CN115281258A - 一种香灰菌发酵茶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种香灰菌发酵茶的制备方法，所述香灰菌株为暗色环纹炭团菌(Annulohypoxylon stygium)Gxun.10030，于2021年11月19日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.23847。本发明包括：(1)菌株的驯化：香灰菌依次通过茶汤培养基、茶叶培养基驯化培养10代后，得到适应茶叶生长的菌株。(2)发酵茶的制备：将上述驯化后的香灰菌接种在只含水和茶叶的培养基中，在避光、一定的温度和湿度条件下共培养，待香灰菌菌丝可完全覆盖茶叶培养基，35℃下烘干12小时即得香灰菌发酵茶。本发明以茶叶为主要原料，经与香灰菌可控发酵，得到的香灰菌发酵茶汤色红润、香气纯正、口感回甘、味道醇厚、品质优异，是一种良好的保健饮品。

Description

一种香灰菌发酵茶的制备方法

技术领域

本发明属于香灰菌发酵茶的制备方法，属于食品加工技术领域，尤其涉及在人工培养条件下，将茶叶与香灰菌在一定的条件下共发酵制备成香灰菌发酵茶的制备方法。

背景技术

香灰菌是银耳的伴生菌，资源丰富，遗传差异大，因其本身含有香气物质得名，目前关于香灰菌的分类地位尚未完全确立。有学者认为香灰菌可能是绿粘帚霉，是炭团菌属的无性阶段。香灰菌富含蛋白质、多糖、矿物元素、氨基酸、黑色素，凝结素等物质，营养价值高，具有抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂等功效。

茶是世界上最受欢迎的饮料之一。茶叶中含有相对较多的化学物质，如咖啡碱和维生素等，可以加速脂肪的氧化。发酵是茶叶生产过程中的关键因素，经过发酵会改变茶叶的化学成分，影响了茶叶的感官和品质。通过发酵不仅会影响茶的气味，改善其口感和余味，还会减少茶的涩味和苦味，使茶的味道变得更醇厚。另外，在发酵过程中，微生物可以提高茶叶的撕裂速度和质量稳定性，产生有益于健康的次生代谢产物。

目前，未见香灰菌用于发酵茶的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种香灰菌发酵茶的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明可以通过如下措施来达到：

香灰菌先后经过茶汤培养基驯化阶段和茶叶培养基驯化阶段。

茶汤培养基驯化阶段为利用茶汤培养基对香灰菌进行生长驯化5代，通过逐步降低培养基中蔗糖的含量，使香灰菌能够在不含蔗糖的茶汤培养基上生长良好；所述茶叶培养基驯化阶段为利用茶叶培养基对已经茶汤培养基驯化阶段后的香灰菌继续进行生长驯化5代，通过逐步降低培养基中蔗糖的含量，使香灰菌能够在不含蔗糖的茶叶培养基上生长良好，得到适应茶叶生长的菌株。

茶汤培养基配方为：100g茶叶，0～10g蔗糖，琼脂20g，1000mL蒸馏水；茶叶培养基配方为：30g茶叶/组培瓶、0～2.0％蔗糖溶液。

香灰菌发酵茶制备：称取茶叶放于培养瓶中，在茶叶中加入茶叶干重的30％～90％的蒸馏水，121℃条件下灭菌30min；将驯化获得的香灰菌用打孔器打孔菌龄相同的1.5cm菌块接种在上述茶叶培养基中，在21℃～30℃条件下避光培养7～20天，待菌丝完全覆盖茶叶培养基，35℃下烘干12小时即得香灰菌发酵茶。

茶叶为绿茶、红茶、白茶、黄茶或代用茶。

真菌在茶叶发酵过程中起着重要作用，发明人首次将香灰菌与茶叶共发酵培养，研制了一种香灰菌发酵茶。本发明在不添加任何培养辅料的前提下，以茶叶作为香灰菌生长的培养基，整个过程无外来污染物，产品经过小鼠急性经口毒试验研究，保证了产品的安全性。本发明将木质素、纤维素为主的茶叶，经香灰菌发酵转化为人体可食用或直接吸收的丰富的微生物真菌营养蛋白及营养成分，富含多糖、氨基酸、非饱和脂肪酸和矿物元素等；同时转化了造成茶叶涩味的多酚类物质，提高了茶红素、茶褐素的含量。采用此技术制备得到的香灰菌发酵茶汤色红润、香气纯正、口感回甘、味道醇厚、品质优异，是一种良好的保健饮品。

附图说明

图1为F1-F5代香灰菌分别利用含0％、0.25％、0.5％、0.75％、1％蔗糖的茶汤培养基驯化培养后菌株的生长速度结果图。

图2为F6-F10代香灰菌分别利用含0％、0.5％、1％、1.5％、2％蔗糖溶液的茶叶培养基驯化培养后菌株长满组培瓶所需天数结果图。

图3为实施例1中香灰菌发酵绿茶结果图。

图4为实施例2中香灰菌发酵红茶结果图。

图5为实施例3中香灰菌发酵白茶结果图。

具体实施方式

一、香灰菌菌种准备

1.1材料准备：

选择培养28～33d，子实体直径7～8cm的银耳菌棒，具有朵形圆正、耳片白且厚，香灰菌丝生长有力的特征，同时培养料表面黑色素分布均匀，无病虫害。

分离纯化培养基：GPY培养基(葡萄糖20g，蛋白胨6g，酵母浸粉10g，琼脂18g，蒸馏水1000mL)。

1.2菌株的分离纯化鉴定

在无菌条件下，从银耳菌棒远离基质块的培养料中直接钩取约0.5mm3菌丝块至表面无积水的GPY培养基上，于23±2℃温度下培养7～10d，在无菌条件下，挑取菌落边缘约0.5mm3菌丝块至表面无积水的GPY培养基上，于23±2℃温度下培养7～10d，得到纯培养的香灰菌。

对分离纯化得到的菌株，转接到GPY培养基上培养5～7d后观察菌落形态；将GPY平板上的香灰菌丝刮下后提DNA，0.8％的琼脂糖凝胶检测提取的DNA。基于ITS序列，通过PCR扩增真菌的5.8S rDNA序列。将获得的序列在NCBI数据库中进行BLAST比对。经形态和分子生物学鉴定，最终由广西民族大学姜明国教授定名为暗色环纹炭团菌(Annulohypoxylonstygium)Gxun.10030，于2021年11月19日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.23847。

1.3菌株的驯化

将经分离纯化鉴定得到的香灰菌直接接种至30g/组培瓶灭过菌的茶叶中，发现香灰菌在茶叶上很难生长，长满需要40天，通过茶汤培养基、茶叶培养基驯化培养10代后，在相同条件下，香灰菌长满茶叶只需9天，大大提高了香灰菌的生长速度。

1.3.1茶汤培养基驯化阶段

该阶段驯化能使香灰菌从GPY培养基阶段快速适应主要由茶叶成分组成的培养基，使香灰菌能在茶叶上更快生长。

茶汤培养基配方：100g茶叶，0～10g蔗糖，琼脂20g，1000mL蒸馏水；制法：将茶叶和蒸馏水混合煮开，过滤掉茶叶渣，分别加入0％、0.25％、0.5％、0.75％、1％的蔗糖，加入琼脂，灭菌锅中121℃灭菌30min，倒平板，冷却。

将生长在GPY培养基上的香灰菌，接种到含有1％蔗糖的茶汤培养基中，置于23℃～25℃中培养，待香灰菌长满整个平板。此为F1代的驯化培养。

将F1代的驯化培养的香灰菌，接种到含有0.75％蔗糖的茶汤培养基中，置于23℃～25℃中培养，待香灰菌长满整个平板。此为F2代的驯化培养。

将F2代的驯化培养的香灰菌，接种到含有0.5％蔗糖的茶汤培养基中，置于23℃～25℃中培养，待香灰菌长满整个平板。此为F3代的驯化培养。

将F3代的驯化培养的香灰菌，接种到含有0.25％蔗糖的茶汤培养基中，置于23℃～25℃中培养，待香灰菌长满整个平板。此为F4代的驯化培养。

将F4代的驯化培养的香灰菌，接种到不含蔗糖的茶汤培养基中，置于23℃～25℃中培养，待香灰菌长满整个平板。此为F5代的驯化培养。

香灰菌在茶汤培养基驯化阶段生长速度如图1，由实验结果可知香灰菌平均生长速度稳步上升，说明菌株已逐渐适应茶汤的培养环境，驯化已取得成效。

1.3.2茶叶培养基驯化阶段

茶叶培养基配方：30g茶叶/组培瓶、0％、0.5％、1％、1.5％、2％的蔗糖溶液。

将F5代的驯化培养的香灰菌，接种到含有2％蔗糖的茶叶培养基中，置于23℃～25℃中培养，待香灰菌长满整个组培瓶。此为F6代的驯化培养。

将F6代的驯化培养的香灰菌，接种到含有1.5％蔗糖的茶叶培养基中，置于23℃～25℃中培养，待香灰菌长满整个组培瓶。此为F7代的驯化培养。

将F7代的驯化培养的香灰菌，接种到含有1％蔗糖的茶叶培养基中，置于23℃～25℃中培养，待香灰菌长满整个组培瓶。此为F8代的驯化培养。

将F8代的驯化培养的香灰菌，接种到含有0.5％蔗糖的茶叶培养基中，置于23℃～25℃中培养，待香灰菌长满整个组培瓶。此为F9代的驯化培养。

将F9代的驯化培养的香灰菌，接种到不含蔗糖的茶叶培养基中，置于23℃～25℃中培养，待香灰菌长满整个组培瓶。此为F10代的驯化培养。

香灰菌在茶叶培养基驯化阶段长满组培瓶所需天数如图2，由实验结果可知香灰菌长满组培瓶所需天数越来越短，说明菌株已逐渐适应茶叶的培养环境，得到适应茶叶生长的菌株。

为方便研究和使用，驯化完成的菌种保存备用，后续即可跳过复杂的菌种分离纯化驯化步骤。

1.3.3菌株驯化效果验证

配置不含蔗糖的茶叶培养基，使用未驯化的香灰菌株与驯化后的香灰菌株进行对比实验，将二者接种至茶叶培养基中23℃～25℃培养9天，对比生长状况。实验结果表明，未经驯化的原始香灰菌株还处于菌种萌发阶段，而经驯化后的香灰菌株可以快速在茶叶培养基上生长，菌丝可完全覆盖茶叶培养基。由此证明经过驯化后的香灰菌株可在茶叶培养基上快速生长。

二、香灰菌发酵茶的制备

实施例1

香灰菌发酵绿茶的制备：称取绿茶放于组培瓶中，在绿茶中加入绿茶干重的60％的蒸馏水，121℃条件下灭菌30min；将驯化获得的香灰菌用打孔器打孔菌龄相同的1.5cm菌块接种在上述茶叶培养基中，在25℃条件下避光培养7天，待菌丝完全覆盖茶叶培养基，35℃下烘干 12小时即得香灰菌发酵绿茶(图3)。

实施例2

香灰菌发酵红茶的制备：称取红茶放于培养瓶中，在红茶中加入红茶干重的70％的蒸馏水，121℃条件下灭菌30min；将驯化获得的香灰菌用打孔器打孔菌龄相同的1.5cm菌块接种在上述茶叶培养基中，在25℃条件下避光培养10天，待菌丝完全覆盖茶叶培养基，35℃下烘干12小时即得香灰菌发酵红茶(图4)。

实施例3

香灰菌发酵白茶的制备：称取白茶放于培养瓶中，在白茶中加入白茶干重的50％的蒸馏水，121℃条件下灭菌30min；将驯化获得的香灰菌用打孔器打孔菌龄相同的1.5cm菌块接种在上述茶叶培养基中，在27℃条件下避光培养11天，待菌丝完全覆盖茶叶培养基，35℃下烘干12小时即得香灰菌发酵白茶(图5)。

由于其它各组香灰菌发酵茶(黄茶、代用茶(银杏叶))样品与上述实施例1、2、3做法相似，在此不再重复叙述。

实施例4

实施例1-3制备的香灰菌发酵茶及其原料，对其茶红素和茶褐素的含量进行测定。依据 NY/T 3675-2020《红茶中茶红素和茶褐素含量的测定分光光度法》中的方法来检测香灰菌发酵茶中茶红素和茶褐素的含量。

1.方法：分光光度法。

(1)提取液制备：称取约0.4g(精确至0.001g)样品于50mL离心管中。加入20mL沸水后，置于沸水浴中浸提5min，期间不时振摇以保证料液充分接触。取出离心管稍加冷却后，于4500 r/min下离心10min，上清液转移至50mL容量瓶中。在残渣中分别再次加入20mL和10mL沸水，重复上述提取操作各1次，将上清液合并转移至同一50mL容量瓶中，冷却至室温后，定容至刻度。此为提取液。

(2)比色液A制备：准确吸取2mL提取液，置于25mL容量瓶，分别加入2mL饱和草酸溶液和6mL水，用95％乙醇定容至刻度，记为比色液A。

(3)比色液B制备：准确吸取10mL提取液，置于50mL离心管，加入正丁醇10mL，2500r/min连续式涡旋10min，4500r/min离心10min。转移至30mL分液漏斗，静置分层后将下层(水层)放至小烧杯中，准确吸取2mL，置于25mL容量瓶，加人2mL饱和草酸溶液和6mL水，用95％乙醇定容至刻度，记为比色液B。

(4)比色液C制备：准确吸取15mL提取液，置于50mL离心管，加人乙酸乙酯15mL，2500 r/min连续式涡旋10min，4500r/min离心10min。取上层(乙酸乙酯层)6mL，置于15mL离心管，加入25g/L碳酸氢钠溶液6mL，充分振摇30s，4500r/mim离心5min，取上层(乙酸乙酯层)4mL，置于25mL容量瓶，用95％乙醇定容至刻度，记为比色液C。

(5)测定：以95％乙醇为参比用1cm比色皿，于380mm处分别测定比色液A、比色液B、比色液C的吸光度值EA、EB、EC。各个样品平行重复进行3次。

2.测定结果

试样中茶红素和茶褐素含量分别按式(1)和式(2)计算：

式中：

X_TB——茶褐素的含量，单位为百分号(％)；

X_TR——茶红素的含量，单位为百分号(％)；

E_A——比色液A吸光度值；

E_B——比色液B吸光度值；

E_C——比色液C吸光度值；

m——称样质量，单位为克(g)；

w——干物质含量(质量分数)，单位为百分号(％)

16.944——罗勃兹(Roberts)经验系数。

表1各样品中茶红素、茶褐素的含量

从表1中可以看出，实施例1、实施例2和实施例3制备的香灰菌发酵茶中茶红素、茶褐素含量显著高于其原料。实施例1、实施例2和实施例3制备的香灰菌发酵茶汤色红润、香气纯正、口感回甘、味道醇厚。

实施例5

将实施例1～3制备的香灰菌发酵茶及其原料进行小鼠急性经口毒试验。

1.实验方法：

(1)试验系统选择依据及试验动物来源：本受试物为功能食品，按《保健食品检验与评价技术规范》、GB 15193.1-2014《食品安全国家标准食品安全性毒理学评价程序》的要求，选用SPF级昆明种小鼠进行最大耐受量(MTD)试验，试验小鼠由广西医科大学实验动物中心提供，生产许可证SCXK(桂)2014-0002。

(2)试验方法：试验动物小鼠重量18～22g，140只，雌雄各半。将动物随机分为对照组和6 个受试组，每组20只，进行急性经口毒性试验前，小鼠灌胃前隔夜禁食16h，不禁水，分别一次经口灌胃，对照组给予蒸馏水0.2mL/10g，受试组给药剂量为15000mg/(kg 00bw)(相当于成人拟用量的150倍)，灌胃2h后再进食。灌胃当日连续观察8h，其后每日观察2次，连续观察14天。

中毒症状观察指标：中枢神经系统和神经肌肉系统、植物神经系统、呼吸系统、泌尿生殖系统、皮肤和毛、眼、消化系统。记录动物中毒反应表现，症状出现的时间，消失的时间和死亡的时间。

病理组织学检查：所有的试验动物均在试验结束时进行解剖，观察各组织器官是否有改变，如出现体积、颜色、质地等改变时，记录并进行病理组织学检查。

2.实验结果

(1)一般状况及症状体征。灌胃给予受试物后，全部受试组小鼠一般状态良好，活动自如，进食、饮水正常、皮毛光泽、精神状态良好，未出现明显毒副反映和动物死亡。

(2)系统解剖肉眼观察。试验结束全部动物存活，解剖肉眼观察，所有动物心、肝、脾、肺、肾等主要脏器、器官表面光滑、色泽质地正常，胃、肠粘膜未见充血、出血等异常改变。

(3)急性毒性试验结果。小鼠给受试物后，连续观察14天，试验动物全部存活，最大耐受量 (MDT)＞15000mg/(kg·bw)，相当于成人每日平均拟用量6g[100mg/(kg·bw)]的150倍。实施例1～3制备的香灰菌发酵茶及其原料为无毒级。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的设计精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种香灰菌发酵茶，其特征在于是利用银耳的伴生菌香灰菌与茶叶进行固体发酵。

2.一种香灰菌发酵茶，其特征在于对权利要求1所述的香灰菌依次通过茶汤培养基、茶叶培养基驯化培养10代后，得到适应茶叶生长的香灰菌株。

3.一种香灰菌发酵茶，其特征在于将权利要求2所述的经驯化培养获得的香灰菌与茶叶在一定的培养条件下共发酵而得。

4.根据权利要求2所述的香灰菌发酵茶的制备方法，其特征在于所述茶汤培养基驯化阶段为：利用茶汤培养基对香灰菌进行生长驯化5代，通过逐步降低培养基中蔗糖的含量，使香灰菌能够在不含蔗糖的茶汤培养基上生长良好；所述茶叶培养基驯化阶段为利用茶叶培养基对已经茶汤培养基驯化阶段后的香灰菌继续进行生长驯化5代，通过逐步降低培养基中蔗糖的含量，使香灰菌能够在不含蔗糖的茶叶培养基上生长良好，得到适应茶叶生长的菌株。

5.根据权利要求3所述的香灰菌发酵茶的制备方法，其特征在于将权利要求2所述的驯化培养10代后获得的香灰菌接种至茶叶培养基中，在避光、适宜的温度和湿度的条件下共培养，待菌丝完全覆盖茶叶培养基，35℃下烘干12小时即得香灰菌发酵茶。

6.根据权利要求4所述的香灰菌发酵茶的制备方法，其特征在于所述茶汤培养基配方为：100g茶叶，0～10g蔗糖，琼脂20g，1000mL蒸馏水；所述茶叶培养基配方为30g茶叶/组培瓶、0～2.0％蔗糖溶液。

7.根据权利要求5所述香灰菌发酵茶的制备方法，其特征在于称取茶叶放于组培瓶中，在茶叶中加入茶叶干重的30％～90％的蒸馏水，121℃条件下灭菌30min；将权利要求2所述的驯化培养10代后的香灰菌接种在上述茶叶培养基中，在21℃～30℃条件下避光培养7～15天，待菌丝完全覆盖茶叶培养基，35℃下烘干12小时即得香灰菌发酵茶。

8.根据权利要求3所述香灰菌发酵茶的制备方法，其特征在于所述茶叶为绿茶、红茶、白茶、黄茶、代用茶。

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