CN115710269A - 多色苝酰亚胺荧光染料及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了多色苝酰亚胺荧光染料及其合成方法和应用，该多色苝酰亚胺荧光染料结构通式如式（I）所示。本发明多色苝酰亚胺荧光染料合成步骤少，制备方法简单，产率高。所得荧光染料保持苝酰亚胺优异的光学性质的同时，进一步提高了苝酰亚胺荧光染料的光稳定性，并将荧光发射波长拓展至732nm(乙醇)，达到了近红外区。此外，该染料生物毒性低，具有较好的生物相容性，不仅能够在多种活细胞内特异性标记脂滴，而且能够匹配不同荧光染料满足多色荧光成像。本发明在脂滴荧光成像领域具有巨大应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及荧光染料领域，具体地说是涉及多色苝酰亚胺荧光染料及其合成方法和应用。
背景技术
苝酰亚胺(PDIs)作为一种常用荧光染料，具有荧光量子产率高、热稳定、光和化学稳定的特点。但是，由于疏水性和π键的缘故，PDIs的水溶性较差，在水溶液中往往存在成像强度比较弱的缺陷。此外，在苝酰亚胺成像实验过程中，多色标记常给科研人员带来困扰，如目的标记荧光与组织的自发荧光区分不开、几种非特异性的荧光标记波谱范围特别靠近等。若要实现多色成像，往往需要在孵育细胞的过程中加入多种染料，这不仅增加了实验成本，其细胞毒性也未可知。
脂滴曾经被认为仅仅是惰性的脂肪颗粒(LDs)，现在人们发现它实际是由纯有机中性脂质核心组成的高度动态的细胞器，脂滴形态的差异通常反映了细胞内的代谢状态。脂滴功能障碍和相关机制与许多病理状况相关，包括流行的代谢疾病，如肥胖、糖尿病和动脉粥样硬化。此外，由于癌细胞需要过量的能量，已经在一系列癌症中观察到脂滴积累，包括处于缺氧或饥饿状态下的癌细胞。尽管最近认识到脂滴的重要性以及脂滴与代谢疾病和癌症之间新出现的相关性，但许多基本问题仍然没有答案。
商业化的脂滴荧光染料主要有尼罗红(Nile Red)和BODIPY493/503，但是，这些染料仍存在着一些重要的缺陷：荧光背景强和斯托克斯位移小。此外，这些传统的荧光分子还面临着聚集诱导淬灭(aggregation-caused quenching，ACQ)的问题。ACQ导致这些分子只能在低浓度下使用，在脂滴成像中极易因光漂白发生荧光强度快速减弱。
因此，急需开发一种新型荧光染料，能够同时满足高亮度、高光稳定性、多色脂滴成像，以简单高效地实现对活细胞不同细胞器的观察。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明的目的就是提供一种，能够同时满足高亮度、高光稳定性、多色脂滴成像的荧光染料及其合成方法和应用。
本发明多色苝酰亚胺荧光染料在保持苝酰亚胺优异的光学性质的同时，进一步提高了苝酰亚胺类染料的光稳定性，并将荧光发射波长拓展至732nm(乙醇)，达到了近红外区。该荧光染料能够特异性标记多种细胞内脂滴，具有紫外吸收强度好、荧光量子产率高、生物毒性低、生物相容性好等特点，能够用于活细胞及活体多色荧光成像。
多色苝酰亚胺荧光染料，其结构通式如式(I)所示：
其中，R1、R2、R3、R4分别独立地为氢、C1-60烷基氨基、C1-60烷基酰胺基、C3-10环烷基氨基、C3-10环烷基单酰胺基、C3-10环烷基双酰胺基、C3-10环烷基单酮胺基或C3-10环烷基多酮胺基；
R5、R6分别独立地为芳基、C1-C20直链烷基、C1-C20支链烷基、六元环状烷基或羧基衍生物；所述羧基衍生物具有下述式(II)的结构：
式(II)中，R7为芳基、C1-C20直链饱和烷基、C1-C20直链不饱和烯烃基、C1-C20支链烷基、C3-C7直链卤代烷基或C3-C7支链卤代烷基。
优选地，R1、R2、R3、R4分别独立地为氢或如下基团中的一种：
其中，n代表1-5的整数。
更优选地，多色苝酰亚胺荧光染料具有如下结构：
多色苝酰亚胺荧光染料的合成方法，其合成路线如下：
其中，R1 ’、R2 ’和R3 ’各自独立地为氢或溴。
具体合成步骤如下。
步骤1：苝酐与氨基衍生物反应，得到苝酰亚胺衍生物：
将苝酐、氨基衍生物和咪唑加入双口烧瓶中，抽换气，氮气保护下升温，反应，向其中加入乙醇，降温，反应，将反应液倒盐酸溶液中，经过滤，洗涤，干燥得苝酰亚胺衍生物。
步骤2：苝酰亚胺衍生物与溴或含溴化合物反应生成中间体单溴或多溴取代苝酰亚胺：
将苝酰亚胺衍生物、碳酸钾、溴或含溴化合物和三氯甲烷加入双口烧瓶中，调节温度，反应，向其中加入亚硫酸氢钠溶液，经洗涤，干燥，过滤，旋干，过柱得单溴或多溴取代苝酰亚胺。
步骤3：上述步骤2所得单溴或多溴取代苝酰亚胺与氮杂环烷烃衍生物反应，或与氮杂环酮衍生物反应，或与羟基氮杂环烷烃衍生物反应再加入戴斯马丁氧化剂氧化，即可得到具有式(I)结构的多色苝酰亚胺荧光染料。
单溴或多溴取代苝酰亚胺，氮杂环烷烃衍生物或氮杂环酮衍生物(或羟基氮杂环烷烃衍生物)，三乙胺，N-甲基吡咯烷酮加入反应管中，抽换气，氮气保护下升温，反应，降温，抽干N-甲基吡咯烷酮，向其中加入二氯甲烷，经萃取，干燥，过滤，旋干，淋洗，过中压制备色谱柱，(得羟基氮杂环烷烃取代化合物，再向其中分批加入戴斯马丁氧化剂进行氧化，经淬灭、萃取、干燥，过滤，旋干、淋洗、过中压制备色谱柱)得到具有通式I结构的多色苝酰亚胺荧光染料。
本发明提供一种多色苝酰亚胺荧光染料的合成方法，该方法具有简单易操作、合成步骤少、产率高等优点。
一种多色苝酰亚胺荧光染料在脂滴荧光成像领域的应用。上述一种多色苝酰亚胺荧光染料在活细胞及活体内能够对脂滴进行特异性标记并实现多色荧光成像。
本发明具有以下特点：
本发明的荧光染料拥有合成方法简单、合成步骤少且产率高等优点。
本发明的荧光染料在发射波长及激发波长均达到了近红外区，稳定性高，组织穿透能力强，对细胞损伤小，更有利于活细胞及活体成像。
本发明的荧光染料在活细胞及活体内能够对脂滴进行特异性标记，并实现多色荧光成像。
附图说明
图1是多色苝酰亚胺荧光染料的紫外吸收光谱(图1(A))和荧光发射光谱(图1(B))。
图2是多色苝酰亚胺荧光染料和参比染料Cy5.5的吸收光谱(光稳定性)测定结果。
图3是多色苝酰亚胺荧光染料PDIs-615与商业染料BODIPY493/503标记的活体HeLa细胞的共定位图像结果。
图4是多色苝酰亚胺荧光染料PDIs-672与商业染料BODIPY493/503标记的活体HeLa细胞的共定位图像结果。
图5是多色苝酰亚胺荧光染料PDIs-615与线粒体、溶酶体、内质网商业染料的共定位成像结果。
图6是多色苝酰亚胺荧光染料PDIs-672与线粒体、溶酶体、内质网商业染料的共定位成像结果。
图7是多色苝酰亚胺荧光染料和商业染料BODIPY493/503标记的活体HeLa细胞的红色和绿色通道信号强度分布图以及共定位系数。
图8是商业染料BODIPY493/503和苝酰亚胺系列染料PDIs-615的共成像结果。
图9是共聚焦成像条件下商业染料BODIPY 493/503和苝酰亚胺系列染料PDIs-615的成像结果。
图10是共聚焦成像条件下商业染料BODIPY 493/503和苝酰亚胺系列染料PDIs-615的荧光信号强度结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的阐述，下述实施例仅作为说明，并不以任何方式限制本发明的保护范围。
在下述实施例中未详细描述的过程和方法是本领域公知的常规方法，实施例中所用试剂均为分析纯或化学纯，且均可市购或通过本领域普通技术人员熟知的方法制备。下述实施例均实现了本发明的目的。
多色苝酰亚胺荧光染料的合成路线如下。
中间产物—PDIs的合成。
500mL双口烧瓶中，加入化合物1(12g，0.0306mol)，3-氨基戊烷(13g，0.153mol)和60g咪唑。抽换气3次，氮气保护下升温至120℃，搅拌反应1小时，升温至160℃继续搅拌反应5小时，停止反应降温至80℃。向反应瓶中加入60mL乙醇，继续降温至35℃，再加入140mL乙醇，倒入650mL 2M的盐酸中，搅拌均匀。过滤，滤饼先用水洗至中性，再用乙醇洗涤3次。真空干燥得15.7g PDIs，收率96％。
PDIs的表征：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.60(d,J＝7.8Hz,4H),8.49(d,J＝8.0Hz,4H),5.07(s,2H),2.38–2.18(m,4H),2.06–1.86(m,4H),0.95(t,J＝7.0Hz,12H).13CNMR(101MHz,Chloroform-d)δ134.36,129.53,126.32,122.95,77.29,57.76,25.06,11.45.MS:Calcd for C34H30N2O4:530.2206,found:531.2278[M+H]+.
中间产物—化合物2和化合物3的合成。
在500mL双口烧瓶中，加入化合物PDIs(6g，0.0113mol)、碳酸钾(6g，0.0441mol)、液溴(90g，0.565mol)和100mL三氯甲烷，升温至50℃，反应48小时。降至室温，向反应体系中加入过量饱和亚硫酸氢钠溶液，除去未反应的液溴。用300mL水分三次洗涤反应体系，有机相用硫酸钠干燥，过滤，旋干，过柱，得到1.1g化合物2，收率16％，3.5g化合物3，收率45％。
化合物2的表征：1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.73(d,J＝8.3Hz,1H),8.88(s,1H),8.71–8.62(m,3H),8.56(dd,J＝8.1,3.5Hz,2H),5.12–4.98(m,2H),2.35–2.18(m,4H),2.03–1.88(m,4H),0.94(td,J＝7.5,3.1Hz,12H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ133.81,133.47,133.43,133.41,128.93,128.65,128.10,128.03,126.95,123.69,122.93,120.90,77.24,57.94,57.74,25.01,24.95,11.36,11.34.
化合物3的表征：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.49(dd,J＝8.2,1.1Hz,2H),8.91(s,2H),8.69(d,J＝7.9Hz,2H),5.05(tt,J＝9.7,5.8Hz,2H),2.24(ddt,J＝14.5,9.4,7.3Hz,4H),1.93(ddd,J＝13.6,7.5,5.9Hz,4H),1.02–0.80(m,12H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ133.13,132.89,132.74,132.34,129.28,128.46,128.09,127.21,121.59,120.77,77.24,58.14,57.94,57.75,24.97,24.91,11.30.
中间产物—化合物4的合成。
将化合物2(100mg，0.164mmol)、3-羟基氮杂环丁烷盐酸盐(54mg，0.492mmol)、三乙胺(0.5mL，3.59mmol)和N-甲基吡咯烷酮2mL加入反应管中。抽换气3次，氮气保护下升温至60℃，反应2小时，降至室温，用真空油泵抽干N-甲基吡咯烷酮。加入15mL二氯甲烷，用纯水45mL分三次萃取有机相，有机相用Na2SO4干燥，过滤，旋干溶剂。粗产物用甲醇和二氯甲烷体积比为1：100的混合溶剂做淋洗剂过中压制备色谱柱，得到81mg化合物4，收率82％。
化合物4的表征：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.69(dd,J＝12.7,8.0Hz,2H),8.53(ddt,J＝16.3,13.7,5.0Hz,3H),8.22(s,1H),8.03(d,j＝4.0,1H),5.10(m,2H),4.82(s,1H),4.27(s,2H),3.88(s,2H),2.30(m,4H),1.95(m,4H),0.94(t,J＝7.4Hz,12H).13CNMR(101MHz,Chloroform-d)δ150.54,135.22,134.65,132.93,129.31,128.53,127.36,125.16,123.87,123.70,121.02,77.30,63.23,57.76,57.52,40.99,29.83,29.66,29.38,27.26,25.12,25.09.MS:Calcd for C37H35N3O5:601.2577,found:601.2533[M+H]+.
中间产物—化合物5的合成。
将化合物3(100mg 0.145mmol)、3-羟基氮杂环丁烷盐酸盐(159mg，1.45mmol)、三乙胺(0.5mL，3.59mmol)和N-甲基吡咯烷酮3mL加入反应管中。抽换气3次，氮气保护下升温至60℃，溶液逐渐变为蓝色，反应72小时，降至室温，用真空油泵抽干N-甲基吡咯烷酮。加入15mL二氯甲烷，用纯水45mL分三次萃取有机相，有机相用Na2SO4干燥，过滤，旋干溶剂。粗产物用甲醇和二氯甲烷体积比为1：100的混合溶剂做淋洗剂过中压制备色谱柱，得到15mg化合物5，收率15％。
化合物5的表征：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.84(s,2H),8.58(s,2H),8.47(s,2H),5.06(s,2H),3.84(s,4H),3.32(s,4H),2.24(s,4H),2.13–1.95(m,2H),1.92(s,4H),0.90(d,J＝7.4Hz,12H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ148.98,132.27,129.05,124.13,122.01,116.53,63.52,60.38,56.88,29.45,25.02,11.71.MS:Calcd for C40H40N4O6:672.2948,found:672.2975[M]+.
实施例1
荧光染料PDIs-615的合成。
将化合物2(100mg 0.164mmol)、氮杂环丁烷盐酸盐(154mg，1.64mmol)、三乙胺(0.5mL，3.59mmol)和N-甲基吡咯烷酮2mL加入反应管中。抽换气3次，氮气保护下升温至60℃，反应3小时，降至室温，用真空油泵抽干N-甲基吡咯烷酮。加入15mL二氯甲烷，用纯水45mL分三次萃取有机相，有机相用Na2SO4干燥，过滤，旋干溶剂。粗产物用甲醇和二氯甲烷体积比为1：100的混合溶剂做淋洗剂过中压制备色谱柱，得到35mg荧光染料PDIs-615，收率36％。
荧光染料PDIs-615的表征：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.69(dd,J＝13.0,8.1Hz,2H),8.61–8.43(m,3H),8.21(d,J＝2.0Hz,1H),7.98(dd,J＝8.1,3.5Hz,1H),5.11(dd,J＝9.6,5.4Hz,2H),4.03(s,4H),2.47(s,2H),2.39–2.20(m,4H),2.09–1.88(m,4H),0.96(t,J＝7.4Hz,12H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ151.07,135.22,134.62,132.81,129.29,128.49,127.32,124.93,123.79,123.53,120.85,115.60,77.30,57.67,57.43,54.35,29.38,27.26,25.12,25.09,16.04,11.42,11.41.MS:Calcd for C37H35N3O4:585.26,found:586.20[M+H]+.
实施例2
荧光染料PDIs-672的合成。
将化合物3(100mg 0.145mmol)、氮杂环丁烷盐酸盐(272mg，2.91mmol)、三乙胺(0.5mL，3.59mmol)和N-甲基吡咯烷酮5mL加入反应管中。抽换气3次，氮气保护下升温至60℃，反应72小时，降至室温，用真空油泵抽干N-甲基吡咯烷酮。加入15mL二氯甲烷，用纯水45mL分三次萃取有机相，有机相用Na2SO4干燥，过滤，旋干溶剂。粗产物用甲醇和二氯甲烷体积比为1：100的混合溶剂做淋洗剂过中压制备色谱柱，得到15mg荧光染料PDIs-672，收率16％。
荧光染料PDIs-672的表征：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.45(d,J＝8.0Hz,2H),8.24–7.97(m,4H),5.10(tt,J＝10.0,5.7Hz,2H),3.96(s,8H),2.41(s,4H),2.30(ddd,J＝14.0,9.7,7.3Hz,4H),1.93(ddd,J＝13.8,7.7,6.1Hz,4H),0.93(t,J＝7.4Hz,12H).13CNMR(101MHz,Chloroform-d)δ149.62,133.13,129.80,124.67,122.83,117.45,77.29,57.42,54.17,29.76,25.17,16.20,11.38.MS:Calcd for C40H40N4O4:640.3050,found:640.3058[M]+.
实施例3
荧光染料PDIs-536的合成。
将三二亚苄基丙酮二钯(0.3mg，0.000328mmol)、4，5-双(二苯基膦)-9，9-二甲基氧杂蒽(0.28mg，0.000492mmol)、2-氮杂环丁酮(7mg，0.0984mmol)、碳酸铯(32mg，0.0984mmol)和1mL甲苯加入反应管中，氮气置换3次。用针管注射入化合物2(20mg，0.0328mmol)和1mL甲苯溶液。升温至100℃，反应3小时，反应结束降至室温加入10mL二氯甲烷稀释，硅藻土过滤，旋干。粗产物用甲醇和二氯甲烷体积比为1：100的混合溶剂做淋洗剂过中压制备色谱柱，得到9mg荧光染料PDIs-536，收率46％。
荧光染料PDIs-536的表征：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.84(m,1H),8.63(m,6H),5.09(m,2H),3.88(t,2H),3.37(t,2H),2.27(m,4H),1.96(m,4H),0.95(m,12H).13C NMR(400MHz,Chloroform-d)δ165.61,134.83,134.62,134.21,133.73,129.18,128.24,127.26,127.12,126.51,125.79,123.96,122.70,57.88,57.70,39.66,37.30,25.05,25.02,11.38,11.33.MS:Calcd for C37H33N3O5:599.2420,found:600.2498[M+H]+.
实施例4
荧光染料PDIs-560的合成。
将三二亚苄基丙酮二钯(1.3mg，0.00145mmol)、4，5-双(二苯基膦)-9，9-二甲基氧杂蒽(0.84mg，0.00145mmol)、2-氮杂环丁酮(31mg，0.436mmol)、碳酸铯(142mg，0.436mmol)和1mL甲苯加入反应管中，氮气置换3次。用针管注射入化合物3(100mg，0.145mmol)和1mL甲苯的溶液。升温至40℃，反应48小时，反应结束降至室温，加入10mL二氯甲烷稀释，硅藻土过滤，旋蒸。粗产物用甲醇和二氯甲烷体积比为1：100的混合溶剂做淋洗剂过中压制备色谱柱，得到21mg荧光染料PDIs-560，收率22％。
荧光染料PDIs-560的表征：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.83(d,J＝6.2Hz,2H),8.63(dd,J＝32.4,8.1Hz,2H),8.49(dd,J＝25.7,8.1Hz,2H),5.06(dt,J＝9.8,4.3Hz,2H),3.84(t,J＝4.8Hz,3H),3.72(s,1H),3.32(t,J＝4.8Hz,4H),2.25(ddd,J＝9.3,4.5,2.2Hz,4H),1.99–1.84(m,4H),0.91(td,J＝7.4,1.6Hz,12H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ165.88,165.27,135.73,134.33,133.84,132.84,129.96,129.11,126.43,126.14,124.97,77.28,57.85,39.89,37.36,37.19,31.97,29.75,29.40,27.26,25.04,22.74,14.17,11.43,11.34,11.27.MS:Calcd for C40H36N4O6:668.2635,found:669.2709[M+H]+.
实施例5
荧光染料PDIs-584的合成。
将化合物4(35mg，0.0582mmol)加入2.5mL二氯甲烷中，冷至0℃，分批加入戴斯马丁氧化剂(56mg，0.0133mmol)，约10分钟加完。0℃搅拌1小时，升至室温搅拌12小时。用饱和亚硫酸氢钠淬灭反应，加入15mL二氯甲烷，用纯水45mL分三次萃取有机相，有机相用Na2SO4干燥，过滤，旋干溶剂。粗产物用甲醇和二氯甲烷体积比为1：100的混合溶剂做淋洗剂过中压制备色谱柱，得到21mg荧光染料PDIs-584，收率60％。
荧光染料PDIs-584的表征：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.80–8.66(m,2H),8.66–8.51(m,3H),8.34(s,1H),8.27(d,J＝8.1Hz,1H),5.18–5.04(m,2H),4.79(s,4H),2.30(d,J＝7.5Hz,4H),1.97(dd,J＝7.8,5.8Hz,4H),0.96(t,J＝7.4Hz,12H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ195.17,148.48,134.78,134.25,133.25,129.25,128.49,127.39,125.56,124.38,124.08,121.63,118.86,77.31,74.37,57.86,57.62,29.76,25.10,25.08,11.41,11.39.MS:Calcd for C37H33N3O5:599.2420,found:599.2416[M]+.
实施例6
荧光染料PDIs-621的合成。
将化合物5(35mg，0.0582mmol)加入2.5mL二氯甲烷中，冷至0℃，分批加入戴斯马丁氧化剂(56mg，0.0133mmol)约10分钟加完。0℃搅拌1小时，升至室温搅拌12小时。反应不完全，补加2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物(300mg，1.92mmol)反应24小时。用饱和亚硫酸氢钠淬灭反应，加入15mL二氯甲烷，用纯水45mL分三次萃取有机相，有机相用Na2SO4干燥，过滤，旋干溶剂。粗产物用甲醇和二氯甲烷体积比为1：100的混合溶剂做淋洗剂过中压制备色谱柱，得到8mg荧光染料PDIs-621，收率57％。
荧光染料PDIs-621的表征：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.56(d,J＝7.9Hz,2H),8.35–8.22(m,4H),5.09(q,J＝4.4,3.8Hz,2H),4.72(s,8H),2.32–2.22(m,4H),1.92(dt,J＝14.0,7.0Hz,4H),0.92(d,J＝7.4Hz,12H).MS:Calcd for C40H36N4O6:668.2635,found:669.2710[M+H]+.
实施例7
紫外吸收光谱和荧光发射光谱实验。
准确称多色苝酰亚胺系列荧光染料PDIs-615、PDIs-672、PDIs-536、PDIs-560、PDIs-584、PDIs-621各1mg，加入1mLDMSO中配成母液。
紫外吸收光谱测试条件：测定范围为300nm-900nm，扫描间隔为1nm。
荧光发射光谱测试条件：激发波长为504nm，发射波长为514nm，激发电压为650V，狭缝宽度为Ex＝5nm，Em＝5nm，扫描速度为1200nm/min，测定范围为450nm-900nm。
多色苝酰亚胺系列荧光染料在二氯甲烷中的紫外-可见吸收光谱如图1(A)所示和荧光发射光谱如图1(B)所示。PDIs-536的最大吸收波长红移至536nm，最大发射波长显著红移至590nm；PDIs-584的最大吸收波长红移至584nm，最大发射波长显著红移至670nm；PDIs-615的最大吸收波长红移至615nm，最大发射波长红移至725nm，斯托克斯位移110nm；PDIs-560的最大吸收波长红移至560nm，最大发射波长红移至595nm；PDIs-621的最大吸收波长红移至621nm，最大发射波长显著红移至678nm；PDIs-672的最大吸收波长红移至672nm，最大发射波长红移至732nm，斯托克斯位移60nm。
实施例8
荧光量子产率测定实验。
荧光量子产率的测定实验选用相对法，在二氯甲烷溶液中测量，以PDIs(二氯甲烷中，Φr＝100％)作为标准，分别测定荧光染料PDIs-536、PDIs-560和PDIs-584在二氯甲烷中的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。以参比染料与待测染料最大激发波长相近的Cy5(二氯甲烷中，Φr＝31％)作为标准，分别测定荧光染料PDIs-615、PDIs-621和PDIs-672在二氯甲烷中的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。通过以下公式来求出荧光染料的荧光量子产率。
Фs＝Φr(ArFs/As Fr)(ns 2/nr 2)
式中，s和r分别代表待测样品和参比物质，A代表在相应激发波长下吸光度，F代表积分荧光强度，n代表溶剂的折射率。
荧光染料PDIs-536、PDIs-560、PDIs-584、PDIs-615、PDIs-621和PDIs-672在稀释的二氯甲烷溶液中荧光量子产率(PLQY)均高达95％。
实施例9
光稳定性测定实验。
为了评估这些多色苝酰亚胺染料的光稳定性，把它们配制成浓度为1.0×10-5M的二氯甲烷溶液，以保持与紫外吸收和荧光量子产率研究的一致性。然后用250W Xe灯照射样品，并采集吸收光谱以评估作为照射结果的最大吸收波长的百分比变化。照射180分钟后，如图2所示，多色苝酰亚胺染料的变化率都很小，PDIs-584下降的最多4％，其余染料下降在1％-4％之间，相对于参比染料Cy5.5下降72％，多色苝酰亚胺染料表现出优异的稳定性。
实施例10
细胞成像实验。
将生长状态良好的人宫颈癌细胞(购自国家实验细胞资源共享服务平台)接种于35mm聚-D-赖氨酸包被的培养皿中，在细胞培养箱中孵育不少于24小时。将孵育后的细胞在含有2μM多色苝酰亚胺荧光染料(含0.1％DMSO)的DMEM培养基中孵育以染色脂滴，并在含有600nM尼罗红(Nile Red)和1.2μM BODIPY493/503的染料中孵育30分钟。用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤活细胞三次后成像，用光谱共聚焦激光扫描显微镜(Olympus Fluoview FV-1000)获得标记细胞的荧光显微镜图像。荧光强度(FI)是来自共聚焦荧光图像的细胞区域(至少20个细胞)的平均荧光强度，其通过LAS AF软件定量。
多色苝酰亚胺荧光染料PDIs-615和商业染料BODIPY 493/503标记的活HeLa细胞的共定位系数为0.91(图3)。
多色苝酰亚胺荧光染料PDIs-672和商业染料BODIPY 493/503标记的活HeLa细胞的共定位系数为0.94(图4)。
为了证实多色苝酰亚胺荧光染料在活细胞中的精确分布，将多色苝酰亚胺荧光染料分别和市售的线粒体、溶酶体、内质网商业染料进行共定位实验，得到了很低的共定位系数(图5，图6)。
接着，使用BODIPY 493/503作为参考脂滴标记物进行了共定位实验。将多色苝酰亚胺荧光染料分别和商业染料BODIPY493/503与HeLa细胞一起孵育后，用PBS缓冲液洗涤细胞三次。获得的光谱数据如下：绿色通道，BODIPY493/503激发波长为488nm，收集的发射波长为490-550nm；PDIs-536和PDIs-560激发波长为515nm，收集的发射波长为520-580nm。红色通道，PDIs-584和PDIs-560激发波长为559nm，收集的发射波长为660-710nm；PDIs-615和PDIs-672激发波长为635nm，收集的发射波长为720-770nm。两个通道的信号强度分布图的良好重叠证明了多色苝酰亚胺荧光染料能够特异性的标记脂滴(图7)。
并且得出PDIs-615与BODIPY493/503、PDIs-560的Pearson共定位系数分别是0.91和0.98，PDIs-536与PDIs-560、PDIs-584、PDIs-621和PDIs-672的Pearson共定位系数分别是0.98、0.96、0.92和0.92。这些结果表明氮杂环丁烷修饰的苝酰亚胺染料具有优异的脂滴靶向定位能力(图7)。
油酸(OA)是一种已知的可以诱导细胞内脂滴生成的试剂，被用来处理HeLa细胞以模拟脂滴的生成和聚集。HeLa细胞与400μM的油酸一起孵育24小时，用BODIPY493/503和PDIs-615染色，然后用共聚焦显微镜成像。在没有与油酸孵育的细胞中，仅记录到少量具有低荧光信号的小尺寸脂滴。相反，在油酸孵育6小时后，脂滴的数量和大小增加并聚集成更大的簇(图8)。结果表明PDIs-615可以监测脂滴的变化。
此外，对实时成像动态系统中荧光染料的稳定性进行测定。
如图9所示，在相同激发条件下的连续共聚焦成像过程中，荧光染料PDIs-615显示出高的光稳定性。
如图10所示，在记录50个共聚焦图像后，PDIs-615仍然保持相对于其初始强度的90％的荧光强度，而作为对比的BODIPY493/503，其荧光强度基本为0％。
Claims (7)
1.多色苝酰亚胺荧光染料，其特征在于，其结构通式如式(I)所示：
其中，R1、R2、R3、R4分别独立地为氢、C1-60烷基氨基、C1-60烷基酰胺基、C3-10环烷基氨基、C3-10环烷基单酰胺基、C3-10环烷基双酰胺基、C3-10环烷基单酮胺基或C3-10环烷基多酮胺基；
R5、R6分别独立地为芳基、C1-C20直链烷基、C1-C20支链烷基、六元环状烷基或羧基衍生物。
2.根据权利要求1所述的多色苝酰亚胺荧光染料，其特征在于，式(I)中，R1、R2、R3、R4分别独立地为氢或如下基团中的一种：
其中，n代表1-5的整数。
3.根据权利要求1所述的多色苝酰亚胺荧光染料，其特征在于，其结构式为：
4.根据权利要求1所述的多色苝酰亚胺荧光染料，其特征在于，所述羧基衍生物具有下述式(II)的结构：
式(II)中，R7为芳基、C1-C20直链饱和烷基、C1-C20直链不饱和烯烃基、C1-C20支链烷基、C3-C7直链卤代烷基或C3-C7支链卤代烷基。
5.权利要求1所述的多色苝酰亚胺荧光染料的合成方法，其特征在于合成路线如下：
其中，R1 ’、R2 ’和R3 ’各自独立地为氢或溴；
该方法步骤如下：
步骤1：苝酐与氨基衍生物反应，得到苝酰亚胺衍生物；
步骤2：苝酰亚胺衍生物与溴或含溴化合物反应生成单溴或多溴取代苝酰亚胺；
步骤3：单溴或多溴取代苝酰亚胺与氮杂环烷烃衍生物反应，或与氮杂环酮衍生物反应，或先与羟基氮杂环烷烃衍生物反应后再加入戴斯马丁氧化剂氧化，即可得到具有式(I)结构的多色苝酰亚胺荧光染料。
6.一种权利要求1～5中任意一项所述的多色苝酰亚胺荧光染料在脂滴荧光成像领域的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述多色苝酰亚胺荧光染料在活细胞及活体内能够对脂滴进行特异性标记，并实现多色荧光成像。
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