CN111265481B - 丹参素棕榈醇酯脂质体及其制备和应用 - Google Patents

丹参素棕榈醇酯脂质体及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种丹参素棕榈醇酯脂质体及其制备方法和应用。所述的丹参素棕榈醇酯脂质体，其特征在于，其原料包含丹参素棕榈醇酯、卵磷脂和胆固醇，其中，丹参素棕榈醇酯、卵磷脂和胆固醇的质量比为10～15：60～70：20～25。本发明以丹参素棕榈醇酯为活性成份，以卵磷脂、胆固醇为辅料，选择合适配比，制成脂质体，将结构修饰与脂质体的优势相结合，能更大程度提高脂质体对药物的包封率，达到改善其生物利用度的目的。

Description

丹参素棕榈醇酯脂质体及其制备和应用
技术领域
本发明涉及丹参素棕榈醇酯脂质体及其制备和应用。
背景技术
根据《中国心血管病报告2017》显示，因心血管病死亡人数占因疾病死亡总人数的40％以上，高于肿瘤及其他疾病。心血管病成为导致人类死亡的首位疾病。尽管近年来心血管疾病的防治工作已经取得了初步成效，但是心血管病的患病率和病死率仍呈上升趋势，医疗工作者面临严峻的挑战[1]。丹参是唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。性微苦，微寒，归心、肝经，具有活血通经，祛瘀止痛，清心除烦，养血安神的功效，在我国已被广泛用于治疗心血管疾病和脑血管疾病[2]。丹参素是丹参主要的水溶性活性成分之一，具有抗心肌缺血及缺氧[3]、抗心肌缺血再灌注损伤[4]、扩张冠脉[5]、抗心肌肥大[6]、抗心律失常[7]、抗血栓[8]等多种药理作用，对心血管系统具有明显的保护作用[9]。丹参素有邻二酚羟基及α-羟基羧酸的结构，这种结构为水溶性成分，亲脂性差、口服吸收差，导致生物利用度低。前期研究表明，丹参素钠在SD大鼠体内的绝对生物利用度仅为9.84％，丹参素作为口服制剂存在生物利用度低、吸收较差的问题。
丹参素水溶性强，脂溶性差，难以透过生物膜，可能是导致其生物利用度低的原因。有文献报道[10]，将丹参素制备脂质体，虽然在一定程度上可以改善其生物利用度，但是＜40％的包封率仍然限制其口服制剂的进一步开发和利用。
参考文献：
[1]陈伟伟、高润霖、刘力生等，《中国心血管病报告2016》概要[J]，中国循环杂志2017,32(6):521-530；
[2]ZHOU L M,ZUO Z,CHOW M S S.Danshen:an overview of its chemistry,pharmacology,pharmacokinetics,and clinical use[J].J Clin Pharmacol,2005,45(12):1345-1359；
[3]WU L,QIAO H,LI Y,et al.Protective roles of puerarin and Danshensuon acute ischemic myocardial injury in rats[J].Phytomedicine,2007,14(10):652-658；
[4]YIN Y,GUAN Y,DUAN J L,et al.Cardioprotective effect of Danshensuagainst myocardial ischemia/reperfusion injury and inhibits apoptosis ofH9c2cardiomyocytes via Akt and ERK1/2phosphorylation[J].Eur J Pharmacol,2013,699(1-3):219-226；
[5]LAM F F,YEUNG J H,CHAN K M,et al.Relaxant effects of danshenaqueous extract and its constituent danshensu on rat coronary artery aremediated by inhibition of calcium channels[J].Vascul Pharmacol,2007,46(4):271-277；
[6]TANG Y Q,WANG M H,LE X Y,et al.Antioxidant and cardioprotectiveeffects of Danshensu(3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxy-propanoic acid fromSalvia miltiorrhiza)on isoproterenol-induced myocardial hypertrophy in rats[J].Phytomedicine,2011,18(12):1024-1030；
[7]LE X Y.Effects of danshensu on the incidence of ischemia-reperfusion induced arrhythmia in hypertrophy rat heart[J].Chin J Nat Med,2009,6(6):461-465；
[8]WANG F,LIU Y Y,LIU L Y,et al.The attenuation effect of 3,4-dihydroxy-phenyl lactic acid and salvianolic acid B on venular thrombosisinduced in rat mesentery by photochemical reaction[J].Clin HemorheolMicrocirc,2009,42(1):7-18；
[9]TANG Y Q,WANG M H,CHEN C L,et al.Cardiovascular protection withdanshensu in spontaneously hypertensive rats[J].Biol Pharm Bull,2011,34(10):1596-160；
[10]纪周新、刘琳琳、李艺养等，《丹参素脂质体的制备及体外释放度研究》[J]，中国药师,2015,18(10):1649-1651.
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种包封率较高的丹参素棕榈醇酯脂质体及其制备和应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种丹参素棕榈醇酯脂质体，其特征在于，其原料包含丹参素棕榈醇酯、卵磷脂和胆固醇，其中，丹参素棕榈醇酯、卵磷脂和胆固醇的质量比为10～15：60～70：20～25。
优选地，所述的卵磷脂为大豆卵磷脂。
优选地，以丹参素棕榈醇酯、卵磷脂和胆固醇的总质量为基准，所述的原料包含丹参素棕榈醇酯10～15％、卵磷脂60～70％和胆固醇20～25％。
本发明还提供了上述的丹参素棕榈醇酯脂质体的制备方法，其特征在于，包括：按质量比称取丹参素棕榈醇酯、卵磷脂和胆固醇，加入有机溶剂溶解，将所得溶液在40～50℃进行真空旋转蒸发得到透明膜，加入去离子水，非真空旋转蒸发进行水化；在冰浴条件下进行超声处理，过滤，得到丹参素棕榈醇酯脂质体溶液。
优选地，所述的真空旋转蒸发的时间为0.5-1.5h。
优选地，所述的非真空旋转蒸发的温度为45～50℃，时间为0.5-1.5h。
优选地，所述的超声处理时间为8～10分钟。
优选地，所述的有机溶剂为氯仿。
优选地，所述的过滤采用用0.22μm或0.45μm滤膜。
优选地，所述的丹参素棕榈醇酯的制备方法包括：
步骤1：称取丹参素钠加入反应容器中，加入甲醇，在搅拌条件下滴入浓硫酸，加热至85～95℃回流反应至溶液成不透明黄色，除去溶剂；
步骤2：将步骤1所得产物加入丙酮溶解，在搅拌条件下加入碳酸钾和溴化苄，加热至75-85℃反应5-8小时，冷却至室温，加水和乙酸乙酯萃取2～3次，有机相用饱和食盐水洗2～3次，干燥，分离纯化；
步骤3：将步骤2所得产物加入溶剂溶解，所述溶剂为体积比为1：0.8-1.2的四氢呋喃和2.3-3.5mol/L的氢氧化钠溶液的混合物，加热至75-85℃反应1.5-4小时，冷却至室温，调节pH为酸性，过滤，收集所得固体产物；
步骤4：将步骤3所得产物加入四氢呋喃溶解，在搅拌条件下加入十六醇，冰浴冷却，加入碳化二亚胺，恢复室温反应3-16h，过滤除去固体，除去溶剂，分离纯化；
步骤5：将步骤4所得产物加入无水甲醇溶解，在搅拌条件下加入钯碳催化剂，在氢气保护中反应3-5小时，过滤除去钯碳催化剂，除去溶剂，分离纯化，得到丹参素棕榈醇酯。
本发明还提供了上述的丹参素棕榈醇酯脂质体在制备治疗抗心肌缺血及缺氧、抗心肌缺血再灌注损伤、扩张冠脉、抗心肌肥大、抗心律失常以及抗血栓药物中的至少一种中的应用。
本发明还提供了一种丹参素棕榈醇酯的制备方法，其特征在于，包括：对丹参素的羧酸基团进行保护，再对丹参素的酚羟基进行保护，脱去羧酸基团的保护基后，与十六醇进行酯化反应，脱去酚羟基的保护基，得到丹参素棕榈醇酯。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明以丹参素棕榈醇酯为活性成份，以卵磷脂、胆固醇为辅料，选择合适配比，制成脂质体，将结构修饰与脂质体的优势相结合，能更大程度提高脂质体对药物的包封率，达到改善其生物利用度的目的。
2、为克服丹参素化学稳定性差，脂溶性差，生物利用度低，治疗效果差等缺点，本发明对丹参素进行结构修饰，制成脂溶性和稳定性更高的丹参素棕榈醇酯，更易透过脂膜，到达治疗部位，在体内广泛存在的酯酶作用下转化为丹参素，发挥药理活性。
3、本发明提高了丹参素的生物利用度，为进一步开发口服制剂提供参考和依据。
附图说明
图1为丹参素棕榈醇酯的核磁图。
具体实施方式
为了更好的理解上述技术方案，下面将结合具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明。
实施例1
(1)对丹参素的羧酸基团进行保护：取100ml单口烧瓶，称取2g丹参素钠加入所述单口烧瓶中，加入30mL甲醇，在磁力搅拌条件下滴入0.5mL浓硫酸(质量分数为98％)，加热至90℃回流反应5h至溶液成不透明黄色，TLC监控反应(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝20：1)，待反应结束，用真空泵旋转蒸发除去溶剂至无溶剂残留，即得目标化合物A(称为(R)-3-(3,4-二羟苯基)-2-羟基丙酸甲酯)。
(2)对丹参素的酚羟基进行保护：将2g未纯化的目标化合物A加入40mL丙酮溶解，在磁力搅拌条件下，加入1.95g碳酸钾和3.71g溴化苄，加热至80℃反应8小时。TLC监控反应(展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝1：1)，待反应结束，冷却至室温，加100mL水和100mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，有机相用饱和食盐水洗2次，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发至干，硅胶柱分离纯化(洗脱剂体积比：石油醚：乙酸乙酯＝1:1)，得白色固体目标化合物B(称为(R)-3-(3,4-双(苯氧基)苯基)-2-羟基丙酸甲酯)。
(3)脱去羧酸基团的保护基：取1g上步得到的目标化合物B加入10ml溶剂(四氢呋喃：3mol/L NaOH＝1:1(体积比))溶解，在磁力搅拌条件下，加热至80℃反应4小时，TLC监控反应(展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝1:1)，待反应结束，冷却至室温，加入质量分数为10％的盐酸调节pH为2。有米黄色固体析出，过滤，收集所得固体产物为目标化合物C(称为(R)-3-(3,4-双(苯氧基)苯基)-2-羟基丙酸)。
(4)与十六醇进行酯化反应：取100ml单口烧瓶，称取200mg目标化合物C，加入2mL四氢呋喃溶解，在磁力搅拌条件下，加入100mg十六醇，冰浴冷却至0℃，加入109mg碳化二亚胺，恢复室温反应16h，TLC监控反应(展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝20：1)，待反应结束，过滤除去固体，滤液旋转蒸发除去溶剂，硅胶柱分离纯化(洗脱剂体积比：石油醚：乙酸乙酯＝20:1)，得目标化合物(R)-3-(3,4-双(苄氧基)苯基)-2-羟基丙酸十六烷醇酯。
(5)脱去酚羟基的保护基：取100ml单口烧瓶，称取200mg(R)-3-(3,4-双(苄氧基)苯基)-2-羟基丙酸十六烷醇酯，加2mL无水甲醇溶解，在磁力搅拌条件下，加入100mg钯碳催化剂，用氢气置换反应瓶内的空气，在氢气保护条件下室温下反应4小时。TLC监控反应(展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝4:1)，待反应结束，抽滤除去钯碳催化剂，旋转蒸发除去溶剂，硅胶柱分离纯化(洗脱剂体积比：石油醚：乙酸乙酯＝4:1)，得白色固体目标化合物丹参素棕榈醇酯，核磁图如图1所示，产率为61.26％。
实施例2-4
表1：丹参素棕榈醇酯脂质体的制备原料
Figure BDA0002409559510000051
Figure BDA0002409559510000061
实施例2和3中丹参素棕榈醇酯、卵磷脂和胆固醇的质量比为10：70：20，和15：60：25。
所述的丹参素棕榈醇酯脂质体的具体制备方法为：
(1)成膜：按上表中的质量称取丹参素棕榈醇酯、大豆卵磷脂、胆固醇，加入20mL氯仿溶解，将所得溶液采用旋转蒸发仪(型号：R-200厂家：瑞士Buchi公司)在40～50℃进行真空旋转蒸发，1小时后得到透明无破损的膜；
(2)水化：加入4mL去离子水，非真空旋转蒸发(温度45～50℃，时间1h)进行水化；
(3)在冰浴条件下采用BRANSON SONIFIER 450水浴超声仪的超声探头进行超声处理10分钟(一档)，得脂质体粗品，用0.22μm滤膜过滤，得到丹参素棕榈醇酯脂质体溶液，伴有淡蓝色乳光。
效果实验
1.丹参素棕榈醇酯脂质体包封率
精密量取1mL的脂质体溶液，采用低温超速离心法，在4℃条件下，以3500r/min离心10min，精密称取超滤管下层溶液100μL，测得游离药物含量为W1，另外精密移取100μL丹参素棕榈醇酯溶液，加入900μL乙腈并且超声破乳，测定药物含量为W2，包封率(EE)计算公式为：EE(％)＝(W2-W1)/W2×100％。
结果如表2所示：
表2：包封率测试结果
实施例1 实施例2 实施例3
平均包封率 88.9％ 87.5％ 89.3％
检测方法和条件：仪器：Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；色谱条件：色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱(4.6mm×250m5μm)；流动相：含0.02％(体积比)甲酸和0.02％(体积比)三乙胺的乙腈-水混合液(体积比50:50，pH为6～7)；流速：1mL/min；检测波长：280nm；柱温：25℃；进样量为20μl。
结果表明，在丹参素基础上，进行结构改造，并且制备脂质体，相比丹参素脂质体不到40％的包封率有显著提高，为进一步丹参素类口服制剂的开发和利用提供参考依据。
2.体外血浆孵育丹参素棕榈醇酯转化研究
实验方案：
丹参素棕榈醇酯脂质体：按照上述处方和制备工艺制备丹参素棕榈醇酯脂质体，用0.22μm的微孔滤膜过滤，即得丹参素棕榈醇酯脂质体。
溶液配制：
丹参素棕榈醇酯对照品溶液：精密称取1mg的丹参素棕榈醇酯，用1mL甲醇溶解后制成丹参素棕榈醇酯对照品溶液。
分别精密量取50μL的实施例1中的丹参素棕榈醇酯脂质体加入2mL人血浆中，涡旋混匀30s，分别将含药血浆分为200μL每份，各取出7份，置于37℃条件下孵育，在0min，30min，1h，1.5h，3h，5h，12h、24h取血浆样品。
将所述血浆样品100μL，加入100μL 1％(体积浓度)乙酸，然后加入100μl3mol/L盐酸，涡旋混合3min。常温下用1000μL乙酸乙酯萃取5分钟，并在13000r/min离心15min。收集800μL上清液并在37℃下蒸发干燥，用100μL含0.05vol％三乙胺和0.05vol％甲酸的乙腈-水混合液(体积比50∶50)复溶后进样HPLC-MS分析。
色谱条件：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流速：1.0mL/min；
紫外线检测波长：280nm；
柱温：30℃；
进样量：20μL；
流动相：含0.05vol％三乙胺和0.05vol％甲酸的乙腈-水混合液(体积比50∶50)
体外血浆孵育实验结果如下表3所示。
表3丹参素棕榈醇酯脂质体在血浆中孵育的药物转化比例
Figure BDA0002409559510000081
上表中的药物转化比例按照下式计算得到：
Ch(丹参素血药浓度)/C0(丹参素棕榈醇酯中丹参素原始浓度)×100％＝药物转化比例(％)(某一时间点血药浓度与加入的丹参素棕榈醇酯脂质体中丹参素浓度的比值)
如上表所示，丹参素棕榈醇酯(HDSS)脂质体在血浆中孵育后能快速的降解，释放活性产物丹参素。在5h时HDSS的降解比例为59％，到24小时降解比例达到了92％，表明HDSS脂质体能在体内有效降解，从而释放出丹参素发挥药理活性。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (7)

1.一种丹参素棕榈醇酯脂质体的制备方法，其特征在于，所述的丹参素棕榈醇酯脂质体的原料包含丹参素棕榈醇酯、卵磷脂和胆固醇，其中，丹参素棕榈醇酯、卵磷脂和胆固醇的质量比为10～15：60～70：20～25；所述的制备方法包括：按质量比称取丹参素棕榈醇酯、卵磷脂和胆固醇，加入有机溶剂溶解，将所得溶液在40～50℃进行真空旋转蒸发得到透明膜，加入去离子水，非真空旋转蒸发进行水化；在冰浴条件下进行超声处理，过滤，得到丹参素棕榈醇酯脂质体溶液；所述的丹参素棕榈醇酯的制备方法包括：
步骤1：称取丹参素钠加入反应容器中，加入甲醇，在搅拌条件下滴入浓硫酸，加热至85～95℃回流反应至溶液成不透明黄色，除去溶剂；
步骤2：将步骤1所得产物加入丙酮溶解，在搅拌条件下加入碳酸钾和溴化苄，加热至75-85℃反应5-8小时，冷却至室温，加水和乙酸乙酯萃取2～3次，有机相用饱和食盐水洗2～3次，干燥，分离纯化；
步骤3：将步骤2所得产物加入溶剂溶解，所述溶剂为体积比为1：0.8-1.2的四氢呋喃和2.3-3.5mol/L的氢氧化钠溶液的混合物，加热至75-85℃反应1.5-4小时，冷却至室温，调节pH为酸性，过滤，收集所得固体产物；
步骤4：将步骤3所得产物加入四氢呋喃溶解，在搅拌条件下加入十六醇，冰浴冷却，加入碳化二亚胺，恢复室温反应3-16h，过滤除去固体，除去溶剂，分离纯化；
步骤5：将步骤4所得产物加入无水甲醇溶解，在搅拌条件下加入钯碳催化剂，在氢气保护中反应3-5小时，过滤除去钯碳催化剂，除去溶剂，分离纯化，得到丹参素棕榈醇酯。
2.如权利要求1所述的丹参素棕榈醇酯脂质体的制备方法，其特征在于，所述的卵磷脂为大豆卵磷脂。
3.如权利要求1或2所述的丹参素棕榈醇酯脂质体的制备方法，其特征在于，以丹参素棕榈醇酯、卵磷脂和胆固醇的总质量为基准，所述的原料包含丹参素棕榈醇酯10～15％、卵磷脂60～70％和胆固醇20～25％。
4.如权利要求1所述的丹参素棕榈醇酯脂质体的制备方法，其特征在于，所述的真空旋转蒸发的时间为0.5-1.5h。
5.如权利要求1所述的丹参素棕榈醇酯脂质体的制备方法，其特征在于，所述的非真空旋转蒸发的温度为45～50℃，时间为0.5-1.5h。
6.如权利要求1所述的丹参素棕榈醇酯脂质体的制备方法，其特征在于，所述的超声处理时间为8～10分钟。
7.如权利要求1所述的丹参素棕榈醇酯脂质体的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂为氯仿。
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