CN115369183A - 西瓜种皮厚度紧密连锁snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种西瓜种皮厚度紧密连锁的SNP分子标记及其应用，旨在解决对西瓜果种皮厚度基因缺乏识别、鉴定方法的技术问题。本发明提供了一种西瓜种皮厚度紧密连锁的SNP位点（西瓜基因组6号染色体第7046144bp处碱基由T突变为C），基于SNP位点的酶切信息设计了dCAPS分子标记引物N6‑32。应用该标记进行分子标记辅助选择育种，能以更快速、准确的进行西瓜种皮厚度的定向遗传改良；通过简便的实验操作和分析即可快速鉴定西瓜果实大小，为西瓜种皮厚度性状的检测提供了快速、简便、科学实用的检测鉴定技术。
Description
技术领域
本发明涉及西瓜分子标记辅助育种领域技术领域，具体涉及一种西瓜种皮厚度紧密连锁SNP分子标记及其应用。
背景技术
西瓜（Citrullus lanatus）是世界十大水果之一，因其汁多味美，富含瓜氨酸、类胡萝卜素、番茄红素等对人体有益的功能营养成分而成为深受人们喜爱的时令水果。然而西瓜果实中的籽粒影响食用体验；因而西瓜种子性状，如种子大小和数量，皆是西瓜新品种选育时重点考察的性状。选育种子小、种子数量少的品种有利于提高西瓜果瓤的食用率，且方便消费者食用。目前主要基于染色体加倍技术而创制的无籽西瓜种子存在明显的“三低”问题（李涵等，2014），加上其果实成熟普遍较晚、需配授粉品种等缺点，制约了无籽西瓜在生产上的全面推广。如能培育出种子可食用的软籽西瓜，像软籽石榴一样咀嚼后吞咽没有障碍，无需吐籽，将是西瓜育种的一个重大突破。
另一方面，西瓜种子是优质的蛋白质和植物油资源(王晓娟，2012)，对人体有重要的保健功能。对于鲜食西瓜而言，厚的种皮是种子的天然保护屏障，但也是种子不能直接食用的主要原因。黏籽西瓜（Citrullus Mucosospermus）是与现代栽培西瓜亲缘关系最近的种群（Guo et al., 2019），部分种质种子外仅包裹着浅黄褐色近乎透明的种皮，种皮厚度仅为普通西瓜种皮厚度的1/3。如能获得可用于辅助育种的分子标记辅助薄种皮品种的选育，将薄种皮种子和果肉一起作为食用对象，最终实现吃瓜不吐籽的创新育种目标（软籽西瓜），具有重要的科学与现实意义。因此，亟待开发一种与西瓜种皮厚度紧密连锁的、易于操作的、鉴定效率高的、成本较低的分子标记，以期可为西瓜种皮厚度基因精细定位和分子鉴定研究提供高效的技术手段。
公开于该背景技术部分的信息仅用于加深对本公开的背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。
发明内容
鉴于以上技术问题中的至少一项，本公开提供了一种西瓜种皮厚度紧密连锁的SNP位点（基于西瓜97103参考基因组序列V2版，西瓜基因组6号染色体第7046144bp处碱基由T突变为C），基于SNP位点的酶切信息设计了dCAPS分子标记引物N6-32。
根据本公开的一个方面，提供一种西瓜果种皮厚度基因紧密连锁的SNP分子标记，基于西瓜97103参考基因组V2版，位于6号染色体7046144bp处的碱基由厚种皮性状的T突变为薄种皮性状的C。
根据本公开的另一个方面，提供一种检测试剂盒，包括NlaIII限制性内切酶及如下引物N6-32：
正向引物N6-32F：5’- TAATAGGGAAGAGTAGAGGG -3’；
反向引物N6-32R：5’- TAAACCAAACACAAGCCAT -3’。
根据本公开的另一个方面，将所述SNP分子标记或所述检测试剂盒应用于西瓜种皮厚度性状品种/系选育中。
根据本公开的另一个方面，提供一种鉴定西瓜种皮厚度基因型的方法，包括如下步骤：
（1）提取待鉴定西瓜总DNA后以所述引物N6-32进行PCR扩增：
（2）以NlaIII限制性内切酶酶切上步所得PCR产物；
（3）对所得酶切产物进行电泳图谱分析，基于所述扩增产物的条带大小及位置关系确定所属基因型，其中，出现单一条带391bp或两条带391bp与375bp则为厚种皮基因型，出现单一条带375bp则为薄种皮基因型。
在本公开的一些实施例中，在所述步骤（1）中，利用植物基因组DNA提取试剂盒TIANGEN提取待鉴定西瓜叶片总DNA。
在本公开的一些实施例中，在所述步骤（1）中， PCR扩增体系为：西瓜叶片总DNA 1μL、所述正向引物N6-32F 1μL、所述反向引物N6-32R 1μL、2× Power Taq PCR MasterMix12.5μL、ddH2O 9.5μL；扩增程序为：94℃ 5 min，35个循环的94℃ 30s、52℃ 30s、72℃ 30s，72℃ 10min。
在本公开的一些实施例中，在所述步骤（2）中，酶切反应体系为：PCR产物2μl，NlaIII限制性内切酶0.2μl，10×buffer 1μl，ddH2O 6.8μl；反应程序为：37℃恒温处理10h，65℃灭活20min。
本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下任一技术效果或优点：
1. 筛选得到一个西瓜种皮厚度紧密连锁的分子标记，应用该标记进行分子标记辅助选择育种，能以更快速、准确的进行西瓜种皮厚度的定向遗传改良。
2. 在不同种皮厚度的西瓜回交群体中进行了鉴定应用，其基因型准确率为100%，可为鉴定西瓜种皮厚度提供新手段，提高育种的准确性和选择效率。
3. 通过简便的实验操作和分析即可快速鉴定西瓜的种皮厚度基因型，为西瓜种皮厚度性状的检测提供了快速、简便、科学实用的检测鉴定技术。
附图说明
图1为本申请一实施例中的西瓜种皮厚度性状QTL定位结果。
图2为本申请一实施例中的分子标记N6-32的引物在西瓜B3(母本)、B4(父本)及部分BCF2群体中的PCR产物酶切结果图；其中，A：母本基因型，B：父本基因型，H：杂合基因型，M：marker；方框内分别为母本、父本条带。
具体实施方式
为了更好的理解本申请技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例一：西瓜种皮厚度紧密连锁SNP位点的确定及分子标记的开发
对不同类型的西瓜材料进行简化基因组测序，结合群体多态性的差异确定群体间的受选择区域，获得与西瓜种皮厚度相关的染色体区间，利用亲本材料的深度重测序筛选目标染色体区间内的SNP位点，并设计CAPS/dCAPS分子标记引物，再利用CAPS/dCAPS分子标记引物及西瓜基因组DNA进行PCR扩增，最后对扩增产物酶切后利用电泳进行验证。所述各个供试材料均为中国农业科学院郑州果树研究所中国西瓜甜瓜中期库保存的创新种质材料。
具体步骤如下：
1. 西瓜种皮厚度主效QTL区间初步定位
利用黏籽西瓜母本B3（中国农业科学院郑州果树研究所中国西瓜甜瓜中期库编号ZXG01562）和父本B4（母本编号ZXG01562，父本编号ZXG01625，母本与父本杂交回交并自交选纯系）杂交获得F1，后F1与B3回交获得BC1群体构建的高密度的遗传连锁图谱，对父母本、F1和BC1群体的99个单瓜进行种皮厚度的直观鉴定；结合遗传连锁图谱和BC1群体表型鉴定结果，利用R/qtl-CIM方法进行QTL初定位，鉴定到种皮厚度的主效QTL。该QTL位于6号染色体上，其LOD峰值为27.19，解释95.96%的表型变异，置信区间为4258103bp-12820185bp（参见图1）。
2. 西瓜种皮厚度SNP位点及的dCAPS标记的开发
（1）利用植物基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN）提取B3、B4西瓜叶片总DNA，具体步骤如下：
①取植物新鲜组织100 mg或干重组织20 mg，加入液氮充分碾磨。加入400 μl缓冲液FGA和6 μl RNase A（10 mg/ml），旋涡振荡1 min，室温放置10 min。
②加入130 μl缓冲液LP2，充分混匀，旋涡振荡1 min。
③12,000 rpm（~13,400×g）离心5 min，将上清移至新的离心管中。
④加入1.5倍体积的缓冲液LP3(例如500 μl的滤液加750 μl缓冲液LP3) (使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，立即充分振荡混匀15 sec，此时可能会出现絮状沉淀。
⑤将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm（~13,400×g）离心30 sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。
⑥向吸附柱CB3中加入600 μl 漂洗液PW (使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(~13,400×g)离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑦重复操作步骤⑥。
⑧将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm (~13,400×g) 离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
⑨将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加200 μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5 min，12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，将溶液收集到离心管中。
⑩用紫外分光光度计测定DNA的浓度，并于-20℃冰箱中保存备用。
（2）鉴定西瓜种皮厚度的dCAPS标记引物的设计
利用父本和母本西瓜材料的深度重测序筛选目标染色体区间存在的SNP突变位点，该位点位于西瓜基因组6号染色体7046144bp处，其碱基由T突变为C。
分析SNP位点的突变信息，获得存在CAPS/dCAPS突变的序列，将该西瓜种皮厚度的特异dCAPS分子标记命名为N6-32，设计dCAPS分子标记引物：
正向引物N6-32F：5’- TAATAGGGAAGAGTAGAGGG -3’；
反向引物N6-32R：5’- TAAACCAAACACAAGCCAT -3’；
采用的限制性内切酶为NlaIII。
（2）PCR反应体系和程序
反应体系：100 ng/μL西瓜植株总DNA 1μL、dCAPS分子标记上游引物N6-32F1 μL、下游引物N6-32R 1 μL、2×Power Taq PCR MasterMix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL；反应程序为：94℃ 5 min，35个循环的94℃ 30 s、52℃ 30s、72℃ 30 s，72℃ 10min；
（3）酶切反应体系和程序：
反应体系为：PCR产物2μl，NlaIII限制性内切酶0.2μl，10×buffer 1μl，ddH2O6.8μl；
反应程序为：37℃恒温处理10h，65℃灭活20min；
（4）对酶切产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读。
A. 试剂配制
① 5× TBE电泳缓冲液：称取Tris 26 .95g，EDTA 1 .86g，硼酸13 .75g，去离子水定容至500mL；
② 40％聚丙烯酰胺溶液：聚丙烯酰胺77 .34g，甲叉双丙烯酰胺2.66g，去离子水定容至200mL；
③ 8％聚丙烯酰胺凝胶：40％聚丙烯酰胺溶液10ml；5×TBE 5mL；10％过硫酸铵(APS)200μL；四甲基乙二胺(TEMED)80μL；蒸馏水22mL；
④ 银染液：硝酸银1g；冰醋酸5mL；无水乙醇50mL；加去离子水定容至500mL；
⑤显影液：氢氧化钠15g；甲醛(37％)2.5mL；加去离子水定容至500mL。
（5）凝胶板准备：凝胶玻璃板用蒸馏水洗净、晾干后，用浸泡过无水乙醇的脱脂棉球擦拭，晾干。将凹板和平板叠合紧密后放入制胶器中压紧并扣好其两边的夹子，凹形玻璃向内侧。在洗瓶内配制8％聚丙烯酰胺凝胶溶液，混匀后快速注入两板中间的缝隙内，并注意防止有气泡产生，注满后迅速插入有齿的梳子，梳子底部与胶面刚好接触为宜，等待溶液充分凝固。
（6）电泳：将制胶器支架从底座上取下，直接放入配套的电泳槽中，在电泳槽底部及支架上两块玻璃板中间倒入适量的1×TBE缓冲液。在PCR产物中加入0.2倍体积的6×DNA Loading Buffer，混匀后取0.8μL加入点样孔内，260V电泳35min。
（7）染色和显影：电泳完成后，从电泳槽中取出玻璃板，撬去凹板，凝胶会贴附于平板上，凝胶面向上将平板放入银染液中，置于脱色摇床上轻摇15min，凝胶会自动脱落下来；银染完毕后，将凝胶取出放入去离子水中清洗10s；清洗完毕后将凝胶转入显影液中，轻摇摇床，待条带清晰后取出凝胶，放置在阅片器上观察并拍照保存。
（8）带型判读：将显影后自然干燥好的玻璃板置于阅片台上，观察父母本以及BC群体条带的位置差异。
利用N6-32分子标记在母本B3和父本B4中的基因型鉴定的结果如图2所示，酶切后B3目的片段大小为375bp一条带，B4目的片段大小为391bp。酶切产物条带为375bp一条带（A）为薄种皮类型，酶切产物条带为391bp（B）的为厚种皮西瓜类型，产物条带为375和391bp两条带（H）的为厚种皮西瓜类型。
实施例二：BCF2群体种皮厚度基因型验证分析
表1 N6-32在BCF2群体中的鉴定和验证
经实施例一进行N6-32分子标记在由B3和B4构建BCF2群体中的基因型鉴定后，检查N6-32分子标记的三种基因型在99个BCF2群体中的分布情况，发现N6-32基因型与西瓜种皮厚度表型完全共分离。结果如表1所示，其中A代表母本带型，B代表父本带型，H代表杂合基因型。
分子标记N6-32的基因型为A的28个株系全部是薄种皮西瓜类型，而基因型为B的16个和H的55个株系均是厚种皮西瓜类型，其基因型鉴定的准确率为100%。
尽管已描述了本发明的一些优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本申请权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (7)
1.一种西瓜种皮厚度紧密连锁SNP分子标记，其特征在于，基于西瓜97103参考基因组V2版，位于6号染色体7046144bp处的碱基由厚种皮性状的T突变为薄种皮性状的C。
2.一种检测试剂盒，其特征在于，包括NlaIII限制性内切酶及如下引物N6-32：
正向引物N6-32F：5’- TAATAGGGAAGAGTAGAGGG -3’；
反向引物N6-32R：5’- TAAACCAAACACAAGCCAT -3’；。
3.权利要求1所述SNP分子标记或权利要求2所述检测试剂盒在西瓜种皮厚薄品种/系选育中的应用。
4.一种鉴定西瓜种皮厚度基因型的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提取待鉴定西瓜总DNA后，以权利要求2中所述引物N6-32进行PCR扩增：
（2）以限制性内切酶NlaIII酶切上步所得PCR产物；
（3）对所得酶切产物进行电泳图谱分析，基于所述扩增产物的条带大小及位置关系确定所属基因型，其中，出现单一条带391bp或两条带391bp与375bp则为厚种皮基因型，出现单一条带375bp则为薄种皮基因型。
5.根据权利要求4所述的鉴定西种皮厚度基因型的方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，利用植物基因组DNA提取试剂盒TIANGEN提取待鉴定西瓜叶片总DNA。
6.根据权利要求4所述的鉴定西瓜种皮厚度基因型的方法，其特征在于，在所述步骤（1）中， PCR扩增体系为：西瓜叶片总DNA 1μL、所述正向引物N6-32F 1μL、所述反向引物N6-32R 1μL、2× Power Taq PCR MasterMix 12.5μL、ddH2O 9.5μL；扩增程序为：94℃ 5 min，35个循环的94℃ 30s、52℃ 30s、72℃30 s，72℃ 10min。
7.根据权利要求4所述的鉴定西瓜种皮厚度基因型的方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，酶切反应体系为：PCR产物2μl，NlaIII限制性内切酶0.2μl，10×buffer 1μl，ddH2O6.8μl；反应程序为：37℃恒温处理10h，65℃灭活20min。
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