CN115605188A - 包含甲基叶酸的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明描述了一种药物和/或营养组合物，其包含颗粒形式的甲基叶酸以及肉碱衍生物盐、药学上可接受的赋形剂和任选的其它药物或营养活性成分。该组合物可用于口服施用。本发明还涉及获得包含颗粒形式的甲基叶酸的组合物的方法及其用于治疗与甲基叶酸减少相关的病症的用途，其中甲基叶酸是有用的。

Description

包含甲基叶酸的组合物

发明领域

本发明描述了一种药物和/或营养组合物，其包含含有甲基叶酸的颗粒以及含有肉碱衍生物盐的颗粒、药学上可接受的赋形剂和任选的其它药物或营养活性成分。该组合物可用于口服施用，优选以片剂或小药囊的形式。

本发明还涉及获得包含颗粒形式的甲基叶酸的组合物的方法及其用于治疗与甲基叶酸减少相关的病症的用途，其中甲基叶酸是有用的。

本领域的状态

L-5-甲基叶酸为叶酸(维生素B9)的代谢活性形式，并且即使在遗传缺陷的存在下，它也能够通过甲基的转移将高半胱氨酸转化回甲硫氨酸。

L-甲基叶酸或6(S)-5-甲基四氢叶酸[6(S)-5-MTHF]为叶酸的主要生物活性非对映异构体，并且是叶酸在循环中的主要形式。它也是通过膜转运到外周组织中的形式，即通过血脑屏障。在细胞中，6(S)-5-MTHF用于高半胱氨酸的甲基化以形成甲硫氨酸和四氢叶酸(THF)。THF是用于合成胸苷-DNA、嘌呤(RNA和DNA)和甲硫氨酸的碳单元的直接受体。约70％的食物叶酸和细胞叶酸由6(S)-5-MTHF组成。叶酸(叶酸的合成形式)必须经历来自亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)的酶促还原以变得具有生物活性。MTHFR的遗传突变决定细胞不能将叶酸转化成6(S)-5-MTHF。D-甲基叶酸或6(R)-5-甲基四氢叶酸[6(R)-5-MTHF]为叶酸的另一种非对映异构体。每天施用2.5mg或更高剂量的研究使得D-甲基叶酸的血浆蛋白结合高于L-甲基叶酸，导致L-甲基叶酸的肾清除率显著高于D-甲基叶酸。此外，D-甲基叶酸储存在身体组织中，主要储存在肝脏中。D-甲基叶酸不被身体代谢，并且已经推定其抑制调节酶。

叶酸在脑代谢及其代谢途径中的关键作用是已知的，并且已经注意到，抑郁症状是叶酸缺乏情况下最常见的神经精神表现之一。抑郁患者的血液中叶酸水平平均比健康对照低25％，并且低叶酸水平代表了抗抑郁剂疗法的不利结果的强易感因素(PapakostasG.I.等人,Am J Psychiatry,2012；169(12):1267-74)。

其它化合物可用于治疗与抑郁和神经病相关的病症，例如肉碱或其衍生物和维生素。大多数叶酸受体存在于小肠中。

甲基叶酸也可用于治疗糖尿病和周围神经病。神经病导致手、臂、足和腿麻木和有时的疼痛和虚弱。这些神经学问题也可发生在其它器官中，包括消化道、心脏和性器官。糖尿病患者可以在任何时间发生神经病性问题，但是人的糖尿病越严重，则发生所述并发症的风险越大。

EP 2781214描述了包含无定形L-5-甲基四氢叶酸钙和作为稳定剂的半胱氨酸的制剂，其中该制剂通过包括以下步骤的方法制备：将MTHF和半胱氨酸共混并由所得共混物形成剂型。所述组合物可以包含屈螺酮和雌二醇，用作避孕药。

CN 107812195描述了一种组合物，其包含MTHF与选自维生素C及其盐、异维生素C及其盐、巯基乙醇、半胱氨酸、巯乙基磺酸、二硫苏糖醇、还原型谷胱甘肽、硫辛酸的还原物质；所述组合物还可以包含雌激素和/或孕酮用作避孕药的。

在http://www.gnpd.com上报道的Monster Multi Dietary Supplement为一种商品制剂，其包含20种维生素和矿物质，用于心血管、骨健康和免疫系统的功能用途。MTHF和L-肉碱包含在胶囊中包括的多种成分的列表中。

美国专利6,441,168描述了5-甲基-(6R,S)、-(6R)-和-(6S)-四氢叶酸钙盐的四种稳定晶型、其制备方法及其在制备药物和食品添加剂中的用途。

还已知肉碱和肉碱衍生物在与抑郁和神经系统疾病相关的疾病中具有有益效果。

US 4,346,107描述了乙酰L-肉碱在治疗性治疗患有脑代谢受损的患者中的用途，例如老年和早老性精神运动退化状态以及老年和早老性痴呆。

US 4,343,816描述了乙酰L-肉碱用于治疗性治疗患有外周血管疾病、例如雷诺病的患者中的用途。

WO 98/57629描述了乙酰L-肉碱用于治疗性治疗患有情绪障碍的年轻个体中的用途，所述情绪障碍可以被分类为情绪恶劣(dysthymia)和抑郁、易激、循环性人格或气质，涉及精神药物的明确滥用。

WO 03/066041描述了乙酰L-肉碱在患有严重抑郁障碍的非痴呆老年个体(NDG-MDD)中治疗性治疗抑郁的用途。

EP 0256999描述了乙酰L-肉碱用于治疗急性和/或慢性周围神经病的用途。

EP 1171111描述了适于制备片剂的乙酰L-肉碱颗粒且没有活性成分的降解，并且解决了肉碱及其衍生物在少量水存在下的不稳定性问题。

B族维生素可用于治疗和预防与所述维生素缺乏相关的神经病，但由于其镇痛、神经保护和抗炎作用，在非缺乏性神经病的情况下也是有价值的辅助。B族维生素、特别是B6(吡哆醇)和B12(钴胺素)具有镇痛作用，特别是当组合使用时，这归因于去甲肾上腺素和血清素(在伤害性疼痛的传递中发挥抑制作用的神经递质)的更大的可利用性和/或功效。所述维生素特异性地抑制在神经性疼痛中涉及的一些病理生理过程，具有剂量依赖性镇痛作用；较高的剂量对应于对疼痛症状的更即时和持续的益处。最终，B族维生素由于其神经保护作用而在周围神经病的治疗中是重要的治疗选择：它们参与多种细胞代谢反应，例如氨基酸代谢(维生素B6)、DNA和脂肪酸的合成和调节、能量产生和叶酸甲基化(维生素B12)；维生素B12还刺激髓鞘形成过程，参与磷脂(髓磷脂纤维的主要成分)的替代。

使用和销售叶酸、特别是钙盐用于其中体内缺乏所述化合物的所有应用，例如神经病和抑郁状态，但是它们的稳定性受各种环境条件的影响，例如pH、温度、氧气或光暴露的变化。

还需要包含甲基叶酸以及活性成分、例如肉碱或其衍生物、维生素等的药物或营养组合物，用于治疗抑郁和神经性综合征，其随时间的推移是稳定的，没有MTHF的任何降解。在后者的情况下，包括维生素如维生素B6和维生素B12对它们也是有用的。

5-甲基四氢叶酸的稳定性问题在以下情况中是特别相关的：药物和营养组合物的生产和储存，还包含可影响最终组合物稳定性的其它活性成分。MTHF在各种环境条件下是不稳定的，例如pH、温度、氧气或光暴露的变化，这使得难以与食物系统整合。

鉴于甲基叶酸的不稳定性及其强烈的降解倾向，因此有必要拥有随时间推移稳定的包含甲基叶酸的组合物。因此，重要的是，所述组合物中的MTHF也不会被组合物的其它成分(例如盐和/或水合成分)降解。为了解决稳定性差的问题，

P.L等人在J.of FoodEng.277,2020,109901中在生物聚合物的存在下通过电喷雾方法包封了MTHF。

Liu Y.等人在J.Agric.Food Chem.2013,61,1,247-254中通过抗坏血酸盐微胶囊化技术解决了MTHF稳定性的问题。

有必要获得稳定的、工业规模可变的MTHF制备，其将包括在药物或营养组合物中，可通过可再现的方法获得，可用于叶酸缺乏的所有个体和甲基叶酸对其具有有益作用的所有个体。

还需要找到一种用于生产药物或营养组合物的方法，所述组合物包含L-5-甲基四氢叶酸与维持成品稳定性的其它活性成分的组合。

已经发现了、并且本发明的目的是，一种稳定的组合物，其包含含有甲基叶酸的颗粒、含有肉碱衍生物盐、优选乙酰L-肉碱盐的颗粒以及药学上可接受的赋形剂和任选的其它天然或合成的活性成分，其已经被发现并且是本发明的主题。

该组合物基于最终组合物的重量计包含5-40％(w/w)量的含有结晶形式的L-甲基叶酸钙(MTHF)的颗粒、50-90％量的含有肉碱衍生物盐、优选乙酰L-肉碱盐的颗粒以及药学上可接受的赋形剂。

该组合物在25℃下稳定至少6个月，没有任何MTHF降解。

包含在最终组合物中的甲基叶酸颗粒的特征可以是，包含基于颗粒重量计2-10％重量的甲基叶酸。

发明概述

本发明涉及一种固体组合物，其包含基于最终组合物的重量计5-40％(w/w)量的含有结晶形式的L-甲基叶酸钙(MTHF)和优选含有基于颗粒重量计3-30％(w/w)的抗氧化剂或稳定剂的颗粒、基于最终组合物的重量计50-90％(w/w)量的含有乙酰L-肉碱盐的颗粒、以及药学上可接受的赋形剂和任选的其它药物或营养活性成分。

甲基叶酸颗粒的特征可以是，包含抗氧化剂或稳定剂，比例为1:1至1:20的甲基叶酸/抗氧化剂重量比。

本发明描述了一种用于制备本发明的组合物的方法，包括如下步骤：

a)制备包含MTHF的颗粒，该制备包括将相对于颗粒重量计3％-10％(w/w)量的MTHF与3％-30％、优选3％-15％(w/w)量的抗氧化剂或稳定剂以及任选的50％-90％(w/w)量的稀释剂和4％-10％(w/w)量的粘合剂混合，然后进行干法或湿法制粒；

b)制备包含肉碱衍生物盐、优选乙酰L-肉碱盐的颗粒，该制备包括将相对于颗粒重量计75-90％(w/w)的肉碱衍生物盐、优选L-乙酰肉碱盐酸盐和任选的5-10％(w/w)的微晶纤维素和5-10％(w/w)的聚乙烯吡咯烷酮一起制粒；

c)将根据步骤a)获得的包含MTHF的颗粒与根据步骤b)获得的包含肉碱衍生物盐、优选乙酰-L-肉碱盐的颗粒和颗粒外赋形剂混合；以及任选地

d)压制步骤c)中获得的混合物。

包含MTHF颗粒的本发明的组合物可用于甲基叶酸在其中有用并具有有益效果的所有个体，膳食摄入不足的个体，脑脊髓液、血浆和/或血液中L-甲基叶酸值低的个体，具有与任意形式的抑郁(情绪障碍)、双相性精神障碍、认知障碍、精神障碍、精神分裂症和内皮功能障碍相关性障碍(例如神经病、外周神经病或糖尿病性神经病)相关的症状的个体。

附图说明

图1报告了在用盐水i.p.处理3天的对照(Ctrl)小鼠和用盐水、MF 3mg/Kg、LAC30mg/Kg或LAC 30+MF 3mg/Kg i.p.处理3天的CUS小鼠中在FST中的不动时间(A)。3天处理后，在使用LAC 30mg/Kg+MF 3mg/Kg的CUS小鼠中不动时间显著减少，n＝8，平均值±SEM。*P<0.05,在A中相比于CUS盐水、CUS Lac 30mg/kg和CUS MF 3mg/Kg，以及在B中相比于对照盐水。在A中F(4,35)＝10,95，在B中F(4,35)＝3,028。

图2报告了用盐水i.p.处理14天的Ctrl小鼠和用盐水、MF 3mg/Kg、LAC30mg/Kg或LAC 30+MF 3i.p.处理14天的CUS小鼠的额皮质中BDNF蛋白质(成熟形式)的蛋白质印迹分析和代表性印迹。n＝2-6只小鼠/组。*p<0.05,相比于所有其它组。F(4.20)＝7.459。

本发明描述

本发明描述了一种固体组合物，其包含含有L-5-甲基-(6S)-四氢叶酸钙、也称作L-5-MTHF、L-甲基叶酸、L-5甲基四氢叶酸或(6S)-5-MTHF、L-5-Me-TH FA、L-5-Me-H4FA、L-5-Me-H4F、L-甲基叶酸和

(下文也称作甲基叶酸或MHTF或甲基叶酸钙)的颗粒(下文也称作MHTF颗粒)、含有肉碱衍生物盐的颗粒(下文也称作肉碱颗粒)和药学上可接受的赋形剂以及任选的其它药物或营养活性成分。

包含在本发明的组合物中的L-5-甲基-(6S)-四氢叶酸钙(MTHF)是选自如US6,441,168中所述的形式I、形式II、形式III、形式IV的晶型，优选形式I。

包含颗粒形式的MTHF和颗粒形式的肉碱衍生物盐的组合物可用于MTHF和肉碱衍生物在其中有用并具有有益效果的所有个体。MTHF可用于其中脑脊髓液、血浆和/或血液中L-甲基叶酸值低的个体，所述个体具有与抑郁、精神分裂症、认知障碍或精神障碍相关的症状。本发明的组合物可用于治疗和/或预防与抑郁、认知障碍或精神障碍相关的症状。

MTHF还可用于治疗内皮功能障碍相关性病症，例如神经病、外周神经病和糖尿病性神经病。本发明的组合物可用于治疗和/或预防与抑郁和/或精神分裂症相关的病症、周围神经病和糖尿病性神经病。

所述的组合物为药物或营养组合物或者食品补充剂。

固体形式的组合物可以是用于口服施用的片剂、胶囊剂或混悬颗粒的形式。

该组合物包含基于最终组合物重量计5％-40％(w/w)量的颗粒形式的MTHF和相对于组合物总重而言50％-90％的乙酰L-肉碱。

MTHF颗粒的特征是，包含抗氧化剂和/或稳定剂，比例为1:1-1:20的甲基叶酸比抗氧化剂/稳定剂重量比。

MTHF颗粒包含2-10％(w/w)量的MTHF和3-30％(w/w)量的抗氧化剂和/或稳定剂以及药学上可接受的赋形剂。

MTHF颗粒可以包含：

-选自天然或合成物质或其混合物的抗氧化剂或稳定剂。天然物质选自抗坏血酸、柠檬酸、白藜芦醇、维生素E、类胡萝卜素、辅酶Q10、羟基苯乙酮、环糊精和山梨醇或其混合物，优选抗氧化剂或稳定剂选自抗坏血酸、柠檬酸或其混合物。合成物质选自

(环糊精)、

(羧甲基纤维素和微晶纤维素)或其混合物。该颗粒还可以包含：

-稀释剂，其选自甘露醇、玉米淀粉、纤维素、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、蔗糖、木糖醇、山梨醇、磷酸氢钙、碳酸钙、高岭土、无水或水合硫酸钙、天然橡胶、麦芽、明胶或其混合物；

-粘合剂，其选自预胶化淀粉、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、PEG、蔗糖、山梨醇、纤维素衍生物、羟丙基甲基纤维素、阿拉伯树胶、共聚维酮、淀粉指示剂或其混合物。

MTHF颗粒还可以包含：

-缓冲剂，其选自磷酸盐、酸式磷酸钾或酸式磷酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾或其混合物；

-螯合剂，其选自乙二胺四乙酸钠盐、柠檬酸、山梨醇、酒石酸、磷酸或其混合物；

-脱水剂，其选自微晶纤维素、乳糖、胶体二氧化硅、高岭土、氧化钛、氧化铝、月桂硫酸钠、硅酸铝和硅酸镁、聚酯和聚乙烯或其混合物。

在一个方面，MTHF颗粒包含2％-10％(w/w)范围的量的MTHF、3％-30％(w/w)范围的量的抗氧化剂和/或稳定剂、50％-90％(w/w)范围的量的稀释剂和2％-10％(w/w)范围的量的粘合剂，基于颗粒成品的重量计。

MTHF颗粒可以包含2-8％(w/w)范围的量的MTHF、5-25％(w/w)的抗氧化剂和/或稳定剂(优选选自抗坏血酸、柠檬酸或其混合物)、60-90％(w/w)的稀释剂和3-8％(w/w)的粘合剂，基于颗粒成品的重量计。

MTHF颗粒包含2-8％(w/w)的MTHF、5-25％(w/w)的柠檬酸或抗坏血酸或其混合物、60-90％(w/w)的玉米淀粉或微晶纤维素和3-8％(w/w)的预胶化淀粉或羟丙基纤维素，基于颗粒成品的重量计。

在另一方面，该颗粒包含2-8％(w/w)的MTHF、5-15％(w/w)的抗坏血酸、70-90％(w/w)的甘露醇或改性淀粉和2-6％(w/w)的羟丙基纤维素，基于颗粒成品的重量计。

在另一方面，该颗粒包含2-8％(w/w)的MTHF、5-15％(w/w)的柠檬酸、2-6％(w/w)的预胶化淀粉和70％-90％(w/w)的玉米淀粉，基于颗粒成品的重量计。

在另一方面，该颗粒包含3-8％(w/w)的MTHF、5-15％(w/w)的抗坏血酸、2-6％(w/w)的羟丙基纤维素和70-90％(w/w)的微晶纤维素，基于颗粒成品的重量计。

在一个特定方面，该颗粒包含30克甲基叶酸钙、60克抗坏血酸、1200克玉米淀粉和50克预胶化淀粉。

该组合物包含5-40％(w/w)范围的量的MTHF颗粒和60-95％(w/w)范围的量的包含肉碱衍生物盐的颗粒，基于最终组合物的重量计。

肉碱衍生物可以选自乙酰L-肉碱、丙酰肉碱及其盐，所述盐选自盐酸盐、富马酸盐、牛磺酸盐或其混合物，优选地，肉碱衍生物为乙酰L-肉碱，更优选乙酰L-肉碱盐酸盐。

在一个方面，肉碱衍生物盐为颗粒形式。

在一个方面，含有聚乙烯吡咯烷酮和微晶纤维素的颗粒形式的乙酰L-肉碱盐酸盐以基于最终组合物重量计50-90％(w/w)范围的量存在。

在另一方面，肉碱颗粒包含75-90％(w/w)量的乙酰L-肉碱盐酸盐、5-10％(w/w)量的羧甲基纤维素和5-10％(w/w)量的聚乙烯吡咯烷酮，基于颗粒成品的重量计。在一个特定方面，乙酰L-肉碱颗粒根据EP 1171111制备。

在一个方面，组合物为用于口服施用的片剂或颗粒剂的形式。

片剂可以包含5-40％(w/w)量的MTHF颗粒和50-95％(w/w)量的乙酰L-肉碱盐酸盐颗粒，基于最终组合物的重量计。

在一个方面，片剂形式的组合物包含5-40％(w/w)范围的量的MTHF颗粒、50-90％(w/w)范围的量的乙酰L-肉碱(优选盐酸盐)颗粒、0.1-15％(w/w)范围的量的润滑剂、0.1-5％(w/w)范围的量的助流剂和0-10％(w/w)范围的量的稀释剂，基于片剂重量计。

MTHF颗粒和乙酰L-肉碱颗粒可以包括在单剂量小药囊中，其中剂量可以根据需要变化。

颗粒外赋形剂可以选自崩解剂、助流剂、润滑剂和稀释剂、维生素、其它活性成分或其混合物。

崩解剂选自淀粉羟乙酸钠、聚维酮(乙烯基吡咯烷酮共聚物)、交聚维酮(聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物)、预胶化淀粉、羧甲基纤维素钠(羧甲纤维素)、交联羧甲基纤维素(交联羧甲纤维素)、淀粉羟乙酸钠、硅酸钙或其混合物。

润滑剂选自硬脂酸镁或硬脂酸钙、硬脂酰醇富马酸钠、氢化植物油、矿物油、聚乙二醇、月桂硫酸钠、甘油酯、苯甲酸钠或其混合物。

助流剂选自滑石粉、胶体二氧化硅、沉淀二氧化硅或其混合物。

片剂可以包含防腐剂、矫味剂、着色剂或甜味剂或其混合物。

片剂可以用薄膜包衣料进行包衣，所述薄膜包衣料可以任选为控释包衣料。

在一个方面，片剂形式的单位组合物如表1中所示。

表1

成分	％(w/w)
		乙酰L-肉碱颗粒	60-80
MTHF颗粒	5-40
		润滑剂	4-15
助流剂	1-5
		稀释剂	0-10

在一个方面，片剂组合物包含50-500mg的MTHF颗粒、500-800mg的乙酰L-肉碱盐酸盐颗粒和可用于片剂制备的药学上可接受的赋形剂。

在一个方面，片剂组合物包含2-30mg的MTHF、400-700mg的乙酰L-肉碱盐酸盐、20-50mg的抗坏血酸或柠檬酸或其混合物、1-50mg的润滑剂、0.1-10mg的助流剂和0-100mg的稀释剂，以及用于片剂制备的药学上有用的赋形剂。

在一个特定方面，片剂形式的单位组合物如表2中所示。

表2

在另一方面，片剂形式的单位组合物如表3中所示。

表3

在另一方面，片剂形式的组合物可以包含维生素，其可以选自水溶性维生素和脂溶性维生素或其混合物。

水溶性维生素选自维生素B1(硫胺素或抗神经炎素)、维生素B2(核黄素或lactoflavin)、维生素B3或维生素PP(尼克酸或烟酸)、维生素B5或维生素W(泛酸)、维生素B6或维生素Y(吡多辛或吡哆胺或吡哆醛)、维生素B8或维生素H或维生素I(生物素)、维生素B9或维生素BC或维生素M(叶酸或蝶酰(单)谷氨酸或folacin)和维生素B12(钴胺素)。

脂溶性维生素选自维生素A(视黄醇和类视色素)、维生素D(D2:麦角骨化醇，D3:胆钙化醇)、维生素E(生育酚)、维生素K(K1:萘醌，K2:叶绿醌，K3:甲基萘醌，甲萘醌)、维生素F(α-亚麻酸，ω3)和维生素Q(泛醌，辅酶Q)。

可以包括粉末和/或颗粒形式的维生素。

在一个方面，组合物包含相对于片剂成品重量计5-40％(w/w)范围的MTHF颗粒、50-90％(w/w)范围的乙酰L-肉碱(优选HCl)颗粒、0-10％(w/w)范围的水溶性维生素、0.1-5％(w/w)范围的润滑剂、0.1-1％(w/w)范围的助流剂和0-10％(w/w)范围的稀释剂，并且片剂可以任选地包薄膜衣。

片剂可以用设计成用于实现活性成分的控释的包衣料进行包衣。

在一个方面，组合物包含基于片剂重量计5-30％(w/w)范围的MTHF颗粒、60-90％(w/w)范围的乙酰L-肉碱(优选HCl)颗粒、1-5％(w/w)范围的水溶性维生素、1-5％(w/w)范围的润滑剂、0.1-1％(w/w)范围的助流剂和0-10％(w/w)范围的稀释剂，并且片剂可以任选地包薄膜衣。

在另一方面，片剂组合物包含50-500mg的MTHF颗粒、500-800mg的乙酰L-肉碱(优选HCl)颗粒、2-50mg的水溶性维生素、1-50mg的润滑剂、1-10mg的助流剂和1-100mg的稀释剂，以及药学上可接受的赋形剂。

在另一方面，片剂组合物包含400-700mg的乙酰L-肉碱盐酸盐颗粒、相当于2-25mgMTHF的量的MTHF颗粒、10-50mg的维生素B6、1-10mg的维生素B12、5-50mg的抗坏血酸或柠檬酸、1-50mg的润滑剂、1-10mg的助流剂和0-100mg的稀释剂。

在一个特定方面，片剂形式的单位组合物如表4中所示。

表4

本发明的包含5-40％(w/w)量的MTHF颗粒和50-90％(w/w)量的乙酰L-肉碱(优选HCl)颗粒的片剂具有以下优点：当于25℃、RH60％储存至少6个月和于40℃、RH 75％储存至少6个月时是稳定的，稳定性定义为保持MTHF测定值高于90％。

本发明的包含5-40％(w/w)量的MTHF颗粒和50-90％(w/w)量的乙酰L-肉碱颗粒(优选HCl)的片剂的特征在于，通过Karl Fischer方法测定的含水量低于5％，硬度值为4-20Kp，且脆碎度值为0.1-1％。

包含颗粒形式的MTHF以及药学上可接受的赋形剂和任选的其它活性成分的组合物具有不降解的优点。颗粒中的MTHF保持稳定，即使在通常导致其降解的水合成分、例如维生素或盐的存在下也如此。

与其中MTHF以甲基叶酸钙盐粉末形式存在于片剂组合物中并接受直接压片的组合物(对比例)不同，包含颗粒形式的MTHF的组合物产生了与T0相比测定值的恢复。

包含MTHF颗粒的组合物是稳定的，MTHF测定值在25℃的温度下维持至少六个月，没有任何甲基叶酸降解。

本发明的另一方面是获得片剂组合物的方法，所述片剂组合物包含5-40％(w/w)量的MTHF颗粒和50-90％(w/w)量的乙酰L-肉碱(优选HCl)颗粒，与最终组合物相比。

制备本发明的片剂的方法包括：

a)制备MTHF颗粒；

b)制备肉碱衍生物盐、优选乙酰L-肉碱、优选HCl颗粒；

c)将步骤a)和b)中获得的颗粒与颗粒外赋形剂混合；

d)压制步骤c)中获得的混合物，和

e)任选地进行薄膜包衣。

根据优选的实施方案，该方法包括：

-将MTHF颗粒和肉碱衍生物盐、优选乙酰L-肉碱、优选HCl颗粒与颗粒外赋形剂混合；

-压制如此获得的混合物，和

-任选地进行薄膜包衣。

根据步骤a)获得的颗粒可以任选地与其它活性成分和药学上可接受的赋形剂一起使用和混合，用于制备单剂量小药囊中的组合物。

MTHF颗粒可以通过干法或湿法制粒制备，将基于颗粒重量计3-10％(w/w)量的MTHF与3-15％(w/w)量的抗氧化剂或稳定剂、50-90％(w/w)量的稀释剂和4-10％(w/w)量的粘合剂混合。

肉碱颗粒的制备包括将基于颗粒重量计75-90％(w/w)的肉碱衍生物盐、优选乙酰L-肉碱、更优选盐酸盐与5-10％(w/w)的微晶纤维素和5-10％(w/w)的聚乙烯吡咯烷酮一起制粒。

所得颗粒优选通过400-800μm筛网过筛。

将MTHF颗粒与肉碱颗粒、优选乙酰L-肉碱盐酸盐颗粒以1:3-1:10的重量比混合，将所得均匀混合物与颗粒外赋形剂混合。

将5-40％(w/w)量的MTHF颗粒与55-85％(w/w)量的肉碱颗粒、优选乙酰L-肉碱颗粒混合，向均匀混合物中加入0.1-5％(w/w)量的润滑剂、0.1-5％(w/w)量的助流剂和0-10％(w/w)量的稀释剂。可以向混合物中加入其它药学上可接受的赋形剂和天然或合成的活性成分。

可以将基于最终组合物重量计0-10％(w/w)量的B族维生素加入到步骤c)中获得的MTHF颗粒和肉碱颗粒、优选乙酰L-肉碱盐颗粒的混合物中。最终，将均匀混合物压制，并将所得片剂包薄膜衣。

本发明已经在体内抑郁动物模型中证明：MTHF和LAC(乙酰L-肉碱)的组合在治疗抑郁中是有效的，具有协同作用。

在接受慢性不可预测应激(CUS)的验证实验模型中进行动物研究，如J HCryan等人,J.Neubiorev.2005,03,009中所述，持续4周以诱导抑郁表型。CUS允许在哺乳动物体内再现对标准抗抑郁剂治疗有响应的抑郁表型。将动物分成五组，将接受MTHF与LAC组合的组与分别接受MTHF和LAC的组进行比较。所有组与接受盐水溶液的组和未接受CUS的组进行比较。

小鼠接受CUS持续4周，在CUS的第3周开始药物治疗并维持至4周处置结束。

为了评价所选产品LAC和MTHF的抗抑郁作用，动物进行了如J H Cryan等人在J.Neubiorev.2005,03,009中所述的强迫游泳试验(“FST”)，并测量了四组动物中表现出的总体不动时间。

结果显示，与其它处置组相比，用MTHF和LAC处理3天后的动物组的强迫游泳不动时间显著减少。

动物研究证实了MTHF和LAC在抑郁模型中的功效，所述组合的功效可以转移至人体剂量，5-95mg/天的MTHF和100-1000mg/天的LAC，可以每天一次或两次单独施用或与其它抗抑郁化合物组合施用。

根据所获得的结果，能够说明：

1)与对照无应激条件相比，暴露于慢性应激(CUS)导致总体不动时间增加，如通过用盐水溶液处理的I组和用盐水处理并接受CUS的II组之间的比较所示；

2)慢性应激(CUS)的作用未被3mg/kg MTHF拮抗，如MTHF处理的III组与对照组(III组)相比所示；

3)慢性应激(CUS)的作用未被30mg/kg LAC拮抗，如用LAC处理的组(IV组)与对照组(II组)相比所示；

4)慢性应激(CUS)的作用分别被共同施用相同剂量的LAC+MTHF拮抗，如II组与V组之间的比较所示。

令人感兴趣的是，用3mg/kg MTHF和LAC 30mg/kg处理的组中的小鼠显示它们的总体不动时间与对照组(I组)报告的对照无应激小鼠的总体不动时间没有差异。

这些数据表明，当以单独施用时没有改善FTS性能的剂量测试时，LAC+MTHF的共同施用能够减少总体不动时间。体内研究已经证明了LAC和MTHF的共同施用产生了显著的抗抑郁样作用。

如上所述，在4周CUS和2周药物治疗后的小鼠，在第5周结束时处死动物，通过蛋白质印迹测量额皮质中BDNF蛋白质的水平。

BDNF是一种重要的神经元营养因子，边缘结构(即额皮质和海马)内BDNF水平的降低已经与由慢性应激和抑郁产生的神经可塑性整体衰减相关(Licznerski et Jonas,ProcNatl Acad Sci U S A.；115(15):3742-3744,2018)。

当与盐水处理的对照CUS小鼠(II组)相比时，在用LAC 30mg/Kg与MF3mg/Kg的组合共同处理(V组)后，暴露于CUS的小鼠的额皮质中的两个边缘结构中的BDNF水平均增加。这些数据证明，LAC+MTHF的共同施用对BDNF产生了与在相同实验中由LAC+MTHF共同处理产生的抗抑郁样作用的行为结果相一致的作用。

图2显示通过蛋白质印迹在小鼠额皮质中测量的BDNF蛋白质表达水平。与分别用LAC和MTHF处理的组(III组和IV组)相比，用30mg/kg LAC和MTHF3mg/Kg处理的组(V组)中小鼠额皮质的BDNF水平显示出增加。

包含MTHF颗粒和肉碱颗粒的组合物可用于影响结构神经元可塑性过程。

根据病症的种类和水平，治疗剂可以每天施用1至6次，例如每天1、2、3、4、5或6次。如果个体存在患有MDD(严重抑郁障碍)的风险，则可以推荐、选择或施用本发明的制剂和抗抑郁药物的组合疗法或辅助疗法。在一些情况下，抗抑郁药物是选择性血清素再摄取抑制剂(SSRI)或选择性去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)。在一些情况下，组合疗法或辅助疗法包括叶酸制剂和SSRI。或者，组合疗法或辅助疗法包括叶酸制剂和SNRI。各种类型或类别的抗抑郁剂是已知的和可商购获得的。抗抑郁剂的非限制性实例包括血清素再摄取抑制剂(SRIs)、血清素再摄取抑制剂(SSRIs)、血清素和多巴胺再摄取抑制剂(SDRIs)、血清素-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRIs)、血清素-去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(SNDRIs)、去甲肾上腺素能和特异性血清素能抗抑郁剂(NASSAs)、去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRIs)、去甲肾上腺素(降肾上腺素)再摄取抑制剂(NRIs)、单胺氧化酶抑制剂(MAOIs)、选择性血清素再摄取增强剂(SSREs)、褪黑激素激动剂、色胺、三环抗抑郁剂(TCAs)和非典型抗抑郁剂。SSRIs发挥阻止突触前神经元再摄取血清素的作用，从而在突触中维持高水平的血清素。

本发明的组合物可用于其中施用MTHF有用的所有个体。包含MTHF和乙酰L-肉碱、优选盐酸盐的组合物可用于治疗和/或预防患有与抑郁、认知障碍或精神病相关的障碍的个体或患有内皮功能障碍、例如神经病、外周神经病和糖尿病性神经病、外周糖尿病性神经病的患者，因为这确保了达到有益效果所需的剂量，并代表了指南中指出的经典药理学治疗的有用支持。

本发明的组合物可以以1、2或3片片剂的剂量每天1、2、3或4次施用以用于抑郁疾病，其中MTHF剂量范围为5-90mg/天，乙酰L-肉碱剂量为100mg至3g/天，无任何副作用。

本发明的组合物可以作为使用的抗抑郁治疗的伴随治疗来施用。

包含基于最终组合物重量计5-40％(w/w)量的MTHF颗粒和50-90％(w/w)量的乙酰L-肉碱盐酸盐颗粒以及药学上可接受的赋形剂的固体组合物可用于治疗和/或预防与抑郁或精神分裂症相关的病症。含有5-20mg MTHF颗粒和400-750mg乙酰L-肉碱颗粒的组合物可以以1、2或3片的剂量每天1、2、3或4次施用，其中MTHF日剂量为5-90mg/天，乙酰L-肉碱日剂量为100mg-1000mg/天，用于与抑郁或精神分裂症相关的病症。

特别地，本发明的包含7.5和15mg MTHF颗粒和500mg乙酰L-肉碱(相当于约590mg乙酰L-肉碱盐酸盐)颗粒的组合物可用于治疗和预防与抑郁状态相关的病症。

包含MTHF和LAC的组合物中还可以包含B族维生素，其中与最终组合物相比，0.1-10％(w/w)量的B族维生素包含在含有5-40％(w/w)量的MTHF颗粒和50-90％(w/w)量的乙酰L-肉碱盐酸盐颗粒的组合物中，所述组合物可用于治疗和/或预防与神经病相关的病症，特别是外周神经病或糖尿病性神经病。

包含2-6mg MTHF颗粒、100-1000mg乙酰L-肉碱颗粒和2-50mg量的维生素、特别是B族维生素如B6和/或B12的组合物可以以1、2或3片每天1、2、3或4次的速率施用，得到2-24mg/天的MTHF剂量、400mg-3g/天的乙酰L-肉碱剂量和2-200mg/天的维生素B6和B12，用于治疗或预防神经病。

本发明的包含3mg MTHF颗粒、500mg乙酰L-肉碱颗粒和2-50mg维生素、特别是B族维生素如B6和/或B12的组合物可用于治疗和/或预防神经病，例如外周神经病或糖尿病性神经病。片剂可以每天施用1、2、3或4次，得到2-12mg MTHF、0.5-2g乙酰L-肉碱和2-140mg B族维生素的日剂量。

该组合物是有效的、良好耐受的和没有副作用。

由于本发明的包含颗粒形式的甲基叶酸的组合物与用于治疗抑郁的药物产品的伴随应用，可以获得协同作用。

下列实施例进一步示例了本发明。

实施例

实施例1:乙酰L-肉碱盐酸盐颗粒的制备

使用流化床将590g乙酰L-肉碱盐酸盐与35g微晶纤维素和56g聚乙烯吡咯烷酮一起进行湿法制粒。将颗粒干燥，通过600μm筛网过筛。

实施例2：L-5-甲基叶酸钙(MTHF)颗粒的制备

通过干法制粒和湿法制粒过程获得了甲基叶酸钙颗粒。

a)干法制粒

将颗粒制备成分以表5所示的量置于混合器中，然后混合。将所得混合物在干式压实机中制粒。将颗粒研磨并通过600μm筛网过筛，使用所得颗粒。

表5

成分	GR1(g)	GR2(g)
			L-5-甲基叶酸钙	30	30
抗坏血酸	-	260
			甘露醇	710	710
硬脂酸镁	5	5

GR1和GR2颗粒具有0.68g/mL的堆密度(BD)和0.79g/mL的振实密度(TD)。

GR1和GR2颗粒以如下粒度分布(PSD)表征，其中：

10％<125μm；50％<425μm；90％<600μm。

b)湿法制粒

将L-5-甲基叶酸钙与成比例量的各种成分以表6所示的比例一起置于高剪切混合器中。

表6

同时，在均化器中以表5所示的量制备包含稳定剂/抗氧化剂(抗坏血酸或柠檬酸)和粘合剂(改性淀粉或羟丙基纤维素)的水溶液，并将粘合剂溶液加入到固体混合物中。

将所得颗粒置于流化床装置中干燥。

然后将所得颗粒研磨并通过600μm筛网过筛。

GR3、GR4和GR5颗粒具有0.58g/mL的堆密度(BD)和0.67g/mL的振实密度(TD)。

GR3、GR4和GR5颗粒以如下粒度分布(PSD)表征：其中，10％<53μm；50％<180μm；90％<425μm。

GR6颗粒具有0.38g/mL的堆密度(BD)和0.46g/mL的振实密度(TD)。

GR6颗粒以如下粒度分布(PSD)表征：其中，10％<53μm；50％<180μm；90％<425μm。

获得的颗粒可以立即使用或储存以用于固体制剂。

实施例3:甲基叶酸钙颗粒的稳定性测定

在40±2℃、RH75％下1个月测试实施例2中制备的GR1-GR6颗粒的稳定性。

通过HPLC使用标准曲线测定了GR1-GR6颗粒中的MTHF测定值。使用具有5μm颗粒的Spherisorb-SCX 4.6x250mm色谱柱；MTHF在等浓度条件下用50mM KH₂PO₄/CH₃CN(32/68)洗脱液在pH2.5下洗脱；流速1.2mL/min，220nm波长UV检测器。

测定值表示为与T0相比的甲基叶酸的回收百分比。

表7显示了在40℃、RH75％下的GR1-GR6颗粒的测定值。

表7

实施例4：包含甲基叶酸和维生素B6和B12的颗粒的制备

a)干法制粒

将颗粒制备成分以表8中所示的量置于混合器中。将所得混合物在干式压实机中制粒。将颗粒研磨，通过600μm筛网过筛，并使用。

表8

成分	GR7(g)
		L-5甲基叶酸钙盐	3
维生素B6	35
		维生素B12	2
甘露醇	100
		硬脂酸镁	0.8

b)湿法制粒

制备了表9中报道的颗粒。

表9

成分	GR8(g)	GR9(g)	GR10(g)	GR11(g)	GR12(g)	GR13(g)
							乙酰L-肉碱HCl						590
L-5甲基叶酸钙盐	3	3	3	3	3	3
							维生素B6	35	35			35	35
维生素B12	2	2	2	2	2	2
							抗坏血酸		30	6			15
柠檬酸					24
							乙酰半胱氨酸				6
甘露醇	250	250
							玉米淀粉FU			50	50		60
改性淀粉					60	8
							PVP	28	28

GR8、GR9、GR10和GR11的制备：将L-5-甲基叶酸钙盐、维生素B6、维生素B12和稀释剂(甘露醇或玉米淀粉FU)以表9中所示的量置于高剪切混合器中。将该混合物用制粒溶液制粒，所述制粒溶液通过将粘合剂或稳定剂/抗氧化剂(PVP或抗坏血酸或乙酰半胱氨酸，以表9中所示的量)溶解在去矿物质水中制得，然后在烘箱或流化床干燥器中干燥直至达到含水量<5％。将所得颗粒通过600μm筛网研磨。

GR12的制备：在柠檬酸的存在下将L-5-甲基叶酸钙盐溶于水中。将改性淀粉和维生素B6和B12以表9中所示的量添加到溶液中。将所得混合物冷冻干燥，通过600μm筛网粉碎。

GR13的制备：将L-5-甲基叶酸钙盐、乙酰L-肉碱盐酸盐、维生素B6、维生素B12和玉米淀粉FU以表9中所示的量置于高剪切混合器中。同时，通过使用Ultraturrax或Silverson均化器将改性淀粉和抗坏血酸分散在去矿物质水中制备了制粒溶液。将该混合物制粒，干燥直至达到<5％的含水量。将颗粒研磨，在600μm筛网上干燥。

在40±2℃、RH75％下1个月测试了GR8-GR13颗粒的稳定性。

通过HPLC测定了GR8-GR13颗粒中的MTHF测定值。使用Spherisorb-SCX4.6×250mm，5μm色谱柱；MTHF在等浓度条件下用洗脱液50mM KH₂PO₄/CH₃CN(32/68),pH＝2.5洗脱，流速＝1.2mL/min，220nm波长UV检测器。

测定值表示为与T0相比的回收百分比。

表10显示了在40℃、RH75％下GR8-GR13颗粒中的MTHF的稳定性。

表10

实施例5：包含维生素B6和B12的颗粒的制备

将颗粒制备成分以表10中所示的量置于混合器中，然后混合。将所得混合物在干式压实机中制粒。将颗粒研磨，通过600μm筛网过筛，使用所得颗粒。

颗粒的组成如表11中所示。

表11

成分	GR14(g)
		维生素B6	350
维生素B12	20
		甘露醇	710
硬脂酸镁	5

实施例6：包含甲基叶酸钙盐和乙酰L-肉碱的片剂的制备(片剂1)

将681g实施例1的乙酰L-肉碱盐酸盐颗粒置于混合器中，加入相当于243g制备GR4的甲基叶酸钙颗粒的量。向均匀混合物中加入10克硬脂酸镁和3g胶体二氧化硅。将该混合物搅拌5分钟(20rpm)，然后在压片机中压制。将所得片剂用欧巴代AMB II包衣。

每个片剂单位的具有表12中所示的组成。

表12

未包衣片剂的特征是，通过Karl Fischer方法测定含水量为1.8％，硬度值为10±3Kp，脆碎度值为0.4％。

在25±2℃、RH 60％和40±2℃、RH75％下6个月测试了包衣片剂(片剂1)的稳定性，与实施例10中报道的T0比较确定了甲基叶酸含量。

实施例7：包含甲基叶酸钙盐和乙酰L-肉碱盐酸盐的片剂的制备(片剂2)

将681g实施例1的乙酰L-肉碱盐酸盐颗粒置于混合器中，加入相当于243g根据制备GR5获得的甲基叶酸钙颗粒的量。向均匀混合物中加入10g硬脂酸镁和3g胶体二氧化硅。将该混合物搅拌5分钟(20rpm)，然后在压片机中压制。将所得片剂用欧巴代AMB II包衣。

每个片剂单位具有表13中所示的组成。

表13

未包衣片剂的特征是，通过Karl Fischer方法测定的含水量为1.8％，硬度值为17±3Kp，脆碎度值为0.2％。

在25±2℃、RH 60％和40±2℃、RH 75％下6个月测试包衣片剂(片剂2)的稳定性，与实施例10中报道的T0比较确定了甲基叶酸含量。

实施例8：包含甲基叶酸钙盐和乙酰L-肉碱盐酸盐的片剂的制备(片剂3和片剂12)

将681g实施例1的乙酰L-肉碱盐酸盐颗粒置于双锥形混合器中，加入相当于243g根据制备GR6获得的甲基叶酸钙颗粒的量。向均匀混合物中加入10g硬脂酸镁和3g胶体二氧化硅。将该混合物搅拌5分钟(20rpm)，然后在压片机中压制。将所得片剂用欧巴代AMB II包衣。

每个片剂单位具有表14中所示的组成。

表14

未包衣片剂的特征是，通过Karl Fischer方法测定的含水量为1.8％，硬度值为12±1Kp，脆碎度值为0.3％。

在25±2℃、RH 60％和40±2℃、RH 75％下6个月测试了包衣片剂(片剂3)的稳定性，与实施例10中报道的T0比较随时间推移确定了甲基叶酸测定值。实施例9：包含甲基叶酸钙盐和乙酰L-肉碱盐酸盐的片剂的制备(片剂4-对比例)

将590g乙酰L-肉碱盐酸盐置于混合器中，加入15g甲基叶酸钙以及35g微晶纤维素、56g聚乙烯吡咯烷酮、33g抗坏血酸、172g玉米淀粉和23g改性淀粉。向均匀混合物中加入10克硬脂酸镁和3g胶体二氧化硅。将该混合物搅拌5分钟(20rpm)，然后在压片机中压制。将所得片剂用欧巴代AMB II包衣。

每个片剂单位具有表15中所示的组成。

表15

成分	量(mg)	％(w/w)
			乙酰L-肉碱	590(＝500mg乙酰L-肉碱)	60.4
微晶纤维素	35	3.6
			聚乙烯吡咯烷酮	56	5.7
甲基叶酸钙	15	1.5
			抗坏血酸	33	3.4
淀粉	172	17.6
			改性淀粉	23	2.3
硬脂酸镁	10	1.0
			胶体二氧化硅	3	0.3
欧巴代AMB II	40	4.1

在25±2℃、RH 60％和40±2℃、RH 75％下2个月测试了包衣片剂(片剂4)的稳定性，与实施例10中报道的T0比较测定了随时间推移的甲基叶酸含量。实施例10：片剂1-4中的组合物的稳定性

在25±2℃、RH 60％下12个月和在40±2℃、RH 75％下6个月测试了片剂1-4的稳定性。

使用粒径为5μm的Spherisorb SCX 4.6×250mm柱和220nm波长UV检测器，通过HPLC测定了甲基叶酸测定值。在等浓度条件下用pH 2.5的50mM KH₂PO₄/CH₃CN(32/68)洗脱液洗脱了甲基叶酸。

稳定性表示为与T0相比的回收百分比，报告在表16和17中。

表16甲基叶酸测定值,T＝25±2℃,RH 60％

表17甲基叶酸测定值,T＝40±2℃,RH 75％

实施例11：包含甲基叶酸钙盐、乙酰L-肉碱和维生素的片剂的制备(片剂5-对比例)

使用几何稀释技术将根据实施例1制备的681g乙酰L-肉碱颗粒、3g甲基叶酸钙、35g维生素B6和2g维生素B12混合45分钟。向均匀混合物中加入14克硬脂酸镁和3克胶体二氧化硅。将该混合物搅拌5分钟(20rpm)，然后在压片机中压制。所得片剂用欧巴代AMB II包衣。

片剂5的每单位组成显示在表18中。

表18

成分	量(mg)	％(w/w)
			乙酰L-肉碱颗粒	681(＝500mg乙酰L-肉碱)	65
甲基叶酸钙	3	0.3
			维生素B6	35	4.5
维生素B12	2	0.2
			硬脂酸镁	14	1.8
胶体二氧化硅	3	0.3
			欧巴代AMB II	32	4.1

未包衣片剂的特征是，通过Karl Fischer方法测定含水量为1.7％，硬度值为12±2Kp，脆碎度值为0.7％。

在25±2℃、RH 60％和40±2℃、RH 75％下6个月测试了包衣片剂(片剂5)的稳定性，与实施例18中报道的T0比较测定了随时间推移的甲基叶酸含量。实施例12：包含甲基叶酸钙盐、乙酰L-肉碱和维生素的片剂的制备(片剂6-对比例)

将根据实施例1制备的681g乙酰L-肉碱颗粒、3g甲基叶酸钙、35g维生素B6、2g维生素B12和50g抗坏血酸混合约45分钟。向均匀混合物中加入14克硬脂酸镁和3克胶体二氧化硅。将该混合物搅拌5分钟(20rpm)，然后在压片机中压制。所得片剂用欧巴代AMB II包衣。

片剂6的每个单位组成显示在表19中。

表19

成分	量(mg)	％(w/w)
			乙酰L-肉碱颗粒	681(＝500mg乙酰L-肉碱)	61
甲基叶酸钙	3	0.3
			抗坏血酸	50	6.0
维生素B6	35	4.3
			维生素B12	2	0.2
硬脂酸镁	14	1.7
			胶体二氧化硅	3	0.3
欧巴代AMB II	32	4.1
			总计	820

未包衣片剂的特征是，通过Karl Fischer方法测定含水量为1.2％，硬度值为10±2Kp，脆碎度值为0.9％。

在25±2℃、RH 60％和40±2℃、RH 75％下6个月测试了包衣片剂(片剂6)的稳定性，与实施例18中报道的T0比较测定了随时间推移的甲基叶酸含量。实施例13：包含甲基叶酸钙盐、乙酰L-肉碱和维生素的片剂的制备(片剂7)

将681g实施例1的乙酰L-肉碱盐酸盐颗粒置于双锥形混合器中，加入相当于74.5g根据制备GR1获得的甲基叶酸钙颗粒的量和108.5g根据制备GR 14获得的包含维生素B6和B12的颗粒。将7g硬脂酸镁和3g胶体二氧化硅加入均匀混合物中。将该混合物搅拌5分钟(20rpm)，然后在压片机中压制。所得片剂用欧巴代AMB II包衣。

单位组成显示在表20中。

表20

未包衣片剂的特征是，通过Karl Fischer方法测定含水量为1.5％，硬度值为19±3Kp，脆碎度值为0.1％。

在25±2℃、RH 60％和40±2℃、RH 75％下6个月测试了包衣片剂(片剂7)的稳定性，与实施例18中报道的T0比较测定了随时间推移的甲基叶酸含量。实施例14：包含甲基叶酸钙盐、乙酰L-肉碱和维生素的片剂的制备(片剂8)

将681g实施例1的乙酰L-肉碱盐酸盐颗粒、相当于100.5g根据制备GR2获得的甲基叶酸钙颗粒的量和108.5g根据制备GR14获得的包含维生素B6和B12的颗粒置于混合器中。将7g硬脂酸镁和3g胶体二氧化硅加入均匀混合物中。将该混合物搅拌5分钟(20rpm)，然后在压片机中压制。所得片剂用欧巴代AMB II包衣。

片剂8的每单位组成显示在表21中。

表21

未包衣片剂的特征是，通过Karl Fischer方法测定含水量为1.8％，硬度值为19±3Kp，脆碎度值为0.2％。

在25±2℃、RH 60％和40±2℃、RH 75％下6个月测试了包衣片剂(片剂8)的稳定性，与实施例18中报道的T0比较测定了甲基叶酸测定值。

实施例15：包含甲基叶酸钙盐、乙酰L-肉碱和维生素的片剂的制备(片剂9)

将681g实施例1的乙酰L-肉碱盐酸盐颗粒置于混合器中，加入相当于86g根据制备GR3获得的甲基叶酸钙颗粒的量、35g维生素B6和2g预先在48g玉米淀粉中稀释的维生素B12。向均匀混合物中加入10克硬脂酸镁和3克胶体二氧化硅。将该混合物搅拌5分钟(20rpm)，然后在压片机中压制。所得片剂用欧巴代AMB II包衣。

片剂9的每单位组成显示在表22中。

表22

未包衣片剂的特征是，通过Karl Fischer方法测定含水量为1.7％，硬度值为9±2Kp，脆碎度值为0.4％。

在25±2℃、RH 60％和40±2℃、RH 75％下6个月测试了包衣片剂(片剂9)的稳定性，与实施例18中报道的T0比较测定了随时间推移的甲基叶酸含量。实施例16：包含甲基叶酸钙盐、乙酰L-肉碱和维生素的片剂的制备(片剂10)

将根据制备获GR13获得的713g乙酰L-肉碱盐酸盐、甲基叶酸钙和维生素B6和B12颗粒、8g硬脂酸镁和3g胶体二氧化硅置于双锥形混合器中。将该混合物搅拌5分钟(20rpm)，然后在压片机中压制。所得片剂用欧巴代AMB II包衣。

片剂5的每个单位组成显示在表23中。

表23

未包衣片剂的特征是，通过Karl Fischer方法测定含水量为1.5％，硬度值为5±1Kp，脆碎度值为0.1％。

在25±2℃、RH 60％和40±2℃、RH 75％下6个月测试了包衣片剂(片剂10)的稳定性，与实施例18中报道的T0比较测定了随时间推移的甲基叶酸含量。实施例17：包含甲基叶酸、乙酰L-肉碱盐酸盐和维生素的片剂的制备(片剂11)

将681g实施例1的乙酰L-肉碱盐酸盐颗粒置于混合器中，加入等于140.8g的根据制备GR7获得的甲基叶酸钙和维生素B6和B12颗粒。将7g硬脂酸镁和3g胶体二氧化硅加入均匀混合物中。将该混合物搅拌5分钟(20rpm)，然后在压片机中压制。所得片剂用欧巴代AMBII包衣。

片剂5的每个单位组成显示在24中。

表24

未包衣片剂的特征是，通过Karl Fischer方法测定含水量为1.7％，硬度值为19±3Kp，脆碎度值为0.3％。

测试了包衣片剂(片剂11)的稳定性，与实施例18中报道的T0比较测定了随时间推移的含量。

实施例18：片剂5-11的稳定性

在25±2℃、RH 60％下12个月和在40±2℃、RH 75％下6个月测试了片剂5-11的稳定性。

使用具有5μm粒度的Spherisorb SCX 4.6×250mm柱和220nm波长UV检测器，通过HPLC测定了甲基叶酸测定值。在等浓度条件下用pH 2.5的50mM KH₂PO₄/CH₃CN(32/68)洗脱液洗脱了甲基叶酸。

稳定性表示为与T0时的浓度相比的回收百分比，报告在表25和26中。

表25在25℃、RH 60％下的L-5-甲基叶酸钙测定值

表26在40℃、RH 75％下的L-5-甲基叶酸钙测定值

实施例19：甲基叶酸和L-乙酰肉碱的共同施用在人类抑郁症的验证动物模型中的作用

将40只7周龄雄性C57Black/6J小鼠进行CUS(“慢性不可预测轻度应激”)，其为如JH Cryan等人在J.Neubiorev.2005,03,009中所述的允许抑郁表型的验证模型。

将动物分成五组，施用以下处理：

I组：8只动物，对照，盐水溶液

II组：8只动物，CUS，盐水溶液

III组：8只动物，CUS，甲基叶酸(MTHF)3mg/kg

IV组：8只动物；CUS，L-乙酰肉碱(LAC)30mg/kg和盐水

V组：8只动物；CUS，共同施用LAC 30mg/kg和MTHF 3mg/kg

在温度受控(21-23℃)的房间中将小鼠每笼4-5只圈养，自由取食和饮水，光照/黑暗周期为12小时。在接受CUS的动物和非应激对照动物中评估了ACL和MF的组合抗抑郁作用。

使小鼠接受CUS持续4周，在此期间以随机和不可预测的方式每天两次向动物施加不同类型的应激：白天一个疗程持续1-3小时，夜晚一个疗程(持续12小时)，两个疗程之间间隔至少6小时。所施加的应激程序如下：食物剥夺；笼放置在旋转平台上；45°倾斜笼；湿垫料(250ml水21℃，750ml垫料)；夜间亮灯；白天关灯；容纳在特殊的透明有机玻璃圆筒内，通风良好，开口为0.4cm，尺寸为125×5cm，动物在其中可以进行小的来回运动但不能转身；更换笼子(将小鼠置于先前被其它小鼠占据的笼子中)；夜晚频闪灯。对CUS动物和各自的对照进行适于两者的行为测试，以评估抑郁样表型和由随后的药理学处理诱导的抗抑郁作用。

药物治疗在CUS的第3周开始，并维持2周，研究在实验开始的第5周结束。在治疗开始后3天进行行为测试，在第5周结束时、在治疗14天后进行小鼠脑的尸检蛋白质研究。

为了评估所选产品LAC和MEF的抗抑郁行为作用，对动物进行如J H Cryan等人在J.Neubiorev.2005,03,009中所述的强迫游泳试验(“FST”)，在5组动物中测定了总体不动时间。

FST先前在数篇文章中进行了验证，总体不动时间被标准抗抑郁药物(例如血清素再摄取抑制剂(SSRI))的急性、亚急性和长期治疗一致性地减少。在测试期间，将小鼠单独放置在填充有温水(28℃)的透明有机玻璃圆筒(25cm高和22cm直径)中6分钟，温水的量足以防止小鼠用后腿接触圆筒的底部。对动物进行录像，然后在测试的最后4分钟测量不动时间(以秒表示)。表27报告了小鼠的行为抗抑郁试验。

表27

强迫游泳试验	总体不动时间(秒)+SD
		I组(盐水)	184.87±41.47
II组(CUS-盐水)	214.25±36.83
		III组(MTHF 3mg/Kg)	230±14.20
IV组(LAC 30mg/Kg)	245.75±30.34
		V组(LAC30+MTHF 3mg/kg)	149.5±33.93

用Anova Fisher’s精确检验进行的统计分析显示出显著效果：F(4.35)＝10.95。实施例20：暴露于慢性应激和用MTHF和/或LAC处理的小鼠的边缘结构中BDNF的表达

如实施例19中所述处理小鼠。在CUS 4周和药理学处理2周(如实施例19中所述)后，在第5周结束时，处死动物，通过蛋白质印迹测量海马和额皮质中BDNF蛋白质的水平。表28报道了小鼠额皮质中BDNF(一种与长期应激和抑郁相关的神经元营养因子)的蛋白质水平。

表28

额皮质中的蛋白质印迹BDNF	光密度带±SD
		I组(盐水)	100.64±23.05
II组(CUS-盐水)	104.70±21
		III组(MTHF 3mg/Kg)	138.46±18.26
IV组(LAC 30mg/Kg)	113.29±28.95
		V组(MTHF 3+LAC 30mg/Kg)	203.47±72.06

对于额皮质中BDNF的蛋白质印迹，Anova Fisher精确为：F(6.23)＝5.886。

图2显示了通过蛋白质印迹在小鼠I额皮质中测量的BDNF蛋白表达水平。该抗体识别17KDa BDNF的成熟形式。与分别用LAC和MTHF处理的组相比，用LAC 30mg和MTHF 3mg组合处理引起了使用特异性抗体印迹BDNF的蛋白质印记强度显著增加。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.片剂组合物，包含基于最终组合物的重量计5-40％(w/w)量的结晶L-甲基叶酸钙(MTHF)颗粒和50-90％(w/w)量的含有肉碱衍生物盐的颗粒以及药学上可接受的赋形剂，其中甲基叶酸颗粒包含至少一种抗氧化剂或稳定剂。

2.根据权利要求1的组合物，其中抗氧化剂或稳定剂选自抗坏血酸和柠檬酸，其量基于颗粒重量计为3-30％(w/w)。

3.根据权利要求1的组合物，其中甲基叶酸颗粒包含：

-2-10％(w/w)的甲基叶酸钙；

-3-30％(w/w)的抗氧化剂或稳定剂；

-50-90％(w/w)的稀释剂；

-4-10％(w/w)的粘合剂。

4.根据权利要求3的组合物，其中MTHF颗粒包含：

-2-8％(w/w)的甲基叶酸钙；

-5-25％(w/w)的抗氧化剂或稳定剂；

-60-90％(w/w)的稀释剂；

-3-8％(w/w)的粘合剂。

5.根据权利要求4的组合物，其中所述颗粒包含：

-2-8％(w/w)的甲基叶酸钙；

-5-25％(w/w)的柠檬酸或抗坏血酸；

-60-90％(w/w)的玉米淀粉或微晶纤维素；

-3-8％(w/w)的预胶化淀粉或羟丙基纤维素。

6.根据权利要求1的组合物，其中肉碱衍生物盐为乙酰L-肉碱盐酸盐。

7.根据权利要求6的组合物，其中乙酰-L-肉碱颗粒包含基于颗粒重量计75％-90％(w/w)量的乙酰-L-肉碱、3-10％(w/w)量的聚乙烯吡咯烷酮和3-10％(w/w)量的微晶纤维素。

8.根据权利要求1的组合物，包含：

-5-40％(w/w)的MTHF颗粒；

-50-90％(w/w)的乙酰L-肉碱颗粒；

-0.1-15％(w/w)的润滑剂；

-0.1-5％(w/w)的助流剂；

-0-10％(w/w)的稀释剂；

-0-10％(w/w)的维生素；和

任选地用成膜包衣料包薄膜衣。

9.根据权利要求8的组合物，包含2-30mg的L-甲基叶酸钙颗粒和400-700mg的乙酰L-肉碱盐酸盐颗粒。

10.根据权利要求8的组合物，由如下成分组成：

-590mg乙酰L-肉碱HCl，

-35mg微晶纤维素，

-56mg聚乙烯吡咯烷酮，

-15mg甲基叶酸钙盐，

-33mg抗坏血酸，

-172mg玉米淀粉，

-23mg预胶化淀粉，

-10mg硬脂酸镁，

-3mg胶体二氧化硅，和成膜包衣料。

11.根据权利要求8的组合物，由如下成分组成：

-590mg乙酰L-肉碱HCl，

-35mg微晶纤维素，

-56mg聚乙烯吡咯烷酮，

-7.5mg甲基叶酸钙盐，

-33mg抗坏血酸，190mg玉米淀粉，-

-23mg预胶化淀粉，

-10mg硬脂酸镁，

-3mg胶体二氧化硅，和成膜包衣料。

12.根据权利要求8的组合物，由如下成分组成：

-590mg乙酰L-肉碱HCl，

-35mg微晶纤维素，

-56mg聚乙烯吡咯烷酮，

-3mg甲基叶酸钙盐，

-6mg抗坏血酸，

-120mg玉米淀粉，

-5mg预胶化淀粉，

-35mg维生素B6，-

-2mg维生素B12，

-10mg硬脂酸镁，

-3mg胶体二氧化硅，和成膜包衣料。

13.制备权利要求1的组合物的方法，包括下列步骤：

a)制备MTHF颗粒，其中将3-10％(w/w)量的MTHF与3-15％(w/w)量的抗氧化剂或稳定剂、50-90％(w/w)量的稀释剂和4-10％(w/w)的量的粘合剂混合，相对于颗粒重量计；

b)制备肉碱颗粒，其中将75-90％(w/w)量的乙酰-L-肉碱盐酸盐与5-10％(w/w)量的微晶纤维素和5-10％(w/w)量的聚乙烯吡咯烷酮混合，相对于最终颗粒重量计；

c)将步骤a)中获得的MTHF颗粒与步骤b)中获得的肉碱衍生物颗粒和颗粒外赋形剂混合并压制成片剂形式。

14.根据权利要求13的方法，其中在步骤c中，将步骤a)和b)中获得的颗粒与基于最终组合物的重量计0-10％量的B族维生素混合。

15.根据权利要求1的组合物，用于治疗和/或预防与抑郁和/或精神分裂症相关的病理学情况。

16.根据权利要求15的用于所述用途的组合物，其中MTHF剂量为5-90mg/天和LAC为100-1000mg/天的剂量，并且其中所述组合物可以每天施用一次或两次，单独或与其它抗抑郁化合物组合。

17.根据权利要求1的组合物，用于治疗和/或预防与神经病相关的病理学情况。

18.根据权利要求16的用于所述用途的组合物，其中MTHF的剂量为2-6mg，乙酰L-肉碱的剂量为100mg-1000mg，B族维生素如B6和/或B12的量为2-50mg。

Claims (22)

1.固体组合物，包含基于最终组合物的重量计5-40％(w/w)量的含有结晶形式的L-甲基叶酸钙(MTHF)的颗粒和50-90％(w/w)量的含有肉碱衍生物盐的颗粒以及药学上可接受的赋形剂和任选的其它药物或营养活性成分。

2.根据权利要求1的组合物，其中甲基叶酸颗粒包含基于颗粒重量计3-30％(w/w)量的抗氧化剂或稳定剂。

3.根据权利要求1的组合物，其中MTHF颗粒包含抗氧化剂或稳定剂，比例为1:1至1:20的甲基叶酸/抗氧化剂重量比。

4.根据权利要求1的组合物，其中甲基叶酸颗粒包含：

-2-10％(w/w)的甲基叶酸钙；

-3-30％(w/w)的抗氧化剂或稳定剂；

-50-90％(w/w)的稀释剂；

-4-10％(w/w)的粘合剂。

5.根据权利要求4的组合物，其中MTHF颗粒包含：

-2-8％(w/w)的甲基叶酸钙；

-5-25％(w/w)的抗氧化剂或稳定剂；

-60-90％(w/w)的稀释剂；

-3-8％(w/w)的粘合剂。

6.根据权利要求5的组合物，其中所述颗粒包含：

-2-8％(w/w)的甲基叶酸钙；

-5-25％(w/w)的柠檬酸或抗坏血酸；

-60-90％(w/w)的玉米淀粉或微晶纤维素；

-3-8％(w/w)的预胶化淀粉或羟丙基纤维素。

7.根据权利要求1的组合物，其中肉碱衍生物盐为乙酰L-肉碱(LAC)盐。

8.根据权利要求7的组合物，其中乙酰L-肉碱盐为乙酰L-肉碱盐酸盐。

9.根据权利要求7或8的组合物，其中所述颗粒包含基于颗粒的重量计80％-90％(w/w)量的乙酰L-肉碱、3-10％(w/w)量的聚乙烯吡咯烷酮和3-10％(w/w)量的微晶纤维素。

10.根据权利要求7或8的组合物，为片剂形式，其包含：

-5-40％(w/w)的MTHF颗粒；

-50-90％(w/w)的乙酰L-肉碱颗粒；

-0.1-15％(w/w)的润滑剂；

-0.1-5％(w/w)的助流剂；

-0-10％(w/w)的稀释剂；

-0-10％(w/w)的维生素；

任选地用成膜包衣料包薄膜衣。

11.根据权利要求9的组合物，其由590mg乙酰L-肉碱HCl、35mg微晶纤维素、56mg聚乙烯吡咯烷酮、15mg甲基叶酸钙盐、33mg抗坏血酸、172mg玉米淀粉、23mg预胶化淀粉、10mg硬脂酸镁、3mg胶体二氧化硅和成膜包衣料组成。

12.根据权利要求9的组合物，其由590mg乙酰L-肉碱HCl、35mg微晶纤维素、56mg聚乙烯吡咯烷酮、7.5mg甲基叶酸钙盐、33mg抗坏血酸、190mg玉米淀粉、23mg预胶化淀粉、10mg硬脂酸镁、3mg胶体二氧化硅和成膜包衣料组成。

13.根据权利要求9的组合物，其由590mg乙酰L-肉碱HCl、35mg微晶纤维素、56mg聚乙烯吡咯烷酮、3mg甲基叶酸钙盐、6mg抗坏血酸、120mg玉米淀粉、5mg预胶化淀粉、35mg维生素B6、2mg维生素B12、10mg硬脂酸镁、3mg胶体二氧化硅和成膜包衣料组成。

14.根据权利要求1-13的组合物，用于口服施用。

15.根据权利要求14的组合物，为片剂形式。

16.制备权利要求1的组合物的方法，包括下列步骤：

a)制备MTHF颗粒，包括将3-10％(w/w)量的MTHF与3-15％(w/w)量的抗氧化剂或稳定剂、50-90％(w/w)量的稀释剂和4-10％(w/w)量的粘合剂干法或湿法制粒混合，相对于颗粒重量计；

b)制备肉碱颗粒，包括将75-90％(w/w)的乙酰L-肉碱盐酸盐与5-10％(w/w)的微晶纤维素和5-10％(w/w)的聚乙烯吡咯烷酮制粒，相对于颗粒重量计；

c)将步骤a)中获得的MTHF颗粒与步骤b)中获得的肉碱颗粒和颗粒外赋形剂混合。

17.根据权利要求16的方法，其中在步骤c中，将步骤a)和b)中获得的颗粒与基于最终组合物的重量计0-10％量的B族维生素混合。

18.根据权利要求16或17的方法，其中将所述颗粒压制，得到片剂形式的组合物。

19.根据权利要求1-15的组合物，用于治疗和/或预防与抑郁和/或精神分裂症相关的病理学情况。

20.根据权利要求19的用于所述用途的组合物，其中MTHF剂量为5-90mg/天和LAC为100-1000mg/天的剂量，并且其中所述组合物可以每天施用一次或两次，单独或与其它抗抑郁化合物组合。

21.根据权利要求1-15的组合物，用于治疗和/或预防与神经病相关的病理学情况。

22.根据权利要求21的用于所述用途的组合物，其中MTHF的剂量为2-6mg，乙酰L-肉碱的剂量为100mg-1000mg，B族维生素如B6和/或B12的量为2-50mg。

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