CN100415732C

CN100415732C - 葛花异黄酮及单体鸢尾苷和鸢尾苷元的提取方法及其应用

Info

Publication number: CN100415732C
Application number: CNB2005100170516A
Authority: CN
Inventors: 李玉新; 王金凤; 孟祥颖; 鲍永利; 乌垠; 薄华本
Original assignee: Northeast Normal University
Current assignee: Northeast Normal University
Priority date: 2005-08-12
Filing date: 2005-08-12
Publication date: 2008-09-03
Anticipated expiration: 2025-08-12
Also published as: CN1800172A

Abstract

本发明为一种中药葛花中异黄酮及其单体鸢尾苷和鸢尾苷元的分离提取方法。葛花乙醇粗提物加去离子水悬浮，上大孔树脂柱，乙醇梯度洗脱，收集50%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，得到葛花异黄酮。将葛花异黄酮加去离子水悬浮，上聚酰胺柱，乙醇梯度洗脱，分别收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，得到鸢尾苷和鸢尾苷元单体。该方法中未使用易燃及有毒性的有机溶剂，无三废污染，异黄酮的含量为90%以上。提取的葛花异黄酮可以缩小急性心肌梗死的心肌梗死面积，降低血清心肌酶水平。

Description

葛花异黄酮及单体鸢尾苷和鸢尾苷元的提取方法及其应用

技术领域

本发明属于植物药用成分提取方法。特别涉及的是从中药葛花中提取对心脑血管疾病有明显预防和治疗作用的有效成分的方法。

背景技术

异黄酮(isoflavoen)是一类植物雌激素(phytoestrongen)，具有雌激素样或抗雌激素作用，被称为天然的选择性雌激素受体调节剂，对人体健康起重要的保护作用。补充异黄酮不仅能够减少冠心病的发生，而且没有激素替代治疗的负作用，还可以调节人体内分泌、降低血脂、防治妇女更年期综合症、骨质疏松症和抗癌等功效。越来越多的研究发现，异黄酮对心脑血管具有多方面调节作用，有望成为一种良好的抗心脑血管疾病的药物。

异黄酮类化合物广泛分布于植物界，但异黄酮的含量却很低。而且，异黄酮的分离纯化工序烦琐，耗时费力，且常常需要多种有毒的有机溶剂，不仅提高了药品的造价，而且给环境带来或多或少的污染，在一定程度上限制了异黄酮类药物的开发和应用。异黄酮是含有多个酚羟基的一类多酚化合物，其生物学活性与其结构密切相关。不同种类的异黄酮因其结构不同，其药理作用也有显著的差别。从葛花中提取的鸢尾苷和鸢尾苷元含有一个甲氧基和二个或三个羟基，是其具有强抗氧化活性的结构基础。已有实验研究表明，鸢尾苷和鸢尾苷元有清除自由基、提高机体抗氧化酶、抗脂质过氧化等作用，还有降低血脂、血糖及抗炎等作用。但其对缺血心肌有无保护作用，至今在国内外还是一片空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种葛花异黄酮及单体鸢尾苷和鸢尾苷元的提取方法以及葛花异黄酮在治疗心肌缺血中的用途。该提取方法是应用无毒且可以反复使用的乙醇、大孔树脂和聚酰胺从葛花中分离出葛化异黄酮及鸢尾苷和鸢尾苷元单体，所提取的异黄酮纯度为90％以上，鸢尾苷单体和鸢尾苷元单体纯度达99％，效果好，毒副作用小，成本低、无污染，实现了高效、经济和环保的目的。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明葛花有效成分的提取方法首先是将葛花粉碎，经乙醇回流提取得到粗提物；将粗提物加入大孔树脂柱，并用乙醇洗脱，得到葛花异黄酮；将得到的葛花异黄酮上聚酰胺柱，并用乙醇洗脱得到鸢尾苷单体和鸢尾苷元。

结扎小鼠冠状动脉左前降支制备急性心肌梗死动物模型，术后即刻腹腔内给药，与盐水对照组比，葛花异黄酮50mg/kg可以缩小梗死面积(44.3％vs 34.8％)，降低血清心肌酶(AST：125.45±39.12vs 58.43±12.68；LDH：11964.22±1671.80vs 8726.44±1235.68)。

本发明与现有技术相比较具有如下优点：

应用乙醇、大孔树脂和聚酰胺从葛花中分离出葛化异黄酮及鸢尾苷和鸢尾苷元单体，不用有毒的有机溶剂，不污染环境，达到了环保的要求。而且，乙醇可以回收重复使用，大孔树脂和聚酰胺也可以处理后再应用，降低了药物成本。与硅胶柱相比，上样量多，耗时少，效率高。提取工艺简单，成本低廉，可进行产业化生产，利于推广应用。

异黄酮类药物毒副作用小，安全可靠，具有多种生物活性，应用前景广泛。葛花在我国自然资源十分丰富，从葛花中提取异黄酮有效成分用于新药研制，是有效利用自然资源的一项有力措施。本发明通过小鼠心肌缺血模型，证明葛花异黄酮对缺血心肌有保护作用，为临床推广应用提供了理论依据。

附图说明

图1为葛花异黄酮薄层层析结果，展开剂为：CHCl₃-MeOH-H₂O(14∶7∶2)。葛花异黄酮主要含三种成份，呈暗紫色荧光，Rf分别为0.44、0.58和0.72。

图2A为鸢尾苷薄层层析结果，展开剂为：CHCl₃-MeOH-H₂O(14∶7∶2)。

图2B为鸢尾苷元薄层层析结果，展开剂为：CHCl₃-MeOH-H₂O(14∶7∶2)。

图3为鸢尾苷质谱结果

图4为鸢尾苷氢谱结果

图5为鸢尾苷碳谱结果

图6为鸢尾苷紫外光谱结果

图7为鸢尾苷元质谱结果

图8为鸢尾苷元氢谱结果

图9为鸢尾苷元碳谱结果

图10为鸢尾苷元紫外光谱结果

具体实施方式

以下通过具体实施方式的实施例对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此实施例理解为对本发明的限制。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段作出的各种替换或变更，均包括在本发明的范围内。

实施例1

葛花异黄酮的分离提取

①将葛花粉碎后，装入索氏提取器；

②90％乙醇回流提取20小时，水浴加热挥发至无醇味而得总浸膏，水浴干燥后备用；

③将葛花乙醇粗提物加去离子水悬浮，湿法上样于50倍量(W∶V)的大孔树脂AB8柱，分别用水、20％、50％、无水乙醇依次洗脱。收集50％乙醇洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得到混合物即为葛花异黄酮。

④以40％丙二醇溶解葛花异黄酮，用5％碳酸氢钠调pH值为7.0，溶解度为10mg/ml，保存待用。

实施例2

鸢尾苷单体和鸢尾苷元的分离提取

①将经实施例1得到的葛花异黄酮加去离子水悬浮，湿法上样于聚酰胺柱，重量体积比为1∶50；

②分别用水、20％、30％、40％、50％、无水乙醇梯度洗柱；

③收集洗液，减压回收溶剂；30％乙醇洗脱液中为鸢尾苷单体，50％乙醇洗脱液中为鸢尾苷元。通过质谱、氢谱、碳谱及紫外光谱对其结构进行鉴定。

④以40％丙二醇溶解葛花异黄酮，用5％碳酸氢钠调pH值为7.0，溶解度为10mg/ml。

实施例3

葛花异黄酮对缺血心肌的保护作用

(1)小鼠心肌梗死动物模型的制备

结扎小鼠冠状动脉左前降支制备急性心肌梗死动物模型。具体方法为：取昆明小鼠，雌雄兼用，体重24～30g，由长春生物制品所实验动物中心提供。室内温度控制在20～25℃之间。小鼠称重后用乙醚吸入麻醉，麻醉后仰卧固定于手术台板上。左胸前皮肤去毛，75％酒精消毒。在胸骨左缘纵行切开皮肤约1.5cm，在切开皮肤之前用角针4号线在切口边缘穿线备用。沿胸大肌下缘逐层分离皮下组织、掀起胸大肌，用眼科镊子于胸骨左缘第4、5肋间分离肋间肌长约1cm，放入自制拉钩，撑开4、5肋骨打开胸腔。轻压胸廓即可将心脏挤出胸腔外。用左手拇指和食指夹住心脏，心尖指向头侧稍偏左。用3×6mm针穿5-0丝线，从肺动脉圆锥左缘进针，在左心耳右下缘处穿出，宽2～3mm，连同心大静脉一齐结扎冠状动脉左前降支(假手术组只穿线不结扎)。迅速将心脏送回胸腔，用双手食指挤压出胸腔内的血液和气体。用预留的缝合线紧闭胸壁。开胸时间不超过30s。

(2)心肌梗死面积测定

术后即刻腹腔内给药，50mg/kg，并设立只用异黄酮溶解介质对照组。术后24小时摘取小鼠心脏，生理盐水冲洗，去除心房、大血管及心脏外结缔组织等，用硝基四氮唑蓝对小鼠心肌进行染色，梗死心肌显示为白色。结果显示对照组梗死面积占心室面积的44.3％，葛花异黄酮治疗组梗死面积占心室面积的34.8％，说明葛花异黄酮可以明显缩小小鼠心肌梗死面积(44.3％ vs 34.8％)，对心肌具有一定的保护作用。

(3)血清谷草转氨酶的测定

谷草转氨酶(AST)测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所

测定步骤如下：

①结扎小鼠冠状动脉左前降支制备急性心肌梗死动物模型，术后即刻腹腔内给药。分别于手术后24h，将各组动物眼球取血，室温放置1-2h，2000r/min离心10min，取血清。用生理盐水稀释血清1倍备用。

②取两个试管，分别作为实验管和对照管，加样方法如下。

	测定管	对照管
	测定管	对照管	血清(ml)	0.05
基质液(37℃预温5分钟)(ml)	0.25	0.25	血清(ml)	0.05

③混匀后，37℃水浴30分钟。然后按下表加样。

2，4-二硝基苯肼液(ml)	0.25	0.25
2，4-二硝基苯肼液(ml)	0.25	0.25	血清(ml)		0.05

④混匀后，37℃水浴20分钟。每管加入2.5ml 0.4mol/L氢氧化钠液，室温放置10分钟，以蒸馏水调零，在505nm波长下测定各管吸光度值，以实验管吸光度值减去对照管吸光度值之差值，查标准曲线，求得相应的AST活力单位。

(4)血清乳酸脱氢酶(LDH)的测定

血清乳酸脱氢酶测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

测定步骤如下：

②取四个试管，分别作为标准管、标准空白管、测定管和测定空白管，加样方法如下。

	标准管	标准空白管	测定管	测定空白管
	标准管	标准空白管	测定管	测定空白管	2umol/ml丙酮酸标准(ml)	0.02
蒸馏水(ml)	0.05	0.07		0.05	2umol/ml丙酮酸标准(ml)	0.02
蒸馏水(ml)	0.05	0.07		0.05	样品(ml)		0.02	0.02
基质缓冲液(ml)	0.25	0.25	0.25	0.25	样品(ml)		0.02	0.02
基质缓冲液(ml)	0.25	0.25	0.25	0.25	辅酶I溶液(ml)		0.05

③混匀后，37℃水浴15分钟。每管加入0.25ml 2，4-二硝基苯肼液混匀后，37℃水浴15分钟。

④每管加入2.5ml 0.4mol/L氢氧化钠液，混匀，室温放置3分钟，440nm，蒸馏水调零，1cm光径，测各管吸光度。

⑤按下述计算公式计算血清LDH活力。

血清中LDH活力(U/L)＝(测定管OD值-测定空白管OD值)*标准管浓度*1000ml*测试前样品稀释倍数/(标准管OD值-标准空白管OD值)。

Claims

1. 葛花异黄酮的提取方法，其特征是：

①将葛花粉碎后，装入索氏提取器；

③将葛花乙醇粗提物加去离子水悬浮，湿法上样于50倍量的大孔树脂AB8柱，分别用水、20％、50％、无水乙醇依次洗脱，收集50％乙醇洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得到混合物即为葛花异黄酮；

2. 鸢尾苷单体和鸢尾苷元的分离提取方法，其特征是：

①将权利要求1得到的葛花异黄酮加去离子水悬浮，湿法上样于聚酰胺柱，重量体积比为1∶50；

②分别用水、20％、30％、40％、50％、无水乙醇梯度洗柱；

③收集洗液，减压回收溶剂；30％乙醇洗脱液中为鸢尾苷单体，50％乙醇洗脱液中为鸢尾苷元；

④以40％丙二醇溶解鸢尾苷单体或鸢尾苷元，用5％碳酸氢钠调pH值为7.0，溶解度为10mg/ml。