。この溶液に4.7μl 2mM(相当する単量体濃度に基づく)のポリカチオン性沈殿剤([+]/[−]=1に相当)を添加した。激しい振盪及び14100gで10分間の遠心分離後、上清を新しい試験管に移して、同じ量のポリカチオン性沈殿剤を再度添加した。この手順を4回繰り返した。ブランクとしてプラスミドDNAの溶液及び蒸留水を用いた。全てのペレットを1ml 2M酢酸カリウム(pH5.5)に溶解した。このサンプルを実施例5に記載のとおり、アガロースゲル電気泳動で解析した。
0.5mlの清澄化アルカリ溶解物(実施例2.1によって調製された)に、0.480mlの蒸留水を添加した。5つの同一のサンプルを、試験管中で、各々に18.9μl 2mM(相当する単量体濃度に基づく)のポリカチオン溶液([+]/[−]=4に相当)を添加することによって調製した。激しい混合及び14100gで10分間の遠心分離後、5つの上清を新しい試験管に移した。この上清に、4.7、9.7、14.2、18.9及び23.6μl([+]/[−]=1、2、3、4、5に相当)のポリカチオン溶液をそれぞれ2mMの濃度で添加した。ブランクとして清澄化アルカリ性溶解物の溶液及び蒸留水を用いた。全てのペレットを1ml 2M酢酸カリウム(pH5.5)に溶解した。このサンプルを実施例5に記載のとおり、アガロースゲル電気泳動で解析した。
AKTA(商標)エクスプローラーシステムに組み込み、そして0.5M NaClを含有する25mM Tris−HCl(pH8)で平衡化したMiniQカラム(4.6×50mm)(全てAmersham Biosciences(スウェーデン、ウプサラ)から入手)上での解析的イオン交換クロマトグラフィーによって、スーパーコイルプラスミドの回収を決定した。清澄化アルカリ性溶解物サンプルにおけるプラスミドの定量におけるRNAの干渉を回避するために、これらをRNase(100μg/ml)とともに解析の前に15分間インキュベートした。100μlのサンプルをカラムに注射し、次いで18カラム容積の0.5〜0.8M NaCl勾配を適用することによって、吸着された核酸を溶出させた。カラムからの溶出物を260nm及び280nmにおいてUV吸光度によってモニターした。この解析は0.4ml/分の流速で行なった。
ゼオライト処理溶解物(実施例2.2)に、11.1ml 2mM PDMDAAC(相当する単量体濃度に基づく)を添加した。水の添加によって最終容積を210mlに設定した。このサンプルを約60秒間混合して、14100gで10分間(15〜20℃)遠心分離した。上清をデカントした後、このペレットを2M NaClを含有する5ml 25mM Tris−HCl(pH8)中に再溶解した。クロマトグラフィー解析(実施例4及び11)を行なって、プラスミドDNA及びRNAの含量を決定したが、タンパク質についてはBCA法を用いた(Sigma手順番号TPRO−562)。清澄化した溶解物、ゼオライト処理した溶解物及び再溶解したペレットをこれらの方法によって解析した。この解析の結果を表1に提示する。
Claims (17)
- 他の核酸、タンパク質、他の高分子量化合物、塩及び他の低分子量物質を含み得る生物学的溶液から核酸を単離する方法であって、該方法は、該溶液に対してポリカチオン性沈殿剤を添加すること及び所望の核酸との可溶性複合体を形成させることによって、溶液中に他の種を残したままで、該所望の核酸を選択的に沈殿させる工程を含み、該沈殿剤は四級アミノ基を含む高度に荷電した直鎖状ポリマーであり、該沈殿剤は、塩の存在下で、ポリカチオン性沈殿剤と核酸との間の電荷比[+]/[−]が、沈殿の間に約0.5以上、好ましくは約1以上であるような量に添加される、方法。
- 沈殿剤が、25以上の正電荷を含む、請求項1記載の方法。
- 沈殿剤の添加の前に生物学的溶液における負電荷の数を推定する工程を含む、請求項1又は請求項2記載の方法。
- 所望の核酸がプラスミドである、請求項1乃至請求項3のいずれか1項記載の方法。
- 生物学的溶液が細胞溶解物である、請求項1乃至請求項4のいずれか1項記載の方法。
- 細胞溶解物がアルカリ性の細胞溶解物である、請求項5記載の方法。
- 細胞溶解物が沈殿剤の添加の前に予め処理される、請求項5又は請求項6記載の方法。
- 沈殿剤におけるポリマー分子量(1モル当たりのグラム)/ポリマー電荷(ポリマー1鎖当たりの電荷の数)の比が約1000未満、好ましくは約400未満である、請求項1乃至請求項7のいずれか1項記載の方法。
- 沈殿剤が約500以上、好ましくは約1000以上の正電荷を含む、請求項8記載の方法。
- 沈殿剤が、ポリ(N,N’−ジメチルジアリルアンモニウムクロライド)、脂肪族イオネンブロミド及びポリ(N−アルキル−4−ビニルピリジニウムハライド)からなる群から選択される、請求項1乃至請求項9のいずれか1項記載の方法。
- 溶液の塩濃度が、核酸/ポリカチオン複合体の定量的選択的な沈殿を可能にするために沈殿剤の添加の間に制御される、請求項1乃至請求項10のいずれか1項記載の方法。
- 溶液から沈殿物を分離することによって形成される沈殿物から所望の核酸を回収する工程、及び引き続く複合体の溶解、及び/又は破壊をまた含む、請求項1乃至請求項11のいずれか1項記載の方法。
- 多価電解質複合体が、溶液において所望の核酸を遊離するための塩の添加によって溶解されるか及び/又は破壊される、請求項12記載の方法。
- 複合体の溶解及び/又は破壊が、電荷比[+]/[−]及び塩の性質に依存して、0.5Mを超える、好ましくは3Mを超える塩濃度で行なわれる、請求項12又は請求項13のいずれか1項記載の方法。
- 沈殿物を分離した後の溶液から所望の核酸を回収する工程をまた含む、請求項1乃至請求項14のいずれか1項記載の方法。
- 形成された第一の沈殿物から第一の所望の核酸を単離する工程と、生物学的溶液から該第一の沈殿物を分離する工程と、沈殿剤の連続的な添加によって残りの溶液から第二の所望の核酸を沈殿する工程とを含む、請求項12乃至請求項15のいずれか1項記載の方法。
- 修飾反応に供されている核酸を単離するための、請求項1乃至請求項16のいずれか1項記載の方法の使用。
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