CN115216551A - 一种检测对虾肝胰腺坏死性细菌的实时荧光定量检测试剂盒 - Google Patents

一种检测对虾肝胰腺坏死性细菌的实时荧光定量检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测对虾肝胰腺坏死性细菌的实时荧光定量检测试剂盒。该试剂盒包含一组检测对虾肝胰腺坏死性细菌的引物组和一组检测对虾属内参基因的引物组，所述两组引物组均包括一对特异性引物及对应的TaqMan探针，试剂盒还包括DNA聚合酶，UNG酶，2×反应缓冲液，密封液，阳性对照参考品和阴性对照参考品。本发明提供的一管式分装试剂盒可直接从复杂样品中检测对虾肝胰腺坏死性细菌，具有特异性强、灵敏度高、实验重复性好、操作便捷快速的优点，不需要昂贵的仪器即可完成检测，并且内参基因可以全程监控检测过程，有效提示假阴性的现象出现。可用于对虾肝胰腺坏死性细菌的快速、准确检测。

Description

一种检测对虾肝胰腺坏死性细菌的实时荧光定量检测试剂盒
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，具体地，涉及一种检测对虾肝胰腺坏死性细菌荧光定量PCR检测试剂盒。
背景技术
对虾肝胰腺坏死病(Necrotizing hepato pancreatitis；NHP)是由一种类立克次体的细菌肝胰腺坏死性细菌(Necrotizing hepato pancreatitis bacterium；NHPB)引起的对虾疾病。NHPB是一种革兰氏阴性菌，大小约为0.25m×0.9jm，多形态，专性细胞内寄生。NHPB是一种感染能力很强的菌种，宿主包括南美白对虾(Li to penaeus vannamei)、白滨对虾(L.seti ferus)、细角滨对虾(L.styli ros tris)等。病原的传播方式主要是水平传播——通过污染的水体、食物等。1990年时，在美国德州的南美白对虾上首次发现NHP，此后在秘鲁、厄瓜多尔、委内瑞拉、巴西、巴拿马、哥斯达黎加等国家均有报道。目前NHP的疫情已波及西半球的养虾产业，对养殖虾业者造成严重损失，其致死率在病征出现的30d内可达20％～95％。世界动物卫生组织认为NHP是一种高危的可能在全球爆发的疾病。通过16SrRNA分析，把NHPB归类于蛋白菌的α亚类，NHPB与斑疹伤寒热立克次氏体和斑点热立克次氏体有83.5％的相似性。
在PCR体系中加入扩增内参，是PCR检测技术标准化的措施之一。内参是在PCR体系中加入一段人工合成的DNA序列，在进行靶标基因的扩增时，内参基因也进行扩增，并且由于靶标基因与内参基因在两个通道各自进行扩增，两个基因并不会互相干扰，所以也不会对检测结果造成影响。一般来说内参基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小，内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量。
在PCR目前分子生物学检测中应用较多的方法是聚合酶链式反应(PCR)，其检测过程PCR仪还需要搭配电泳仪和凝胶成像仪使用，操作步骤多，耗时长，且过程易造成气溶胶污染。实时荧光定量PCR(Quantitative Real－time PCR)是在常规PCR技术的基础上添加荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知浓度模板进行定量分析的方法。与普通PCR技术相比，实时荧光定量PCR技术的TaqMan探针特异性强，可进行单个核苷酸的区分，同时操作更简便，检测时间更短。
发明内容
本发明在现有技术的基础上进行了改进措施，提供了一种检测对虾肝胰腺坏死性细菌的实时荧光定量检测试剂盒。该试剂盒包含一组检测对虾肝胰腺坏死性细菌的引物组和一组检测对虾属内参基因的引物组，所述两组引物组均包括一对特异性引物及对应的TaqMan探针，试剂盒还包括DNA聚合酶，反转录酶，2×反应缓冲液，密封液，阳性对照参考品和阴性对照参考品。本发明提供的试剂盒可直接从复杂样品中检测对虾肝胰腺坏死性细菌，具有特异性强、灵敏度高、实验重复性好和操作便捷快速的优点，同时设计内参基因引物作为内部参照，排除因样品核酸问题或者试剂失效导致的异常结果，适用于对虾肝胰腺坏死性细菌的现场快速、准确检测。
本发明的第一个目的是提供一组检测对虾肝胰腺坏死性细菌的引物组和一组检测对虾属内参基因的引物组。
本发明的第二个目的是提供一种带内参的检测试剂盒，具有特异性强、灵敏度高、实验重复性好和操作便捷快速的优点，同时设计内参基因引物作为内部参照，排除因样品核酸问题或者试剂失效导致的异常结果，适用于对虾肝胰腺坏死性细菌的现场快速、准确检测。
本发明的第三个目的是提供所述试剂盒在检测对虾肝胰腺坏死性细菌中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一组检测对虾肝胰腺坏死性细菌的引物组，所述引物组由正向引物F1、反向引物R1和荧光探针Q1组成，所述正向引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，荧光探针Q1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述荧光探针Q1的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
更优选地，所述荧光探针Q1的5’端标记6-FAM荧光基团，3’端标记MGB淬灭基团。
一组检测对虾属内参基因的引物组，其特征在于，所述引物组由正向引物F2、反向引物R2和荧光探针Q2组成，所述正向引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，荧光探针Q2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地，所述荧光探针Q2的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
更优选地，所述荧光探针Q2的5’端标记6-FAM荧光基团，3’端标记MGB淬灭基团。
一种检测试剂盒，所述试剂盒包含所述一组检测对虾肝胰腺坏死性细菌的引物组和一组检测对虾属内参基因的引物组。
优选地，所述试剂盒中还包含DNA聚合酶，反转录酶，UNG酶，2×反应缓冲液，密封液，阳性对照参考品和阴性对照参考品。
优选地，所述DNA聚合酶为Tth DNApolymerase和热启动抗体的混合液，UNG酶为尿嘧啶-N-糖基化酶，2×反应缓冲液是含有dATP、dCTP、dGTP和dUTP的2×浓度的反应溶液，密封液为矿物油。
优选地，所述阳性对照参考品为含有对虾肝胰腺坏死性细菌检测靶标基因的质粒DNA，所述阳性对照参考品为无RNA酶的去离子水。
优选地，所述试剂盒的反应体系为：对虾肝胰腺坏死性细菌的引物组的正向引物F1、反向引物R1和荧光探针Q1引物在反应体系中的终浓度分别为0.4～0.6μM、0.4～0.6μM和0.2～0.3μM；对虾属内参基因的引物组正向引物F2、反向引物R2和荧光探针Q2引物在反应体系中的终浓度分别为0.2～0.4μM、0.2～0.4μM和0.1～0.2μM；2×反应缓冲液12.5μL，DNA聚合酶2～4U，UNG酶0.3～0.5U，待检样品2～5μL，加无RNA酶的去离子水至25μL。
更优选地，所述试剂盒的反应体系为：对虾肝胰腺坏死性细菌的引物组正向引物F1、反向引物R1和荧光探针Q1引物在反应体系中的终浓度分别为0.4μM、0.4μM和0.2μM；对虾属内参基因的引物组正向引物F2、反向引物R2和荧光探针Q2引物在反应体系中的终浓度分别为0.24μM、0.24μM和0.16μM。2×反应缓冲液12.5μL，DNA聚合酶1.5U、UNG酶0.3U，待检样品5μL，加无RNA酶的去离子水至25μL。
优选地，所述反应体系的反应条件为50℃5min；95℃5min；95℃15s、60℃30s，45个循环。
所述试剂盒在检测对虾肝胰腺坏死性细菌中的应用。
本发明根据扩增曲线来判断检测结果。扩增曲线呈“S”形，检测结果为阳性，即检测样品中含有对虾肝胰腺坏死性细菌；无“S”形扩增曲线出现，检测结果为阴性，即检测样品不含有对虾肝胰腺坏死性细菌。
所述试剂盒在检测对虾肝胰腺坏死性细菌中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)特异性强：本发明用于引物设计的对虾肝胰腺坏死性细菌保守基因序列是一段特异性片段(序列如SEQ ID NO.7所示)，针对该目的基因片段设计一对特异引物和一个荧光探针进行扩增，特异性强。
(2)灵敏度高：对于含有对虾肝胰腺坏死性细菌检测靶标基因的阳性质粒，最低检出限可达到101copies/μL；
(3)实验重复性高：对阳性对照参考品(质粒浓度106copies/μL和101copies/μL)分别进行20次重复实验，Ct值变异系数≤5％；扩增曲线均呈典型“S”型曲线。
(4)操作简单且结果直接客观：操作步骤简单，可直接从复杂样品中检测对虾肝胰腺坏死性细菌，通过观察扩增曲线直接判断阴阳性，结果直接客观，不需要繁琐的电泳等其他任何分析步骤，对操作人员的经验要求不高，适合现场快速、准确检测。
(5)设置内参引物：可根据内参引物的扩增结果是否正常，排除因样品核酸问题或者试剂失效导致的异常结果。
附图说明
图1为实施例2中荧光定量PCR法检测对虾肝胰腺坏死性细菌的样品的结果示意图。
图2为实施例2中荧光定量PCR法检测对虾肝胰腺坏死性细菌的样品对虾属内参的结果示意图。
图3为实施例3中荧光定量PCR法检测对虾肝胰腺坏死性细菌的质粒DNA的灵敏度的结果示意图。
图4为实施例3中荧光定量PCR法检测对虾属内参的质粒DNA的灵敏度的结果示意图。
图5为实施例4中荧光定量PCR法检测对虾肝胰腺坏死性细菌的实际样品的特异性的结果示意图。
图6为实施例4中荧光定量PCR法检测实际样品内参基因的结果示意图。
图7为实施例5中荧光定量PCR法检测对虾肝胰腺坏死性细菌的106copies/μL浓度的质粒DNA的重复性的结果示意图。
图8为实施例5中荧光定量PCR法检测对虾属内参的106copies/μL质粒DNA的重复性的结果示意图。
图9为实施例5中荧光定量PCR法检测对虾肝胰腺坏死性细菌的101copies/μL质粒DNA的重复性的结果示意图。
图10为实施例5中荧光定量PCR法检测对虾属内参的101copies/μL质粒DNA的重复性的结果示意图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1一种检测对虾肝胰腺坏死性细菌荧光定量PCR检测试剂盒
一、组成：
一组检测对虾肝胰腺坏死性细菌的荧光定量PCR引物组、一组检测对虾属内参基因的引物组、DNA聚合酶、反转录酶、UNG酶、2×反应缓冲液、密封液、阳性对照参考品和阴性对照参考品。
其中，检测对虾肝胰腺坏死性细菌的荧光定量PCR引物组，由核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的正向引物F1、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物R1和核苷酸序列如SEQID NO.3所示的荧光探针Q1组成，
检测对虾属内参基因的引物组，由正向引物F2、反向引物R2和荧光探针Q2组成，所述正向引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，荧光探针Q2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，
是以对虾肝胰腺坏死性细菌保守基因作为特异靶标基因序列，序列如SEQ IDNO.7所示；以对虾属18SrRNA部分基因序列为内参基因，序列如SEQ ID NO.8所示。采用引物设计软件PrimerExpress3.0.1设计的，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
对虾肝胰腺坏死性细菌的引物组：
正向引物F1(SEQ ID NO.1)：5’-GTACACACCGCCCGTCAAG-3’；
反向引物R1(SEQ ID NO.2)：5’-GCTGGTTAGCTCATCGCCTTA-3’；
荧光探针Q1(SEQ ID NO.3)：5’-CATGGAAGTTATCTTTTC-3’；
荧光探针Q1的5’端标记6-FAM荧光基团，3’端标记能够淬灭荧光基团所发射荧光信号的淬灭基团MGB。
对虾属内参基因的引物组：
正向引物F2(SEQ ID NO.4)：5’-AAGGGCCGCGGTATACTGA-3’；
反向引物R2(SEQ ID NO.5)：5’-CGAGCCTCCAATTAAAAGACTAATG-3’；
荧光探针Q2(SEQ ID NO.6)：5’-CGTGCGAAGGTAGCATA-3’；
荧光探针Q2的5’端标记6-FAM荧光基团，3’端标记能够淬灭荧光基团所发射荧光信号的淬灭基团MGB。
对虾肝胰腺坏死性细菌保守基因序列(SEQ ID NO.7)：
GTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCAGCAGTTCGGCTGGGGACTCTAAGAAAACTGCCGGTGACAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGATGTCAGGTCCTCATGGCCCTTATGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGATCACAATGAGAAGCAAGGGGGTGACCCGGAGCCAATCTCTAAAAATCGTCTCAGTTCGGATTGTTCTCTGCAACTCGAGAGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATGCTGCGGTGAATACGTTCACGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGTTATCTTTTCTTTAAGGCGATGAGCTAACCAGCAATGGAGGCAGTCGACCACAGAAAAGGTGATGACTGGGGTTAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGTGGCTGGATTACCTCCTTTCTA
对虾属内参基因序列(SEQ ID NO.8)：
CGCCTGTTTATCAAAAACATGTCTATATGATTGGTATGTAAAGTCTGGCCTGCCCACTGATTTATTTTAAAGGGCCGCGGTATACTGACCGTGCGAAGGTAGCATAATCATTAGTCTTTTAATTGGAGGCTCGTATGAATGGTTGGACAAAAAGCAAACTGTCTCAATTATATTTATTGAATTTAACTTTTAAGTGAAAAGGCTTAAATAAATTAAGGGGACGATAAGACCCTATAAAGCTTTACAATAAGTTACCTATATTATAAATTGTTAGTATAACTTGAGTTTAGGTAACGTTTGTTGCGTTGGGGCGACGAGAATATAATAAGTAACTGTTCTTAAGTTATTTAATGACAGAAATTTCTGGAAAATTAATGATCCTCTACTAGAGATCATAAGATTAAGTTACTTTAGGGATAACAGCGTAATCTTCTTTGAGAGTCCACATCGACAGGAAGGGTTGCGACCTCGATGTTGAATTAAGGGTTCCTTATAATGCAGCAGTTATAAAGGAGGGTCTGTTCGACCTTTAAATCCTTACATGATCTGAGTTCAAACCGG
DNA聚合酶为Tth DNA polymerase和热启动抗体的混合液，UNG酶为尿嘧啶-N-糖基化酶，2×反应缓冲液是含有dATP、dCTP、dGTP和dUTP的2×浓度的反应溶液，密封液为矿物油。
阳性对照参考品为含有对虾肝胰腺坏死性细菌检测靶标基因与对虾属内参基因的质粒DNA，所述阴性对照参考品为无RNA酶的去离子水。
二、使用方法
1、将样品研磨至均匀状态，向离心管中加入400μL裂解液，振荡混匀30s。室温放置5～10min，10000rpm离心3min去除杂质。
2、取出试剂盒中的核酸吸附柱套管，尽可能多的转移上清液至柱子中，10000rpm离心1min。倒弃滤液后把核酸吸附柱套回收集管中，加入500μL洗涤液至吸附柱中，10000rpm离心1min。再加入400μL洗涤液，10000rpm离心1min，弃滤液，10000rpm空离3min，将核酸吸附柱转移至新的1.5mL离心管，加入100μL洗脱液至柱子的膜中央。室温静置1min，10000rpm离心1min。
3、弃去柱子，完成提取于-20℃保存备用，长期保存于-80℃。
4、进行PCR反应
反应体系为：对虾肝胰腺坏死性细菌的引物组正向引物F1、反向引物R1和荧光探针Q1引物在反应体系中的终浓度分别为0.4μM、0.4μM和0.2μM，对虾属内参基因的引物组正向引物F2、反向引物R2和荧光探针Q2引物在反应体系中的终浓度分别为0.24μM、0.24μM和0.16μM，2×反应缓冲液12.5μL，DNA聚合酶1.5U，UNG酶0.3U，待检样品5μL，加无RNA酶的去离子水至25μL。
反应程序为：50℃5min；95℃5min；95℃15s、60℃30s，45个循环。
对提取的DNA进行检测，同时设置阴性对照。
三、结果判定
用上述试剂盒对对虾肝胰腺坏死性细菌的实际样品进行检测，样品呈现典型的“S”型曲线扩增(如图1所示)，为阳性结果，证明样品中检出对虾肝胰腺坏死性细菌。反之，结果为阴性。
用上述试剂盒对对虾肝胰腺坏死性细菌的实际样品对虾属内参进行检测，样品呈现典型的“S”型曲线扩增(如图2所示)，为阳性结果，证明样品中检出对虾属内参。反之，结果为阴性，可能是因样品核酸问题或者试剂失效导致的异常结果。
实施例3灵敏度实验
将质粒DNA进行10倍梯度稀释，分别以107copies/μL、106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL和100copies/μL八个梯度浓度DNA作为模板和阴性对照(无RNA酶的去离子水)，使用实施例1的试剂盒进行检测。
如图3所示，结果表明：将对虾肝胰腺坏死性细菌质粒DNA进行10倍梯度稀释后，该试剂盒可检测浓度为101copies/μL的质粒DNA。
如图4所示，结果表明：将对虾属内参质粒DNA进行10倍梯度稀释后，该试剂盒可检测浓度为101copies/μL的质粒DNA。
实施例4特异性实验
用实施例1的试剂盒分别检测对虾肝胰腺坏死性细菌、致急性肝胰腺坏死病副溶血性弧菌、虾肝肠胞虫和十足目虹彩病毒的样品。
如图5所示，结果表明，检测样品内参基因均出现扩增曲线，显示检测样品的核酸正常，排除因样品核酸问题或者试剂失效导致的异常结果。
如图6所示，结果表明，仅检测对虾肝胰腺坏死性细菌的样品出现扩增曲线，其余样品没有扩增，显示该试剂盒检测特异性良好。
实施例5重复性实验
以浓度为106copies/μL和102copies/μL的对虾肝胰腺坏死性细菌质粒DNA为模板DNA，各自设置20次平行，同时设置阴性对照(无RNA酶的去离子水)使用实施例1的试剂盒进行检测。
如图7、8、9、10所示，结果表明，质粒DNA两个浓度重复20次进行检测实验，重复性良好，Ct值变异系数≤5％，证明该试剂盒稳定性良好。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Figure BDA0003716256860000101
Figure BDA0003716256860000111
序列表
<110> 连云港旋达生物科技有限公司
<120> 一种检测对虾肝胰腺坏死性细菌的实时荧光定量检测试剂盒
<130> 2022
<141> 2022-06-27
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgtgcgaagg tagcata 17

Claims (10)

1.一组检测对虾肝胰腺坏死性细菌的引物组，其特征在于，所述引物组由正向引物F1、反向引物R1和荧光探针Q1组成，所述正向引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，荧光探针Q1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的一组检测对虾肝胰腺坏死性细菌的引物组，其特征在于，所述荧光探针Q1的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
3.一组检测对虾属内参基因的引物组，其特征在于，所述引物组由正向引物F2、反向引物R2和荧光探针Q2组成，所述正向引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，荧光探针Q2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
4.根据权利要求2所述的一组检测对虾属内参基因的引物组，其特征在于，所述荧光探针Q2的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
5.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的检测对虾肝胰腺坏死性细菌的引物组，还包含权利要求3或4所述的检测对虾属内参基因的引物组。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含DNA聚合酶，反转录酶，UNG酶，2×反应缓冲液，密封液，阳性对照参考品和阴性对照参考品。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Tth DNA polymerase和热启动抗体的混合液，UNG酶为尿嘧啶-N-糖基化酶，2×反应缓冲液是含有dATP、dCTP、dGTP和dUTP的2×浓度的反应溶液，密封液为矿物油；
所述阳性对照参考品为含有对虾肝胰腺坏死性细菌检测靶标基因与对虾属内参基因的质粒DNA，所述阳性对照参考品为无RNA酶的去离子水。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系为：对虾肝胰腺坏死性细菌的引物组的正向引物F1、反向引物R1和荧光探针Q1引物在反应体系中的终浓度分别为0.4～0.6μM、0.4～0.6μM和0.2～0.3μM；对虾属内参基因的引物组正向引物F2、反向引物R2和荧光探针Q2引物在反应体系中的终浓度分别为0.2～0.4μM、0.2～0.4μM和0.1～0.2μM；2×反应缓冲液12.5μL，DNA聚合酶2～4U，UNG酶0.3～0.5U，待检样品2～5μL，加无RNA酶的去离子水至25μL。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述反应体系的反应条件为50℃5min；95℃5min；95℃15s、60℃30s，45个循环。
10.权利要求5～8任一所述试剂盒在检测对虾肝胰腺坏死性细菌中的应用。
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