CN115444927A

CN115444927A - 艾默德斯在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用

Info

Publication number: CN115444927A
Application number: CN202211134600.8A
Authority: CN
Inventors: 王琳琳; 徐一月; 董涛涛; 李步托; 范秉杰
Original assignee: Cancer Hospital of Shandong First Medical University
Current assignee: Cancer Hospital of Shandong First Medical University
Priority date: 2022-09-19
Filing date: 2022-09-19
Publication date: 2022-12-09
Anticipated expiration: 2042-09-19
Also published as: CN115444927B

Abstract

本发明属于药物研发技术领域，本发明提供了艾默德斯在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。本发明通过CCK‑8细胞活力实验、克隆形成实验、划痕实验、Transwell迁移实验、Transwell侵袭实验、流式Annexin V/PI细胞凋亡实验和小鼠皮下移植瘤实验，研究了艾默德斯对三阴性乳腺癌的抗癌作用。研究结果表明，艾默德斯具有良好的抑瘤性，同时具有较好的安全性。这表明，艾默德斯在治疗三阴性乳腺癌方面有良好的应用前景和巨大的药物开发价值。

Description

艾默德斯在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物研发技术领域，尤其涉及艾默德斯在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。

背景技术

乳腺癌是全球发病率第一的恶性肿瘤，也是造成癌症相关死亡的主要原因之一。2020年，全球新增226万例乳腺癌患者，严重危害人类，特别是女性的生命健康和生活质量。乳腺癌是起源于乳腺上皮细胞的恶性肿瘤，具有高度异质性，三阴性乳腺癌(triplenegative breast cancer)是其中恶性程度最高的亚型，占全部乳腺癌人群的10-20％。三阴性乳腺癌的激素受体、Her-2受体表达均为阴性，因此患者无法从内分泌治疗和抗Her-2靶向治疗中获益，极大限制了患者的用药，影响预后。

目前标准的三阴性乳腺癌治疗药物为化疗药物，包括蒽环类、紫杉类、铂类等，但这些药物毒性较大。并且，三阴性乳腺癌的异质性使患者容易发生耐药，导致无药可用。这一现状催生了三阴性乳腺癌药物的大力研发，包括免疫治疗、PARP抑制剂、抗血管生成治疗和抗体偶联药物等。然而，这些药物的适应症局限，疗效往往未得到大型临床试验验证，仍需进一步探索。

传统的新药研发模式包括生物萃取、化合物合成等，耗时长，成本高。通过药物再利用的方法发现现有化合物的新适应症，能够极大降低新药研发的金钱成本和时间成本，且显著降低了药物的安全风险，是一种非常具有前景的方法。众所周知的例子有，沙利度胺治疗多发性骨髓瘤，西地那非治疗勃起功能障碍。深度学习属于人工智能的子领域，最广泛使用的技术是构建深度神经网络，对输入特征进行加权和非线性变化，挖掘肉眼无法识别的隐藏信息。基于深度学习适合大样本数据的特点，将深度学习用于药物再利用是很有希望的研究方向。

艾默德斯(Emodepside)是一种从真菌代谢物中提取得到的环八缩肽家族成员衍生物，目前作为猫犬驱虫剂使用，对多种丝虫、线虫感染具有治疗效果。目前艾默德斯还未批准被用于人类寄生虫感染的治疗。I期临床试验证明，艾默德斯在人类男性受试者中，具有良好的药代动力学特征，吸收迅速、初始分布迅速，代谢缓慢，终末半衰期长。且没有发现艾默德斯存在重要的不良反应。目前尚无任何将艾默德斯用于肿瘤治疗，特别是三阴性乳腺癌的研究报道。

发明内容

为克服现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供了艾默德斯在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了艾默德斯在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。

本发明还提供了艾默德斯在制备抑制三阴性乳腺癌细胞增殖的试剂中的应用。

本发明还提供了艾默德斯在制备抑制三阴性乳腺癌细胞迁移的试剂中的应用。

本发明还提供了艾默德斯在制备抑制三阴性乳腺癌细胞侵袭的试剂中的应用。

本发明还提供了艾默德斯在制备促进三阴性乳腺癌细胞凋亡的试剂中的应用。

本发明还提供了艾默德斯在制备抑制三阴性乳腺癌细胞异体移植瘤生长的试剂中的应用。

优选的，所述药物或试剂的剂型包括注射剂或口服液。

优选的，所述药物或试剂还含有药学上可接受的辅料。

优选的，所述艾默德斯的作用浓度为15μM/l或25μM/l。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明通过CCK-8细胞活力实验、克隆形成实验、划痕实验、Transwell迁移实验、Transwell侵袭实验、流式AnnexinV/PI细胞凋亡实验和小鼠皮下移植瘤实验，研究了艾默德斯对三阴性乳腺癌的抗癌作用。研究结果表明，5μM/l和15μM/l的艾默德斯可以显著抑制MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进其凋亡。15μM/l和25μM/l的艾默德斯可以显著抑制4T1细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进其凋亡。且艾默德斯对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系增殖、迁移和侵袭能力的影响呈现浓度依赖性。在小鼠体内，艾默德斯具有良好的抑瘤性，同时具有较好的安全性。这表明，艾默德斯在治疗三阴性乳腺癌方面有良好的应用前景和巨大的药物开发价值。

附图说明

图1为CCK-8细胞活力实验结果；

图2为克隆形成实验结果(注：***表示p<0.001)；

图3为划痕实验结果(注：***表示p<0.001；(a)和(b)分别表示对MDA-MB-231细胞和4T1细胞的结果)；

图4为Transwell细胞迁移实验结果(注：***表示p<0.001)；

图5为Transwell细胞侵袭实验结果(注：***表示p<0.001)；

图6为流式AnnexinV/PI细胞凋亡实验结果(注：***表示p<0.001；(a)和(b)分别表示对MDA-MB-231细胞和4T1细胞的结果)；

图7为小鼠皮下移植瘤实验结果(注：*表示p<0.05；***表示p<0.001)。

具体实施方式

在本发明中，所述药物或试剂的剂型包括注射剂或口服液。

在本发明中，所述药物或试剂还含有药学上可接受的辅料。

在本发明中，所述艾默德斯的作用浓度优选为15μM/l或25μM/l。

下面结合实验例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

以下实验例中的TNBC细胞系MDA-MB-231和4T1购买自武汉普诺赛(Procell)细胞库。

实验例1

CCK-8细胞活力实验：

(1)取对数生长期的细胞，消化并计数，稀释成5×10⁴个细胞/ml的细胞悬液。

(2)取96孔板，在预备进行实验的孔腔周围的一圈孔腔内各加入100μl PBS溶液，以防止液体蒸发影响实验结果。

(3)在96孔板的第二列加入100μl完全培养基，将细胞悬液吹打混匀，从第三列起，在96孔板的每个孔内加入100μl细胞悬液，每次加液前重新吹打，确保每个孔内加入的细胞数量相同。为保证细胞均匀分布，加液时动作轻柔，从一侧缓缓加入，不要使96孔板产生无谓的晃动。

(4)24小时后，在显微镜下观察细胞，保证细胞贴壁。

(5)吸弃96孔板中的旧培养基，分别在含有细胞的孔腔内加入含浓度为0、5、10、25、50、100、250、500μM/l艾默德斯的完全培养基，制作3个复孔。

(6)在药物处理12、24、36和48小时后，吸弃原培养基，用PBS溶液洗涤1次，加入含10％CCK-8试剂的完全培养基100μl，放入37℃细胞培养箱。

2小时后，使用酶标仪测定450nm处的吸光度(OD值)，空白孔的吸光度为Ab，对照孔的吸光度为Ac，实验孔的吸光度为As。细胞存活率＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％。绘制细胞生长曲线，计算12、24、36和48小时的IC50值。

实验结果如图1所示。由图1可知，对于TNBC细胞系MDA-MB-231，艾默德斯作用12小时的半抑制浓度(IC50，50％inhibiting concentration，杀灭50％细胞所需要的浓度)为14.49μM/l；24小时的IC50为6.79μM/l；36小时的IC50为2.46μM/l；48小时的IC50为1.24μM/l。对于TNBC细胞系4T1，艾默德斯作用12小时的IC50为19.07μm/l；24小时的IC50为15.43μM/l；36小时的IC50为2.15μM/l；48小时的IC50为1.62μM/l。

实验例2

基于实验例1的IC50结果，选择药物浓度(在MDA-MB-231细胞中，艾默德斯5μM/l；在4T1细胞中，艾默德斯15μM/l)进行克隆形成实验：

(1)消化MDA-MB-231细胞，制作浓度为3×10³的细胞悬液，准备好6孔板，孔中预先加入1ml完全培养基，然后加入1ml上述细胞悬液，上下、左右混匀。

(2)消化4T1细胞，制作浓度为1×10³的细胞悬液，在预先加入1ml完全培养基的6孔板中加入1ml上述细胞悬液，混匀。

(3)24小时后细胞贴壁，吸弃旧培养基，在MDA-MB-231细胞中，加入5μM/l的艾默德斯或10μl DMSO。在4T1细胞，加入15μM/l的艾默德斯，或30μl DMSO。

(4)24小时后吸弃旧培养基，用PBS溶液洗涤3遍后加入新鲜的完全培养基，每日观察细胞生长情况，每三天予以换液。MDA-MB-231培养14天，4T1细胞培养10天后，6孔板出现肉眼可见的细胞聚集团块，终止培养。

(5)吸弃培养基，用PBS洗涤3次后，在6空板各孔内加入200μl 4％组织细胞固定液，室温下固定30分钟后吸弃4％组织细胞固定液，PBS溶液洗涤后加入200μl结晶紫染液，均匀铺满孔底，室温染色30分钟。

吸取结晶紫染液并回收，用缓慢的水流清洗6孔板，洗去残留的结晶紫。晾干后拍照，使用Image J软件计数每孔的细胞克隆数，计算克隆形成率。实验重复3次。

实验结果如图2所示。由图2可知，MDA-MB-231细胞中，空白对照组克隆形成率为53.23％，溶剂对照组为47.93％，艾默德斯处理组为4.33％。4T1细胞中，空白对照组克隆形成率为62.37％，溶剂对照组为55.2％，艾默德斯处理组为2.03％。可见，艾默德斯明显抑制了MDA-MB-231细胞和4T1细胞的克隆形成。

实验例3

根据实验例1的IC50数据，确定艾默德斯在后续研究的给药浓度(在MDA-MB-231细胞中分别为5μM/l和15μM/l，在4T1细胞中分别为15μM/l和25μM/l)，进行划痕实验：

(1)准备干净的6孔板，用marker笔在底部笔直地画三条与长边平行的线。胰酶消化细胞，计数后用完全培养基将细胞悬液稀释，配制成浓度为5×10⁵的细胞悬液，加入6孔板，每孔加2ml，使每孔的细胞数为10⁶个。

(2)24小时后，细胞贴壁，融合程度达到100％。用200μl枪头垂直于孔底，沿着与长边垂直的方向快速划线，一个孔共计画三条线。用PBS溶液洗涤3遍。加入2ml含不同浓度药物的无FBS培养基。使用倒置显微镜4倍物镜，在每个划痕和marker笔相交点的上缘拍照，记录每张照片的位置信息。

(3)24小时后，吸弃含药物的旧培养基，PBS溶液洗涤3次，加入新鲜的不含FBS的培养基。再次在倒置显微镜下，与上述相同的位置拍照。划痕后48小时，再次用相同的方法拍照。实验重复3次。

Image J软件分析划痕在不同时间点的面积，计算划痕修复率，绘制柱状图。

实验结果如图3所示。由图3可知，对于MDA-MB-231细胞，在划痕后24h，空白对照组的划痕修复率为19.59％，低浓度艾默德斯组为4.29％，高浓度艾默德斯组为-1.68％。在划痕后48小时，空白对照组的划痕修复率为37.83％，低浓度艾默德斯组为0.45％，高浓度艾默德斯组为-7.88％。对于4T1细胞，在划痕后24h，空白对照组划痕修复率为14.37％，低浓度艾默德斯组为1.88％，高浓度艾默德斯组为-12.35％。在划痕后48小时，空白对照组划痕修复率为28.60％，低浓度艾默德斯组为5.55％，高浓度艾默德斯组为-21.62％。

可见，艾默德斯显著抑制了MDA-MB-231和4T1细胞的横向迁移运动能力。且与对照组相比，划痕后24小时和48小时，低浓度艾默德斯组的划痕修复率降低。高剂量组因细胞死亡过多，甚至出现划痕增大。

实验例4

Transwell迁移实验：

(1)消化细胞并计数，配制成浓度为1×10⁵的细胞悬液。加入事先准备好的6孔板，每孔中加入2ml。

(2)24小时后细胞贴壁，吸弃旧培养基，PBS溶液洗涤3遍后加入2ml含不同浓度药物的无FBS培养基。24小时后吸弃含药物的旧培养基，PBS溶液洗涤3遍，消化收集细胞，计数细胞，用无FBS的培养基重悬成浓度5×10⁵的细胞悬液。加入适量5％的BSA溶液使BSA浓度保持在0.05％-0.2％之间，以确保渗透压与完全培养基一致。

(3)取100μl上述细胞悬液加入Transwell小室中，放置在24孔板上，相应的下室加入500μl完全培养基。

(4)15小时后取出小室，吸弃液体，将小室底部的聚碳酸酯膜放入4％组织细胞固定液中，室温固定。30分钟后取出小室，用PBS溶液清洗1次，放入结晶紫染液中，染色30分钟。

取出Transwell小室，用PBS溶液轻柔地清洗2遍，用干净的棉签擦拭小室聚碳酸酯膜的内面，放在显微镜下观察并拍照。实验重复3次。

实验结果如图4所示。由图4可知，在细胞接种15小时后，空白对照组细胞可穿越聚碳酸酯膜，证明MDA-MB-231细胞和4T1细胞均具有较强的细胞迁移能力。对于MDA-MB-231细胞，空白对照组的细胞平均迁移数为542，低剂量艾默德斯组为172，高剂量艾默德斯组为45.3。对于4T1细胞，空白对照组的细胞平均迁移数为145.7，低剂量艾默德斯组为55，高剂量艾默德斯组为15.7。

划痕实验和Transwell迁移实验共同证明，艾默德斯可明显抑制TNBC细胞的迁移能力。

实验例5

Transwell侵袭实验：

(1)解冻基质胶，用无FBS的完全培养基稀释50倍，加入Transwell小室的聚碳酸酯膜上，每室加入100μl。放入37℃培养箱中2小时。全程冰上操作，枪头提前放入4℃冰箱预冷。

(2)细胞铺板，药物处理细胞，小室内外加样：操作同Transwell侵袭实验。

20小时后取出小室，洗涤、固定、染色和拍照，操作同Transwell侵袭实验。实验重复3次。

实验结果如图5所示。由图5可知，在细胞接种20个小时后，空白对照组细胞能够穿越小室底部的基质胶和聚碳酸酯膜，证明MDA-MB-231细胞和4T1细胞均具有较强的细胞侵袭能力。对于MDA-MB-231细胞，空白对照组的细胞平均侵袭数为89，低剂量艾默德斯组为46.7，高剂量艾默德斯组为28.7。对于4T1细胞，空白对照组的细胞平均侵袭数为104，低剂量艾默德斯组为20.3，高剂量艾默德斯组为17.3。

总之，艾默德斯处理后，TNBC细胞的侵袭能力明显降低，且呈现浓度依赖性。

实验例6

流式AnnexinV/PI细胞凋亡实验：

(1)消化细胞，配制细胞浓度为5×10⁴的细胞悬液，铺板，在6孔板的每个孔中加入2ml混合均匀的细胞悬液。

(2)24小时后细胞贴壁，细胞融合度约为60％。吸弃旧培养基，用PBS溶液轻柔地洗涤3次后，加入2ml含不同浓度药物的完全培养基。

(3)24小时后，收集上清培养基到15ml离心管，用预冷的PBS溶液洗涤培养皿中的细胞3次，加入胰酶消化，终止消化后收集细胞悬液到上述15ml离心管中。1000rpm，3分钟离心。吸弃上清液，加入PBS溶液2ml吹打混匀，再次1000rpm，3分钟离心。吸弃上清液，加入1×buffer，计数细胞，使细胞浓度为1×106，取100μl上述细胞悬液，加入5μlAnnexinV-FITC和5μl PI，室温避光孵育15分钟。

(4)加入400μl 1×buffer，吹吸混匀，然后用300目细胞筛网过滤细胞悬液，在1小时内上流式分析仪进行分析。实验需重复进行3次。

使用Flow Jo_V10软件分析结果。

实验结果如图6所示。由图6可知，对于MDA-MB-231细胞，空白对照组细胞有约1.97％发生凋亡，其中以晚期凋亡为主。加入艾默德斯后，细胞凋亡率显著增加，早期凋亡细胞增加更加明显。随着艾默德斯浓度增加，TNBC细胞凋亡率随之增加，低剂量组和高剂量组分别为3.87％和4.94％。

对于4T1细胞，空白对照组细胞有约1.90％发生凋亡，同样以晚期凋亡为主。加入艾默德斯刺激后，4T1细胞凋亡率显著增加，早期凋亡细胞增加更加明显。加大艾默德斯浓度，细胞凋亡率亦增加，低剂量组和高剂量组分别为5.68％和14.94％。

以上结果证明，艾默德斯明显促进了MDA-MB-231细胞和4T1细胞凋亡。

实验例7

小鼠皮下移植瘤实验：

(1)实验准备6周龄BALB/c雌鼠，随机分成4组：溶剂对照组、环磷酰胺组、低剂量和高剂量艾默德斯组，每组6只小鼠。在准备注射肿瘤细胞的前一天给4T1细胞更换新鲜的完全培养基，保证细胞处于对数生长期。种瘤当日，取出4T1细胞，PBS溶液洗涤后胰酶消化，1000rpm，3分钟离心后吸弃上清液，加入2ml预冷的PBS溶液。轻柔地吹打混匀细胞，再次1000rpm，3分钟离心，吸弃上清液，计数细胞，配制浓度为1×10⁷的细胞悬液，置于冰上，在1个小时内完成细胞注射。

(2)提前用电动剃毛刀备皮，选择小鼠腋下的血流丰富的位置。给每只小鼠腹腔注射100μl戊巴比妥钠，麻醉小鼠。用75％的酒精棉球擦拭裸露的皮肤，混匀细胞悬液，1ml一次性注射器吸入悬液后排空管内残余空气，倾斜进针，向前走针约1cm，每只小鼠注射100μl细胞悬液。注射完毕，缓慢退出注射器针头，避免从针孔处漏液。

(3)将小鼠放回饲养笼，密切观察小鼠的麻醉清醒时间，待看到小鼠苏醒且活动正常后，离开动物房。每日观察小鼠的饮食、活动情况和体重变化。观察种瘤部位有无肿瘤形成，有无感染或破溃。

(4)接种第12天接种部位出现明显的质硬结节，予以每组小鼠口服不同的溶液：溶剂或不同浓度的艾默德斯。予以环磷酰胺组小鼠腹腔注射100mg/kg的环磷酰胺。每日用游标卡尺测量肿瘤大小，包括最长径a和最短径b，根据公式体积V＝a×b²/2计算肿瘤体积。每日用电子秤称量每只小鼠的体重，注意观察小鼠的精神状态，活动能力及运动的平衡性。

(5)15天后处死小鼠，取瘤观察形态，测量肿瘤大小，称量肿瘤重量，拍照。

实验结果如图7所示。由图7可知，体内实验结果表明，2.5mg/kg和5mg/kg的艾默德斯对4T1细胞构建的小鼠移植瘤模型，均具有明显的抑制肿瘤生长作用。在用药后15天，移植瘤肿瘤出现有统计学意义的差异，显示艾默德斯具有长时间抑制小鼠TNBC移植瘤生长的作用。且艾默德斯用药后，小鼠体重出现一过性下降，但所有小鼠体重均在1周内恢复正常，没有出现死亡、步履蹒跚、运动能力下降等不良反应。

综上可知，5μM/l和15μM/l的艾默德斯可以显著抑制MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进其凋亡。15μM/l和25μM/l的艾默德斯可以显著抑制4T1细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进其凋亡。且艾默德斯对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系增殖、迁移和侵袭能力的影响呈现浓度依赖性。在小鼠体内，艾默德斯具有良好的抑瘤性，同时具有较好的安全。这表明，艾默德斯在治疗三阴性乳腺癌方面有良好的应用前景和巨大的药物开发价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.艾默德斯在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。

2.艾默德斯在制备抑制三阴性乳腺癌细胞增殖的试剂中的应用。

3.艾默德斯在制备抑制三阴性乳腺癌细胞迁移的试剂中的应用。

4.艾默德斯在制备抑制三阴性乳腺癌细胞侵袭的试剂中的应用。

5.艾默德斯在制备促进三阴性乳腺癌细胞凋亡的试剂中的应用。

6.艾默德斯在制备抑制三阴性乳腺癌细胞异体移植瘤生长的试剂中的应用。

7.根据权利要求1～6任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物或试剂的剂型包括注射剂或口服液。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物或试剂还含有药学上可接受的辅料。

9.根据权利要求1～6任意一项所述的应用，其特征在于，所述艾默德斯的作用浓度为15μM/l或25μM/l。