CN115666597A - 睾丸功能改善剂和睾丸功能改善方法 - Google Patents

睾丸功能改善剂和睾丸功能改善方法 Download PDF

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Abstract

一种睾丸功能改善剂，可显著改善动物的睾丸功能，该睾丸功能改善剂包含来源于来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞或它们的永生化干细胞的培养上清的微小颗粒，其中，睾丸功能改善是指：睾丸自身形成精子的能力的改善、由睾丸得到的精子自身的功能的改善、和由睾丸得到的精子与雌性作用的功能的改善、以及使因老龄而老化的这些功能年轻化；或者，添加到从动物取出到体外的精液中以进行精子激活。

Description

睾丸功能改善剂和睾丸功能改善方法
技术领域
本发明涉及睾丸功能改善剂和睾丸功能改善方法。
背景技术
作为不孕症的改善或治疗方法、使家畜的人工授精稳定化的方法，已知有使用间充质干细胞(mesenchymal stromal cells)进行精子激活的方法(参照专利文献1)。
专利文献1中记载了精子激活剂，其以选自来自脂肪组织的干细胞、来自牙髓的干细胞、来自骨髓的干细胞和来自脐带血的干细胞的一种以上的细胞的破碎物为有效成分。另外，专利文献1中记载了：在来自牙髓的干细胞等的破碎物中，有效成分的主要成分是热休克蛋白(Heat Shock Protein、HSP)之一种的HSP90α。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO2018/038180号。
发明内容
发明所要解决的课题
专利文献1中只记载了：在向从动物取出到体外的精液中添加精子激活剂的情况下，可维持精子的运动性等。因此，专利文献1并没有暗示直接给予至动物而可改善睾丸功能的精子激活剂。
需要说明的是，专利文献1中记载的精子激活剂是在回收间充质干细胞的细胞群后通过冷冻溶解处理等进行破碎而制造的，因此原本就杂质多，认为难以直接给予至动物。
本发明所要解决的课题在于：提供可显著改善动物的睾丸功能的睾丸功能改善剂。
需要说明的是，这里所说的“睾丸功能”是指由睾丸产生精子的功能，另外，作为其精子的功能，意思是指可进行正常的妊娠和胎儿的生育、分娩的正常的生殖功能。
用于解决课题的手段
在本发明中发现了：通过使用来源于来自牙髓的干细胞的培养上清或来自脂肪的干细胞的培养上清(或它们的永生化干细胞的培养上清)的微小颗粒(微粒)，可显著改善动物的睾丸功能，从而解决了上述课题。
需要说明的是，专利文献1是向从动物取出到体外的精液中添加的精子激活剂，故着眼于热休克蛋白作为有效成分，而没有着眼于来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清或外来体(Exosome，外泌体)等微小颗粒。
以下记载作为用于解决上述课题的具体方法的本发明的构成和本发明的优选构成。
[1] 睾丸功能改善剂，其是包含来源于来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞或它们的永生化干细胞的培养上清的微小颗粒的睾丸功能改善剂，
睾丸功能改善是指：睾丸自身形成精子的能力的改善、由睾丸得到的精子自身的功能的改善和由睾丸得到的精子与雌性作用的功能的改善、以及使因老龄而老化的这些功能年轻化；或者，添加到从动物取出到体外的精液中以进行精子激活。
[2] [1]所述的睾丸功能改善剂，其中，微小颗粒为外来体。
[3] [1]或[2]所述的睾丸功能改善剂，该睾丸功能改善剂不含来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞和永生化干细胞，
不含MCP-1，并且
不含Siglec-9。
[4] [1]～[3]中任一项所述的睾丸功能改善剂，该睾丸功能改善剂是睾丸的精子形成能力改善剂。
[5] [1]～[3]中任一项所述的睾丸功能改善剂，该睾丸功能改善剂是妊娠能力改善剂。
[6] [1]～[3]中任一项所述的睾丸功能改善剂，该睾丸功能改善剂是畸形儿抑制剂。
[7] [1]～[6]中任一项所述的睾丸功能改善剂，其中，微小颗粒是由培养上清纯化的微小颗粒。
[8] [1]～[7]中任一项所述的睾丸功能改善剂，该睾丸功能改善剂包含0.5×108个以上的微小颗粒。
[9] [1]～[8]中任一项所述的睾丸功能改善剂，其中，来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞是来自人牙髓的干细胞或来自人脂肪的干细胞。
[10] [1]～[8]中任一项所述的睾丸功能改善剂，其中，来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞是来自人以外的动物的牙髓的干细胞或来自人以外的动物的脂肪的干细胞。
[11] 睾丸功能改善方法，该方法包括：对动物给予[1]～[10]中任一项所述的睾丸功能改善剂的工序。
[12] [11]所述的睾丸功能改善方法，其特征在于：
改善动物的睾丸的精子形成能力；
改善动物的妊娠能力；或者
抑制动物的畸形儿。
[13] [11]或[12]所述的睾丸功能改善方法，该方法是对动物的睾丸注射睾丸功能改善剂。
[14] [11]～[13]中任一项所述的睾丸功能改善方法，其中，动物的每个睾丸的微小颗粒的给予量为0.5×108～2×108个/每个睾丸。
发明效果
根据本发明，可提供可显著改善动物的睾丸功能的睾丸功能改善剂。
附图说明
[图1] 图1是对于给予了实施例1的睾丸功能改善剂(SGF Exosome，SGF外来体)或实施例2的来自脂肪组织的外来体(AT-MSC Exosome，AT-MSC外来体)的老龄雄性小鼠和比较例1的未给予外来体的老龄雄性小鼠(Untreated Control，未处理的对照)和参考例1的年轻雄性小鼠，比较精子数的柱状图(Bar Chart)。
[图2] 图2(A)表示对老龄雄性小鼠的睾丸给予生理盐水的比较例11和12 (PBS对照)的交配试验和分娩试验的流程。图2(B)表示对老龄雄性小鼠的睾丸给予实施例1的睾丸功能改善剂(SGF外来体)的实施例11和12的交配试验和分娩试验的流程。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。以下记载的构成要件的说明有时是基于代表性的实施方式或具体例子而进行的说明，但本发明并不限定于这样的实施方式。需要说明的是，本说明书中，用“～”表示的数值范围意思是指包括“～”前后所记载的数值作为下限值和上限值的范围。
[睾丸功能改善剂]
本发明的睾丸功能改善剂是包含来源于来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞或它们的永生化干细胞的培养上清(以下，也称为来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清)的微小颗粒的睾丸功能改善剂，
睾丸功能改善是指：睾丸自身形成精子的能力的改善、由睾丸得到的精子自身的功能的改善和由睾丸得到的精子与雌性作用的功能的改善、以及使因老龄而老化的这些功能年轻化；或者，添加到从动物取出到体外的精液中以进行精子激活。
利用该构成，可提供可显著改善动物的睾丸功能的睾丸功能改善剂。
需要说明的是，在下文中关于永生化干细胞有时会省略记载，但在来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的说明中也包括这些永生化干细胞。
以下，说明本发明的优选方案。
＜微小颗粒＞
在本发明中，使用来源于来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清的微小颗粒。微小颗粒例如通过从来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的分泌、出芽或分散等，由来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞中导出，并浸出、释放或脱落到细胞培养基中。因此，微小颗粒包含在来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清中。
本发明的睾丸功能改善剂可将来源于来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞或它们的永生化干细胞的培养上清的微小颗粒以包含在它们的培养上清中的状态使用、或者也可以以由培养上清纯化的状态使用。即，可使用来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞或它们的永生化干细胞的培养上清作为本发明的睾丸功能改善剂，也可使用包含由它们的培养上清纯化的微小颗粒的任意组合物作为本发明的睾丸功能改善剂。
本发明中，微小颗粒优选为由培养上清纯化的微小颗粒。
(微小颗粒的特性)
微小颗粒优选为选自外来体(exosome)、微小泡、膜颗粒、膜小泡、核外颗粒体(Ectosome)和外囊泡(exovesicle)或微囊泡(microvesicle)的至少1种，更优选为外来体。
微小颗粒的直径优选为10～1000nm、更优选为30～500nm、特别优选为50～150nm。另外，希望在其微小颗粒的表面存在CD9、CD63、CD81等称为四旋蛋白(tetraspanin)的分子，其可以是单独的CD9、单独的CD63、单独的CD81，或者可以是它们中的2种或3种的任意组合。
以下，有时会说明使用外来体作为微小颗粒的情况下的优选方案，但本发明的微小颗粒并不限定于外来体。
外来体优选为在多胞体与原形质膜融合时由细胞释放的细胞外小泡。
外来体的表面优选包含来源于来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞(或者它们的永生化干细胞)的细胞膜的脂质和蛋白。
在外来体的内部优选包含核酸(微小RNA、信使RNA、DNA等)和蛋白等来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的细胞内物质。
已知外来体被用于通过从某个细胞向另一个细胞运输遗传信息而进行的细胞与细胞的通信。外来体可容易地追踪，且可靶向至特异性区域。
(微小颗粒的含量)
本发明的睾丸功能改善剂对微小颗粒的含量没有特别限定。本发明的睾丸功能改善剂优选包含0.5×108个以上的微小颗粒，更优选包含1.0×108个以上，特别优选包含2.0×108个以上。
另外，本发明的睾丸功能改善剂对微小颗粒的含有浓度没有特别限定。本发明的睾丸功能改善剂优选包含0.01×108个/mL以上的微小颗粒，更优选包含0.1×108个/mL以上，特别优选包含1.0×108个/mL以上。
(来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清)
对来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清没有特别限定。
来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清优选实质上不含血清。例如，来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清优选血清含量为1质量%以下、更优选为0.1质量%以下、特别优选为0.01质量%以下。
-来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞-
来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞可来源于人，也可来源于人以外的动物。作为人以外的动物，可列举：与后述的给予睾丸功能改善剂的对象动物(生物种)同样的动物，优选哺乳动物。
对用于培养上清的来自牙髓的干细胞没有特别限定。可使用脱落乳牙牙髓干细胞(stem cells from exfoliated deciduous teeth)或通过其他方法获取的乳牙牙髓干细胞或恒齿牙髓干细胞(dental pulp stem cells；DPSC)。除人乳牙牙髓干细胞或人恒齿牙髓干细胞以外，还可使用猪乳牙牙髓干细胞等来源于人以外的动物的来自牙髓的干细胞。
来自牙髓的干细胞(或来自脂肪的干细胞)除了可产生外来体还可产生血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子-β (TGF-β)-1和-3、TGF-a、KGF、HBEGF、SPARC、其他生长因子、趋化因子等各种细胞因子。另外，还可产生其他的多种生理活性物质。
本发明中，来自牙髓的干细胞的培养上清中使用的来自牙髓的干细胞特别优选为包含多种蛋白的来自牙髓的干细胞，优选使用乳牙牙髓干细胞。即，本发明中，优选使用乳牙牙髓干细胞的培养上清(SGF)。
对培养上清中使用的来自脂肪的干细胞没有特别限定。作为来自脂肪的干细胞，可使用任意的脂肪组织中所含的体干细胞。除来自人脂肪的干细胞以外，还可使用猪脂肪干细胞等来源于人以外的动物的来自脂肪的干细胞。作为来自脂肪的干细胞，例如可使用按照国际公开WO2018/038180号的[0023]～[0041]中记载的方法调制的来自脂肪的干细胞，该公报的内容作为参照纳入到本说明书中。
用于本发明的来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞只要可实现目标处置即可，可以是天然干细胞，也可以是经基因修饰的干细胞。
特别是，在本发明中，可使用来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的永生化干细胞。通过使用实质上可无限增殖的永生化干细胞，可使干细胞的培养上清中所含的生物因子的量和组成长期稳定。对来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的永生化干细胞没有特别限定。永生化干细胞优选为未癌化的永生化干细胞。来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的永生化干细胞可通过在来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞中单独或组合添加以下的低分子化合物(抑制剂)进行培养来调制。
作为TGF β受体抑制剂，只要是具有抑制转化生长因子(TGF) β受体功能的作用的物质即可，没有特别限定，例如可列举：2-(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-4-基-2-叔丁基-1H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶、3-(6-甲基吡啶-2-基)-4-(4-喹啉基)-1-苯硫基氨基甲酰基-1H-吡唑(A-83-01)、2-(5-氯-2-氟苯基)蝶啶-4-基)吡啶-4-基胺(SD-208)、3-(吡啶-2-基)-4-(4-醌基)]-1H-吡唑、2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶(以上，Merck公司)、SB431542 (Sigma-Aldrich公司)等。可优选列举A-83-01。
作为ROCK抑制剂，只要是具有抑制Rho结合激酶的功能的作用的物质即可，没有特别限定。作为ROCK抑制剂，例如可列举：GSK269962A (Axonmedchem公司)、Fasudilhydrochloride (Tocris Bioscience公司)、Y-27632、H-1152 (以上，富士胶片和光纯药株式会社)等。可优选列举：Y-27632。
作为GSK3抑制剂，只要是抑制GSK-3 (Glycogen Synthase Kinase 3 (糖原合酶激酶3)、糖原合成酶3)的物质即可，没有特别限定，可列举：A 1070722、BIO、BIO-丙酮肟(以上，TOCRIS公司)等。
作为MEK抑制剂，只要是具有抑制MEK (MAP激酶-ERK激酶)的功能的作用的物质即可，没有特别限定，例如可列举：AZD6244、CI-1040 (PD184352)、PD0325901、RDEA119(BAY86-9766)、SL327、U0126-EtOH (以上，Selleck公司)、PD98059、U0124、U0125 (以上，Cosmo Bio株式会社)等。
在将本发明的睾丸功能改善剂用于再生医疗的情况下，从再生医疗等安全性确保法的要求出发，包含来源于来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清的微小颗粒的睾丸功能改善剂为不含除来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞以外的其他体干细胞的方案。然而，在再生医疗以外的技术领域使用本发明的睾丸功能改善剂的情况下，睾丸功能改善剂可含有除来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞以外的间充质干细胞或其他体干细胞，但优选不含。
作为除来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞以外的间充质干细胞，包括来自骨髓的干细胞、来自脐带的干细胞、来自脐带血的干细胞，但并不限定于这些。
作为除间充质干细胞以外的其他体干细胞的例子，包括来自真皮系、消化系、骨髓系、神经系等的干细胞，但并不限定于这些。作为真皮系体干细胞的例子，包括上皮干细胞、毛囊干细胞等。作为消化系体干细胞的例子，包括胰腺(整体的)干细胞、肝干细胞等。作为(除间充质干细胞以外的)骨髓系体干细胞的例子，包括造血干细胞等。作为神经系体干细胞的例子，包括神经干细胞、视网膜干细胞等。
本发明的睾丸功能改善剂可含有体干细胞以外的干细胞，但优选不含。作为体干细胞以外的干细胞，包括胚胎干细胞(ES细胞)、诱导多能干细胞(iPS细胞)、胚胎癌细胞(EC细胞)。
-来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清的调制方法-
对来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清的调制方法没有特别限定，可采用现有的方法。
来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清是培养来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞而得到的培养液，不包含细胞本身。例如通过在来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养后分离去除细胞成分，可得到可用于本发明的培养上清。可使用适当施行了各种处理(例如，离心处理、浓缩、溶剂的置换、透析、冷冻、干燥、冷冻干燥、稀释、脱盐、保存等)的培养上清。
用于得到来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清的来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞可通过常规方法筛选，可根据细胞的大小或形态、或作为粘附性细胞来筛选。在来自牙髓的干细胞的情况下，可从由脱落的乳牙或恒齿采集的牙髓细胞中作为粘附性细胞或其传代细胞来筛选。在来自脂肪的干细胞的情况下，可从由脂肪组织采集的脂肪细胞中作为粘附性细胞或其传代细胞来筛选。在来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清中，可使用培养所筛选的干细胞而得到的培养上清。
需要说明的是，“来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清”优选为培养来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞而得到的、不包含其细胞本身的培养液。本发明中使用的来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清优选在其一个方案中即使作为整体也不包含细胞(无论细胞的种类如何)。该方案的细胞增殖剂通过该特征自然地使来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞自身与包含来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的各种组合物明确地区别开来。该方案的典型例子是：不含来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞、而仅由来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清构成的组合物。
本发明中使用的来自牙髓的干细胞的培养上清可包含来自乳牙牙髓的干细胞和来自成人牙髓的干细胞两者的培养上清。本发明中使用的来自牙髓的干细胞的培养上清优选包含来自乳牙牙髓的干细胞的培养上清作为有效成分，更优选包含50质量%以上、优选包含90质量%以上。本发明中使用的来自牙髓的干细胞的培养上清更特别优选为仅由来自乳牙牙髓的干细胞的培养上清构成的组合物。
在用于得到培养上清的来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养液中，可使用基础培养基、或在基础培养基中添加了血清等的培养基等。需要说明的是，作为基础培养基，除Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)以外，还可使用Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)(GIBCO公司等)、Ham F12培养基(HamF12) (SIGMA公司、GIBCO公司等)、RPMI1640培养基等。另外，作为可添加在培养基中的成分的例子，可列举：血清(胎牛血清、人血清、羊血清等)、血清替代品(Knockout血清替代品(KSR)等)、牛血清白蛋白(BSA)、抗生素、各种维生素、各种矿物质。
然而，为了调制不含血清的“来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清”，可在整个过程中或最后或从最后起的数次传代培养中使用无血清培养基。例如，通过用不含血清的培养基(无血清培养基)培养来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞，可调制不含血清的来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清。进行1次或多次的传代培养，通过将最后或从最后起的多次传代培养用无血清培养基进行培养，也可得到不含血清的来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清。另一方面，通过利用透析或基于柱的溶剂置换等从回收的培养上清中去除血清，也可得到不含血清的来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清。
在用于得到培养上清的来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养中，可直接适用通常所采用的条件。关于来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清的调制方法，除了根据干细胞的种类适当调整干细胞的分离和筛选工序以外，可与后述的细胞培养方法同样进行。根据来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的种类进行的来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的分离和筛选可由本领域技术人员适当进行。
另外，在来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养中，为了大量生产有助于改善睾丸功能的特定的外来体，可适用特别条件。作为特别条件，例如可列举：低温条件、低氧条件、微重力条件等与任何刺激物进行共培养的条件等。
-来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清中所含的其他成分-
本发明中用于调制外来体的来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清除包含来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清以外，还可包含其他成分，但优选实质上不含其他成分。
然而，也可将用于调制外来体的各种添加剂添加至来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清中，然后进行保存。
(微小颗粒的纯化)
可由来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清纯化微小颗粒。
微小颗粒的纯化优选为由来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清分离包含微小颗粒的组分，更优选为分离微小颗粒。
微小颗粒可通过根据微小颗粒的特性从非缔合成分中分离而分离出来。例如，微小颗粒可根据分子量、大小、形态、组成或生物学活性进行分离。
本发明中，通过分取对来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清进行离心处理而得到的、含有大量微小颗粒的特定组分(例如沉淀物)，可纯化微小颗粒。可去除除规定组分以外的组分的不需要的成分(不溶成分)。从睾丸功能改善剂中去除溶剂和分散介质、以及不需要的成分可以不是完全去除。可示例离心处理的条件如下：100～20000g、1～30分钟。
本发明中，通过对来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清或其离心处理物进行过滤处理，可纯化微小颗粒。可通过过滤处理去除不需要的成分。另外，如果使用适当孔径的滤膜，则可同时进行不需要的成分的去除和灭菌处理。对用于过滤处理的滤膜的材质、孔径等没有特别限定。可按照已知方法用适当的分子量或尺寸截留的滤膜进行过滤。从容易分取外来体的观点来看，滤膜的孔径优选为10～1000nm、更优选为30～500nm、特别优选为50～150nm。
本发明中，可采用柱色谱等进一步的分离方法分离来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清或其离心处理物或者它们的过滤处理物。例如，可采用使用了各种柱的高效液相色谱(HPLC)。柱可使用尺寸排阻柱或结合柱。
在各处理阶段的各组分中，为了追踪微小颗粒(或其活性)，可利用微小颗粒的1种以上的特性或生物学活性。例如，为了追踪微小颗粒，可采用光散射、折射率、动态光散射或UV-可见光检测器。或者，为了追踪各组分中的活性，可利用睾丸功能改善活性等治疗活性。
作为微小颗粒的纯化方法，可采用日本特表2019-524824号公报的[0034]～[0064]中记载的方法，该公报的内容作为参照纳入到本说明书中。
＜其他成分＞
本发明的睾丸功能改善剂除了含有微小颗粒，还可根据给药的对象动物的种类或目的，在不损及本发明效果的范围内含有其他成分。作为其他成分，可列举：营养成分、抗生素、细胞因子、保护剂、载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、无痛化剂、稳定剂、保存剂、防腐剂等。
作为营养成分，例如可列举：脂肪酸等、维生素等。
作为抗生素，例如可列举：青霉素、链霉素、庆大霉素等。
作为载体，可列举：作为药学上可接受的载体而已知的材料。
本发明的睾丸功能改善剂可以是微小颗粒本身，也可以是进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂等的药物组合物。药物组合物的目的在于促进对给药对象的动物给予微小颗粒。
药学上可接受的载体优选为不会对给药对象的动物引起显著的刺激性、不会抑制所给予的化合物的生物学活性和特性的载体(包含稀释剂)。载体的例子为：丙二醇；(生理)盐水；乳液；缓冲液；培养基、例如DMEM或RPMI等；含有去除自由基的成分的低温保存培养基。
另一方面，本发明的睾丸功能改善剂优选不含规定的物质。
例如，本发明的睾丸功能改善剂优选不含来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞。
另外，本发明的睾丸功能改善剂优选不含MCP-1。然而，可包含MCP-1以外的细胞因子。作为其他细胞因子，可列举：日本特开2018-023343号公报的[0014]～[0020]中记载的细胞因子等。
另外，本发明的睾丸功能改善剂优选不含Siglec-9。然而，可包含除Siglec-9以外的其他唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素。
需要说明的是，本发明的睾丸功能改善剂优选实质上不含血清(胎牛血清、人血清、羊血清等)。另外，本发明的睾丸功能改善剂优选实质上不含Knockout血清替代品(KSR)等现有的血清替代品。
本发明的睾丸功能改善剂优选上述的其他成分的含量(固体成分量)均为1质量%以下、更优选为0.1质量%以下、特别优选为0.01质量%以下。
＜睾丸功能改善剂的制造方法＞
对本发明的睾丸功能改善剂的制造方法没有特别限定。
可使用通过上述方法调制的来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清、或商业购入而获取的来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清作为睾丸功能改善剂。
另外，可利用上述方法调制来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清，然后由来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清纯化微小颗粒，调制睾丸功能改善剂。或者，可由商业购入而获取的来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清纯化微小颗粒，调制睾丸功能改善剂。也可接受包含废弃处理的来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清的组合物(或适当纯化其组合物)，从中纯化微小颗粒，调制睾丸功能改善剂。
对本发明的睾丸功能改善剂的最终形态没有特别限定。例如，本发明的睾丸功能改善剂可列举：将微小颗粒与溶剂或分散介质一同填充至容器中而形成的形态；将微小颗粒与凝胶一同凝胶化且填充至容器中而形成的形态；将微小颗粒冷冻和/或干燥进行固态化制成制剂或填充至容器中而形成的形态等。作为容器，例如可列举：适于冷冻保存的管、离心管、袋等。冷冻温度例如可设为-20℃～-196℃。
＜睾丸功能改善剂的用途＞
本发明的睾丸功能改善剂可改善睾丸功能。睾丸功能除了包括睾丸自身形成精子的能力(精子数的增加等)或睾丸自身的其他功能(男性激素的增加等)，还包括由睾丸得到的精子自身的功能(运动性、运动率、存活期间、无基因异常的改善等)、或由睾丸得到的精子与雌性作用的功能(妊娠能力改善或畸形儿抑制能力等不育症改善能力等)。而且，具有使因老龄而老化的睾丸功能年轻化的效果，该年轻化适用于上述全部项目。
本发明中，睾丸功能改善是指：睾丸自身形成精子的能力的改善、由睾丸得到的精子自身的功能的改善和由睾丸得到的精子与雌性作用的功能的改善、以及使因老龄而老化的这些功能年轻化；或者，添加到从动物取出到体外的精液中以进行精子激活。即，可通过本发明的睾丸功能改善剂改善的睾丸功能为：睾丸自身形成精子的能力(精子数的增加等)、由睾丸得到的精子自身的功能(运动性、运动率、存活期间、无基因异常的改善等)、由睾丸得到的精子与雌性作用的功能(妊娠能力改善或畸形儿抑制能力等不育症改善能力等)、以及使因老龄而老化的这些睾丸功能年轻化(年轻化适用于上述全部项目)；或者，添加到从动物取出到体外的精液中以进行精子激活。
这里，睾丸中有参与造精功能的支持细胞(sertoli cell)和参与激素分泌功能以释放睾酮的睾丸间质细胞(leydig cell)。本发明中，优选进行与造精功能有关的睾丸功能改善。
作为通过给予本发明的睾丸功能改善剂可期待效果或降低发病风险的疾病，可列举：男性不孕症的一部分、不育症等。这里，男性不孕症中有造精功能障碍(精子形成障碍)、精路通过障碍、性功能障碍(生殖功能改善、勃起功能障碍)。本发明中，即使在男性不孕症中，也可优选改善由造精功能障碍(精子形成障碍)、精路通过障碍引起的男性不孕症，可改善由这些引起的妊娠能力。从通过给予本发明的睾丸功能改善剂可期待效果或降低发病风险的疾病中排除勃起不全(ED)。另外，也排除“仅由性功能障碍(生殖功能改善、勃起功能障碍)引起的男性不孕症”。需要说明的是，即使在睾丸中勃起障碍也是由睾丸间质细胞(参与激素分泌功能而释放睾酮)的功能下降引起的，与参与造精功能的支持细胞的功能并不直接相关。
作为一个优选方案，本发明的睾丸功能改善剂优选为睾丸的精子形成能力改善剂。睾丸的精子形成能力改善剂优选在对动物(优选动物的睾丸)给药的情况下可增加精子形成数。
作为另一优选方案，本发明的睾丸功能改善剂优选为妊娠能力改善剂。妊娠能力改善剂优选在对动物给药的情况下可增加与雌性或女性的交配次数和/或妊娠的概率(受孕率、自然妊娠率)。
作为又一优选方案，本发明的睾丸功能改善剂优选为不育症改善剂、更优选为畸形儿抑制剂。不育症改善剂优选为来自雄性(来自男性)的不育症改善剂。不育症改善剂更优选在对动物给药的情况下可增加与雌性或女性交配而分娩的幼崽(孩子)中可正常发育的幼崽数、即发育异常或死亡数少。不育症改善剂特别优选在对动物给药的情况下可获得大量的无基因异常(或少)的精子。另外，不育症改善剂特别优选为畸形儿抑制剂、即在对动物给药的情况下可增加无基因异常(或少)的幼崽数。
需要说明的是，本发明的睾丸功能改善剂除了可显著改善动物的睾丸功能，还可用作添加在从动物取出到体外的精液中的精子激活剂。例如，本发明的睾丸功能改善剂和睾丸功能改善方法还包括：对冷冻精液给予本发明的睾丸功能改善剂的方案。然而，本发明的睾丸功能改善剂优选为在对动物的睾丸给药的情况下可显著改善动物的睾丸功能的方案。即，优选从本发明的睾丸功能改善剂中排除添加在从动物取出到体外的精液中的精子激活剂。
与现有的睾丸功能改善剂或精子激活剂相比，本发明的睾丸功能改善剂具有以下优点：容易大量生产，可有效利用以往作为酸鱼废弃物等废弃的干细胞的培养液，降低干细胞的培养液的废弃成本等。特别是在来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清为来自人牙髓的间充质干细胞或来自人脂肪的干细胞的培养上清的情况下，在对人适用本发明的睾丸功能改善剂的情况下也具有以下优点：在免疫学等观点上的安全性高、伦理性的问题也少。在来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清为来源于各种疾病患者(不孕症等)的来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清的情况下，在对其患者适用本发明的睾丸功能改善剂时，安全性更高，伦理性的问题也会减少。
本发明的睾丸功能改善剂由于是来源于来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清，故可用于修复医疗的用途。特别是包含来自牙髓的干细胞或来自脂肪的干细胞的培养上清(特别是SGF)的液体优选用于修复医疗的用途。这里，在以干细胞移植为前提的再生医疗中，已知干细胞不是再生的主角，而是干细胞产生的体液成分与自身的干细胞一起修复脏器。以往的干细胞移植所伴随的癌化、标准化、给药方法、保存性、培养方法等困难的问题得到解决，利用SGF等使用了来自牙髓的干细胞的培养上清或来自脂肪的干细胞的培养上清的睾丸功能改善剂可进行修复医疗。与干细胞移植相比，在使用了本发明的睾丸功能改善剂的修复中没有移植细胞，故不易发生肿瘤化等，可谓更加安全。另外，SGF或来自脂肪的干细胞的培养上清或本发明的睾丸功能改善剂具有可使用恒定标准化的品质的产品的优点。由于可选择大量生产或有效的给药方法，因此能够以低成本利用。
[睾丸功能改善方法]
本发明的睾丸功能改善方法包括：对动物给予本发明的睾丸功能改善剂的工序。
对动物给予本发明的睾丸功能改善剂的方法没有特别限定。
给药方法为点滴、局部给药、滴鼻剂等，侵袭非常少，几乎没有确认到副作用。作为局部给药的方法，优选注射。另外，还优选电穿孔，其是通过对皮肤表面施加电压(电脉冲)使细胞膜短暂地产生微细的孔，使有效成分渗透至真皮层，这在常规护理中是无法达到的。
本发明的睾丸功能改善方法优选包括：对动物的睾丸注射本发明的睾丸功能改善剂的工序。
给予至动物的本发明的睾丸功能改善剂至少在睾丸内循环，若发现疼痛的组织(也包括干细胞)，则通过归巢效应(homing effect)使组织(干细胞)自身激活并修复再生。而且，所给予的本发明的睾丸功能改善剂有时也在体内循环，刺激脑下垂体，使激素平衡健全，新陈代谢的周期像原来一样代谢亢进。
另一方面，向从动物取出到体外的精液中给予的本发明的睾丸功能改善剂将精子激活。
对给予睾丸功能改善剂的对象动物的岁数(年龄、周龄等)没有特别限定。本发明的睾丸功能改善剂可对年轻的动物给药，也可对老龄的动物给药。
根据本发明的睾丸功能改善剂的一个优选方案，可改善因衰老等导致睾丸功能变差的老龄动物的睾丸功能，因此特别是优选对老龄动物给药。在本发明的睾丸功能改善剂包含来源于来自脂肪的干细胞的培养上清的(由其纯化的)微小颗粒的情况下，可使因衰老等导致睾丸功能变差的老龄动物的睾丸功能改善到与年轻动物的睾丸功能同等程度。而且，在本发明的睾丸功能改善剂包含来源于来自牙髓的干细胞的培养上清的(由其纯化的)微小颗粒的情况下，可使因衰老等导致睾丸功能变差的老龄动物的睾丸功能改善到年轻动物的睾丸功能以上。
对给予睾丸功能改善剂的对象动物(生物种)没有特别限定。给予睾丸功能改善剂的对象动物优选为哺乳动物、鸟类(鸡、鹌鹑、鸭等)、鱼类(鲑鱼、鳟鱼、金枪鱼、鲣鱼等)。作为哺乳动物，可以是人，也可以是非人哺乳动物，但特别优选为人。作为非人哺乳动物，更优选为牛、猪、马、山羊、绵羊、猴、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠，特别优选为马。
即使在马中，也优选用作赛马的品种，更优选为纯血马(thoroughbred，纯种马)。赛马通常在老龄后往往被用作种马，但本发明的睾丸功能改善剂可针对老龄雄性进行睾丸功能改善(精子形成能力、妊娠能力和不育症改善能力)使提高到与年轻雄性同等程度以上，因此作为给予本发明的睾丸功能改善剂的对象动物，优选赛马。另外，还存在赛马在年轻时获取并保存了很多精液的情况，本发明的睾丸功能改善剂也可提高精子形成能力以增加精液中的精子数，因此作为给予本发明的睾丸功能改善剂的对象动物，也优选年轻的赛马。
在给予睾丸功能改善剂的情况下，对每个睾丸的微小颗粒的给予量没有特别限定。本发明的睾丸功能改善方法优选每个睾丸的微小颗粒的给予量为0.1×108～1000×108个/每个睾丸，更优选为0.5×108～100×108个/每个睾丸，特别优选为0.5×108～2×108个/每个睾丸。
实施例
以下，列举实施例和比较例以进一步具体地说明本发明。以下的实施例中所示的材料、使用量、比例、处理内容、处理步骤等只要不脱离本发明的宗旨则可适当变更。因此，本发明的范围不应由以下所示的具体例子限定性地解释。
[实施例1]：SGF外来体
＜来自牙髓的干细胞的培养上清的调制＞
使用DMEM培养基代替DMEM/Ham F12混合培养基，其他则依据日本专利第6296622号的实施例6中记载的方法，调制了乳牙牙髓干细胞的培养上清。在原代培养中，添加胎牛血清(FBS)进行培养，在传代培养中分取使用原代培养液进行培养的传代培养液的上清使不含FBS，调制乳牙牙髓干细胞的培养上清进行使用。需要说明的是，DMEM是Dulbecco改良Eagle培养基，F12是Ham F12培养基。
将所得到的乳牙牙髓干细胞的培养上清作为SGF。
＜由来自牙髓的干细胞的培养上清调制外来体＞
按照以下的方法由SGF纯化来自牙髓的干细胞的外来体。
用孔径为0.22微米的过滤器过滤乳牙牙髓干细胞的培养上清SGF (100mL)，之后将其溶液在4℃下以100000×g离心分离60分钟。倾析上清，将外来体浓缩颗粒重新悬浮于磷酸缓冲盐水(PBS)中。将重新悬浮的样品以100000×g离心分离60分钟。再次将颗粒作为浓缩样品从离心管的底部回收(约100μl)。蛋白浓度通过微小BSA蛋白测定试剂盒(Pierce、Rockford、IL)来确定。外来体浓缩溶液在-80℃下保管。
将所得到的外来体浓缩溶液作为实施例1的睾丸功能改善剂。以下，将实施例1的睾丸功能改善剂也称为SGF外来体(SGF Exosome)。
＜SGF外来体的特性＞
SGF外来体中所含的微小颗粒的平均粒径为50～150nm。
每50μL的SGF外来体包含2×108个微小颗粒。即，SGF外来体是0.04×108个/μL的高浓度外来体溶液。
另外，按照已知方法对所得到的SGF外来体的成分进行分析。其结果可知：SGF外来体不含来自牙髓的干细胞，不含MCP-1，也不含Siglec-9。因此，可知与作为间充质干细胞的培养上清的有效成分的MCP-1和Siglec-9以及它们的类似物不同的有效成分是SGF外来体的有效成分。
＜小鼠中的精子形成试验＞
对老龄雄性小鼠(60周龄)的睾丸注射给予50μL的SGF外来体。即，对老龄雄性小鼠的每个睾丸直接给予包含2×108个(20μg)外来体的SGF外来体。
给药后，于2周后摘出睾丸(附睾尾部)，计数每个睾丸的精子数，求出2次的平均。所得结果见图1。
[实施例2]：AT-MSC外来体
除了使用来自脂肪的干细胞以外，与实施例1同样地操作，调制了来自脂肪的干细胞的培养上清。由所得到的来自脂肪的干细胞的培养上清，与实施例1同样地操作来调制外来体。将所得外来体作为AT-MSC外来体(AT-MSC Exosome)。
除了使用AT-MSC外来体以外，与实施例1同样地操作，进行小鼠中的精子形成试验。所得结果见图1。
＜AT-MSC外来体的特性＞
AT-MSC外来体中所含的微小颗粒的平均粒径为50～150nm。
每50μL AT-MSC外来体包含2×108个微小颗粒。即，AT-MSC外来体是0.04×108个/μL的高浓度外来体溶液。
另外，按照已知方法对所得到的AT-MSC外来体的成分进行分析。其结果，可知AT-MSC外来体不含来自脂肪的干细胞、不含MCP-1、也不含Siglec-9。因此，可知与作为间充质干细胞的培养上清的有效成分的MCP-1和Siglec-9以及它们的类似物不同的有效成分为AT-MSC外来体的有效成分。
[比较例1]：未处理的对照
作为未处置的对照，对于未给予外来体的老龄雄性小鼠(60周龄)，与实施例1同样地操作，进行小鼠中的精子形成试验(N=1)。所得结果见图1。
[参考例1]：12周龄小鼠
对于未给予外来体的年轻雄性小鼠(12周龄)，与实施例1同样地操作，进行小鼠中的精子形成试验(N=1)。所得结果见图1。
根据图1，首先，在未作任何处置的情况下(未给予外来体的情况下)，与比较例1的老龄雄性小鼠相比，参考例1的年轻雄性小鼠(12周龄)的精子数多。
接下来，在老龄雄性小鼠(60周龄)的例子之间进行比较可知：与未给予比较例1的外来体的情况相比，在给予了实施例1的SGF外来体或实施例2的AT-MSC外来体的情况下精子数均显著增加。特别是，与给予了实施例2的AT-MSC外来体的情况相比可知：在给予了实施例1的SGF外来体的情况下精子数进一步增加，观察到高的精子形成能力。
另一方面，在老龄雄性小鼠(60周龄)的例子与年轻雄性小鼠(12周龄)的例子之间进行比较可知：在给予了实施例2的AT-MSC外来体的情况下，精子数增加(恢复)到与对参考例1的年轻雄性小鼠(12周龄)未给予外来体的情况同等程度或稍差的程度。而且，还可知：特别是在对老龄雄性小鼠(60周龄)给予实施例1的SGF外来体的情况下，超过了对参考例1的年轻雄性小鼠(12周龄)未给予外来体的情况，精子数显著增加(强壮)。通过给予实施例1的SGF外来体，可使老龄雄性小鼠的精子数较年轻雄性小鼠的精子数有所增加，这可谓是本领域技术人员无法预测程度的显著效果。
由以上可知：根据本发明的睾丸功能改善剂，在精子形成能力方面，可显著改善动物的睾丸功能。
[实施例11、12、比较例11、12]
按照图2的流程，进行交配试验和分娩试验。
准备4只老龄雄性小鼠(58周龄)，分成2组。
如图2(B)所示，对2只各自的老龄雄性小鼠的每个睾丸直接给予2×108个实施例1中得到的SGF外来体。给予量设为50μL/每个睾丸。将实施例11的老龄雄性小鼠作为雄1、将实施例12的老龄雄性小鼠作为雄2。
作为对照，如图2(A)所示，在实施例11和12中，对2只老龄雄性小鼠的睾丸分别给予等量的50μL生理盐水(PBS对照)代替SGF外来体。将比较例11的老龄雄性小鼠作为雄3、将比较例12的老龄雄性小鼠作为雄4。
实施例11、12、比较例11、12的老龄雄性小鼠的生育进行了2周。
＜与雌性小鼠的交配试验＞
观察正常雌性小鼠的外阴部，选择外阴部红且肿胀(性周期处于发情前期)的雌性小鼠，用于与各实施例和比较例的老龄雄性小鼠交配。
使2只年轻的12周龄的雌性小鼠(区别为雌1和雌2)分别与各实施例和比较例的1只老龄雄性小鼠同居，从傍晚开始饲养。
在从饲养开始起16小时后(次日)和40小时后(第2天)，观察雌性小鼠的外阴部，确认栓塞(阴道栓)的有无，确认交配是否成立。如果栓塞为“有”，则判断为交配成立，在16小时后栓塞为“有”的情况下，不进行40小时后的栓塞有无的确认(下述表1和表2中的“-”评价)。
其结果，可知：在与给予了SGF外来体的实施例11的雄1和实施例12的雄2交配的4只雌性小鼠中，有3只栓塞为“有”。另一方面，可知在与PBS对照的(未给予外来体的)比较例11的雄3和比较例12的雄4交配的4只雌性小鼠中栓塞均为“无”。
在所得结果中，雄1～雄4与各自的雌1的交配结果见下述表1，雄1～雄4与各自的雌2的交配结果见下述表2。
[表1]
Figure DEST_PATH_IMAGE002
[表2]
Figure DEST_PATH_IMAGE004
＜分娩试验＞
之后，单独饲养交配成立的雌性小鼠，确认20天以内的生产(分娩)，计数仔小鼠的数量(参照图1的分娩确认)。
其结果，在上述表1和表2中，由栓塞为“有”的雌性小鼠总计生出15只仔小鼠，由栓塞为“无”的雌性小鼠没有生出仔小鼠。
具体而言，关于与给予了SGF外来体的实施例11的雄1的交配，由栓塞为“有”的雌1的小鼠(参照上述表1)生出4只仔小鼠，由栓塞为“无”的雌2的小鼠(参照上述表2)没有生出仔小鼠。
关于与给予了SGF外来体的实施例12的雄2的交配，由栓塞为“有”的雌1的小鼠(参照上述表1)生出6只仔小鼠，由栓塞为“有”的雌2的小鼠(参照上述表2)生出5只仔小鼠。
另一方面，关于与PBS对照的(未给予外来体的)比较例11的雄3的交配，由栓塞为“无”的雌1的小鼠(参照上述表1)和栓塞为“无”的雌2的小鼠(参照上述表2)均未生出仔小鼠。
关于与PBS对照的(未给予外来体的)比较例12的雄4的交配，由栓塞为“无”的雌1的小鼠(参照上述表1)和栓塞为“无”的雌2的小鼠(参照上述表2)均未生出仔小鼠。
之后，自分娩起24小时后确认仔小鼠的腹部是否存在乳斑(乳汁的存积)。在出生的15只仔小鼠中，有14只确认到了乳斑。在给予了SGF外来体的实施例12的雄2的小鼠与第2只雌性(雌2)小鼠的交配后出生的1只仔小鼠中没有确认到乳斑。
在所得结果中，上述表1所记载的雄1～雄4与各自的第1只雌性(雌1)交配后的分娩结果汇总于下述表3，上述表2所记载的雄1～雄4与各自的第2只雌性(雌2)交配后的分娩结果汇总于下述表4。
[表3]
Figure DEST_PATH_IMAGE006
[表4]
Figure DEST_PATH_IMAGE008
根据上述表1～表4，相当于普通的老龄雄性小鼠(58周龄)的、PBS对照的(未给予外来体的)比较例11或12的雄性小鼠均无法使雌性小鼠妊娠。认为这是由于因衰老导致雄性小鼠的睾丸功能变差的缘故。
相对于此，在给予了SGF外来体的实施例11或实施例12的雄性小鼠的情况下，分别可使至少1只雌性小鼠妊娠，并且可确认到由各自的雌性小鼠分娩。因此，可知给予了SGF外来体的雄性小鼠容易使雌性小鼠妊娠，并且容易分娩仔小鼠。
由以上可知：根据本发明的睾丸功能改善剂，在妊娠能力(使雌性妊娠的能力)方面，可显著改善(恢复)动物的睾丸功能。
＜仔小鼠的发育试验＞
饲养在分娩试验中出生的15只仔小鼠，出生后4周龄时确认发育的状态。
其结果，在出生的15只仔小鼠中，13只发育正常，2只死亡(发育异常)。
在所得结果中，雄1～雄4与各自的第1只雌性(雌1)交配后的仔小鼠的发育结果见下述表5，雄1～雄4与各自的第2只雌性(雌2)交配后的仔小鼠的发育结果见下述表6。
[表5]
Figure DEST_PATH_IMAGE010
[表6]
Figure DEST_PATH_IMAGE012
由上述表5和表6可知：在给予了SGF外来体的实施例11或实施例12的雄性小鼠的情况下，生出的仔小鼠正常发育的概率高。因此，可知：给予了SGF外来体的雄性小鼠，其仔小鼠正常发育的概率高，可改善(或抑制)来自雄性的不育症。该结果暗示了：在给予了SGF外来体的实施例11或实施例12的雄性小鼠中，得到了大量无基因异常(或少)的精子、以及生出了无基因异常(或少)的仔小鼠。
需要说明的是，PBS对照的(未给予外来体的)比较例11或12的雄性小鼠在分娩试验中没有生出仔小鼠，因此无法进行发育试验。
由以上可知：本发明的睾丸功能改善剂可改善来自雄性的不育症。
由以上的各实施例可知：本发明的睾丸功能改善剂可显著改善动物的睾丸功能，特别是可改善精子形成能力、妊娠能力和不育症。特别是，在本发明的睾丸功能改善剂的优选方案中可知：可显著改善因衰老等导致睾丸功能(或生殖能力)变差的老龄雄性的精子形成能力、妊娠能力和不育症。
[实施例21]：永生化MSC外来体
将作为TGF β受体抑制剂的3-(6-甲基吡啶-2-基)-4-(4-喹啉基)-1-苯硫基氨基甲酰基-1H-吡唑(A-83-01) (Merck公司)和作为ROCK抑制剂的Y-27632 (富士胶片和光纯药株式会社)组合添加在按照与实施例1同样的方法调制的来自人牙髓的干细胞中，按照已知的方法进行培养，从而得到了永生化MSC (间充质干细胞)。
除了使用所得到的永生化MSC以外，与实施例1同样地操作，调制了永生化MSC的培养上清。与实施例1同样地操作，由所得到的永生化MSC的培养上清调制了外来体。将所得到的外来体作为永生化MSC外来体。
除了使用永生化MSC外来体以外，与实施例1同样地操作，进行了精子形成试验。具体而言，对老龄雄性小鼠(60周龄、N=1)的睾丸注射给予永生化MSC外来体。即，对老龄雄性小鼠的每个睾丸直接给予了包含2×108个(20μg)外来体的永生化MSC外来体。
给药后，于2周后摘出睾丸(附睾尾部；附睾尾(caudal epididymis))，在计数每个睾丸的精子数时，精子数为11.9×106个/附睾尾。
[比较例21]：未处理的对照
作为未处置的对照，对于未给予外来体的老龄雄性小鼠(60周龄)，与实施例21同样地操作，进行了小鼠中的精子形成试验(N=1)。
给药后，于2周后摘出睾丸(附睾尾部；附睾尾(caudal epididymis))，在计数每个睾丸的精子数时，精子数为6.3×106个/附睾尾。
由以上的实施例21和比较例21可知：与未给予比较例21的外来体的情况相比，在给予了实施例21的永生化MSC外来体的情况下精子数显著增加。由以上可知：根据本发明的睾丸功能改善剂，在精子形成能力方面，可显著改善动物的睾丸功能。

Claims (14)

1.睾丸功能改善剂，其是包含来源于来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞或它们的永生化干细胞的培养上清的微小颗粒的睾丸功能改善剂，
睾丸功能改善是指：睾丸自身形成精子的能力的改善、由睾丸得到的精子自身的功能的改善和由睾丸得到的精子与雌性作用的功能的改善、以及使因老龄而老化的这些功能年轻化；或者，添加到从动物取出到体外的精液中以进行精子激活。
2.权利要求1所述的睾丸功能改善剂，其中，上述微小颗粒为外来体。
3. 权利要求1或2所述的睾丸功能改善剂，该睾丸功能改善剂不含上述来自牙髓的干细胞、上述来自脂肪的干细胞和上述永生化干细胞，
不含MCP-1，并且
不含Siglec-9。
4.权利要求1～3中任一项所述的睾丸功能改善剂，该睾丸功能改善剂是睾丸的精子形成能力改善剂。
5.权利要求1～3中任一项所述的睾丸功能改善剂，该睾丸功能改善剂是妊娠能力改善剂。
6.权利要求1～3中任一项所述的睾丸功能改善剂，该睾丸功能改善剂是畸形儿抑制剂。
7.权利要求1～6中任一项所述的睾丸功能改善剂，其中，上述微小颗粒是由上述培养上清纯化的微小颗粒。
8.权利要求1～7中任一项所述的睾丸功能改善剂，该睾丸功能改善剂包含0.5×108个以上的上述微小颗粒。
9.权利要求1～8中任一项所述的睾丸功能改善剂，其中，上述来自牙髓的干细胞或上述来自脂肪的干细胞是来自人牙髓的干细胞或来自人脂肪的干细胞。
10.权利要求1～8中任一项所述的睾丸功能改善剂，其中，上述来自牙髓的干细胞或上述来自脂肪的干细胞是来自人以外的动物的牙髓的干细胞或来自人以外的动物的脂肪的干细胞。
11.睾丸功能改善方法，其包括：对动物给予权利要求1～10中任一项所述的睾丸功能改善剂的工序。
12.权利要求11所述的睾丸功能改善方法，其特征在于：
改善上述动物的睾丸的精子形成能力；
改善上述动物的妊娠能力；或者
抑制上述动物的畸形儿。
13.权利要求11或12所述的睾丸功能改善方法，该睾丸功能改善方法是对上述动物的睾丸注射上述睾丸功能改善剂。
14.权利要求11～13中任一项所述的睾丸功能改善方法，其中，上述动物的每个睾丸的上述微小颗粒的给予量为0.5×108～2×108个/每个睾丸。
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