CN103896897B - 一种红花药材中活性成分的提取、分离及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种红花药材中活性成分的提取、分离和检测方法，所述的方法包括⑴提取过程：取红花药材，用乙醇提取，醇提液进行浓缩干燥，加入酸水水解，水解液回收溶剂并浓缩，再用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩、干燥成浸膏，留用；⑵分离、纯化过程：取步骤⑴中留用的浸膏，用硅胶柱分离，再用葡聚糖凝胶LH-20柱纯化，即得。本发明所述的提取、分离和检测方法具有简单可行、科学等特点。

Description

一种红花药材中活性成分的提取、分离及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种红花药材中活性成分的提取、分离及其检测方法。
背景技术
红花为菊科植物红花CartkamustinctoriusL.的干燥花，夏季花由黄变红时进行采摘，阴干或晒干。性温,味辛,具有活血通经、散瘀止痛的功能,主要用于经闭、痛经、恶露不行、癥瘕痞块、跌打损伤、疮疡肿痛等症。国内外学者们对红花的化学成分及药理作用进行了较为深入的研究，具体内容如下：
A:化成成分研究：
⑴.查耳酮类：主要为红花黄色素(saffloryellow,SY),它是含有多种成分的水溶性混合物。TakahashiY等于1982年分离得到红花黄色素A(SY-A)；1984年进一步分离得到红花黄色素B(SY-B)；Danisova等分离得到SY-C.Meselhy等1993年首次分离得到羟基红花黄色素A(hydroxysaffloryellowA,HSYA)。YinHB等首次得到红花苷Cartormin，红花苷(Carthamin)是红花中的一种色素，由于红花苷具某些独特的化学性质和光学特征，多年来其结构一改再改，比较混乱。
⑵.黄酮类：主要含有6-羟基山萘酚、山萘酚-3-葡萄糖苷、6-羟基山奈酚-3-0-葡萄糖苷、6-羟基山奈酚-7-0-葡萄糖苷、山奈酚、槲皮素、6-羟基-山奈酚、黄芩苷、槲皮素苷、山奈酚-3-芸香糖苷和芦丁、槲皮素-3-葡萄糖苷、槲皮素-6-葡萄糖苷、杨梅素及芹黄素,木樨草素,木樨草素-7-0-β-D-葡萄糖苷、丁香脂素等。
⑶.脂肪酸类：有棕榈酸、二棕榈酸、肉豆蔻酸、香豆酸、月桂酸、油酸、亚油酸。
⑷.甾体类：红花甲醇提取物中分离出了3种饱和甾醇,9种5-甾醇,1种9β、19-环甾醇和7种7-甾醇,15α,20β-二羟基-4-孕烯-3酮等,研究还发现含有β-谷甾醇、豆甾醇。
⑸.多糖类：该成分是由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和中乳糖以β-键连接的一种多糖体。
⑹.聚炔类：主要为3(顺),11(反)-和3(反)-十三碳-1,3,11-三烯-5,7,9-三炔、二十九烷、β-谷甾醇-3-O-葡萄糖苷、十六烷酸甘油酯、反-3-十三烯-5,7,9,11-四炔-1,2-双醇和反-反-3,11-十三烯-5,7,9-三炔-1,2-双醇等。
⑺.微量元素：红花花中含钾、钠、氯等大量元素,还富含铬、锰、锌、钼等微量元素。
⑻.其它：红花中含benzyl-0-β-D-glucopyra-noside、5-羟甲基糠醛、胡萝卜苷等。
B.药理活性:
⑴对心功能及血管的影响:小剂量红花煎剂对蟾蜍心脏有轻微兴奋作用，使心跳有力、振幅加大，对心肌缺血有益；大剂量对蟾蜍反而有抑制作用，而扩张体冠动脉及股动脉。研究表明红花黄色素可减少大鼠低灌流离体心脏乳酸脱氢酶(LDH)漏出，缓解心室肌组织ATP含量下降及其超微结构的损伤；又可缓解大鼠心肌线粒体混悬液中线粒体的肿胀及膜流动性下降，即缓解大鼠心肌缺氧性损伤，改善心肌能量代谢，腹腔注射红花黄色素可明显降低大鼠心率，且显著改善异丙基肾上腺素(ISOP)所致的心电图缺血性改变；同时可缓解大鼠低灌流离体心脏的心率及冠状动脉流量的下降。红花黄色素对大鼠缺血再灌注损伤心肌的影响实验表明，红花黄色素能影响心肌蛋白的表达，对心肌缺血再灌注有一定保护作用。红花黄素在缺氧复氧条件下对大鼠肺动脉内皮细胞P-选择素(Ps)及细胞间黏附分子-1(ICAM-1)基因表达的影响实验表明，单纯缺氧状态下大鼠肺动脉血管内皮细胞Ps、ICAM-1表达无明显变化，缺氧复氧条件下Ps、ICAM-1表达上调，红花黄素可抑制缺氧负氧条件下Ps、ICAM-1的过度表达。
⑵降血压、降血脂作用：研究表明红花黄色素对自发性高血压大鼠有明显降压作用，大鼠灌服红花黄色素后血浆肾素活性和血管紧张素Ⅱ均有明显下降，并能够显著降低冠心病心绞痛患者的胆固醇和甘油三酯。
⑶抗凝血、抑制血栓形成的作用：研究表明红花黄色素A通过抑制PAF所致血小板黏附、释放及血小板内游离Ca2+浓度升高而使血小板活化受到抑制，缓解了血栓形成、炎症反应等病理变化，减轻了血液循环障碍。羟基红花黄色素A抗凝作用的研究表明HSYA可抑制ADP诱发的家兔血小板聚集，延长PT及RT，提示该成分为红花抗血栓有效成分，可阻断多种途径诱发的血栓形成反应。
⑷对神经系统的作用：红花黄色素A对大鼠缺血脑细胞线粒体的损伤有明显的保护作用，表现为抑制缺血脑线粒体膜流动性的降低、膜磷脂降解、线粒体肿胀、NADH脱氢酶、琥珀酸脱氢酶和细胞色素c氧化酶活性的降低，改善线粒体呼吸功能；同时羟基红花黄色素A能明显降低脑缺血大鼠脑线粒体丙二醛(MDA)含量、升高超氧化物歧化酶(SOD)活性、抑制Ca2+过多摄入。
⑸抗自由基、抗氧化、抗衰老作用：红花黄色素可清除羟自由基、抑制脂质过氧化、保护细胞膜，其主要成分羟基红花黄色素A为一查耳酮类成分，其分子中含有多个酚羟基。红花水提液有抗氧化作用，可清除羟自由基及抑制脂质过氧化反应，可显著延长中老龄鼠游泳时间及常压缺氧和寒冷条件下存活时间，增强小鼠在各种不利环境中的生存能力并显著抑制中老龄大鼠体内过氧化质生成，具有抗衰老作用。
⑹抗炎、免疫抑制作用、兴奋子宫作用、抗肿瘤等作用。
目前，本权利人独家生产的丹红注射液是由丹参、红花2味药材制成的中药注射剂，具有活血化瘀，通脉舒络之功效，用于瘀血闭阻所致的胸痹及中风，证见：胸痛，胸闷，心悸，口眼歪斜，言语蹇涩，肢体麻木，活动不利等症；冠心病、心绞痛、心肌梗塞，瘀血型肺心病、缺血性脑病、脑血栓；为深受上述疾病折磨的广大患者带来了非常显著的治疗效果。其中红花药材是该成方制剂的主要组成药味，本申请人对购得的红花原料药，通过对不同批次、不同产地的红花药材进行分析，发现均有一个未知成分对红花药材中的指标成分山柰素的含量检测存在干扰，为了解决这一技术问题，从而保证红花药材的质量控制，其最终保证丹红注射液的疗效和用药安全。据此，我们对红花药材中该未知部位进行分离、纯化及结构解析和药效评价等方面的研究。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种红花药材中活性成分的提取、分离方法；
本发明的目的之二在于解析所提取的活性物质的化学结构；
本发明的目的之三在于提供红花药材中该活性物质的检测方法。
本发明所述的红花中活性成分的提取、分离方法，它是由如下步骤操作：
⑴提取过程：取红花药材，用乙醇提取，醇提液进行浓缩干燥，加入酸水水解，水解液回收溶剂并浓缩，再用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩、干燥成浸膏，留用；
⑵分离、纯化过程：取步骤⑴中留用的浸膏，用硅胶柱分离，再用葡聚糖凝胶LH-20柱纯化，即得。
进一步来说，所述方法的技术方案操作如下：
⑴提取过程：取红花药材，用与红花药材重量比为6-10倍量、浓度为95%的乙醇提取2-3次，每次1-2h，合并，醇提液浓缩干燥成浸膏，用60℃、浓度为95%乙醇进行溶解后，加入体积比为2～5:1的盐酸溶液加热水解1-2h，水解液进行减压浓缩至无醇味，以水混悬，再用与混悬液体积比为1:1～3的乙酸乙酯萃取2-3次，萃取液浓缩、干燥成浸膏，留用；
⑵分离、纯化过程：取步骤⑴中留用的浸膏，与100-200目硅胶按重量比为1:1～2混合，装柱，以体积比为100:0～70:20的石油醚-丙酮进行洗脱，并收集比例是80:20～75:25的洗脱液并浓缩、干燥成浸膏，再将浸膏与100-200目硅胶按重量比为1:1～2混合，以体积比为70:1的氯仿-甲醇进行洗脱，收集该洗脱液并浓缩、干燥成浸膏后，再上葡聚糖凝胶LH-20柱，先用甲醇洗脱，再以氯仿-甲醇液洗脱，收集、合并洗脱液，浓缩干燥并粉碎成干膏粉，即得。
进一步，所述方法较优的技术方案如下：
⑴提取过程：取红花药材，用与红花药材重量比为8倍量、浓度为95%的乙醇提取2次，每次1.5h,合并，醇提液于45℃减压浓缩干燥成浸膏，用60℃、浓度为95%乙醇进行溶解后，加入体积比为3:1的盐酸溶液加热水解1h，水解液进行减压浓缩至无醇味，以水混悬，用与混悬液体积比为1:2的乙酸乙酯萃取2次，萃取液于65℃减压浓缩、干燥成浸膏，留用；
⑵分离、纯化过程：取步骤⑴中留用的浸膏，与100-200目硅胶按重量比为1:1.5混合，装柱，以体积比为100:0～70:20的石油醚-丙酮进行洗脱，并收集85:15～75:25的洗脱液，并浓缩、干燥成浸膏，再将浸膏与100-200目硅胶按重量比为1:1.5混合，以体积比为70:1的氯仿-甲醇进行洗脱，收集该洗脱液并浓缩、干燥成浸膏，再上葡聚糖凝胶LH-20柱，先用甲醇洗脱，再以体积比为1:1的氯仿-甲醇洗脱，收集、合并洗脱液，浓缩干燥并粉碎成干膏粉，即得。
上述3个提取方法中，所述盐酸溶液的配制方法是：取15体积份的盐酸加水至37体积份。
以上所有的技术方案中所提取、分离的组分为黄色粉末，最终结合1HNMR和13CNMR确定此化合物为黄酮类化合物，其化学结构为6-甲氧基山奈酚，结构式如下：
（具体测定数据见表1），并且所得到的6-甲氧基山奈酚的纯度应大于98.5%。
表11HNMR和13CNMR实验数据
本发明技术方案中还提供了对红花药材中山奈素和6-甲氧基山奈酚检测方法，具体如下：
⑴色谱条件：AgilentEclipseXDB-C18色谱柱，以体积比45:55的甲醇-0.4%磷酸溶液为流动相，流速1.0ml/min,检测波长：367nm；
⑵对照品溶液制备：取山柰素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含9μg的溶液，即得；
⑶供试品溶液的制备：取红花药材0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液15ml，置平底烧瓶中，加盐酸溶液5ml，摇匀，置水浴中加热水解30min，冷却，转移至25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
⑷测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，按照步骤⑴中所述的色谱条件测定化合物山奈素和6-甲氧基山奈酚的含量，即得。
有益效果
1.红花中该活性物的首次分离获得：
通过查新现有技术，目前发现6-甲氧基山柰酚主要存在于巴西蜂胶、蓼科植物蓼蓝、矢车菊属植物Centaureapannonica(Heuff.)Simonk及食虫谷精草属植物、旋覆花等植物中，因此，本技术方案最终所确定的提取化合物为6-甲氧基山奈酚，且该活性物为首次从红花中分离得到，按照我们目前研究的结果显示，该活性成分可能与红花的品种或种植环境相关联。
2.生物活性：
6-甲氧基山奈酚（3,5,7-trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-6-methoxy-4H-chromen-4-one）是一种存在于动植物中，其结构含有黄酮母核的黄酮类衍生物。Katsuhiro,H等人从巴西蜂胶（BrazilianPropolis）的醇-水提取物中分离得到了该物质；Takaharu,H等人从蓼科的蓼蓝（PolygonumTinctoriumLour）地上部分的乙酸乙酯提取物中分离得到了该物质；Tanja,M.I从矢车菊属植物Centaureapannonica(Heuff.)Simonk的提取物中得到了该物质，并进行了详细的结构研究；Fabiana,V.Z等人通过HPLC-ESI-ITMSn技术在分离鉴定食虫谷精草属植物PaepalanthuschiquitensisHerzog的提取物中发现了该物质。通过上述研究可以看出，6-甲氧基山奈酚是广泛存在的黄酮化合物，是不同植物代谢过程中产生的一类次级代谢物。
国内外，对该化合物的药理活性进行了深入研究，由于其具有黄酮的结构母核，该化合物具有一般黄酮类物质的生理活性，由于其结构中存在多个羟基官能团，因而具有一定的还原特性，在体内可发挥一定的抗氧化，清除自由基的特性。Katsuhiro,H等人利用2,2'-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐（AAPH）产生氧化自由基介导的亚油酸胶束氧化，对巴西蜂胶中的多种黄酮化合物的抗氧化性能进行了研究，研究发现6-甲氧基山奈酚具有较好的抗氧化活性，其对AAPH对亚油酸的氧化的抑制作用的IC50值为1.4μM，其抗氧化能力接近于具有较强抗氧化能力且使用广泛的二叔丁基对甲酚（BHT）。Kazuo，S等人利用小肠Caco-2细胞和肝系HepG2细胞对巴西蜂胶中的多种黄酮类化合物的抗氧化活性进行了研究，利用氧化自由基对上述细胞膜进行破坏后，细胞对硫巴比妥酸（thiobarbituricacid）转运能力的丧失，通过上述黄酮类化合物加入后，细胞上下界面的硫巴比妥酸浓度的改变，考察了上述化合物清除自由基的能力，研究表明，6-甲氧基山奈酚具有较好的清除自由基效果。Ernesto，E等人利用TOPS-MODEQSAR技术研究了不同基团取代基取代后的黄酮衍生物对自由基清除能力之间的构效关系，通过研究表明了6-甲氧基山奈酚结构中羟基是决定其抗氧化性能的关键集团。
除了具有清除自由基抗氧化的活性之外，Gerald,Z.T等人对该化合物与神经系统的作用进行了研究，根据以往的报道中的槲皮素具有抑制细胞周期素依赖性激酶（Cyclin-dependentkinases,CDK）的活性，该研究对6-甲氧基山奈酚对Cdk5激酶的相互作用进行了研究，Cdk5/p35系统是与体内神经系统神经元迁移与大脑发育密切相关的调节系统，该系统的失调会导致一系列的复杂的神经系统疾病，尤其是造成阿尔茨海默症的主要病因，通过研究发现黄酮中的许多化合物对该酶具有一定的抑制作用，而这种抑制的结构基础是黄酮结构中的特有的官能团所决定的，通过分子对接发现黄酮结构中B环在较少取代的情况下，同时具有较高的甲氧基化后，其对Cdk5的活性变高，通过体外实验发现具有上述结构特点的黄酮衍生物对Cdk5抑制的EC50在微摩尔数量级，是极好的该激酶抑制剂。
在该化合物的生物毒性研究方面，Kazuo,S等人利用MTT试验研究了该化合物的细胞毒性，研究表明与空白培养液相比，加入含有该化合物的提取液后，细胞的存活率为空白对照的96%，在2h的孵化时间后，大部分该化合物以游离态形式存在，通过上述研究表明该化合物具有较低的细胞毒性；同时Fabiana,V.Z等人通过对该化合物对沙门氏菌的致突变作用即Ames实验研究发现该化合物具有一定的致突变作用，由于其结构中的羟基可以与碱基序列中的嘌呤与嘧啶之间形成氢键，该化合物结构可以插入碱基序列中造成遗传代码复制过程中错误形成突变，该致突变作用是黄酮类化合物的共同特性，相比于其它黄酮类化合物，由于6-甲氧基山奈酚中甲氧基空间结构较大，相比于其它黄酮化合物，该结构的致畸变作用较弱，该化合物所导致的致突变作用在安全范围之内。
综上所述，6-甲氧基山奈酚主要药效活性及作用为：①具有一定的抗氧化，清除自由基的作用；②该化合物具有预防神经系统方面的疾病；③该化合物具有一定的致突变作用，由于该致突变作用是黄酮类化合物的共同特性，相比于其它黄酮类化合物，由于6-甲氧基山奈酚中甲氧基空间结构较大，相比于其它黄酮化合物，该结构的致畸变作用较弱，该化合物所导致的致突变作用在安全范围之内。
3.首次查找出依据中国药典方法测定红花药材中活性成分山奈素的未知干扰峰，并建立了对两个活性成分均能够达到含量测定要求的检测方法。
具体实施方式
此处，应当理解本领域的普通技术人员基于此处内容公开的启示下，但凡在本发明的精神和实质范围内，所作的任何改变、等同替换和改进，例如，本领域的技术人员可以理解，在本发明药物的质量检测方法中，对于所给出的某些具体数值进行适当的修改也有可能达到实现质量控制的目的。这些均应当落在本发明的保护范围之内。此外，应当理解，此处提供的具体实施例仅仅是示意性的、指导性的，而不应当解释为对本发明方案的限制。
以下通过具体实施例来阐述本发明所述的红花药材中活性成分的获取及检测方法，进一步让本领域的技术人员能够全面理解本发明的内容。
实施例1：
⑴取红花药材，用与红花药材重量比为8倍量、浓度为95%的乙醇提取2次，每次1.5h,合并，醇提液于45℃减压浓缩干燥成浸膏，用60℃、浓度为95%乙醇进行溶解后，加入体积比为3:1的盐酸溶液加热水解1h，水解液进行减压浓缩至无醇味，以水混悬，用与混悬液体积比为1:2的乙酸乙酯萃取2次，萃取液于65℃减压浓缩、干燥成浸膏，留用；
⑵取步骤⑴中留用的浸膏，与100-200目硅胶按重量比为1:1.5混合，装柱，以体积比为100:0～70:20的石油醚-丙酮进行洗脱，并收集85:15～75:25的洗脱液，并浓缩、干燥成浸膏，再将浸膏与100-200目硅胶按重量比为1:1.5混合，以体积比为70:1的氯仿-甲醇进行洗脱，收集该洗脱液并浓缩、干燥成浸膏，再上葡聚糖凝胶LH-20柱，先用甲醇洗脱，再以体积比为1:1的氯仿-甲醇洗脱，收集、合并洗脱液，浓缩干燥并粉碎成干膏粉，即得。
实施例2：
⑴取红花药材，用与红花药材重量比为6倍量、浓度为95%的乙醇提取3次，每次1h,合并，醇提液于45℃减压浓缩干燥成浸膏，用60℃、浓度为95%乙醇进行溶解后，加入体积比为2:1的盐酸溶液加热水解1.5h，水解液进行减压浓缩至无醇味，以水混悬，用与混悬液体积比为1:1的乙酸乙酯萃取3次，萃取液于65℃减压浓缩、干燥成浸膏，留用；
⑵取步骤⑴中留用的浸膏，与100-200目硅胶按重量比为1:1混合，装柱，以体积比为100:0～70:20的石油醚-丙酮进行洗脱，并收集85:15～75:25的洗脱液，并浓缩、干燥成浸膏，再将浸膏与100-200目硅胶按重量比为1:1混合，以体积比为70:1的氯仿-甲醇进行洗脱，收集该洗脱液并浓缩、干燥成浸膏，再上葡聚糖凝胶LH-20柱，先用甲醇洗脱，再以体积比为1:1的氯仿-甲醇洗脱，收集、合并洗脱液，浓缩干燥并粉碎成干膏粉，即得。
实施例3：
⑴取红花药材，用与红花药材重量比为10倍量、浓度为95%的乙醇提取3次，每次2h,合并，醇提液于45℃减压浓缩干燥成浸膏，用60℃、浓度为95%乙醇进行溶解后，加入体积比为5:1的盐酸溶液加热水解2h，水解液进行减压浓缩至无醇味，以水混悬，用与混悬液体积比为1:3的乙酸乙酯萃取3次，萃取液于65℃减压浓缩、干燥成浸膏，留用；
⑵取步骤⑴中留用的浸膏，与100-200目硅胶按重量比为1:2混合，装柱，以体积比为100:0～70:20的石油醚-丙酮进行洗脱，并收集85:15～75:25的洗脱液，并浓缩、干燥成浸膏，再将浸膏与100-200目硅胶按重量比为1:2混合，以体积比为70:1的氯仿-甲醇进行洗脱，收集该洗脱液并浓缩、干燥成浸膏，再上葡聚糖凝胶LH-20柱，先用甲醇洗脱，再以体积比为1:2的氯仿-甲醇洗脱，收集、合并洗脱液，浓缩干燥并粉碎成干膏粉，即得。
实施例4：上述实施例1-3所制得提取物干膏粉的检测方法
⑴色谱条件：AgilentEclipseXDB-C18色谱柱，以体积比45:55的甲醇-0.4%磷酸溶液为流动相，流速1.0ml/min,检测波长：367nm；
⑵对照品溶液制备：取山柰素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含9μg的溶液，即得；
⑶供试品溶液的制备：取红花药材0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液15ml，置平底烧瓶中，加盐酸溶液5ml，摇匀，置水浴中加热水解30min，冷却，转移至25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
⑷测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，按照步骤⑴中所述的色谱条件测定化合物山奈素和6-甲氧基山奈酚的含量，即得。
实施例5：上述实施例1-3所制得提取物干膏粉的结构解析结果
上述提取物干膏粉为黄色粉末，采用上述实施例4中所述的检测方法，以含未知化合物的红花药材为对照药材，对未知峰进行定位，采用面积归一法，检测化合物的纯度，经检测该化合物纯度均大于98.5%。结合1HNMR和13CNMR确定此化合物为黄酮类化合物，1HNMR和13CNMR与参考文献比较数据如下：
通过上述数据分析，该化合物1HNMR和13CNMR数据可知确定，该化合物为6-甲氧基山奈酚。

Claims (3)

1.一种提取、分离红花药材中活性成分6-甲氧基山奈酚的方法，其特征在于，所述的方法按如下步骤操作：
⑴提取过程：取红花药材，用与红花药材重量比为6-10倍量、浓度为95％的乙醇提取2-3次，每次1-2h，合并，醇提液浓缩干燥成浸膏，用60℃、浓度为95％乙醇进行溶解后，加入体积比为2～5:1的盐酸溶液加热水解1-2h，水解液进行减压浓缩至无醇味，以水混悬，再用与混悬液体积比为1:1～3的乙酸乙酯萃取2-3次，萃取液浓缩、干燥成浸膏，留用；
⑵分离、纯化过程：取步骤⑴中留用的浸膏，与100-200目硅胶按重量比为1:1～2混合，装柱，以体积比为100:0～70:20的石油醚-丙酮进行洗脱，并收集比例是80:20～75:25的洗脱液并浓缩、干燥成浸膏，再将浸膏与100-200目硅胶按重量比为1:1～2混合，以体积比为70:1的氯仿-甲醇进行洗脱，收集该洗脱液并浓缩、干燥成浸膏后，再上葡聚糖凝胶LH-20柱，先用甲醇洗脱，再以氯仿-甲醇液洗脱，收集、合并洗脱液，浓缩干燥并粉碎，即得。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法进一步的操作步骤如下：
⑴提取过程：取红花药材，用与红花药材重量比为8倍量、浓度为95％的乙醇提取2次，每次1.5h,合并，醇提液于45℃减压浓缩干燥成浸膏，用60℃、浓度为95％乙醇进行溶解后，加入体积比为3:1的盐酸溶液加热水解1h，水解液进行减压浓缩至无醇味，以水混悬，用与混悬液体积比为1:2的乙酸乙酯萃取2次，萃取液于65℃减压浓缩、干燥成浸膏，留用；
⑵分离、纯化过程：取步骤⑴中留用的浸膏，与100-200目硅胶按重量比为1:1.5混合，装柱，以体积比为100:0～70:20的石油醚-丙酮进行洗脱，并收集85:15～75:25的洗脱液，并浓缩、干燥成浸膏，再将浸膏与100-200目硅胶按重量比为1:1.5混合，以体积比为70:1的氯仿-甲醇进行洗脱，收集该洗脱液并浓缩、干燥成浸膏，再上葡聚糖凝胶LH-20柱，先用甲醇洗脱，再以体积比为1:1的氯仿-甲醇洗脱，收集、合并洗脱液，浓缩干燥并粉碎，即得。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述红花药材的检测方法如下：
⑴色谱条件：AgilentEclipseXDB-C18色谱柱，以体积比45:55的甲醇-0.4％磷酸溶液为流动相，流速1.0ml/min,检测波长：367nm；
⑵对照品溶液制备：取山柰素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含9μg的溶液，即得；
⑶供试品溶液的制备：取红花药材0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液15ml，置平底烧瓶中，加盐酸溶液5ml，摇匀，置水浴中加热水解30min，冷却，转移至25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
⑷测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，按照步骤⑴中所述的色谱条件测定化合物山奈素含量。
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