CN115504863B - 一种酶解/双相酸水解耦合双水相萃取技术从葡萄皮渣中提取白藜芦醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公布了一种酶解/双相酸水解耦合双水相萃取技术从葡萄皮渣中提取白藜芦醇的方法。该方法是将葡萄皮渣采用酶解和双相酸水解的方法进行处理，然后通过两次双水相萃取法分离，经脱色、蒸发、结晶、离心分离、干燥，得到白色晶体反式白藜芦醇。本发明采取的酶解结合双相酸水解法，既可以提高白藜芦醇的转化率，又可以克服酶解时间长、酸水解易破坏白藜芦醇结构的缺陷。本发明提取分离过程操作简便，白藜芦醇转化率高，分离过程不使用毒性较高的试剂，安全环保。

Description

一种酶解/双相酸水解耦合双水相萃取技术从葡萄皮渣中提 取白藜芦醇的方法
技术领域
本发明涉及天然产物有效成分分离提取技术领域，具体涉及利用酶解/双相酸水解耦合双水相萃取技术从葡萄皮渣中分离白藜芦醇的方法。
背景技术
白藜芦醇（resveratrol），又名芪三酚，化学名为(E)-5-[2-(4-羟苯基)-乙烯基]-1,3-苯二酚，分子式C14H12O3，白色针状晶体，无臭，难溶于水，易溶于乙醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇等有机溶剂。自然界中主要分布于葡萄属、蓼属、花生属等植物中，包括虎杖、决明、等常见药用植物和葡萄、花生等农作物中。
现代药理研究表明，白藜芦醇对多种癌细胞具有显著抑制作用，而且可以提升放疗效果；白藜芦醇还可以抑制血小板非正常凝聚，预防动脉粥样硬化，保护心脏，扩张动脉血管和改善微循环，是心脑血管疾病的化学预防剂。
白藜芦醇的制备方法主要包括从虎杖等植物中提取和化学合成。化学合成法普遍存在着合成路线长、产率不高、副产物复杂、产品中溶剂残留多等诸多缺点。由于虎杖中含有的白藜芦醇较其它植物高，工业生产效率高等特点，是白藜芦醇工业提取的重要原料。但是，随着白藜芦醇市场紧俏，虎杖原料日渐匮乏，原料价格攀升，提高了生产成本。而葡萄酒工业副产品葡萄皮渣中也含有白藜芦醇，且资源丰富、来源稳定，是性价比较高的制备白藜芦醇原料。
从葡萄皮渣或葡萄植株上提取白藜芦醇的工艺，一般采用有机溶剂提取，经色谱分离、纯化等环节获得产品。CN102211980A公布了一种以葡萄酒厂废渣为原料制备白藜芦醇的方法，通过甲醇或乙醇提取，提取物经大孔吸附树脂分离，得到白藜芦醇提取物；CN104262111A公布的从葡萄中提取白藜芦醇的方法，是以乙酸乙酯为提取溶剂，经硅胶柱分离获得白藜芦醇；CN102491880A公布的方法则采用低极性溶剂和高极性溶剂配合提取，经大孔吸附树脂分离获得产品。由于白藜芦醇在葡萄皮渣中的含量不高，所以产率较低，而且色谱分离的方法往往会提高产品成本。
白藜芦醇苷（白藜芦醇的葡萄糖苷）是植物中白藜芦醇的主要存在方式，含量约为白藜芦醇的7-12倍，因此，通过对白藜芦醇苷水解从而提高白藜芦醇的得率，引起了研究人员和工程技术人员的注意。CN104087623A和CN109896929A分别公布了采用酶水解白藜芦醇苷的工艺，所用酶制剂包括纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶等；CN103333054A公布的水解葡萄皮渣的酶为纤维素酶。这些方法的主要不足在于：外加酶制剂，水解后不易回收，提高了生产成本；酶解反应时间长，生产效率不高。
近年来，醇水溶液-无机盐体系作为新型双水相萃取溶剂体系因条件温和、成本低廉、醇易回收、毒性低等特点，已应用于天然产物活性成分的分离领域。CN105039426A公布了一种利用超声辅助双水相萃取白藜芦醇的技术，以18-27%的(NH4)2SO4水溶液和13-30%的无水乙醇水溶液形成双水相体系，从虎杖中萃取白藜芦醇。目前未见采用双水相技术从葡萄皮渣中制备白藜芦醇的文献报道。曹雪杰等用乙醇-磷酸氢二钾体系从葡萄籽乙醇提取物中分离白藜芦醇（广州化工，2015，43（11）：65-67），该方法采用封管技术从葡萄籽中提取白藜芦醇，不利于工业生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶解/双相酸水解耦合双水相萃取技术从葡萄皮渣中分离白藜芦醇的方法。该方法利用葡萄皮渣中自有的酶在室温下水解，并耦合双相酸水解技术，避免了酸水解过程中产物发生其它副反应，提高了白藜芦醇的收率；并利用白藜芦醇的酸性，使用碱性盐溶液使之成盐，提高水溶性，再加入醇溶液形成双水相体系，通过两次双水相萃取，获得高纯度反式白藜芦醇。该方法不使用色谱分离，操作简单，成本低廉，具有明显的工艺适用性和工艺经济性。
为了达到上述目的，本发明通过以下技术方案加以实现：
一种酶解/双相酸水解耦合双水相萃取技术从葡萄皮渣中分离白藜芦醇的方法，其特征在于，先将葡萄皮渣利用自身含有的酶进行酶解，再利用酸水溶液和低级脂肪酸的一元醇酯混合所得双相酸水溶液加速水解过程，然后用碱性盐溶液和醇溶液形成双水相体系，通过两次双水相萃取分离，最后通过活性炭脱色、过滤、蒸发、结晶、离心分离、减压干燥处理，得到白色晶体白藜芦醇。
一种酶解/双相酸水解耦合双水相萃取技术从葡萄皮渣中分离白藜芦醇的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
a. 将葡萄皮渣在30℃ - 50℃下保温酶解12小时-72小时；
b. 向步骤a所得酶解后的葡萄皮渣中加入浓度为1 mol/L-5 mol/L的酸水溶液和低级脂肪酸的一元醇酯的混合溶液，一元醇酯与酸水溶液的混合比例为体积比3:1-1:2，用量比为葡萄皮渣：混合溶液（v：w）=1 kg：(6-8) L，加热回流6小时-18小时，得反应混合物；
c. 分取步骤b所得反应混合物中的有机层，水洗至中性，回收有机溶剂，得浓缩液；
d. 将步骤c所得浓缩液用20%-50%的碱水溶液萃取；
e. 向步骤d所得萃取液中加入等体积的50%-80%醇水溶液，静置分层，分取上层溶液，回收有机溶剂，得浓缩液；
f. 将步骤e所得浓缩液再用20%-50%的碱水溶液萃取；
g. 向步骤f所得萃取液中加入等体积的50%-80%乙醇水溶液，静置分层，分取上层溶液，回收乙醇，得浓缩液；
h. 向步骤g所得浓缩液中加入活性炭，回流脱色2-4小时，过滤；
i. 将步骤h所得滤液依次经蒸发、结晶、离心分离、减压干燥处理，得到白色晶体反式白藜芦醇。
进一步，步骤a中所述葡萄皮渣为新鲜葡萄皮渣或干燥葡萄皮渣，含水量不低于30%，对于含水量低于30%的葡萄皮渣，加水润湿使含水量不低于30%。对于新鲜的葡萄皮渣或含水量不少于30%的葡萄皮渣，可直接酶解；对于含水量低于30%的葡萄皮渣，加入适当水分润湿后，使含水量大于等于30%即可酶解。本发明方法既适用于新鲜的葡萄皮渣，也适用于放置一段时间后风干的葡萄皮渣，适用原材料范围扩大，这是本发明的显著优势之一；本发明利用了葡萄皮渣中自带的酶和酵母进行酶解，克服了外加酶制剂与原料接触不充分，酶解不完全的缺陷，同时也规避了因外加酶制剂引入外源性杂质的风险。
进一步优化的，步骤a中所述酶解温度为30℃-50℃，时间为24小时-72小时。
步骤a中所述酶解条件温和，容易达到，而且较现有技术公开的酶解时间短，显著节省了提取分离时间，提高了生产效率。
进一步，步骤b中所述酸为硫酸、盐酸、乙酸、甲酸中的任意一种或多种。
进一步，步骤b中所述低级脂肪酸的一元醇酯为乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯中的任意一种或多种。
进一步优化的，步骤b中所述低级脂肪酸的一元醇酯与酸水溶液的混合比例为体积比2:1-1:2。
进一步，步骤d、f中所述碱水溶液为Na2CO3、NaHCO3、K2CO3、KHCO3、Na2HPO4、Na3PO4、K2HPO4、K3PO4中的任意一种或多种，萃取用碱水溶液的用量为浓缩液体积的1-3倍。
进一步，步骤e中所述的醇为甲醇、乙醇、异丙醇中的任意一种。
进一步，步骤h中所述的脱色用活性炭的用量为浓缩液体积的1%-3%。
进一步，上述方法所得白藜芦醇为反式白藜芦醇，含量高达 98.83%。
步骤c中所述水洗至中性并回收有机溶剂，主要目的是减少待萃取的溶液的体积，节约萃取溶剂。
步骤b中，向由步骤a所得酶解后的葡萄皮渣中加入由酸水溶液和低级脂肪酸的一元醇酯组成的混合溶液，进行回流水解。该混合溶液为双相酸水溶液，双相酸水解是本发明的又一显著优势，具体表现为：一是将酶水解和酸水解耦合，酸可以促进葡萄皮渣中的白藜芦醇苷向白藜芦醇的转化，进一步将尚未酶解的白藜芦醇苷分解转化为白藜芦醇，使转化更加充分；二是白藜芦醇不溶于水，葡萄皮渣中白藜芦醇苷酶解转化为白藜芦醇后，加入双相酸水溶液，即可使白藜芦醇转溶于双相酸水溶液中的有机溶剂低级脂肪酸的一元醇酯中，避免了白藜芦醇长时间与酸接触导致的结构变化，减少副产物的生成，提高了白藜芦醇的收率；三是加入双相酸水溶液，同时可使白藜芦醇生成后即可离开酶解与酸水解体系进入有机溶剂低级脂肪酸的一元醇酯中，维持反应始终向生成物方向进行，进一步促进了白藜芦醇苷向白藜芦醇的转化，提高了白藜芦醇的收率。
步骤c中所述水洗至中性并回收有机溶剂，主要目的是减少待萃取液的体积，节约萃取溶剂。
步骤d、f中采用碱水溶液进行萃取，碱可与白藜芦醇形成盐，白藜芦醇成盐后在水中的溶解度提高，因此可以得到可更好的萃取效果。
步骤e中加入与碱水溶液等体积的浓度为50%-80%的醇溶液。在此条件下，可以形成稳定的双水相体系，白藜芦醇因其较强的脂溶性，转溶于有机相。
步骤g中加入与碱水溶液等量的，浓度为50%-80%的乙醇溶液。在此条件下，一方面可以形成稳定的双水相体系萃取白藜芦醇，另一方面，乙醇可以作为最后白藜芦醇重结晶的溶剂，而且，乙醇毒性较小，且易于回收，可以最大程度提升最后所得产物的安全性。
步骤h中用活性炭作为脱色剂回流脱色。采用的脱色剂可有效吸附萃取液中的色素，有利于白藜芦醇的结晶纯化。
步骤i中所述的白色白藜芦醇晶体，为针状结晶。
有益效果
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1. 适用原料范围广：本发明所用原材料葡萄皮渣既可以是新鲜的葡萄皮渣，也可以是放置一段时间或风干的葡萄皮渣，只要含水量不低于30%即可进行酶解，适用原料范围广，具有明显的工艺适用性。
2. 白藜芦醇收率高：本发明采用酶水解耦合双相酸水解的技术，酶水解专属性高、条件温和，酸水解效率高，双相酸水解还可避免水解产物反式白藜芦醇长时间与酸接触导致结构发生变化的缺陷，进一步提高了反式白藜芦醇的收率。本发明采用酶水解与双相酸水解二者相结合，大幅提高了白藜芦醇的收率，使得白藜芦醇的总收率可达0.7‰，高于葡萄皮中0.5‰的白藜芦醇含量，再次证明了采用酶解耦合双相酸水解工艺的优越性。
3.分离纯化工艺简单:：本发明利用白藜芦醇的酸性，加碱性盐溶液使之成盐，再加入醇溶液形成双水相体系，通过两次双水相萃取，得到高纯度反式白藜芦醇。分离过程中未采用操作繁琐的色谱方法，分离纯化工艺简便易行，可操作性强，生产成本低廉。
4. 生产过程安全环保：本发明反式白藜芦醇分离纯化过程中未使用高毒性的有机溶剂，利于环保，所得产物安全性高，，因此具有明显的工艺经济性。
5. 产物纯度高：本发明所得产物中反式白藜芦醇的含量可高达98.83%。
附图说明
图1为白藜芦醇和白藜芦醇苷对照品的HPLC图；
图中，出现在9min左右的色谱峰为白藜芦醇苷，出现在20min左右的是白藜芦醇的色谱峰。
图2为经酶解/双相酸水解耦合技术得到的水解液的HPLC图；
图中，出现在20min左右的是白藜芦醇的色谱峰，而在9min左右未检出白藜芦醇苷，证明水解完全。
图3为由实施例4得到的白藜芦醇样品的1H-NMR谱。
图4为由实施例4得到的白藜芦醇样品的13C-NMR谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例1
将新鲜的葡萄皮渣1000 g，在30℃下保温酶解24小时后，将酶解后的葡萄皮渣转移至反应釜中，加入2 mol/L的盐酸水溶液和乙酸乙酯的混合溶液（2:1）6000 mL，回流6小时，滤取水解液，分取乙酸乙酯层；将乙酸乙酯层水洗至中性，减压回收乙酸乙酯，用20%的Na2CO3水溶液1000mL分次萃取；合并萃取液，加入等量的60%异丙醇水溶液，静置分层，分取有机层，减压回收至300 mL；浓缩液用40% Na3PO4水溶液900mL分次萃取；合并萃取液，加入等量80%乙醇水溶液，静置分层，分取有机层，乙醇减压回收至180 mL；加入1.8g活性炭，回流4小时，滤除活性炭，减压浓缩，放置24小时，即可观察到无色针晶出现，离心分离得到白藜芦醇结晶0.52 g。采用高效液相色谱法（HPLC），测定白藜芦醇含量。HPLC色谱条件为：以十八烷基键合相硅胶为固定相，乙腈-水（23:77，V/V）为流动相，流速为1 mL/min，检测波长为 306 nm，柱温为25-50℃。以白藜芦醇标准品为对照，采用外标一点法检测，测得白藜芦醇的含量为98.52%。
由实施例1得到的白藜芦醇对照品和白藜芦醇苷对照品的HPLC色谱图，见图1。其中，出现在9min左右的色谱峰为白藜芦醇苷，出现在20min左右的是白藜芦醇的色谱峰。
实施例2
将风干的葡萄皮渣（含水量约10%）1000 g，加入1000 mL水润湿（含水量55%），在50℃下保温酶解72小时后，将酶解后的葡萄皮渣转移至反应釜中，加入5 mol/L的乙酸水溶液和乙酸甲酯的混合溶液（1:2）11000 mL，回流3小时，滤取水解液，分取乙酸甲酯层；将乙酸甲酯层水洗到中性，减压回收甲酸甲酯，用30%的K2HPO4水溶液1500 mL分次萃取；合并萃取液，加入等量的40%甲醇水溶液，静置分层，分取有机层，减压回收至400 mL；浓缩液用50%KHCO3水溶液1000mL分次萃取；合并萃取液，加入等量60%乙醇水溶液，静置分层，分取有机层，减压回收至200 mL；加入6 g活性炭，回流2小时，滤除活性炭，减压浓缩，放置24小时，即可观察到无色针晶出现，离心分离得到白藜芦醇结晶0.56 g。采用高效液相色谱法（HPLC），测定白藜芦醇含量。HPLC色谱条件为：以十八烷基键合相硅胶为固定相，乙腈-水（23:77，V/V）为流动相，流速为1 mL/min，检测波长为 306 nm，柱温为25-50℃。以白藜芦醇标准品为对照，采用外标一点法检测，测得白藜芦醇的含量为98.39%。
由实施例2得到的白藜芦醇样品的高效液相色谱图，见附图2。
实施例3
将葡萄皮渣（含水量约30%）10000 g，在50℃下保温酶解50小时后，将酶解后的葡萄皮渣转移至反应釜中，加入3 mol/L的硫酸水溶液和乙酸甲酯的混合溶液（1:1）80000mL，回流3小时，滤取水解液，分取乙酸甲酯层；将乙酸甲酯层水洗至中性，减压回收，用40%的Na3PO4水溶液5000 mL分次萃取；合并萃取液，加入等量的80%乙醇水溶液，静置分层，分取有机层，减压回收至1000 mL；浓缩液用40%Na2HPO4水溶液9000mL分次萃取；合并萃取液，加入等量70%乙醇水溶液，静置分层，分取有机层，减压回收至1000 mL；加入20 g活性炭，回流6小时，滤除活性炭，减压浓缩，放置24小时，即可观察到无色针晶出现，离心分离得到白藜芦醇结晶5.47 g。采用高效液相色谱法（HPLC），测定白藜芦醇含量。HPLC色谱条件为：以十八烷基键合相硅胶为固定相，乙腈-水（23:77，V/V）为流动相，流速为1 mL/min，检测波长为306 nm，柱温为25-50℃。以白藜芦醇标准品为对照，采用外标一点法检测，测得白藜芦醇的含量为98.53%。
实施例4
取葡萄皮渣（含水量约30%）10000 g，在经过单因素实验设计优化下的工艺参数条件下酶解，即38℃下保温酶解24小时后，将酶解后的葡萄皮渣转移至反应釜中，加入酸水溶液和乙酸乙酯的混合溶液进行双相酸水解，单因素实验筛选工艺参数发现，硫酸浓度在0.5%-1.5%、水解时间在5-7小时、乙酸乙酯和酸水比例在3:1-1:1、料液比为1:4-1:6时，白藜芦醇得率较高。在此基础上，通过响应面法实验设计优化，结果表明，硫酸浓度、乙酸乙酯和酸水比例以及硫酸浓度和水解时间的交互作用对结果影响显著，优化后的工艺参数为使用1%的硫酸作为水解催化剂，乙酸乙酯和酸水比例为3:1，料液比为1:5，水解6小时，白藜芦醇得率最高。滤取水解液，分离乙酸乙酯层；将乙酸乙酯层水洗至中性，减压回收乙酸乙酯，再用碱水溶液分次萃取。经单因素实验筛选，40%的NaHCO3水溶液5000 mL分次萃取，可使白藜芦醇转化为白藜芦醇的钠盐进而溶解于碱水溶液中。合并萃取液，加入一定浓度的异丙醇水溶液，形成双水相萃取溶液，静置分层，同样采用单因素实验设计，优化后的异丙醇水溶液浓度为80%（v/v），与碱水溶液等量。分取有机层，减压回收至1000 mL；浓缩液再用经单因素实验设计优化后的工艺参数，即40% NaHCO3水溶液9000 mL分次萃取；合并萃取液，加入等量80%异丙醇水溶液，静置分层，分取有机层，减压回收至1000 mL；加入20 g活性炭，回流3小时，滤除活性炭，减压浓缩，放置24小时，即可观察到无色针晶出现，离心分离得到白藜芦醇结晶7.47 g。采用高效液相色谱法，测定白藜芦醇含量。以白藜芦醇标准品为对照，采用外标一点法，测得白藜芦醇含量为98.83%。HPLC色谱条件为：以十八烷基键合相硅胶为固定相，乙腈-水（23:77，V/V）为流动相，流速为1 mL/min，检测波长为 306 nm，柱温为25-50℃。
为验证酶解耦合双相酸水解的工艺效果，对实施例4中所得水解液进行高效液相色谱（HPLC）分析。HPLC色谱条件为：以十八烷基键合相硅胶为固定相，甲醇-水（35:65，V/V）为流动相，流速为1 mL/min，检测波长为 308 nm，柱温为25-50℃。以白藜芦醇苷标准品为对照，采用外标一点法，检测水解液中白藜芦醇苷的含量。结果为：水解液中未检出白藜芦醇苷（色谱图见附图2），说明白藜芦醇苷全部转化为白藜芦醇。
具体优化筛选过程为：
1. 实验材料、试剂与仪器
实验材料：葡萄皮（葡萄酿酒工业副产物，由宁夏葡萄与葡萄酒技术创新中心提供）。
试剂：白藜芦醇对照品（购自成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-11050301，质量分数≥98%）、白藜芦醇苷对照品（购自成都德思特生物科技有限公司，批号DSTDH003802，质量分数≥98%）；盐酸、硫酸、磷酸、NaOH、NaHCO3、Na2CO3、乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丁酯、甲醇、乙醇、异丙醇、活性炭、微孔滤膜（0.22μm）、色谱甲醇、色谱乙腈、纯化水。
仪器：高效液相色谱仪：waters1525泵、2996二极管阵列检测器。
2. 待测样品的制备
2.1 酶解样品的制备
取葡萄皮100g，按照《中国药典》（2020年版4部）干燥失重法（通则0831）测定含水量，38℃保温酶解一段时间后，用6倍量的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，减压回收有机溶剂并用色谱甲醇定容于10mL量瓶中，作为待测样品，考察酶解对白藜芦醇提取率的影响。
2.2 双相酸水解样品的制备
葡萄皮100g，保温酶解一段时间后，加入一定浓度的酸和低级脂肪酸的一元醇酯，双相酸水解一定时间，转移至分液漏斗中，分取有机相；将有机相水洗至中性，减压回收有机溶剂并用色谱甲醇定容于10mL量瓶中，作为待测样品，评估酶解耦合双相酸水解对白藜芦醇提取率的影响。
2.3 碱萃取样品的制备
取葡萄皮100g，按照优化后的酶解和双相酸水解工艺参数水解，有机相减压浓缩至原体积的20%， 用等体积的碱水溶液萃取3次；合并萃取液，用浓盐酸调节pH=3，用等体积的乙酸乙酯萃取3次；合并萃取液，减压浓缩至干，色谱甲醇溶解并定容于10mL量瓶中，作为待测样品，筛选萃取用的碱溶液及碱溶液的浓度。
2.4 双水相萃取的样品制备
取葡萄皮100g，按照优化后的酶解和双相酸水解工艺参数水解，并用筛选的最佳碱溶液萃取后，加入等量的一定浓度的甲醇、乙醇或异丙醇水溶液，使之形成双水相体系，静置分层，分取有机层；有机层减压浓缩至原体积的10%，再用等体积的碱水溶液萃取3次；合并萃取液，加入等量的一定浓度的乙醇水溶液，使之形成双水相体系，静置分层，分取有机层；减压浓缩乙醇至原体积的20%，加入活性炭，回流脱色3h，滤去活性炭，乙醇溶液继续浓缩至一半体积，放置结晶。结晶用色谱甲醇溶解并定容于10mL量瓶中，作为待测样品，评估双水相萃取的效果。
3. 样品溶液中白藜芦醇的测定
3.1 色谱条件
色谱柱：YMC C18（250*4.6 mm，5 μm）；
流动相：甲醇-水（35:65，V/V）；
检测波长：306 nm；
流速：1 mL/min；
柱温：30 ℃。
3.2 标准曲线的绘制
精密称取白藜芦醇对照品，用色谱甲醇配制成0.1mg/mL的溶液，再精密吸取1、2、3、4、5、6、7mL，转移至10mL量瓶中，用色谱甲醇定容至刻度，配制成含白藜芦醇0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07mg/mL的对照品溶液。溶液经0.22μm过滤，按照《中国药典》（2020年版4部）高效液相色谱法（通则0512）操作，精密吸取20μL注入高效液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积（A）为纵坐标，白藜芦醇对照品溶液浓度（c）为横坐标，绘制标准曲线为A=6*107c+103469，R 2 =0.9997。
3.3 样品溶液中白藜芦醇含量测定
精密吸取上述待测样品20μL注入高效液相色谱仪，测定峰面积，先计算白藜芦醇的含量，再计算提取率。
4. 结果与讨论
4.1 酶解时间的选择
将葡萄皮置于38℃下，分别保温酶解12、24、48、72h，用6倍量乙酸乙酯萃取3次后，测定白藜芦醇的提取率，结果如表1所示。
表1 酶解时间对白藜芦醇提取率的影响（mean±SD，n=3）
由表1可知，酶解时间对白藜芦醇的提取率影响不大，通过24h酶解即可得到较好的提取率，将酶解时间延长至72h，白藜芦醇提取率并没有得到有效提高，因此，后续筛选工艺参数时，酶解时间确定为24h。
4.2 双相酸水解工艺参数的筛选
4.2.1 酸催化水解白藜芦醇苷的催化剂的选择
酸催化水解糖苷键常用的酸有盐酸、硫酸、甲酸、乙酸等，为了选择合适的酸催化剂，试验采用1%的盐酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸为催化剂，加入2倍量的乙酸乙酯，形成双相酸水解体系，料液比为1:8，对酶解24h后的葡萄皮进行酸水解8h，结果如表2所示。
表2 不同酸对白藜芦醇提取率的影响（mean±SD，n=3）
。
表2的结果提示，硫酸具有最好的水解效率，这可能与硫酸在水解过程中提供更多的氢离子有关。后续双水解工艺参数优化中，酸水解的催化剂选择为硫酸。
4.2.2 双相酸水解工艺参数的优选
为了优化双相酸水解的工艺参数，以硫酸为水解催化剂，根据经验，选择酸的浓度、酸水与乙酸乙酯的比例、水解时间和料液比为考察因素，白藜芦醇提取率为指标，优选工艺参数，结果见表3。
表3 双相酸水解工艺参数的筛选（mean±SD，n=3）
。
白藜芦醇苷是O-苷，较易于酸水解，为了保证白藜芦醇结构在水解过程中不发生变化，采用较低的酸浓度进行水解。表3结果表明，当硫酸浓度为1%时，即可获得较高的白藜芦醇提取率，酸浓度继续增加，并不能获得更高的提取率，因此，工艺中采用1%硫酸作为水解催化剂。乙酸乙酯在水中具有一定的溶解度，合适的酸水和乙酸乙酯能形成双相水解体系，可以更好地将生成的白藜芦醇转溶于乙酸乙酯中，表3的结果表明，酸水和乙酸乙酯的比例为1:3时，白藜芦醇的提取率最高，在实验过程中，也能观察到乙酸乙酯与酸水之间有明显的分层。水解时间短，不足以达到理想的水解效果，时间过长，有可能使白藜芦醇的结构发生改变，实验结果表明，水解6h，白藜芦醇的提取率最高，超过7h，则有一定降低。料液比对白藜芦醇的提取率影响较小。根据优选的条件水解葡萄皮中白藜芦醇苷，发现在水解液的高效液相色谱中，未发现白藜芦醇苷的色谱峰，说明水解完全。
4.3 碱萃取过程中碱的选择
白藜芦醇结构中含有酚羟基，可以与碱形成盐，溶解于水中，从而与不含有酚羟基的化学成分分离。可以与酚羟基形成盐的有NaOH、NaHCO3、Na2CO3等，实验过程比较了不同浓度的碱萃取后，白藜芦醇的得率，结果见表4。
表4 不同碱和碱的浓度对白藜芦醇得率的影响（mean±SD，n=3）
表4的结果表明，碱萃取过程中，碱的种类和浓度对白藜芦醇的得率有较大的影响，NaHCO3萃取可以得到最高的白藜芦醇得率，NaOH和Na2CO3的得率较低。后两者的碱性较强，容易与白藜芦醇的乙酸乙酯溶液乳化，从而导致一部分白藜芦醇分散在乳化层，而在实验过程中，NaHCO3很容易与乙酸乙酯分层。从操作角度考虑，选择NaHCO3较为合适。在萃取时，随着碱的浓度的升高，白藜芦醇的得率都随之升高，碱的浓度达到0.3%和0.5%时，得率相近，因此，选择0.3%的NaHCO3作为碱萃取的浓度。
4.4 双水相萃取中醇的选择
虽然白藜芦醇在酯中溶解度较高，但是在最后产品中可能有溶解残留，也不方便利用重结晶法对白藜芦醇纯化，我们选择双水相萃取，使用不同的醇与NaHCO3溶液形成双水相体系，利用白藜芦醇在两相之间的分配系数不同，使之转溶于醇中。不同的醇对白藜芦醇得率的影响见表5。
表5 不同的醇与NaHCO3溶液形成的双水相体系对白藜芦醇得率的影响（mean±SD，n=3）
。
50%和80%的甲醇、乙醇和异丙醇可以与NaHCO3溶液形成双水相体系，其中，乙醇的萃取效果最好，而且乙醇的毒性最小，价格最低，双水相萃取过程中，选择80%的乙醇与NaHCO3溶液来纯化白藜芦醇。
对由实施例4得到的白藜芦醇进行核磁共振检测，所得白藜芦醇的核磁共振图谱，见图3和图4。图3为 1H-NMR图谱（Me2CO-d 6，400 MHz），图4为 13C-NMR图谱（Me2CO-d 6，100MHz）。具体信号归属如下：
1H-NMR（Me2CO-d 6，400 MHz）：8.47（s，1H，OH-3´），8.21（2H，OH-3，5），7.44（d，2H，J=8Hz，H-2´，6´），7.04（d，1H，J=16Hz，H-β），6.90（d，1H，J=16Hz，H-α），6.85（d，2H，J=8Hz，H-3´，5´），6.56（d，2H，J=4Hz，H-2，6），6.29（t，1H，J=4Hz，H-4）。其中，H-α和H-β的偶合常数J=16Hz，即可推断该双键为反式构型，即所得白藜芦醇为反式白藜芦醇。
13C-NMR（Me2CO-d 6，100 MHz）：140.9（C-1），105.7（C-2，6），159.6（C-3，5），102.7（C-4），126.8（C-α，β），128.7（C-1´），130.0（C-2´），116.4（C-3´，5´），158.2（C-4´），129.1（C-6´）。
上述实施例仅为本发明较佳的实施方式，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，可以设计出很多其他的修改或优化实施方式，这些修改或优化实施方式将落在本申请公开的范围之内。

Claims (4)

1.一种酶解/双相酸水解耦合双水相萃取技术从葡萄皮渣中分离白藜芦醇的方法，其特征在于，先将葡萄皮渣利用自身含有的酶进行酶解，再利用酸水溶液和低级脂肪酸的一元醇酯混合所得双相酸水溶液加速水解过程，然后用碱性盐溶液和醇溶液形成双水相体系，通过两次双水相萃取分离，最后通过活性炭脱色、过滤、蒸发、结晶、离心分离、减压干燥处理，得到白色晶体白藜芦醇；
具体包括以下步骤：
a. 将葡萄皮渣在30℃ - 50℃下保温酶解12小时－72小时；
b. 向步骤a所得酶解后的葡萄皮渣中加入浓度为1 mol/L－5 mol/L的酸水溶液和低级脂肪酸的一元醇酯的混合溶液，用量比为葡萄皮渣：混合溶液为1 kg：(6－8) L，加热回流6小时－18小时，得反应混合物；
c. 分取步骤b所得反应混合物中的有机层，水洗至中性，回收有机溶剂，得浓缩液；
d. 将步骤c所得浓缩液用20%－50%的碱水溶液萃取；
e. 向步骤d所得萃取液中加入等体积的50%－80%醇水溶液，静置分层，分取上层溶液，回收有机溶剂，得浓缩液；
f. 将步骤e所得浓缩液再用20%－50%的碱水溶液萃取；
g. 向步骤f所得萃取液中加入等体积的50%－80%乙醇水溶液，静置分层，分取上层溶液，回收乙醇，得浓缩液；
h. 向步骤g所得浓缩液中加入活性炭，回流脱色4－8小时，过滤；
i. 将步骤h所得滤液依次经蒸发、结晶、离心分离、减压干燥处理，得到白色晶体反式白藜芦醇；
步骤a中所述葡萄皮渣为新鲜葡萄皮渣或干燥葡萄皮渣，含水量不低于30%，对于含水量低于30%的葡萄皮渣，加水润湿使含水量不低于30%；
步骤b中所述酸为硫酸、盐酸、乙酸、甲酸中的任意一种或多种；
步骤b中所述低级脂肪酸的一元醇酯为乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯中的任意一种或多种，与酸水溶液的混合比例为体积比3:1－1:2；
所述白藜芦醇为反式白藜芦醇；
步骤d、f中所述碱水溶液中的碱为Na2CO3、NaHCO3、K2CO3、KHCO3、Na2HPO4、Na3PO4、K2HPO4、K3PO4中的任意一种或多种，碱水溶液用量为浓缩液体积的1－3倍；
步骤e中所述的醇为甲醇、乙醇、异丙醇中的任意一种。
2.如权利要求1所述的一种酶解/双相酸水解耦合双水相萃取技术从葡萄皮渣中分离白藜芦醇的方法，其特征在于，步骤a中所述酶解时间为24小时－72小时。
3.如权利要求1所述的一种酶解/双相酸水解耦合双水相萃取技术从葡萄皮渣中分离白藜芦醇的方法，其特征在于，步骤h中所述的脱色用活性炭的用量为浓缩液体积的1%－3%。
4.如权利要求1所述的一种酶解/双相酸水解耦合双水相萃取技术从葡萄皮渣中分离白藜芦醇的方法，其特征在于所得产物反式白藜芦醇，含量高达98.83%。
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