CN115448919B - 一种海洋来源的萘啶类抗炎活性化合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及海洋生物及医药技术领域，具体地说，涉及一种从海洋海绵Aaptos suberitoides中分离得到的萘啶类抗炎活性化合物及其制备方法。本发明所述的萘啶类抗炎活性化合物是从海绵Aaptos suberitoides中分离出来的新化合物，通过核磁共振(NMR)、质谱(MS)等方法，结合相关文献对比鉴定了化合物结构和分子式；通过实验探究发现，该化合物可显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症，通过MAPK信号通路调控炎症，降低促炎因子IL‑1β、IL‑6和TNF‑αmRNA水平以及iNOS和COX2蛋白水平的表达，从而抑制炎症的发生。本发明首次披露该具有良好抗炎活性的新化合物，为开发利用我国海洋生物资源及抗炎新药的研发提供了科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及海洋生物及医药技术领域，具体地说，涉及一种从海洋海绵Aaptossuberitoides中分离得到的萘啶类抗炎活性化合物及其制备方法。
背景技术
炎症是机体对各种外源性或内源性损伤所做出的一种防御性反应。如果炎症得不到有效控制，就会导致类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、糖尿病甚至癌症等各种疾病。目前，临床上所用的抗炎药物主要有非甾体抗炎药及糖皮质激素，但是这两类药物在长期大量使用后均存在一些严重的不良反应。因此，开发更加安全有效的新型抗炎药物具有广阔的临床应用前景。
巨噬细胞是人体内一种重要的免疫细胞，在启动炎症反应和抵抗外界侵染中起着较为关键的作用。巨噬细胞感受外界刺激(如病毒、物理伤害以及药物等)后能够产生一系列炎症物质，包括细胞因子(IL-6、IL-12等)、趋化因子以及炎症介质。一部分物质会表现出促炎特性，这些物质是导致炎症反应加重的重要因素。因此，想要控制炎症反应的加重以及缓解炎症反应的发展，抑制巨噬细胞分泌炎症物质已是研究的热点之一。LPS是十分重要的致炎因子，它能够刺激体内的巨噬细胞合成和释放多种内源性活性因子，进而诱发炎症。利用LPS处理巨噬细胞是常用的体外炎症模型造模手段。
Aaptos suberitoides属于Aaptos属(Porifera,Demospongiae,Suberitida,Suberitidae)，广泛分布于越南、日本、印度尼西亚和加勒比海浅水水域。以往的化学研究表明，其主要化学成分为aaptamine类生物碱，至今未见其抗炎活性的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海洋来源的萘啶类抗炎活性化合物，第二目的是提供海洋来源的萘啶类抗炎活性化合物的制备方法。
本发明的第一目的采用以下技术方案实现：
一种海洋来源的萘啶类抗炎活性化合物，其特征在于：所述化合物是从海绵Aaptos suberitoides中分离得到的，其分子式为C10H8N2O3，结构式为：
该化合物命名为：4-carbomethoxy-5-keto-1,6-naphthyridine。
本发明的第二目的采用以下技术方案实现：
本发明所述萘啶类抗炎活性化合物的制备方法，包括以下步骤：
1、原料处理：将冷冻保存的海绵样品用粉碎机粉碎后，在室温下用甲醇动态冷浸提取3次，每次浸泡3天；合并3次提取液，40℃温度条件下减压浓缩；然后，用无水甲醇溶解脱盐3次，制得浸膏；
2、减压硅胶柱层析：将浸膏溶解于1.5-3倍重量的纯甲醇中，再用浸膏重量1-3倍的100-200目硅胶拌样后上减压硅胶柱；再分别用石油醚与乙酸乙酯体积配比为100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:4的石油醚乙酸乙酯溶液和二氯甲烷与甲醇体积配比为20:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷甲醇溶液进行梯度洗脱，分别收集各部分的洗脱液并浓缩，用TLC薄层色谱监测并合并相同的部分；
3、ODS柱层析：取步骤2中体积配比为1:2的石油醚乙酸乙酯溶液洗脱得到的组分，过ODS柱，再分别用浓度为甲醇与水体积配比为1:4、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2的甲醇溶液进行梯度洗脱，分别收集各部分的洗脱液并浓缩，用TLC薄层色谱监测并合并相同的部分；
4、高效液相色谱分离：取步骤3中体积配比为3:7甲醇溶液洗脱得到的组分通过高效液相分析用ODS C18柱制备可得所述化合物，保留时间为25.0分钟，即制得所述化合物。
优选的，步骤2中，所述减压硅胶柱的填料硅胶为200-300目。
优选的，步骤4中，所述ODS C18柱采用YMC ODS C18柱，型号为10×250mm,填料粒径为5μm，流动相为乙腈/水15:85v/v，流速为1.5mL/min。
有益效果：本发明所述的萘啶类抗炎活性化合物是从海绵Aaptossuberitoides中分离出来的新化合物，该化合物的制备方法简单易行，人工合成也易于实现。通过核磁共振(NMR)、质谱(MS)等方法，结合相关文献对比鉴定化合物结构，鉴定该海绵来源新化合物为4-carbomethoxy-5-keto-1,6-naphthyridine；同时，采用Griess法对化合物进行抗炎活性测试，并采用RT-qPCR和Western Blot法对化合物抗炎活性机制进行探究，发现该化合物可显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症，通过MAPK信号通路调控炎症，降低促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA水平以及iNOS和COX2蛋白水平的表达，从而抑制炎症的发生。本发明首次披露该具有良好抗炎活性的新化合物，为开发利用我国海洋生物资源及抗炎新药的研发提供了科学依据。
附图说明
图1为本发明所述化合物的制备方法工艺流程图。
图2为本发明所述化合物的高分辨质(HRESIMS)谱图。
图3为本发明所述化合物的核磁共振氢(1H NMR)谱图。
图4为本发明所述化合物的核磁共振碳(13C NMR)谱图。
图5为本发明所述化合物的核磁共振氢(1H-1H COSY)谱图。
图6为本发明所述化合物的核磁共振氢(HSQC)谱图。
图7为本发明所述化合物的核磁共振氢(HMBC)谱图。
图8为本发明所述化合物对RAW264.7细胞产生NO的影响的示意图。
RAW264.7细胞以1×105mL-1浓度种于24孔板，化合物(40μg/mL、80μg/mL)37℃预处理细胞1h后，LPS(1μg/mL)37℃处理24h，使用NO检测试剂盒即Griess法对细胞培养上清中NO含量进行检测；测定样本在520nm处的吸光度，用样品和标准品的吸光度作图；##p＜0.01vs.对照组，有统计学意义；***p＜0.001vs.LPS单独处理组，有统计学意义。
图9为本发明所述化合物对RAW264.7细胞毒活性的示意图。
以不同浓度化合物(20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL)37℃处理细胞48h或以不同浓度化合物预处理细胞1h后，LPS(1μg/mL)37℃处理48h；*p＜0.05，有统计学意义。
A.化合物单独处理对RAW264.7细胞的影响。
B.化合物+LPS共同处理对RAW264.7细胞的影响。
图10为本发明所述化合物降低LPS诱导的RAW264.7细胞中促炎因子mRNA表达水平的示意图。
化合物(40μg/mL、80μg/mL)37℃预处理细胞1h后，LPS(1μg/mL)37℃处理24h，处理后从所有组中提取RNA并逆转录为cDNA，将逆转录后的cDNA用试剂盒进行RT-qPCR，用Cq值(2-ΔΔCq法)绘图，用β-Actin基因归一化计算各基因的相对表达；####p＜0.0001vs.对照组，有统计学意义，****p＜0.0001vs.LPS单独处理组，有统计学意义。
A.TNF-α的相对表达；B.IL-1β的相对表达；C.IL-6的相对表达。
图11为本发明所述化合物降低LPS激活的RAW264.7细胞中促炎因子iNOS和COX2的mRNA和蛋白表达的示意图。
化合物(40μg/mL、80μg/mL)37℃预处理细胞1h后，LPS(1μg/mL)37℃处理24h；处理后从所有组中提取RNA并逆转录为cDNA，将逆转录后的cDNA用试剂盒进行RT-qPCR；用Cq值(2-ΔΔCq法)绘图；用β-Actin基因归一化计算各基因的mRNA相对表达；对于蛋白表达，从细胞中获取蛋白并进行Western blotting，用三个独立的灰度扫描值计算表达水平；用GAPDH基因归一化计算各基因的蛋白相对表达。##p＜0.01,###p＜0.001,####p＜0.0001vs.对照组，有统计学意义；**p＜0.01,***p＜0.001,****p＜0.0001vs.LPS单独处理组，有统计学意义。
A.iNOS的mRNA相对表达；B.COX2的mRNA相对表达；C.iNOS和COX2的Western blot图；D.iNOS的蛋白相对表达；E.COX2的蛋白相对表达。
图12为本发明所述化合物对LPS激活的RAW264.7细胞MAPKs通路的影响的示意图。
化合物(40μg/mL、80μg/mL)37℃预处理细胞1h后，LPS(1μg/mL)37℃处理24h；对于蛋白表达，从细胞中获取蛋白并进行Western blot，用三个独立的灰度扫描值计算表达水平；用蛋白质的总蛋白和磷酸化蛋白归一化计算相对表达。###p＜0.001,####p＜0.0001vs.对照组，有统计学意义；***p＜0.001,****p＜0.0001vs.LPS单独处理组，有统计学意义。
A.MAPKs通路的Western blot图；B.p-P38/P38的蛋白相对表达；C.p-ERK/ERK的蛋白相对表达；D.p-JNK/JNK的蛋白相对表达。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。
实施例：
本实施例所述海洋来源的萘啶类抗炎活性化合物，其特征在于：所述化合物是从海绵Aaptos suberitoides中分离得到的，其分子式为C10H8N2O3，结构式为：
该化合物命名为：4-carbomethoxy-5-keto-1,6-naphthyridine。
所述海绵Aaptos suberitoides于2012年采自于西沙永兴岛海域，并将其于-20℃冷冻保存。
如图1所示，所述萘啶类抗炎活性化合物的制备方法包括以下步骤：
1、原料处理：将冷冻保存的湿重2.5kg的海绵样品用粉碎机粉碎后，在室温下用甲醇动态冷浸提取3次，每次浸泡3天；合并3次提取液，40℃温度条件下减压浓缩；然后，用无水甲醇溶解脱盐3次，制得浸膏162.5g(海绵Aaptos suberitoides粗提物)；
2、减压硅胶柱层析：将浸膏溶解于1.5-3倍重量的纯甲醇中，再用浸膏重量1-3倍的100-200目硅胶拌样后上减压硅胶柱，所述硅胶减压柱的填料硅胶为200-300目；再分别用石油醚与乙酸乙酯体积配比为100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:4的石油醚乙酸乙酯溶液和二氯甲烷与甲醇体积配比为20:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷甲醇溶液进行梯度洗脱，分别收集各部分的洗脱液并浓缩，用TLC薄层色谱监测并合并相同的部分；
3、ODS柱层析：取步骤2中体积配比为1:2的石油醚乙酸乙酯溶液洗脱得到的组分，过ODS柱，再分别用浓度为甲醇与水体积配比为1:4、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2的甲醇溶液进行梯度洗脱，分别收集各部分的洗脱液并浓缩，用TLC薄层色谱监测并合并相同的部分；
4、高效液相色谱分离：取步骤3中体积配比为3:7甲醇溶液洗脱得到的组分通过高效液相分析用ODS C18柱(所述ODS C18柱采用YMC ODS C18柱，型号为10×250mm,填料粒径为5μm，流动相为乙腈/水15:85v/v，流速为1.5mL/min)制备可得所述化合物，保留时间为25.0分钟，即制得所述化合物。
化合物结构解析
取制备的萘啶类抗炎活性化合物，通过核磁共振(NMR)、质谱(MS)等方法，并结合相关文献对比，对其结构进行鉴定，结果如下：该化合物为棕色针状结晶，由高分辨质谱确定分子式为C10H8N2O3([M+H]+m/z 205.0612；计算值205.0608)，如图2所示。氢谱中显示两组耦合质子信号8.96，7.45(each,1H,d,J＝4.3Hz)和δH 7.52，6.67(each,1H,d,J＝9.0Hz)，如图3所示；如图6所示，HSQC谱图确定4个氢质子分别连与次甲基碳δC154.8,118.8,134.0,106.2。碳谱低场区还显示4个季碳信号(δC 141.6,117.0,160.8,154.8)，如图4所示。以上信号为1,6-萘啶生物碱的特征性信号。另外，氢谱中在δH3.85处还显示一个甲氧基信号与δC52.6相关，碳谱中还显示一个羰基碳信号(δC 168.0)。如图7所示，在HMBC谱图中，H-2(δH8.96)与C-3(δC 118.8),C-4(δC 141.6),和C-8a(δC 154.8)相关，H-3(δH 7.45)与C-2(δC154.8),C-9(δC 168.0),和C-4a(δC 117.0)相关,H-7(δH 7.52)与C-5(δC 160.8),C-8(δC106.2)和C-8a(δC 154.8)相关，H-8(δH 6.67)与C-4a,C-7(δC 134.0)相关,甲氧基信号(δH3.85)与C-4和C-9相关。
由以上相关信号推测，本发明所述萘啶类抗炎活性化合物的结构与文献报道的3,5-dicarbomethoxy-1,6-naphthyridine结构相似，不同之处在于C-5的羰基被酮基替代。因此，本发明所述萘啶类抗炎活性化合物确定为4-carbomethoxy-5-keto-1,6-naphthyridine。
表1：化合物的1D、2D NMR数据(500M，DMSO-d6)
| position | δH,mult(J in Hz) | δC | HMBC |
| 1 | - | ||
| 2 | 8.96(d,J＝5.4Hz) | 154.8 | C-3,4,8a |
| 3 | 7.45(d,J＝6.0Hz) | 118.8 | C-2,4a,9 |
| 4 | 141.6 | ||
| 4a | 117.0 | ||
| 5 | 160.8 | ||
| 6 | - | ||
| 7 | 7.52(d,J＝9.0Hz) | 134.0 | C-5,8,8a |
| 8 | 6.67(d,J＝9.0Hz) | 106.2 | C-4a,,7,8a, |
| 8a | 154.8 | ||
| 9 | 168.0 | ||
| 9-OCH3 | 3.85(s) | 52.6 | C-4,9 |
抗炎活性测定实验
细胞：小鼠来源的巨噬细胞株RAW264.7，培养于含10％的胎牛血清、100U/mL青霉素、链霉素的1640培养液，置于5％CO2、37℃培养箱中培养，1-2天换液1次。待细胞生长至70％-80％融合度后进行传代，2-3d传代1次。
1、CCK8法检测化合物对RAW264.7细胞活力的影响
取对数生长期细胞，调整RAW264.7细胞悬液浓度为5×104mL－1，加入96孔板内，每孔100μL，置于5％CO2、37℃培养箱中培养过夜，之后加入终浓度分别为0、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的化合物，每组设3个复孔，继续培养48h。每孔加入CCK8试剂10μL，继续培养2h。终止培养，在酶标仪A450nm处测量各孔的吸光度值，计算化合物对细胞的抑制率。
2、化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO的影响
取对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度为1×105mL－1，取1mL加于24孔细胞培养板内，置5％CO2、37℃培养箱中培养过夜，根据预实验结果，每孔分别加入40μg/mL、80μg/mL的化合物孵育1h后，再加入或不加入终浓度为1μg/mL的LPS，置培养箱中继续培养24h。取细胞上清，通过Griess试剂法，酶标仪A540nm处检测细胞培养上清中的NO含量。
3、化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞mRNA表达的影响
取对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度为2.5×105mL－1，取2mL加于6孔细胞培养板内，置5％CO2、37℃培养箱中培养过夜。每孔分别加入40、80μg/mL的化合物孵育1h后再加入或不加入终浓度为1μg/mL的LPS，置培养箱中继续培养24h。处理后用TRIZOL试剂提取总RNA。使用逆转录试剂盒将分离的总RNA逆转录为cDNA。从GeneBank中获得序列，采用NCBI设计引物，引物见表1，在荧光定量PCR仪上采用相应的引物、cDNA等材料按步骤进行扩增，采用2-△△CT相对定量法进行基因表达分析，如下表所示：
4、化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞蛋白表达的影响
取对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度为2.5×105mL－1，取2ml加于6孔细胞培养板内，置5％CO2、37℃培养箱中培养过夜。每孔分别加入40μg/mL、80μg/mL的化合物孵育1h后再加入或不加入终浓度为1μg/mL的LPS，置培养箱中继续培养24h。将RIPA缓冲液加入细胞中，提取总蛋白，然后用BCA蛋白检测试剂盒估算蛋白浓度。将10μg的蛋白质加入SDS-PAGE进行分离并转膜，5％脱脂牛奶室温封闭1-2h，然后在4℃与稀释的一级抗体孵育过夜。用1×TBST溶液洗膜，并用辣根过氧化物酶偶联二级抗体在室温下孵育1h，再次洗涤。最后，通过ECL化学发光法显影成像并分析结果。
5、统计分析
所有数据均用x±s表示。与对照组比较，差异有统计学意义(#p＜0.05，###p＜0.001,####p＜0.0001)；与LPS处理组比较(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001,****p＜0.0001)。vs.对照组，有统计学意义；采用one-way ANOVA检验。
实验结果解析：
1、化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞NO含量的影响
通过实验测定了化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞产生NO水平的影响。如图8所示，与对照组相比，LPS刺激导致RAW264.7细胞中NO含量显著增加；与LPS处理组比较，化合物+LPS处理组均显著降低NO水平。在浓度为40μg/mL、80μg/mL时，与LPS处理组相比，RAW264.7细胞NO的释放量分别减少了62％、72％。
2、化合物对RAW264.7细胞活力的影响
在深入研究化合物的抗炎作用之前，采用CCK8法测定化合物(图9A)或与LPS共处理(图9B)对细胞活性的影响。图9A的结果显示，化合物在20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL浓度下均无细胞毒性。与对照组相比，在100μg/mL浓度下，细胞存活率仍高达91％。
为了研究化合物与LPS合用对RAW264.7细胞的毒性作用，用不同浓度(20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL)的化合物与LPS(1μg/mL)共处理细胞24h，CCK8法测定细胞活性。结果显示，当化合物与LPS合用时，当浓度达到80μg/mL时，对RAW264.7细胞的毒性作用无显著性差异。因此，根据RAW264.7细胞NO的产生和细胞毒性结果，选择40μg/mL、80μg/mL的化合物进行进一步的实验。
3、化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌促炎细胞因子的影响
据研究，RAW264.7细胞受LPS刺激后，产生炎症，释放大量的促炎细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β等。为了确定化合物是否具有抗炎活性，采用RT-qPCR方法检测IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平。如图10所示，与对照组相比，LPS处理组TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平显著升高；与LPS处理组相比，化合物+LPS处理组显著降低了LPS诱导的TNF-α(图10A)、IL-1β(图10B)和IL-6(图10C)mRNA的表达。这些结果表明了化合物在转录水平上抑制了促炎细胞因子的表达。
4、化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞中促炎因子iNOS和COX-2表达的影响
iNOS促进NO的合成，COX-2催化花生四烯酸合成PGE2。NO和PGE2均可引起炎症部位的细胞损伤。因此，抑制iNOS和COX-2的表达可以减轻炎症反应。为观察化合物是否具有抑制iNOS和COX-2表达的作用，采用RT-qPCR和Western blotting方法分析COX-2和iNOS的mRNA和蛋白水平表达。
如图11A、B所示，与对照组相比，LPS处理组细胞中iNOS和COX-2的mRNA表达均显著升高；与LPS处理组相比，化合物+LPS处理组显著降低上述细胞因子的基因表达水平，化合物(80μg/mL)+LPS处理组甚至低于空白对照组。
如图11C、D、E所示，与对照组相比，LPS处理组细胞中iNOS的表达增加了1.44倍；化合物在80μg/mL时，其抑制率为27％。此外，LPS处理组COX-2的表达较未处理的对照组增加1.78倍，化合物(40和80μg/mL)+LPS处理组COX-2的表达分别降低41％和56％。
因此，化合物的抗炎作用与其抑制iNOS和COX-2的表达有关。
5、化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞MAPK信号通路的影响
丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在炎症中起关键作用。MAPKs的磷酸化与COX-2和iNOS的激活有关。因此，为了研究和证实化合物是否通过MAPK信号通路抑制LPS刺激的RAW 264.7细胞产生NO，抑制COX-2和iNOS的表达，进行了Western blot实验。结果表明，如图12所示，与对照组相比，LPS诱导p38、ERK和JNK的磷酸化水平分别增加1.5倍、2.1倍和1.8倍。与LPS处理组相比，化合物在40μg/mL时使ERK1和JNK的磷酸化水平分别降低36％和43％，而对P38的磷酸化水平无抑制作用。此外，当浓度为80μg/mL时，化合物使p38、ERK、JNK的磷酸化水平分别降低53％、58％、51％。由此提示化合物通过MAPK信号通路抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞的炎症反应。
本发明中所述的参考文献如下：
[1]Kim S,Choi H S,Ko Y,et al.5-Hydroxymaltol Derived from BeetrootJuice through Lactobacillus Fermentation Suppresses Inflammatory Effect andOxidant Stress via Regulating NF-kB,MAPKs Pathway and NRF2/HO-1 Expression[J].Antioxidants,2021,10(8):1324.
[2]Trang D T,Tai B H,Hang D T T,et al.Four new aaptamine alkaloidsfrom marine sponge Aaptos aaptos.Nat Prod Res.2022 Oct；36(19):5022-5031.
[3]Qianqian H,Shuang M,Na N,et al.A review of the secondarymetabolites from the marine sponges of the genus aaptos.Natural productcommunications,2020,15(9):1-12.
综上所述，本发明所述的萘啶类抗炎活性化合物通过核磁共振(NMR)、质谱(MS)等方法，结合相关文献对比鉴定化合物结构，鉴定该海绵来源新化合物为4-carbomethoxy-5-keto-1,6-naphthyridine；同时，采用Griess法对化合物进行抗炎活性测试，并采用RT-qPCR和Western Blot法对化合物抗炎活性机制进行探究，发现该化合物可显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症，通过MAPK信号通路调控炎症，降低促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA水平以及iNOS和COX2蛋白水平的表达，从而抑制炎症的发生。本发明首次披露该具有良好抗炎活性的新化合物，为开发利用我国海洋生物资源及抗炎症新药的研发提供了科学依据。
Claims (4)
1.一种海洋来源的萘啶类抗炎活性化合物，其特征在于：所述化合物的分子式为C10H8N2O3，结构式为：
2.如权利要求1所述萘啶类抗炎活性化合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)原料处理：将冷冻保存的海绵Aaptos suberitoides样品用粉碎机粉碎后，在室温下用甲醇动态冷浸提取3次，每次浸泡3天；合并3次提取液，40℃温度条件下减压浓缩；然后，用无水甲醇溶解脱盐3次，制得浸膏；
(2)减压硅胶柱层析：将浸膏溶解于1.5-3倍重量的纯甲醇中，再用浸膏重量1-3倍的100-200目硅胶拌样后上减压硅胶柱；再分别用石油醚与乙酸乙酯体积配比为100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:4的石油醚乙酸乙酯溶液和二氯甲烷与甲醇体积配比为20:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷甲醇溶液进行梯度洗脱，分别收集各部分的洗脱液并浓缩，用TLC薄层色谱监测并合并相同的部分；
(3)ODS柱层析：取步骤(2)中体积配比为1:2的石油醚乙酸乙酯溶液洗脱得到的组分，过ODS柱，再分别用浓度为甲醇与水体积配比为1:4、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2的甲醇溶液进行梯度洗脱，分别收集各部分的洗脱液并浓缩，用TLC薄层色谱监测并合并相同的部分；
(4)高效液相色谱分离：取步骤(3)中体积配比为3:7甲醇溶液洗脱得到的组分通过高效液相分析用ODS C18柱制备可得所述化合物，保留时间为25.0分钟，即制得所述化合物。
3.根据权利要求2所述萘啶类抗炎活性化合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述减压硅胶柱的填料硅胶为200-300目。
4.根据权利要求2所述萘啶类抗炎活性化合物的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述ODS C18柱采用YMC ODS C18柱，型号为10×250mm,填料粒径为5μm，流动相为乙腈/水15:85v/v，流速为1.5mL/min。
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